Apresentação MEV - Completa

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Universidade do Estado do Rio de Janeiro – UERJ
Faculdade de Engenharia Mecânica – FEN
Disciplina: Microscopia Eletrônica de Varredura
Grupo: 3
Participantes: Michelle Lopes, Ingrid Veras, Isabel Santos e André Martins
Plano de Aula
Sumário da Apresentação
Motivação do Trabalho 
Introdução ao assunto
Metodologia Aplicada
Resultados
Discussão dos Resultados
Vantagens
Desvantagens
Conclusão Final
Trabalhos Futuros
MEV aplicado a materiais biológicos
Plano de Aula
Motivação do Trabalho
https://lnnano.cnpem.br/instalacoes/microscopia-e-criomicroscopia/microscopia-eletronica/
https://www.megacurioso.com.br/fotografia/44484-imagens-microscopicas-de-insetos-sao-nojentas-e-incriveis-ao-mesmo-tempo.htm
Comparativo das diferentes condições de processamento e uso do microscópio Eletrônico de Varredura
em células e insetos. 
Tendo em vista as diferenças dos materiais biológicos, Os espécimes são, normalmente, frágeis, hidratados, facilmente danificáveis e apresentam pouco contraste natural. Por isso, é necessário, antes da observação no microscópio eletrônico, empregar métodos apropriados visando garantir sua integridade e melhor visualização. 
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Plano de Aula
Motivação do Trabalho
Tipo de cultivo
Morfologia
Saber a diferença dos materiais biológicos e suas características no processamento e observação no microscópio. 
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Plano de Aula
Introdução ao Assunto
Plano de Aula
Introdução ao Assunto
Artigo 1- Avaliar o efeito de indução apoptótica da abamectina em células de Spodoptera frugiperda (Sf9). 
Artigo 2 - Avaliar O possível envolvimento de uma (antena) estrutura peculiar no contexto do mecanismo de reconhecimento do hospedeiro.
Artigo 3- Avaliar o papel dos palpos labiais nos comportamentos relacionados ao olfato de insetos.
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Plano de Aula
Introdução ao Assunto
Artigo 4 – este estudo fornece uma metodologia detalhada com uma técnica mais simples de “sem preparação de amostra” para escanear amostras biológicas frescas sem o uso de qualquerprodutos químicos e máquinas adicionais
Artigo 5 - este estudo visa fornecer informações adicionais a partir de uma fonte alternativa de dados morfológicos
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Plano de Aula
Metodologia Adotada
Artigo 1 - 
As linhas celulares Sf9 e SL-1 foram tratadas com 1 μg/mL e 10 μg/mL Amostras de rotenona e de células foram coletadas em 24 e 48 h, respectivamente. Para análise SEM, as células foram fixadas com glutaraldeído a 2,5% por 4 h e pós-fixado em tetróxido de ósmio por 1 h a 4 ◦C. Em seguida, as amostras foram desidratado em gradiente ascendente de álcool (50%, 70%, 80%, 90%, e 100%). Após a desidratação em acetato de amila, as amostras foram secas em ponto crítico e revestidas com ouro-paládio.
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Plano de Aula
Metodologia Adotada
Microscópio Eletrônico de Varredura JEOL, JSM-6390
Configurações das análises:
Aceleração: 10KV
Magnificação: 6400x 
Condições de vácuo: ?
Detector: Elétrons secundários
Plano de Aula
Resultados
Imagens SEM(Fig. 2B) membrana celular enrugada com alguns 'buracos negros' na superfície após o tratamento com rotenona. 
Esses resultados sugeriram o necrose nas duas linhagens celulares de insetos.
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Estudar as estruturas e distribuição de sensilas dos palpos labiais S. frugiperda usando um Microscópio Eletrônico de varredura 3D.
Artigo 2 
Chen et al . 2021
Configurações das análises:
Aceleração: 10KV
Magnificação: 150x
Condições de vácuo: alto vácuo
Detector: Elétrons secundários
Preparo das amostras: Metalizados 
-Microscópio Eletrônico de Varredura Hitachi SU8010
Plano de Aula
Metodologia Adotada
Reconhecimento de finas estruturas nos palpos labiais, e as sensilas localizadas no LPO de S. frugiperda. 
Essas finas estruturas são órgãos olfativos responsáveis pelo reconhecimento de compostos voláteis em plantas.
Plano de Aula
Resultados
Artigo 3
Manduca sexta (Sphingidae)
Spodoptera frugiperda (Noctuidae)
Ovos entre tricomas de Solanum 
Estudar estruturas de plantas e de duas espécies de Lepidoptera sem o uso de técnicas elaboradas e obter bons resultados no MEV de bancada. 
Configurações das análises:
Aceleração: 10KV
Magnificação: 
Condições de vácuo: 
Detector:
Elétrons secundários:
Preparo das amostras
Microscópio Eletrônico - SNE- 4500 Plus Tabletop 
Watts et al. 2021
Plano de Aula
Metodologia Adotada
Watts et al. 2021
Plano de Aula
Resultados
Reconhecer morfologia de: tricomas (pêlos); estruturas de defesa física contra herbívoros, espinhos, ceras e características morfológicas de insetos;
Obtiveram imagens em alta resolução utilizando técnicas simples e obter bons resultados.
Fig. A – ovo de S. frugiperda em Tomate 75x; B- Tricoma de Solanaceae 1000x
Watts et al. 2021
Plano de Aula
Resultados
Diversidade de Tricomas de diferentes famílias de plantas
Artigo 4
MEV– Philips XL 30 
Riolo et al. 2016
Vespas adultas foram anestesiadas em CO2 – 18°C; 
Antenas foram cortadas usando laminas de barbear - MET; 
Montadas em stubs;
Metalizadas
Microscópio Eletrônico – Philips XL 30
Metalizador - Balzers SCD 040
Plano de Aula
Metodologia Adotada
Riolo et al. 2016
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Plano de Aula
Resultados
Riolo et al. 2016
Artigo 5 – Dissertação 
Sardinha 2019
Metodologia Adotada
Plano de Aula
Resultados
Realizar um estudo descritivo do pterostigma em grupos de vespas apoideas da família Crabronidae com ênfase na subtribo Stigmina 
Sardinha 2019
Plano de Aula
Metodologia Adotada
Metalizadora - Baltec- SCD 050
Ponto crítico - Baltec- SCD 050
Sardinha 2019
Plano de Aula
Resultados
Sardinha 2019
Artigo 6 – Iniciação Científica 
Geração dos esferoides: Placas de 96 poços revestidos com argarose (1,5%)
Plano de Aula
Metodologia Adotada
Shimadzu Corporation - Superscan SS-550
Cultivo da linhagem Ca SKi
Cristina (5,7-diidroxiflavona) diluída em DMSO na concentração de 40mM;
Plano de Aula
Resultados
Plano de Aula
Discussão dos Resultados
Morfologia: foi possível observar que os esferóides CN apresentam estrutura composta por células e matriz extracelular. Os esferóides tratados com as concentrações de 50µM e 100µM de crisina mantém as células na sua superfície, porém nota-se um aumento na quantidade de matriz extracelular
Esferoides tratados com crisina: não foi mais observado células na superfície do mesmo, mas apenas matriz extracelular. 
	As células que compõe a superfície do esferóides foram mortas em decorrência do tratamento. 
	A matriz extracelular permaneceu nos esferóides, o que pode atuar como uma barreira contra a ação da crisina às células do interior dos esferóides.
Foi observado que por conta da preparação das lâminas, os esferóides acabaram perdendo seu formato tridimensional, adquirindo um formato plano, semelhante à um disco, o que impossibilitou a avaliação do diâmetro dos mesmos.
Plano de Aula
Metodologia Adotada
•Após o revestimento com o filme binário, as amostras foram colocadas em placa de cultura de tecido de 96 poços.
•As células VERO (ATCC CCL-81 – célula epitelial aderente de rim de macaco –As amostras semeadas com as células VERO foram semeadas 50.000 células em 100 μL de suspensão
•Depois da semeadura as amostras retornaram à estufa de CO2 (5%) permanecendo por 24 h a 37 °C.
•Para manter a estrutura celular as amostras foram fixadas com solução de glutaraldeído durante 16 h a 37 °C.
•Posteriormente, o glutaraldeído foi aspirado e a desidratação crescente da amostra foi realizada em solução etanólica (30, 50, 70 e 100%) por cerca de 30 min à temperatura ambiente.
•Finalmente, as amostras foram metalizadas com ouro e seguiram para a análise no microscópio eletrônico de varredura (JEOL JSM 6360 LV) com aceleração de 15 kV. 
Plano de Aula
Resultados
MEV de células aderidas à superfície do filme binário
Plano de Aula
Discussão dos Resultados
•A adesão celular é um dos pré-requisitos para a proliferação e diferenciação celular antes da formação do tecido.
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•A adesão celular a uma superfície inicia-seatravés de uma adesão preliminar, caracterizada por ligações fracas, passando pelo espalhamento celular que favorece a formação de ligações fortes entre a célula e o substrato.
•
•Assim, uma análise das imagens de MEV permite a comprovação da biocompatibilidade do filme sol-gel binário, uma vez que, as células VERO semeadas sobre a superfície da amostra, apresentaram-se perfeitamente aderidas ao substrato. 
Plano de Aula
Vantagens
Ótima resolução: Tornando-se uma ferramenta importante em atividades de pesquisa;
Grande profundidade de foco: Atinge a resolução 300 vezes maior que o microscópio óptico;
Fácil interpretação das micrografias: diversidade em informações obtidas;
Riquesas nos detalhes.
•Funções estruturais
•Relação insetos X ambiente/hospedeiros
•Apoptose
•Ultraestrutura
No geral, demonstramos que o uso do DSEM, que é rápido, fácil de operar e barato, pode produzir imagens de qualidade semelhante a outros SEM, com custos de aquisição, manutenção e metodologia significativamente menores.
Além de poder utilizar espécimes frescos (com alto teor de água conteúdo como folhas, uma tarefa quase impossível com um SEM tradicional), excluindo procedimentos de preparação de amostras elaborados; 
Plano de Aula
Vantagens
Plano de Aula
Desvantagens
Limitações no aplicação da microscopia no pesquisa biológica: Não é possível visualizar células viva.
Dificuldade de examinar amostras isoladas e a impossibilidade em examinar amostras hidratadas.
Resistência da amostra ao bombardeamento do feixe de elétrons e ao vácuo da coluna.
Imagens obtidas em escala de preto, cinza e branco;
Tecnologia cara.
•Impossibilidade de analisar amostras hidratadas
•Longo tempo de preparo
•Ausência de coloração
Plano de Aula
Conclusões Finais
Devido a algumas limitações impostas as analise no MEV, ele serve como um método de analise complementar, quando o intuito é analisar estruturas vivas.
Lembrando que uma dessa implicações se da ao fato das amostras necessitarem passar por diversos processos para que tanto o vácuo presente na coluna quando o direcionamento dos feixes de elétrons não sofram alterações que reflitam na qualidade de obtenção da imagem. 
Tudo isso implica em manter a identidade bioquímica da célula.
Plano de Aula
Trabalhos Futuros
FIB (focused Ion Beam) - Metodologia que permite ter uma visão tridimensional de uma organela, célula, ou o instrumento de estudo que está sendo observado, por meio de de cortes seriados, a tomografia eletrônica, e a microscopia eletrônica de duplo feixe.