Inflamação na Medula Espinhal em Neuropatia Dolorosa

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DAIANE OLIVEIRA MATIAS 
 
 
 
 
 
 
 
AVALIAÇÃO DA INFLAMAÇÃO NA MEDULA ESPINHAL EM UM MODELO DE 
NEUROPATIA DOLOROSA INDUZIDA PELO PACLITAXEL 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Rio de Janeiro - RJ 
2018
 
 
15 
 
DAIANE OLIVEIRA MATIAS 
 
 
 
 
 
 
 
AVALIAÇÃO DA INFLAMAÇÃO NA MEDULA ESPINHAL EM UM MODELO DE 
NEUROPATIA DOLOROSA INDUZIDA PELO PACLITAXEL 
 
 
 
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas, da 
Faculdade de Farmácia da Universidade 
Federal do Rio de Janeiro, como requisito 
parcial à obtenção do Título de Mestre em 
Ciências Farmacêuticas. 
Orientador: Prof. Robson da Costa. 
Co-orientadora: Prof.ª Cláudia Pinto 
Figueiredo. 
 
 
 
 
 
Rio de Janeiro - RJ 
2018 
 
 
 
 
Ficha Catalográfica 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Matias, Daiane Oliveira 
 Avaliação da inflamação na medula espinhal em um modelo de neuropatia 
dolorosa induzida pelo paclitaxel. / Daiane Oliveira Matias. – Rio de Janeiro: UFRJ / 
Centro de Ciências da Saúde, Faculdade de Farmácia, 2018. 
69 f. il. ; 31 cm. 
Orientador: Robson da Costa 
Coorientadora: Cláudia Pinto Figueiredo 
Dissertação (mestrado) -- UFRJ, CCS, Faculdade de Farmácia, Programa de Pós- 
Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2018. 
 
 Referências: p. 61-69. 
 
 1. Paclitaxel. 2. Doenças do Sistema Nervoso Periférico- induzido quimicamente. 
3.Inflamação. 4. Neuroglia - imunologia. 5. Medula espinhal. 6. Neutropenia. 7. 
Farmácia - tese. I. Costa, Robson da. II. Figueiredo, Cláudia Pinto. III. UFRJ, CCS, 
Faculdade de Farmácia, Programa de Pós- Graduação em Ciências Farmacêuticas. 
IV. Título. 
 
 
AGRADECIMENTOS 
 
Agradeço a Deus por ter me mantido resiliente e pelas bênçãos concebidas a 
mim nos últimos anos. 
 Ao meu orientador Robson da Costa, pela oportunidade, orientação, 
dedicação, paciência e ensinamentos em todos estes anos desde a iniciação 
cientifica, a co-orientadora e professora Claudia P. Figueiredo e a todos os 
colaboradores do Núcleo de Neurociências da Faculdade de Farmácia (NNeFFar). 
 Ao professor Leandro Miranda Alves, pela receptividade e orientação nos 
experimentos de imuno-histoquímica deste trabalho. 
 A professora Ana Luísa Palhares de Miranda, pelo incentivo e acolhimento. 
 A Mariana Soares pela ajuda em grande parte dos experimentos deste 
trabalho. 
 Aos demais amigos que colaboraram ativamente para a realização deste 
trabalho, Rafaela Vieira, Natália Linhares, Fabiana Chaves, Aline França, Vanessa 
Domitila, Vinicius Santos e Luciana Afonso. 
 Aos demais amigos do laboratório de estudos em farmacologia experimental 
(Lefex), pela agradável convivência e motivação diária. 
 A minha família e amigos, em especial a minha mãe Marilva Oliveira, avó 
Santana Oneide, irmão Wenglis Oliveira, prima Marina Cruz, irmão Yuri Cavalcante, 
amigo Jonathas Xavier e namorado Carlos Henrique Rodrigues, pelo amor, incentivo 
e confiança. 
 A CAPES, CNPq, e FAPERJ pelo suporte financeiro. 
 
 
 
Meus sinceros agradecimentos a todos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“Seus feitos são seus monumentos. ” 
(Palacio, R. J. 2013) 
 
 
 
RESUMO 
Matias, Daiane Oliveira. Avaliação da inflamação na medula espinhal em um 
modelo de neuropatia dolorosa induzida pelo paclitaxel. Rio de Janeiro, 2018. 
Dissertação de Mestrado, Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Faculdade 
de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2018. 
A neuropatia periférica dolorosa é um efeito adverso dose limitante do paclitaxel 
(PTX), um quimioterápico amplamente utilizado no tratamento oncológico. Estudos 
recentes evidenciam a importância da neuroinflamação na medula espinhal (ME) na 
patogênese das neuropatias dolorosas causadas por lesão de nervos. No entanto, 
os mecanismos neuroinflamatórios que ocorrem na neuropatia periférica induzida 
pelo PTX ainda não são conhecidos. Neste estudo buscamos avaliar o envolvimento 
da inflamação na ME na neuropatia induzida pelo PTX. Camundongos swiss machos 
(30-40 g) foram tratados com PTX (2 mg/Kg, i.p.) ou veículo (0.9% NaCl) uma vez ao 
dia por 5 dias consecutivos. A neuropatia periférica foi avaliada pela sensibilidade 
plantar dos animais a estímulos mecânicos (filamentos de von Frey), ao frio (teste da 
acetona) e ao calor (teste de Hargreaves). O tratamento com PTX reduziu 
significantemente o limiar de retirada da pata aos estímulos mecânicos a partir do 7º 
dia do protocolo experimental. As sensibilidades térmicas ao frio e ao calor não 
foram alteradas. A migração de células imunes para o SNC pode contribuir para 
neuropatia periférica, então avaliamos o papel dos neutrófilos na neuropatia induzida 
pelo PTX através do ensaio de atividade da enzima mieloperoxidase (MPO), 
determinando indiretamente a migração dessas células para a medula espinhal. Foi 
avaliado também o efeito da depleção de neutrófilos sobre a hipersensibilidade 
mecânica. Nossos resultados demonstram que não houve alteração da atividade da 
MPO na ME de animais tratados com PTX, sugerindo não haver alterações na 
migração de neutrófilos para esta estrutura neste modelo. Ainda, a depleção de 
neutrófilos com vimblastina (5 mg/Kg i.v.) não interferiu no desenvolvimento da 
neuropatia dolorosa causada pelo PTX, corroborando os dados bioquímicos. Os 
níveis espinhais de interleucina-1β (IL-1β), foram quantificados (por ELISA) nos 
diferentes grupos experimentais. A ME de camundongos tratados com PTX 
apresentou níveis de IL-1β similares aos observados nos animais tratados com 
veículo. As células gliais são chaves nos mecanismos neuroinflamatórios em 
diferentes modelos de dor; neste trabalho avaliamos através do ensaio de 
imunohistoquímica os níveis espinhais de marcadores para astrócito (GFAP) e 
microglia (Iba-1), com o intuito de quantificar a ativação/migração de células da glia 
para ME. Nossos resultados demonstram que a imunomarcação para GFAP 
encontra-se significativamente aumentada 24 h após o primeiro tratamento com 
PTX, indicando aumento na ativação de astrócitos. No entanto, não se observou 
alterações significativas para a imunomarcação de Iba-1, sugerindo não haver 
aumento na migração células microgliais. A participação de microglia na neuropatia 
induzida pelo PTX foi também avaliada pelo tratamento com a minociclina (doses de 
30 e 100 mg/kg), inibidor da ativação de microglia. O tratamento com a minociclina 
 
 
na dose de 30 mg/kg não alterou significativamente a sensibilidade mecânica 
causada pelo PTX; entretanto, quando administrada na dose de 100 mg/kg, reduziu 
de forma significativa a sensibilidade mecânica associada ao modelo. Em conjunto, 
nossos dados sugerem que células gliais da medula espinhal contribuem para a 
neuropatia dolorosa induzida pelo paclitaxel. 
 
Palavras-Chaves: Neuroinflamação, Paclitaxel, Neuropatia, Quimioterápicos, 
Neutrófilos, Glia. 
 
 
 
ABSTRACT 
Matias, Daiane Oliveira. Evaluation of spinal cord inflammation in a model of 
painful neuropathy induced by paclitaxel. Rio de Janeiro, 2018. Master's Degree 
Dissertation, Post-Graduation in Pharmaceutical Sciences, Faculty of Pharmacy, 
Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2018. 
Painful peripheral neuropathy is a dose-limiting adverse effect of paclitaxel (PTX), a 
chemotherapy widely used in cancer treatment. Recent studies have demonstrated 
the importance of neuroinflammation in the spinal cord (SC) in the pathogenesis of 
painful neuropathies caused by nerve damage. However, the neuroinflammatory 
mechanisms that occur in peripheral neuropathy induced by PTX are unknown. In 
this study, we sought to evaluate the involvement of SC inflammation in PTX-induced 
neuropathy in mice. Male swiss mice (30-40 g) were treatedwith PTX (2 mg/kg, i.p.) 
or vehicle (0.9% NaCl) once a day for 5 consecutive days. Peripheral neuropathy 
was evaluated by assessing mouse plantar sensitivity to mechanical (von Frey 
filaments), cold (acetone test) and heat (Hargreaves test) stimuli. Treatment with PTX 
significantly reduced the paw withdrawal threshold to mechanical stimulus from the 
7th day of the experimental protocol. The thermal sensitivities to cold and heat were 
not altered. Migration of immune cells to the CNS may contribute to peripheral 
neuropathy, so we evaluated the role of neutrophils in PTX-induced neuropathy by 
assessing the activity of myeloperoxidase (MPO) enzyme, an indirect marker of 
neutrophils migration into the SC. The effect of neutrophil depletion on mechanical 
hypersensitivity was also evaluated. Our results demonstrate that there was no 
alteration in MPO activity in the mouse SC after the treatment with PTX, suggesting 
no changes in neutrophil migration to this structure in this model. Furthermore, 
neutrophil depletion with vimblastine (5 mg/kg i.v.) did not interfere in the 
development of painful neuropathy caused by PTX, corroborating the biochemical 
data. Spinal levels of interleukin-1β (IL-1β) were quantified (by ELISA) in the different 
experimental groups. SC of mice treated with PTX showed IL-1β levels similar to 
those observed in vehicle treated animals. Glial cells are key cells in the 
neuroinflammatory mechanisms in different pain models; in this work we evaluated 
the spinal levels of astrocyte (GFAP) and microglia (Iba-1) markers by 
immunohistochemical assay to quantify the migration of glial cells to the SC. Our 
results demonstrate that immunostaining for GFAP is significantly increased 24 h 
after the first PTX treatment, indicating increased astrocyte activation. However, no 
significant changes were observed for Iba-1 immunostaining, suggesting no increase 
in microglial cell migration. The participation of microglia in PTX-induced neuropathy 
was also evaluated by treatment with minocycline (doses of 30 and 100 mg / kg), an 
inhibitor of microglia activation. Treatment with minocycline at the dose of 30 mg / kg 
did not significantly alter the mechanical sensitivity caused by PTX; however, when 
administered at a dose of 100 mg/kg, it significantly reduced the mechanical 
sensitivity associated with the model. Taken together, our data suggest that glial cells 
from the SC contribute to painful neuropathy induced by paclitaxel. 
 
 
Keywords: Neuroinflammation, Paclitaxel, Neuropathy, Chemotherapeutics, 
Neutrophils, Glia. 
 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
Figura 1: Esquema ilustrativo do circuito neuronal fisiológico da dor............ 17 
Figura 2: Esquema ilustrativo dos danos que ocorrem a mitocôndria no 
gânglio da raiz dorsal (GRD) após o tratamento com o paclitaxel 
20 
Figura 3: Células imunológicas liberam mediadores que produzem 
sensibilização periférica de neurônios sensoriais nociceptores...... 
22 
Figura 4: Microglia e células T medeiam a sensibilização central da dor na 
medula espinhal................................................................................. 
24 
Figura 5: Avaliação da sensibilidade térmica no modelo de neuropatia 
induzida por PTX ............................................................................ 
40 
Figura 6: Caracterização do modelo de neuropatia periférica induzida pelo 
PTX ................................................................................................ 
42 
Figura 7: Avaliação da migração de neutrófilos para medula espinhal de 
camundongos tratados com PTX ................................................... 
43 
Figura 8: Efeito da depleção de neutrófilos sobre a neuropatia causada pelo 
PTX ........................................................................................ 
45 
Figura 9: Níveis da citocina pró-inflamatória IL-1β em animais tratados com 
PTX ........................................................................................ 
47 
Figura 10: Níveis de expressão de astrócitos (GFAP) na medula espinhal de 
animais tratados com PTX ............................................................. 
49 
Figura 11: Níveis de expressão de microglia (IBA-1) na medula espinhal de 
animais tratados com PTX ............................................................. 
50 
Figura 12: Bloqueio da microglia reduziu a hiperalgesia mecânica induzida por 
PTX .......................................................................................... 
52 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE TABELAS 
 
Tabela 1: Contagem total e diferencial de leucócitos no sangue de 
animais no 3º dia após o tratamento com vimblastina 
....................................................................................... 
46 
Tabela 2: Contagem total e diferencial de leucócitos no sangue de 
animais no 18º dia após o tratamento com vimblastina 
............................................................................................ 
46 
 
 
 
 
 
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS 
 
 ATC – Antidepressivos tricíclicos 
ATP – Adenosina trifosfato 
AMPAR – Receptor a-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiónico 
CGRP – Peptídeo relacionado ao gene da calcitonina 
G – Grama 
GABA – Ácido Gama-aminobutírico 
GFAP – Proteína glial fibrilar ácida 
GRD – Gânglio da raiz dorsal 
H – Horas 
IASP – Associação Internacional do Estudo da Dor 
IBA-1 – Molécula adaptadora de cálcio ionizado - 1 
IL-1β – Interleucina 1 beta 
IL-5 – Interleucina 5 
IL-6 – Interleucina 6 
IL-17A – Interleucina 17A 
i.p. – Intraperitoneal 
i.t. – Intratecal 
i.v. – Intravenoso 
LPNC – Ligação parcial do nervo ciático 
MAPK – Proteína quinase ativada por mitógeno K 
ME – Medula espinhal 
 
 
mPTP – Poro de transição de permeabilidade mitocondrial 
MPO – Mieloperoxidase 
NF-kB – Fator nuclear -kB 
NPIQ – Neuropatia periférica induzida por quimioterápico 
NPIP – Neuropatia periférica induzida pelo paclitaxel 
NDMAR – Receptor N-metil-D-aspártico 
PGE2 – Prostaglandina E2 
PI3K – Fosfatidilinositol 3 quinase 
PI3Kγ – Fosfatidilinositol 3 quinase gama 
PKC – Proteína quinase C 
PLC – Fosfolipase C 
PTX – Paclitaxel 
ROS – Espécie reativa de oxigênio 
SNC – Sistema nervoso central 
SNP – Sistema nervoso periférico 
SP – Substância P 
TLRs – Recpetores do tipo Toll 
TNF – Fator de necrose tumoral 
TNF-α – Fator de necrose tumoral alfa 
TRPV1 – Receptor de potencial transitório vanilóide 1 
OXA – Oxaliplatina 
v.o. – Via oral 
 
 
 
SUMÁRIO 
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................... 15 
1.1 Dor neuropática ..................................................................................... 15 
1.2 Tratamentos farmacológicos ................................................................ 18 
1.3 Neuropatia periférica dolorosa induzida pelo paclitaxel ........................ 19 
1.4 Inflamação e dor neuropática ............................................................... 21 
2. OBJETIVOS ........................................................................................... 30 
2.1 Objetivo geral ........................................................................................ 30 
2.2 Objetivos específicos ............................................................................. 30 
3. MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................... 31 
3.1 Reagentes ............................................................................................... 31 
3.2 Animais ................................................................................................. 32 
3.3 Procedimentos Experimentais ............................................................... 32 
3.2.1 Neuropatia periférica induzida pelo paclitaxel ....................................... 33 
3.3.2 Avaliação da sensibilidademecânica ................................................... 33 
3.3.3 Avaliação da sensibilidade ao frio ......................................................... 34 
3.3.4 Avaliação da sensibilidade ao calor ...................................................... 34 
3.3.5 Avaliação da atividade da mieloperoxidase .......................................... 34 
3.3.6 Ensaio imuno enzimático (ELISA) para dosagem da citocina IL-1 β .... 35 
3.3.7 Imunohistoquímica ............................................................................ 35 
3.3.8 Depleção de neutrófilos .................................................................... 37 
3.3.9 Tratamento com Minociclina ............................................................. 38 
3.3.1 Análise estatística ........................................................................... 38 
4. RESULTADOS 39 
4.1 Caracterização do modelo de neuropatia periférica induzida pelo PTX 39 
4.2 Avaliação da migração de neutrófilos para medula espinhal após o 
tratamento com PTX ................................................................................. 
43 
 
 
4.3 Efeito da depleção de neutrófilos sobre a hipersensibilidade mecânica 
induzida pelo PTX .................................................................................... 
44 
4.4 Avaliação dos níveis da citocina pró-inflamatória IL-1β na medula 
espinhal de animais tratados com PTX ................................................... 
47 
4.5 Avaliação dos níveis de marcadores de células gliais na medula espinhal 
de animais tratados com PTX ................................................................. 
48 
4.6 Efeito do tratamento com minociclina sobre a hipersensibilidade mecânica 
causada pelo PTX ...................................................................................... 
51 
5. DISCUSSÃO .............................................................................................. 53 
6. CONCLUSÕES........................................................................................... 60 
 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................... 61 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
15 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
1.1. Dor 
 A dor é por definição uma experiência sensorial e emocional desagradável 
associada ou relacionada à lesão real ou potencial dos tecidos (IASP, 2010). Sendo 
assim a dor é um mecanismo fisiológico fundamental de proteção e defesa contra 
agentes nocivos externos ou lesão tecidual. A capacidade de detectar estímulos 
nocivos é extremamente importante para o bom funcionamento do organismo, 
entretanto comumente a dor pode sofrer alterações em seu curso normal e deixar de 
ser uma função útil de alerta agudo e tornar-se crônica e debilitante (BASBAUM et 
al., 2009; KUNER, 2010). 
O processamento fisiológico da dor envolve circuitos neuronais periféricos e 
centrais tanto excitatórios quanto inibitórios, que em condições normais estão em 
equilíbrio e a disfunção desses circuitos resulta no desenvolvimento patológico da 
dor e o surgimento da dor crônica (WOOLF, 2010). Determinados estímulos nocivos, 
como calor, frio, compressão mecânica e componentes químicos podem ser 
detectados por diferentes tipos de fibras (C e Aδ) nervosas periféricas. As fibras C 
podem ser subdividas em fibras C peptidérgicas e fibras C não peptidérgicas; ambas 
são fibras nociceptivas não mielinizadas, de pequeno diâmetro. As fibras Aδ também 
são fibras nociceptivas, porém pouco mielinizadas e de médio diâmetro. Ambas 
fibras C e Aδ respondem a estímulos mecânicos, térmicos e químicos; essas fibras 
diferem apenas na velocidade na qual são capazes de conduzir os sinais neuronais. 
Ainda existem as fibras Aα e Aβ que fisiologicamente desempenham funções 
relacionadas a sensação tátil e movimentos, no entanto em condições patológicas 
elas podem passar a transmitir também os estímulos nocivos. Os corpos celulares 
das fibras aferentes primárias encontram-se no gânglio da raiz dorsal (GRD) e suas 
terminações encontram-se entre as lâminas I e IV do corno dorsal da medula 
espinhal, onde ocorre a comunicação entre sistema nervoso periférico e sistema 
nervoso central (KUNER, 2010; WOOLF, 2011). 
Os estímulos nocivos são convertidos em sinais elétricos pelos receptores de 
potencial transitório e pelos receptores purinérgicos, ainda essa atividade elétrica é 
amplificada pelos canais de sódio Nav 1.8 e Nav 1.7 desencadeando o potencial de 
16 
 
ação. As fibras nociceptivas aferentes transmitem esse sinal até a medula espinhal, 
liberando os neurotransmissores como por exemplo, adenosina trifosfato (ATP), 
CGRP (Peptídeo relacionado ao gene da calcitonina), substância P (SP) e 
glutamato. Estes mediadores ativam neurônios de segunda ordem na fenda 
sináptica, os quais por via ascendente projetam estes sinais até o cérebro, 
especificamente no tálamo e córtex onde a dor por fim é processada e interpretada 
(Figura 1) (KUNER, 2010; GANGADHARAN e KUNER, 2013; LATREMOLIERE e 
WOLF 2010; COLLOCA et al., 2017). 
 
Figura 1. Esquema ilustrativo do circuito neuronal fisiológico da dor. Fonte: Kunner, R. 
Central mechanismis of pathological pain, Nature, 2010. 
 
17 
 
 
Considerando suas características, a dor pode ser classificada em três tipos: 
i) dor nociceptiva, protetora, que responde a estímulos prejudiciais ou nocivos; ii) dor 
inflamatória que resulta de uma lesão tecidual, sendo também um mecanismo de 
defesa contra um dano maior a área afetada e, iii) dor patológica, uma resposta mal-
adaptativa decorrente de uma disfunção do sistema nervoso, que produz dor mesmo 
após a cura da lesão ou na ausência de um estimulo nocivo (WOOLF, 2010). 
1.2. Dor neuropática 
A dor neuropática é um subtipo de dor patológica, de difícil tratamento, que é 
causada por uma lesão que afeta o sistema somatosensorial. Como resposta a essa 
lesão, a dor neuropática é tipicamente caracterizada pela hiperalgesia, ou seja, 
resposta dolorosa aumentada a estímulos mecânicos e térmicos nocivos, bem como 
pela alodinia, sendo uma resposta dolorosa a estímulos inócuos, uma vez que 
ocorrem mudanças significativas nas propriedades eletrofisiológicas e moleculares 
dos neurônios nociceptores e da medula espinhal (LOESER e TREEDE, 2008). 
Existem diversos fatores que podem desencadear o desenvolvimento da dor 
neuropática, dentre eles estão incluídos principalmente lesões focais ou multifocais 
no sistema nervoso periférico, como a neuralgia pós-herpética, dor do membro 
fantasma e neuralgia traumática; lesões no sistema nervoso central, como lesão na 
medula espinhal e esclerose múltipla; doenças neuropáticas complexas, como a 
síndrome dolorosa complexa e as polineuropatias periféricas generalizadas, 
causadas por diabetes mellitus, álcool, HIV e por efeito tóxico de quimioterápicos 
usados no tratamento do câncer (JI et al., 2014). 
A dor neuropática tem grandes consequências clínicas e sociais e acomete 
cerca de 6,9 a 10% da população mundial (KAWAI et al., 2017; IASP, 2014). No 
Brasil, a dor crônica e condição clinica bastante frequente, acometendo entre 28 e 
41% da população brasileira (DIAS et al., 2009; SA et al., 2009). Além disso, de 25 a 
34% dos pacientes com dor neuropática, sofrem de distúrbios psiquiátricos como 
ansiedade e depressão (GUSTORFF et al., 2008), afetando assim em longo prazo a 
qualidade física e emocional de vida destes pacientes, visto que 80% dos pacientes 
18 
 
com dor neuropática também apresentam distúrbios do sono e consequentemente 
alterações do humor (ALKAN MELIKOGLU e CELIK, 2017). 
 
1.3. Tratamentos farmacológicos para dor neuropática 
 
A dor neuropática é de difícil tratamento pois as terapias disponíveis não são 
eficazes para a maior parte dos pacientes com esta condição. Baseado nos 
mecanismos fisiopatológicos envolvidos, o tratamento atual da dor neuropática 
envolve principalmente a modulação daexcitabilidade neuronal. 
Desta forma, o tratamento de primeira escolha são os antidepressivos 
tricíclicos (ATC) (nortriptilina e desmipramina), inibidores da recaptação de 
serotonina e noradrenalina (duloxetina) e ligantes do canal de cálcio alfa-2-delta-1 
(gabapentina e pregabalina). A utilização destes fármacos é limitada em virtude de 
sua ação lenta (dias ou até semanas), pois exige a administração inicial em 
pequenas doses com aumento gradual até que se atinja a dose efetiva para o 
controle da dor. Além disso todos possuem muitos efeitos adversos, tais como 
letargia, sedação, toxicidade cardíaca pelo uso de ATC e sonolência e tontura pelo 
uso de gabapentina (DWORKIN, 2007). 
O tratamento de segunda escolha baseia-se no uso de analgésicos opióides 
(morfina, tramadol, oxicodona, metadona) principalmente pela falta de estudos de 
segurança com o tratamento a longo prazo, e pelo seu potencial clássico em causar 
dependência e tolerância. Alguns dos efeitos adversos observados na terapia com 
opióides são alterações imunológicas, náuseas, vômitos, constipação, sonolência e 
tontura (DWORKIN, 2007 e 2010; COLLOCA L. et al., 2017). 
Ainda não existe tratamento específico para a neuropatia periférica induzida 
por quimioterápico (NPIQ), no entanto um ensaio clinico demonstrou eficácia para a 
duloxetina em 5 semanas de tratamento na redução dos sintomas de dor em 
pacientes com neuropatia periférica induzida por Paclitaxel (PTX) ou Oxaliplatina 
(OXA) em comparação com o placebo; no entanto o efeito benéfico foi apenas 20% 
maior que o relatado pelo grupo placebo (SMITH EM et al., 2013). Na clínica, ainda 
são utilizados alguns nutracêuticos (vitamina E, vitamina B6, magnésio, cálcio, 
acetil-L-carnitina, glutamina, glutationa dentre outros), como estratégias adjuvantes 
de farmacoterapia da NPIQ (SCHLOSS JM et al., 2013). 
19 
 
 
1.4. Neuropatia periférica dolorosa induzida pelo paclitaxel 
A neuropatia periférica induzida por quimioterápico (NPIQ) pode ocorrer de 
três formas: autonômica, motora e/ou sensorial. Esta última é a forma mais frequente 
entre os quimioterápicos, e pode manifestar-se como parestesia ou disestesia, dor 
em queimação, bem como alodinia mecânica e térmica ao frio (FLATTERS e 
BENNETT, 2006). 
O paclitaxel (PTX) é um quimioterápico eficaz contra diferentes tipos de 
câncer. No entanto, um de seus principais efeitos adversos é a neuropatia dolorosa, 
a qual pode se manifestar de forma aguda (durante a quimioterapia) ou crônica 
(após a quimioterapia e com duração de pelo menos 6 meses). A forma aguda 
acomete entre 59-78% dos usuários, enquanto 30% deles desenvolvem a forma 
crônica (BEIJERS et al. 2012; BALAYSSAC et al., 2011). 
Em relação aos taxanos, classe à qual pertence o PTX, acredita-se que o 
efeito tóxico destes medicamentos sobre os aferentes primários ocorra por atuarem 
sobre a dinâmica dos microtúbulos axonais, como na formação ou aumento da 
polimerização dos microtúbulos, o que impediria o funcionamento normal do 
citoesqueleto celular e, consequentemente, comprometeria o transporte axonal de 
proteínas, vesículas e organelas (CARLSON et al., 2011; CAROZZI, CANTA e 
CHIERAZZI, 2015). 
Ainda, há fortes evidências que a neurotoxicidade causada pelo paclitaxel age 
principalmente através de disfunção mitocondrial nos GRD, levando ao aumento da 
concentração intracelular de cálcio (excitotoxicidade neuronal) e estresse oxidativo. 
Tais eventos podem desencadear a apoptose celular de parte das fibras sensoriais e 
seria responsável também pela degeneração de fibras sensoriais periféricas 
remanescentes (JAGGI e SINGH, 2012). 
A administração de PTX age diretamente nas mitocôndrias levando a 
liberação de citocromo C o que inicia a ativação da caspase durante a apoptose. O 
poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP), é um complexo multi-
molecular contendo proteínas transmembranas como canais de aníons dependentes 
de voltagem/tensão, o translocador de nucleotídeos de adenina e as proteínas de 
20 
 
membrana mitocondrial. A abertura da mPTP é seguida pela perda de potencial de 
membrana mitocondrial aumentando a geração de espécies reativas de oxigênio 
(ROS) e levando a redução dos níveis de ATP e liberação de Ca2+ (MARTIN et al., 
2009). O PTX abre os mPTP e resulta em mitocôndrias vacuoladas/dilatadas e 
funcionalmente comprometidas (Figura 2). A Mitocôndria em neurônios periféricos 
tem um mecanismo de reparo mais lento que em outros tecidos. Além disso, as 
mitocôndrias estão envolvidas na homeostase intracelular de Ca2+ e se as 
mitocôndrias estão danificadas ou a captação mitocondrial de Ca2+ é prejudicada, 
isto pode ser responsável pela propagação aumentada da sinalização induzida pelo 
Ca2+ e, assim, os processos dependentes de Ca2+ na dor neuropática induzida por 
PTX poderiam ser desencadeados como a ativação dos canais iônicos dependentes 
de Ca2+ como Nav 1.7, Nav 1.8 e ainda os receptores de potencial transitório (TRP), 
especificamente TRPV1, TRPA1 e TRPV4 já foram relatados em participar destes 
mecanismos (KIDD et al., 2002; MIRONOV et al., 2005; FERRIER et al., 2013; 
CARROZZI et al., 2015). 
 
Figura 2. Esquema ilustrativo dos danos que ocorrem a mitocôndria no gânglio da raiz 
dorsal (GRD) após o tratamento com o paclitaxel. Fonte: V.A. Carozzi et al. 
Neuroscience Letters 596 90–107, 2015. 
A NPIQ do tipo sensorial dificulta a adesão dos pacientes ao tratamento e, 
frequentemente, leva a diminuição da dose eficaz contra o câncer ou, até mesmo, 
21 
 
interrupção da quimioterapia (QUASTHOFF e HARTUNG, 2002). Outro fator que 
reforça a importância clínica da NPIQ é o fato de que ela pode causar dor crônica, 
com duração de meses ou anos (HAN e SMITH, 2013). Desta maneira, o emprego 
de modelos animais na tentativa de elucidar os mecanismos responsáveis pelo 
desenvolvimento da NPIQ é de extrema importância principalmente no que diz 
respeito a estratégias preventivas. 
Até o momento, não foram desenvolvidas terapias eficazes para o tratamento 
da dor crônica. Além disso, as opções disponíveis atualmente para o tratamento 
deste tipo de dor são acompanhadas de muitos efeitos adversos que limitam o uso 
destes medicamentos (COLLOCA L. et al., 2017). Portanto, é importante que sejam 
realizados estudos para identificar alvos moleculares que sirvam como ponto de 
partida para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para o tratamento 
da dor neuropática. 
1.5. Inflamação e dor neuropática 
Diversos mecanismos estão envolvidos na fisiopatologia da dor neuropática 
incluindo a sensibilização neurônios periféricos e centrais, e a participação de 
células não-neuronais, como as células gliais e células do sistema imunológico (REN 
K e DUBNER R. 2010). 
Logo após um dano a um nervo periférico, a inflamação é desencadeada pela 
ativação imune inata de receptores como os do tipo Toll (TLRs) que reconhecem 
moléculas endógenas liberadas de células danificadas como por exemplo as 
proteínas de choque térmico (LACAGNINA et al., 2018). Os TLRs são expressos em 
células do sistema imunológico, incluindo monócitos ou macrófagos e células 
dendríticas, e em células relacionadas ao sistema imunológico, como os 
queratinócitos. A ligação aos TLRs é seguida pela ativação da sinalização do fator 
nuclear-kB (NF-kB) e pela liberação fatores endógenos de sinalização como 
mediadores pró-inflamatórios como citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento 
são liberados, sensibilizando os nociceptores, fibras nervosas do tipo Aδ 
mielinizadas de médio diâmetro e fibras C não-mielinizadas de pequeno diâmetro, as 
quais são responsivas a estímulos nocivos mecânicos, térmicos e químicos 
(WOOLF, 2007, 2010; LATREMOLIERE, 2009; REN K e DUBNER R. 2010). 
22 
 
As células imunes residentes como mastócitos e macrófagos também são 
ativadas minutos após a lesão e também passam a liberar mediadores inflamatórios 
comocitocinas pró-inflamatórias (IL-5, IL-6 e IL-1β), efetores da cascata do sistema 
complemento (C3a e C5a) e vasodilatadores (bradicinina). Neutrófilos, monócitos e 
linfócitos T migram pelo sangue aderem às paredes dos vasos, extravasam e se 
acumulam no local da lesão. Essas células imunológicas contribuem para a 
sensibilização nociceptiva periférica, liberando fatores solúveis (TNF-α, PGE2, IL-1β, 
IL-17A) e interagindo diretamente com os nociceptores (Figura 3) (CUNHA et al, 
2005; REN K e DUBNER R. 2010; RITTNER et al, 2008; PINHEIRO-RIBEIRO et al., 
2017). 
 
Figura 3. Células imunológicas liberam mediadores que produzem sensibilização 
periférica de neurônios sensoriais nociceptores. Fonte: Pinho-Ribeiro et al., “Nociceptor 
Sensory Neuron-Immune Interactions in Pain and I Inflammation. Trends in Immunology, 
2017. 
As citocinas pró-inflamatórias derivadas das células imunes são mediadores 
cruciais para a atividade dos nociceptores e para a sensibilização a dor. A primeira 
citocina descrita como hiperalgésica foi a IL-1β (FERREIRA et al., 1988). Vem sido 
largamente descrito um grande papel para as citocinas na modulação da dor de 
forma geral e incluindo-se a dor neuropática. Destacando IL-1β, IL-6, TNFα, IL-17A e 
IL-5 que atuam diretamente nos neurônios nociceptores. Especificamente a IL-1β 
atua sensibilizando os neurônios nociceptores via fosforilação da p38, MAPK, e 
canais de sódio Nav 1.8, levando ao aumento da geração de potencial de ação e 
resultando em hiperalgesia mecânica e térmica. A IL-1β também ativa o IL-1R1 nos 
neurônios nociceptores levando ao aumento da expressão dos receptores de 
23 
 
potencial transitório vanilóide-1 (TRPV1) e consequentemente gerando sensibilidade 
aos estímulos térmicos (Figura 3) (BINSHTOK AM, et al. 2008; EBBINGHAUS M, et 
al. 2012; PINHEIRO-RIBEIRO et al., 2017). 
A sensibilização periférica transmite as informações nociceptivas para a 
medula espinhal, e os eventos espinhais desencadeados por esses 
neurotransmissores e mediadores levam à sensibilização central, um processo 
crítico que contribui para a cronicidade da dor. Após a lesão do nervo e em 
condições de dor crônica, os neurônios nociceptores expressam e liberam dos seus 
terminais aferentes para a medula espinhal, neurotransmissores, neuromoduladores 
e mediadores inflamatórios, tais como ATP, CGRP, SP, quimiocinas (fractalcina, 
CXCL1), citocinas (IL-6 e IL-1β) glutamato e moléculas de adesão celular, estes 
agem sobre os receptores no terminal do nervo pós-sináptico, e nas células da glia, 
como microglia e astrócitos, modulando a atividade destas células. Estes eventos 
contribuem para a ativação microglial e podem sensibilizar e alterar o limiar de 
disparo neuronal, o que causa alterações importantes na morfologia, migração de 
células imunes para o local da lesão e proliferação celular, ou seja gerando uma 
correlação patológica com a sensibilização central e estados de dor crônica (Figura 
4) (REN K. e DUBNER R. 2010; ZHAO et al., 2017; ZHANG ZJ et al., 2017; 
PINHEIRO-RIBEIRO et al., 2017). 
Além da ativação de células gliais, a lesão no nervo induz a migração de 
células do sistema imune inato e adaptativo para o sistema nervoso periférico e 
central, como linfócitos T, também produzindo citocinas e quimiocinas que 
amplificam a resposta inflamatória, que dada a localização passa a ser denominada 
neuroinflamação (JI et al., 2014; PENG et al., 2017). 
24 
 
 
Figura 4. Microglia e células T medeiam a sensibilização central da dor na medula 
espinhal Fonte: Pinho-Ribeiro et al., “Nociceptor Sensory Neuron-Immune Interactions in 
Pain and I Inflammation. Trends in Immunology, 2017. 
Um dos mecanismos propostos para fundamentar a plasticidade sináptica, 
pertinente ao desenvolvimento e persistência da dor crônica, inclui interações 
neurônio-glia. Nesta proposta as células imunes, a glia e os neurônios formam uma 
integração na qual a ativação de uma resposta imune modula a excitabilidade das 
vias de dor. De forma análoga aos neurônios, as células imunes e glia mostram 
plasticidade dinâmica, e contribuem para a hiperexcitabilidade neuronal nas vias de 
transmissão da dor (REN K. e DUBNER R. 2008, 2010; DELEO JA et al., 2004). 
De acordo com esta proposta já foi demonstrado que em diferentes modelos 
animais de dor inflamatória como injeção de formalina (FU KY et al., 2000) ou 
carragenina (HUA XY et al., 2005) na pata traseira, ocorre de fato a ativação de 
células da gliais na medula espinhal (avaliadas pelo aumento da expressão de 
CD11b, IBA-1 e GFAP). 
Uma vez ativadas, as células gliais contribuem para o aumento e a 
manutenção da dor neuropática, liberando potentes neuromoduladores na medula 
25 
 
espinhal, como fatores de crescimento, citocinas pró-inflamatórias (TNF, IL-1β, IL-6) 
e quimiocinas como CC ligante 2 (CCL2), CXC ligante 3 (CXCL3) e CXC ligante 1 
(CXCL1), que causam alterações na atividade dos receptores N-metil-D-aspártico 
(NDMAR) a-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiônico (AMPAR). A 
hiperexcitabilidade também pode ser causada por uma perda de interneurônios 
inibitórios gabaérgicos, ou alterações de função nas quais eles passam a exercer 
ações excitatórias a níveis espinhais. Essas mudanças em neurônios de segunda 
ordem explicam de forma plausível a alodinia observada tanto por dados de 
estudos em animais quanto em humanos (COLLOCA et al., 2017). 
Em particular, as quimiocinas estão envolvidas na neuroinflamação em 
diferentes localizações anatômicas, incluindo o nervo lesado, o gânglio da raiz 
dorsal, a medula espinhal e o cérebro, contribuindo para o processamento crônico 
da dor (REN K. e DUBNER R. 2010; ZHANG et al. 2012). 
É cada vez mais evidente que as células da microglia e vários tipos de 
células, incluindo neurônios, oligondendrócitos e astrócitos possuem uma rede de 
mecanismos de sinalização celular que sustentam o quadro de dor neuropática; de 
fato alguns estudos relataram que em diferentes modelos de dor neuropática como 
aquela causada por constrição do nervo ciático (ECHEVERRY et al., 2008), 
transecção do nervo ciático (LIU et al., 2000) e ligadura parcial do nervo ciático 
(NARITA et al., 2006) ocorreu proliferação celular precoce e transitória na medula 
espinhal ipsilateral à lesão, e a maioria das células em proliferação foram positivas 
para iba-1 (marcador de microglia), juntamente com alguns progenitores de 
oligodendrócitos (NG2 positivas) e astrócitos (GFAP positivas); destas células 30% 
foram astrócitos e sendo que o fenótipo para microglia foi predominante sendo mais 
de 60% desta população de células recém-geradas. Ainda, os autores observaram 
uma correlação temporal entre a proliferação microglial e as respostas anormais a 
dor, sugerindo então uma importante contribuição da microglia para os sintomas da 
dor neuropática (SUTER et al., 2007). 
Juntamente com a microglia, os astrócitos são outro tipo de célula glial cuja 
contribuição no desenvolvimento da dor neuropática é cada vez mais reconhecida. 
Em concordância, um estudo que investigava o papel glial na dor neuropática 
causada pela oxaliplatina em ratos, mostrou que o tratamento intratecal com 
26 
 
inibidores da microglia e astrócitos, minociclina e fluorocitrato, respectivamente, 
reduziram de forma significativa a dor provocada pela oxaliplatina, com uma maior 
eficácia para o fluorocitrato o que indica um papel proeminente dos astrócitos na dor 
neuropática (DI CESARI MANNELI et al., 2014). Corroborando estes achados, outro 
estudo mostrou que ocorre ativação de astrócitos, mas não da microglia na medula 
espinhal de ratos, após o tratamento com oxaliplatina e bortezomibe, e isto acontece 
de forma paralela as alterações comportamentais de dor evocadas pelos 
quimioterápicos (ROBINSON MA et al., 2014). 
Ainda sobre as interações neuroinflamatórias mediadas pelas células gliais, 
em contraste com o que foi observado para oxaliplatina,no modelo de dor 
neuropática induzida por paclitaxel, estudos sugerem que há expressão microglial e 
astrocitária na medula espinhal de camundongos tratados com o paclitaxel, de modo 
que também se correlaciona com os sinais de dor neuropática (RUIZ-MEDINA et al., 
2013; PEVIDA et al., 2013). Essas evidências sugerem que a microglia e os 
astrócitos espinhais são elementos centrais nos mecanismos de dor neuropática, e 
podem ser um alvo potencial para o tratamento do estado de dor crônica. 
As quimiocinas constituem uma família de mediadores inflamatórios e 
imunológicos que, assim como as citocinas, são proteínas secretórias produzidas 
por leucócitos e células teciduais constitutivas após alguma lesão; entretanto as 
quimiocinas são moléculas bem menores que as citocinas, com peso molecular de 7 
a 15 kDa (OLIVEIRA et al. 2007). De acordo com o número e espaçamento dos 
aminoácidos existentes nos dois primeiros resíduos de cisteína da extremidade N-
terminal elas são classificadas em quatro subfamílias: CXC, CC, CX3C e C, onde C 
representa cisteína e X ou X3 representa um ou três aminoácidos (PALOMINO e 
MARTI, 2015). No início da década passada, foi proposto um novo sistema de 
nomenclatura para as quimiocinas que usa o nome da família, indicando a classe à 
qual a quimiocina pertence, seguido da letra “L” (designando ligante) e um número, 
correspondente ao já utilizado para designar o gene que codifica a quimiocina 
(ZLOTNIK e YOSHIE, 2000). 
As quimiocinas desempenham suas funções via receptores acoplados a 
proteína G, os quais possuem sete domínios transmembrana; a região extracelular é 
constituída por três alças e pela região N-terminal, onde se liga à quimiocina, e a 
27 
 
região intracelular é formada por três alças e o domínio C-terminal que fazem a 
transdução do sinal. Estes receptores podem reconhecer mais do que uma 
quimiocina, mas estão praticamente restritos a uma única subfamília, dessa forma a 
nomenclatura baseia-se na especificidade do receptor para a subfamília de 
quimiocinas. Assim, os receptores são denominados de CXCR1 a CXCR6 (quando 
se ligam as quimiocinas CXC), CCR1 a CCR10 (ligação ás quimiocinas CC), 
CX3CR1 (liga-se a fractalcina) e XCR1 (liga-se à linfotactina) (ABBADIE et al., 2003; 
ZHANG et al., 2012). 
O principal papel das quimiocinas no desenvolvimento de um processo 
inflamatório é o recrutamento de células do sistema imune para o sítio de inflamação 
(GUERREIRO, SANTOS-COSTA, E AZEVEDO-PEREIRA, 2011). Entretanto, outras 
funções vêm sido atribuídas para estes peptídeos. Em 2003 Abbadie e 
colaboradores realizaram um estudo com camundongos nocautes para o receptor de 
quimiocina CCR2 e verificaram que estes animais não desenvolveram alodinia 
mecânica no modelo de dor neuropática induzida pela ligadura do nervo, bem como 
apresentaram resposta dolorosa reduzida em modelos de dor inflamatória. Além 
disso, estes autores demonstraram que animais selvagens submetidos a estes 
modelos de dor crônica apresentavam maior ativação de microglia positiva para 
CCR2 na medula espinhal (ABBADIE et al., 2003). 
Posteriormente, outros trabalhos mostraram que CCL2, uma quimiocina que 
se liga preferencialmente ao CCR2, produzida por neurônios sensoriais danificados 
ou não, em estados de dor neuropática, desempenha um papel essencial para a dor 
neuropática em ratos, uma vez que o anticorpo anti-CCL2 injetado por via intratecal 
(i.t.) reduziu a ativação microglial e os comportamentos de dor nestes animais 
(ABBADIE et al., 2003; THACKER et al., 2009; ZHANG et al., 2012). Coletivamente, 
esses dados sugerem que o recrutamento e a ativação de macrófagos e microglia 
perifericamente e no tecido neural podem contribuir tanto para a dor inflamatória, 
como para a dor neuropática. 
A fractalcina (CX3CL1) é uma quimiocina expressa na superfície extracelular 
de terminações centrais de aferentes primários na medula espinhal, bem como em 
neurônios espinhais. Na medula espinhal dorsal, o receptor de fractalcina (CX3CR1) 
é expresso principalmente pela microglia, e já é bem conhecido o efeito 
28 
 
neuromodulatório da fractalcina sobre a dor neuropática; vários estudos mostram 
que a inibição farmacológica do CX3CR1 leva ao retardo do desenvolvimento de 
alodinia mecânica e hiperalgesia térmica em diferentes modelos de dor neuropática 
(MILLIGAN et al., 2004). Complementando estes achados, outro estudo investigou 
ainda a via pela qual a fractalcina ativa a microglia em uma condição de dor 
neuropática. Utilizando o modelo de ligação do nervo espinhal (SNL), Zhuang e 
colaboradores (2007) verificaram que há a liberação de fractalcina após a lesão 
nervosa, o que gera uma importante interação neurônio-microglia, que é mediada 
pela ativação de CX3CR1 e, subsequentemente, ativação de p38 MAPK; eventos 
estes que são cruciais para o desenvolvimento da dor neuropática neste modelo 
(ZHUANG et al., 2007). 
Os primeiros relatos correlacionando a participação direta de uma quimiocina 
na dor foram através da administração intradérmica da interleucina-8 (IL-8) em ratos 
o que gerou uma redução do limiar de dor destes animais, causando uma 
hiperalgesia mecânica de maneira dose e tempo dependente, a IL-8 pertence a 
subfamília CXC e tem como homologa CINC-1 em ratos e CXCL1 (também 
conhecida como quimiocina derivada de queratinóticos) em camundongos (CUNHA, 
1991; REUTERSHAN et al., 2006). Esta quimiocina é normalmente liberada por 
macrófagos ativados e células endoteliais, entre outras células, e causam 
preferencialmente o recrutamento de neutrófilos através da ligação a seus 
receptores, CXCR1 e CXCR2 (RAVIDRAN et al., 2013). 
Em relação a contribuição da quimiocina CXCL1 para a dor neuropática, foi 
visto que no modelo de ligadura do nervo espinhal (SNL), ocorre um aumento da 
expressão desta quimiocina, bem como do seu receptor CXCR2, no corno dorsal da 
medula espinhal; neste estudo os autores verificaram que a CXCL1 foi induzida 
principalmente pelos astrócitos espinhais, e que a administração intratecal do 
anticorpo neutralizante de CXCL1 foi capaz de reduzir de forma transitória a 
hipersensibilidade mecânica e térmica associadas ao modelo (LI et al., 2007; 
ZHANG et al., 2013). Ademais, outro recente estudo utilizando um modelo de 
ligadura parcial do nervo ciático (LPNC), demonstrou que CXCL1 possuí quimiotaxia 
por neutrófilos tanto no nervo lesionado quanto na medula espinhal, e isso é crucial 
para o estabelecimento da dor neuropática neste modelo, pois o tratamento com o 
29 
 
anticorpo anti-CXCL1 preveniu de forma eficaz as respostas nociceptivas induzidas 
pela LPNC. Além disso, os autores verificaram que a administração de CXCL1 no 
nervo ciático dos camundongos produziu dor de longa duração de forma similar ao 
modelo de PSLN (MANJAVACHI et al., 2014). 
Ainda outro trabalho do grupo, demonstrou envolvimento da sinalização 
CXCL1/CXCR2 na neuropatia periférica induzida pelo quimioterápico PTX em 
camundongos, foi observado um aumento desta quimiocina na medula espinhal dos 
animais após o tratamento com o PTX, e ainda o tratamento com o anticorpo Anti-
CXCL1 ou com o antagonista do receptor CXCR2 (SB225002), ambos por via i.t., 
foram capazes de reduzir a hiperalgesia mecânica observada neste modelo 
(MANJAVACHI et al., 2015). O envolvimento de outras quimiocinas e seus 
receptores no desenvolvimento e/ou manutenção da dor crônica também já foram 
reportados, incluindo: CXCL12 e seu receptor CXCR4 (BHANGOO et al., 2007), 
CCL3 e seu receptor CCR5 (MATSUCHITA et al., 2014) e CCL7 (IMAI et al. 2013). 
Ainda, estudos recentes apontam o envolvimento das quimiocinas CCL2 e CXCL12 
na dor neuropática induzida por oxaliplatina, bortezomib ou paclitaxel (PEVIDA et al., 
2013; ROBINSON et al.,2014; XU et al. 2017). 
Juntas estas evidências sugerem que o processo inflamatório no sistema 
nervoso e especialmente na medula espinhal seja crucial para o desenvolvimentoe 
manutenção da dor neuropática. No entanto, os eventos inflamatórios e mecanismos 
de sensibilização central, especificamente na medula espinhal, que possam estar 
envolvidos na neuropatia periférica que é induzida pelo PTX não estão bem 
esclarecidos, por exemplo, i) se ocorre a migração de células imunes tais como 
neutrófilos para a medula espinhal, ii) ou a produção de citocinas pró-inflamatórias 
(como IL-1β) iii) ou a ativação e/ou migração de células gliais. 
 
 
 
 
 
30 
 
2. OBJETIVOS 
 
2.1. Objetivo Geral 
Avaliar o envolvimento da inflamação na medula espinhal no modelo de 
neuropatia periférica dolorosa causada pelo paclitaxel. 
2.2. Objetivos específicos 
 
• Caracterizar o modelo de neuropatia periférica dolorosa induzida pelo paclitaxel, 
através da avaliação da sensibilidade mecânica, ao calor e ao frio; 
 
• Avaliar a migração de neutrófilos para a medula espinhal em diferentes tempos 
após o tratamento com paclitaxel, através da determinação da atividade da 
enzima mieloperoxidase; 
 
• Verificar se a depleção de neutrófilos, pelo tratamento com vimblastina, interfere 
com o desenvolvimento da neuropatia periférica causada pelo paclitaxel; 
 
• Quantificar os níveis da citocina IL-1β, na medula espinhal em diferentes tempos 
após o tratamento com paclitaxel, através da técnica ELISA; 
 
• Avaliar os níveis de marcadores para microglia e astrócitos na medula espinhal 
em diferentes tempos após o tratamento com paclitaxel, através da técnica de 
imunohistoquímica; 
 
• Testar o efeito do tratamento com o inibidor de microglia, minociclina, sobre o 
desenvolvimento da neuropatia dolorosa induzida pelo paclitaxel. 
 
 
 
 
 
 
 
31 
 
3. MATERIAIS E MÉTODOS 
 
3.1. Reagentes 
 
3-Aminopropiltrietoxisileno (ATPS) Sigma 
Acetona PA Vetec 
Ácido Cítrico Sigma 
Álcool absoluto Isofar 
Anticorpo Anti-iba-1 Rabbit Wako laboratory chemicals (catalog no. 
019-19741) 
Anticorpo monoclonal Anti-GFAP Sigma aldrich (product number g 3893) 
Albumina Bovina Sigma 
Albumina Soro Bovino (BSA) Sigma 
Citrato de Sódio Sigma 
Cloreto de sódio 0,9% Equiplex/vemer 
Diaminobenzidina 3,3 (DAB) Dako liquid dab+ substrate chromogen 
system k3468 
EDTA LabSynth 
Entellan Merck 
Quetamina/Xilazina Syntec 
Fosfato de Potássio Monobásico Reagen 
Fosfato de Potássio Bibásico Grupo química 
Fosfato de Sódio Monobásico Merck 
Fosfato de Sódio Bibásico Grupo química 
Giemsa Merck 
Hematoxilina de Harris Merck 
Hexadeciltrimetilamônio (HTAB) Sigma 
Histofine Histofine® simple stain TM max po (g) 
Kit específico IL1-β de ELISA R&d systems 
Minociclina Sigma 
Pacitaxel Accord farmacêutica ltda 
Paraformaldeído Sigma 
Peróxido de hidrogênio Vetec 
Tetraborato de sódio Sigma 
Tetrametilbenzidina (TMB) Lgc biotecnologia 
Tris Sigma 
32 
 
Triton Sigma 
Tween 20 Isofar 
Turk Dinâmica 
Vimblastina Libbs farmacêutica ltda 
Xilol Isofar 
Wright Bioclin 
 
3.2. Animais 
Foram utilizados camundongos Swiss machos, pesando entre 35 e 50 
gramas, com aproximadamente 90 dias, provenientes do Biotério da Faculdade de 
Farmácia da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). Os animais foram 
mantidos em temperatura e umidade controladas (22 ± 1°C, 60-80 % de umidade), 
em ciclo 12h claro/12h escuro, com livre acesso a água e ração. A criação e 
utilização dos animais foram conduzidas de acordo com as recomendações do Guia 
de Uso e Cuidado com Animais Laboratoriais do National Institutes of Health (NIH) 
dos Estados Unidos da América (Publicação do NIH No 80-23, revisado em 1996) e 
em conformidade com a lei brasileira Nº 11.794, de 8 de outubro de 2008. Todos os 
procedimentos empregados no presente estudo foram previamente aprovados pelo 
Comitê de Ética da Universidade Federal de Santa Catarina (número do protocolo 
PP00811), e submetidos a Comissão de Ética no Uso de Animais em Pesquisa da 
Universidade Federal do Rio de Janeiro (Número de ordem: 018/18). 
Os animais foram distribuídos randomicamente entre os grupos 
experimentais, utilizando-se 6-8 animais por grupo para os experimentos 
comportamentais e 2-5 animais por grupo para os experimentos 
mol3eculares/bioquímicos. Todos os experimentos comportamentais foram 
conduzidos de maneira cega a fim de reduzir viés experimental. Os animais 
permaneceram no laboratório a temperatura controlada (22 ± 2 ºC) durante um 
período de adaptação de pelo menos 1 h antes da realização dos testes 
comportamentais, realizados geralmente entre 08h00min e 16h00min. O número de 
animais e a intensidade dos estímulos nocivos utilizados foram os mínimos 
necessários para demonstrar efeitos consistentes. 
 
33 
 
3.3. Procedimentos Experimentais 
 
3.2.1 Neuropatia periférica induzida pelo paclitaxel 
 
A neuropatia periférica dolorosa causada pelo paclitaxel (PTX) foi induzida 
seguindo metodologia proposta por Polomano e colaboradores (2001) e adaptada 
para camundongos (SMITH et al., 2004), com algumas modificações (COSTA et al., 
2011). O quimioterápico foi administrado durante cinco dias consecutivos, entre os 
dias 0 e 4 do protocolo experimental. O PTX foi administrado por via intraperitoneal 
(i.p.) na dose de 2 mg/Kg, diariamente, 1 vez ao dia. Animais controle receberam o 
veículo (NaCl 0,9%). O volume de administração das soluções foi de 10 mL/Kg. Os 
animais foram pesados antes da indução do modelo e semanalmente, a cada início 
de semana, após a indução do modelo, durante o período total de avaliação dos 
animais. A pesagem foi realizada em balança analítica. 
3.2.2 Avaliação da sensibilidade mecânica 
 
Os animais foram colocados individualmente em compartimentos de acrílico 
transparente (9 x 7 x 11 cm) localizados sobre uma plataforma de arame elevada, 
para permitir o acesso a superfície ventral das patas traseiras direitas. Os animais 
foram ambientados por pelo menos 1h antes dos testes comportamentais. A 
frequência de resposta de retirada das patas traseiras foi obtida através de 10 
aplicações consecutivas (duração de 1 s cada) do filamento de Von Frey de 0,6 g 
(VFH, Stoelting, Chicago, USA). O filamento 0,6 g, por produzir em média 20% de 
frequência de retirada da pata, foi utilizado durante todo o trabalho por ser 
considerado um valor adequado para a avaliação da hiperalgesia mecânica 
(BORTOLANZA et al., 2002; QUINTÃO et al., 2005). Objetivando determinar o limiar 
mecânico basal (B), todos os grupos de animais foram submetidos à avaliação 
prévia e novamente avaliados em diferentes tempos após o tratamento com PTX. O 
aumento de 2,5 vezes de porcentagem de retirada da pata (em relação ao basal de 
cada animal) foi considerado como indicativo de indução de hiperalgesia mecânica. 
 
 
34 
 
3.2.3 Avaliação da sensibilidade ao frio 
 
Os animais foram colocados individualmente em caixas de acrílico (9 x 7 x11 
cm) localizadas sobre uma plataforma de arame elevada que permite o acesso às 
patas dos animais. Após ambientação de 30 minutos, 100 μL de acetona padrão 
analítico (PA) foram aplicados na superfície plantar da pata posterior direita com o 
auxílio de uma seringa. Os animais foram observados por 2 minutos, e o tempo que 
o animal permaneceu lambendo e/ou agitando a pata estimulada com a aplicação da 
acetona foi contabilizado e considerado como indicativo de nocicepção declarada 
(DE LA CALLE, 2002). A sensibilidade ao frio foi avaliada em vários intervalos de 
tempo após a indução da neuropatia periférica induzida pelo PTX, o aumento no 
tempo gasto com comportamentos nociceptivos foi considerado como indicativo de 
hipersensibilidade térmica ao frio. 
3.2.4 Avaliação da sensibilidade ao calor 
 
A avaliação da sensibilidade ao calor foi feita pela medida do tempo de 
latência da retirada da pata frente a estimulação por um feixe de luz radiante 
(HARGREAVES, 1988). A intensidade do feixe luminoso foi adequada para não 
causar a retirada da pata dos animais controle num intervalo mínimode tempo de 10 
segundos. Inicialmente, os animais foram colocados sob funis de vidro localizados 
sobre uma plataforma de vidro transparente, onde permaneceram pelo menos 
durante 30 minutos antes do teste. Decorrido o tempo de adaptação dos animais ao 
aparato, um feixe de luz previamente estabelecido foi incidido abaixo do fundo 
transparente e posicionado sob a pata posterior direita dos animais. Os grupos de 
animais foram submetidos à avaliação da sensibilidade ao calor antes e em 
diferentes tempos após o tratamento com PTX. A hipersensibilidade térmica foi 
representada pela redução do tempo de latência em relação ao tempo de resposta 
basal de cada animal. Animais com medida acima de 20 segundos foram excluídos. 
3.2.5 Avaliação da atividade da mieloperoxidase 
 
A migração de neutrófilos para a medula espinhal foi quantificada 
indiretamente através da atividade da enzima mieloperoxidase (MPO). Para isso, os 
animais foram sacrificados em diferentes tempos (8 – 24 horas e 7 - 14 dias) do 
protocolo de indução com o quimioterápico paclitaxel e a medula espinhal foi 
35 
 
coletada. O tecido foi homogeneizado em tampão (Na3PO4 0,5 M e 0,5% de 
hexadeciltrimetilamônio (HTAB); pH 6,0), para a lise dos neutrófilos e liberação da 
MPO para o sobrenadante, este sobrenadante foi coletado para a reação 
colorimétrica. Foi utilizado 25 μL do sobrenadante para o ensaio de atividade da 
MPO. A reação enzimática para MPO foi realizada na presença de 
tetrametilbenzidina (TMB) 1,6 mM, NaPO4 80 mM e peróxido de hidrogênio (H2O2) 
0,3 mM (ANDREWS; KRINSKY, 1982). A absorbância foi medida por 
espectrofotometria em 690 nm, e os resultados foram expressos como densidade 
ótica por grama de tecido. 
3.2.6 Ensaio imunoenzimático (ELISA) para dosagem da citocina IL-1β 
Os níveis teciduais de IL-1β na medula espinhal foram determinados em 
diferentes tempos após o tratamento com o quimioterápico PTX (8 - 24 horas e 7 -14 
dias). As medulas foram removidas e homogeneizadas com tampão fosfato. O 
homogenato foi centrifugado a 10.000 RPM por 10 minutos a 4 ºC, e o sobrenadante 
armazenado a -80 ºC até o momento da análise. Os níveis da citocinas foram 
determinados utilizando-se Kits específicos IL1-β de ELISA (enzyme linked immuno 
sorbent assay) de acordo com as recomendações do fabricante (R&D Systems). Os 
resultados foram expressos por pg de IL-1 β por mililitro de sobrenadante. 
 
3.2.7 Imunohistoquímica 
 
Coleta de tecidos 
 
 Os camundongos tratados com PTX ou veículo foram eutanasiados em 
diferentes tempos do protocolo de indução (8 – 24 horas e 7 -14 dias), para a coleta da 
medula espinhal. Para tal, os animais foram anestesiados com quetamina (80 mg/kg, 
i.p.) e xilazina (10 mg/kg, i.p.) e, logo em seguida, foi realizada uma perfusão com 
solução salina (NaCl 0,9%) em seguida com paraformaldeído (PFA) 4%. 
 
Preparo dos cortes histológicos 
 
Após a fixação, as medulas espinhais dos animais foram desidratadas em 
concentrações crescentes de álcool (70%, 90% e 100%) e clarificadas em xilol a 
100% (xilol I, xilol II e xilol III) e embebidas em parafina. Os cortes teciduais (secção 
36 
 
transversal) de 3 μm espessura foram obtidos em micrótomo (Leica RM2235) e 
montados sobre lâminas cobertas com solução de ATPS, diluído em solução de 
acetona PA a 5%. Logo após, as lâminas obtidas foram mantidas em estufa a uma 
temperatura de 50 °C durante 1 h para adesão dos cortes às lâminas. 
Após fixação, os cortes foram desparafinados em três xilol a 100% e 
reidratados por passagens sucessivas em etanol em concentrações decrescentes 
(100%, 90% e 70%). Em seguida, os cortes foram lavados em H2O destilada (2 x) e, 
logo após, em solução de tetraborato de sódio a 5% para bloqueio dos radicais 
aldeídicos livres. 
Em seguida, as lâminas foram submetidas à recuperação antigênica 
utilizando tampão citrato (ácido cítrico 0,1M + citrato de sódio 0,1 M) a 0,01M e pH 
6,0 em steamer a 96oC por 30 minutos. Os cortes foram lavados com tampão fosfato 
salina (PBS, 0,01M, pH=7,4) e, em seguida, incubados com H2O2 a 3% em metanol 
por 20 min ao abrigo da luz. As lâminas foram retiradas do banho-maria, mantidas 
durante 30 min à temperatura ambiente e lavadas com PBS 2x e com destilada 2x. 
Para bloqueio de ligações inespecíficos os cortes foram incubados com 
solução de albumina bovina 5% contendo gelatina, triton e Tween20 por 30 min em 
câmara úmida e temperatura ambiente. 
 
Detecção imunológica 
 
A imunodetecção foi realizada utilizando anticorpo monoclonal anti-GFAP 
(1:150 diluído em solução PBS/BSA 3%) e anti-IBA-1 (1:100 diluído em solução 
PBS/BSA 3%). Os cortes foram incubados overnight em câmara úmida a 
temperatura de 2-8 °C. No dia seguinte, deixadas a temperatura ambiente por 20 
min e lavadas com tampão PBS/Tween20 a 0,25%. Após a lavagem as lâminas 
foram incubadas com soro normal de cabra a 10% diluído em free fatty milk para 
bloqueio de possíveis ligações inespecíficas advindas do anticorpo secundário do 
polímero Histofine. Após lavagem as lâminas foram incubadas com o polímero anti-
rat e anti-rabbit Histofine conjugado a estreptavidina-peroxidase em câmara úmida 
durante 1h e 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, as lâminas foram 
lavadas três vezes em PBS/Tween20 (0,25%) por 5 minutos. Finalmente, os cortes 
foram incubados com solução cromógena DAB+: 1-5% Tetracloruro de bifenilo 
37 
 
3,3',4,4'-tretrailtetramonio para revelação da reação. 
 
Contracoloração e montagem das lâminas 
 
Após a revelação, foram realizadas a contracoloração dos cortes com solução 
de hematoxilina de Harris (diluída 1:3 em água destilada). Em seguida os cortes 
foram desidratados com concentrações crescentes de etanol (etanol 70%, 80%, 90% 
e 100%), clarificados em xilol a 100% e as lâminas montadas com Entellan. Para 
cada reação foi utilizado um controle negativo na ausência do anticorpo primário das 
reações. As imagens foram obtidas utilizando objetiva de 40x e ocular de 10x em 
microscópio óptico (OLYMPUS BX60) e câmera digital (Q-IMAGING Q31899), 
acoplados. Imagens digitalizadas adquiridas e o número de células imunomarcadas 
foi determinado utilizando Q-Capture Pro. Cada lâmina continha 3 cortes da medula 
espinhal, de cada corte foi obtido 3 imagens de campos diferentes, totalizando 9 
imagens por n. Para a quantificação foi considerado a média de células 
imunomarcadas nos 9 campos analisados. 
 
 
3.2.8 Depleção de neutrófilos 
 
Para avaliar o papel dos neutrófilos no modelo de dor neuropática induzida 
por PTX, os camundongos foram depletados de neutrófilos, como descrito 
anteriormente (RAEBURN et al., 2002; MANJAVACHI et al., 2015). Para isso, os 
animais receberam sistemicamente vimblastina (5 mg/Kg, i.v.) 24 e 72 h antes da 
primeira administração do PTX. A resposta de sensibilidade mecânica foi medida em 
diferentes períodos de tempo após os procedimentos. 
A fim de confirmar a depleção de neutrófilos induzida pelo tratamento com 
vimblastina (5 mg/Kg, i.v.) foi realizada a contagem total e diferencial de leucócitos 
em um grupo paralelo de animais. Para isso, amostras de sangue (1 mL) de animais 
devidamente anestesiados foram coletadas por punção cardíaca em microtubos 
contendo EDTA e processadas para contagens manual em câmara de Neubauer 
com líquido de Turk para contagem total e extensões sanguíneas em lâminas para 
coloração Wright e Giemsa para contagem diferencial. As coletas foram realizadas 
em diferentes grupos animais no 3º e 18º dia após o tratamento com vimblastina, e 
os valores de referência utilizados nas contagens foram descritos por Vianna (2007). 
38 
 
 
3.2.9 Tratamento com minociclina 
 
Para avaliar a participação da microglia na hipersensibilidade mecânica 
induzida pelo PTX, os animais foram tratados com minociclina, um inibidor de 
microglia. As doses e via de administração foram escolhidas com base em trabalhos 
anteriores indicandouma inibição microglial após administração crônica de 
minociclina (CHIN et al., 2017; ZYCHOWSKA M. et al., 2016). A minociclina foi 
administrada durante sete dias consecutivos, entre os dias 0 e 6 do protocolo 
experimental, por via i.p. na dose de 30 ou 100 mg/kg, diariamente, 1 vez ao dia. 
Animais controle receberam o veículo (NaCl 0,9%). O volume de administração das 
soluções será de 10 mL/Kg. 
3.3.10 Análise estatística 
Os resultados foram apresentados como a média ± erro padrão da média. A 
normalidade dos dados foi testada pelos testes de normalidade de Kolmogorov-
Smirnov, D`Augostino e Shapiro-Wilk. Os dados com distribuição normal foram 
avaliados por meio de análise de variância (ANOVA) de uma via ou duas vias com 
medidas repetidas, seguidas dos pós-testes de Dunnetts e Bonferroni. Os dados que 
não apresentaram distribuição normal foram avaliados pelo teste de Kruskal-Wallis 
seguido do pós-teste de comparações múltiplas de Dunn. Valores de P menores que 
0,05 (P<0,05) foram considerados como indicativos de significância. As analises 
estatísticas foram realizadas utilizando o software GraphPad Prism® 5.00. 
 
39 
 
4. RESULTADOS 
 
4.1. Caracterização do modelo de neuropatia periférica induzida pelo PTX 
O primeiro objetivo deste trabalho consistiu em caracterizar o modelo da dor 
neuropática induzida pelo paclitaxel, para isso os animais foram avaliados em 
diferentes tempos quanto à sensibilidade plantar a estímulos térmicos (frio e calor) e 
mecânico. 
O primeiro parâmetro avaliado foi a sensibilidade ao frio através da aplicação 
de acetona na pata traseira de camundongos. Como observado na Figura 5 (A), a 
resposta provocada pela aplicação de acetona não diferiu entre os animais tratados 
com PTX e veículo (controle). Este resultado indica que o tratamento com PTX não 
alterou a sensibilidade de camundongos ao frio. 
Em seguida, avaliou-se a sensibilidade ao calor pelo método de Hargreaves. 
De modo semelhante ao teste da acetona, não se observou diferença entre os 
grupos controle e PTX quanto a sensibilidade ao calor (Figura 5B), indicando que 
animais tratados com o quimioterápico não desenvolveram hiperalgesia térmica ao 
calor. 
40 
 
 
Figura 5. Avaliação da sensibilidade térmica no modelo de neuropatia induzida por 
Paclitaxel (PTX). Avaliação da sensibilidade ao frio (A; n=9) e ao calor (B; n=11-12) em 
diferentes intervalos de tempo após a administração do PTX. Cada grupo representa a 
média de 8-12 animais, e as barras verticais indicam o erro padrão da média (EPM). ANOVA 
de duas vias, seguido pelo teste de Bonferroni. B, limiar basal. 
41 
 
Por conseguinte, avaliamos a sensibilidade mecânica através da aplicação de 
filamentos de Von Frey. A partir do 7º dia após a primeira administração do PTX, foi 
possível observar uma diferença significativa na sensibilidade mecânica dos animais 
quando comparados ao grupo controle que recebeu apenas o veículo (NaCl 0,9%). 
Esta resposta se manteve até o 21º dia do protocolo de avaliação o que demonstra 
que o perfil neuropático foi estabelecido nos animais (Figura 6A). 
Com intuito de avaliar o bem-estar dos animais, foi realizado o 
acompanhamento do peso corporal, onde os animais foram pesados semanalmente 
após o tratamento com PTX. Como observado na Figura 6 (B) durante o protocolo o 
grupo tratado com quimioterápico ganhou mais peso em relação ao grupo controle. 
42 
 
 
Figura 6. Caracterização do modelo de neuropatia periférica induzida pelo paclitaxel 
(PTX). Avaliação da sensibilidade mecânica (A; n=9) e avaliação do peso dos animais (B; 
representado pelo Δ do peso, n= 9). Cada grupo representa a média de 9 animais, e as 
barras verticais indicam o erro padrão da média (EPM). *p<0,05, ANOVA de duas vias, 
seguido pelo teste de Bonferroni. B, limiar ou peso basal. 
43 
 
4.2. Avaliação da migração de neutrófilos para medula espinhal após o 
tratamento com PTX 
Considerando que a migração e participação de células do sistema imune 
como macrófagos e neutrófilos são importantes para o estabelecimento e 
manutenção da dor neuropática em diferentes modelos murinos (LIU T, et al., 2000; 
GUERRERO et al., 2008; MANJAVACHI et al., 2014), avaliamos se existe aumento 
de neutrófilos na medula espinhal dos animais com neuropatia no presente modelo. 
Para tal, foi quantificada a atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) na medula 
espinhal dos camundongos em diferentes períodos de tempo após a administração 
do PTX. A MPO é um indicador indireto da migração de neutrófilos. Conforme 
demonstrado na Figura 7, a atividade da enzima MPO na medula espinhal não foi 
alterada significativamente nos animais tratados com PTX quando comparado com o 
grupo controle. 
0
200
400
600
Veículo 8h 24h 7d 14d
Tempo após tto com PTX
M
P
O
 (
D
.O
./
g
 d
e
 t
e
c
id
o
)
 
Figura 7. Avaliação da atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) na medula 
espinhal de camundongos tratados com paclitaxel (PTX). Cada grupo representa a 
média de 6 a 10 animais por grupo. E as barras verticais indicam o erro padrão da média 
(EPM. Teste de Kruskal-Wallis seguido do pós-teste de comparações múltiplas de Dunn. 
 
44 
 
4.3. Efeito da depleção de neutrófilos sobre a hipersensibilidade mecânica 
induzida pelo PTX 
 
Para avaliar a importância dos neutrófilos na hipersensibilidade mecânica 
induzida pelo PTX, realizamos depleção farmacológica de neutrófilos com 
vimblastina. A figura 8A ilustra que o tratamento com a vimblastina não interferiu 
com o desenvolvimento da hiperalgesia mecânica induzida pelo PTX. Uma vez que 
a vimblastina também é um quimioterápico, avaliamos se este composto seria capaz 
de alterar o limiar mecânico de camundongos. No entanto, a administração de 
vimblastina não alterou a sensibilidade mecânica de camundongos (Figura 8B). 
É importante destacar que o tratamento com vimblastina reduziu 
significativamente a contagem total (não demonstrado) e diferencial (Tabela 1) de 
neutrófilos no sangue de camundongos no 3º dia após o tratamento, ou seja, antes 
da indução da neuropatia com PTX (Tabela 1). No entanto, os níveis celulares 
retornaram aos valores normais no 18º dia após o tratamento com vimblastina, ou 
seja, após o período de avaliação da neuropatia induzida pelo PTX (Tabela 2). 
Resultados semelhantes foram observados para a contagem total de leucócitos 
(Tabelas 1 e 2). Não foi observada perda de peso ou alteração na temperatura e nos 
sinais aparentes de bem-estar animal após o tratamento com vimblastina (dados não 
demonstrados). 
 
45 
 
 
Figura 8. Efeito da depleção de neutrófilos sobre a neuropatia causada pelo paclitaxel 
(PTX). (A) A depleção de neutrófilos não altera a hipersensibilidade mecânica induzida por 
PTX. (B) O tratamento com vimblastina não altera a sensibilidade mecânica em 
camundongos. Cada representa a média de 6 - 9 animais, e as barras verticais indicam o 
erro padrão da média (EPM). *P <0,05, ANOVA de duas vias, seguido pelo teste de 
Bonferroni. B, limiar basal. 
0
20
40
60
80
100
Controle
PTX (2 mg/kg, i.p.)
+ Vimblastina (5 mg/kg, i.v.)
B 7 8 9 10 14
**
*
**
A
Tempo após o 1o tratamento com PTX (dias)
F
re
q
u
ê
n
c
ia
 d
e
 R
e
s
p
o
s
ta
 (
%
)
0
20
40
60
80
100
Controle
Vimblastina (5 mg/kg, i.v.)
B 7 8 9 10 14
B
Tempo após o 1o tratamento com Vimblastina (dias)
F
re
q
u
ê
n
c
ia
 d
e
 R
e
s
p
o
s
ta
 (
%
)
46 
 
Tabela 1. Contagem total e diferencial de leucócitos no sangue de animais no 3º dia após o 
tratamento com vimblastina. 
 Valores de referência 
(Vianna et al., 2007) 
Controle Vimblastina 
Estatística 
Media Erro padrão Media 
Erro 
padrão 
Leucócitos (mm³) 6000 - 15000 2700 ± 228,2 1250 ± 176,8 *(P <0.05) 
Neutrófilo (%) 20 -30 19,25 ± 4,131 0,75 ± 0,25 *(P <0.05) 
Linfócito (%) 70-80 80 ± 4,203 99,25 ± 0,25 NS 
Monócito (%) 0-2 0 0 0 0 NS 
Eosinófilo (%) 0-7 0 0 0 0 NS 
Basófilo (%) 0-1 0 0 00 NS 
O total de leucócitos e a porcentagem de neutrófilos foi significativamente reduzida no 
grupo vimblastina em comparação com o grupo controle. Resultados expressos como 
média ± erro de cada grupo. *P< 0,05, Teste t de Student. 
 
Tabela 2. Contagem total e diferencial de leucócitos no sangue de animais no 18º dia após o 
tratamento com vimblastina. 
 Valores de 
referência 
(Vianna et al., 
2007) 
Controle PTX PTX + Vimblastina 
Estatística 
Media 
Erro 
padrão 
Media Erro padrão Média Erro padrão 
Leucócitos (mm³) 6000 - 15000 
4300 ± 856,9 5831,25 ± 1088 5143,75 ±635,7 NS 
Neutrófilo (%) 20 -30 
19,88 ± 3,399 17,88 ± 2,887 23,75 ± 4,139 NS 
Linfócito (%) 70-80 
78,5 ± 3,561 80,38 ± 2,815 73,25 ± 4,689 NS 
Monócito (%) 0-2 
0,875 ± 0,2950 1,25 ± 0,2500 1,25 ± 0,3134 NS 
Eosinófilo (%) 0-7 
0,625 ± 0,3750 0,5 ± 0,2673 0,25 ± 0,1637 NS 
Basófilo (%) 0-1 
0,125 ± 0,1250 0 0 0,25 ± 0,1637 NS 
O total de leucócitos e a porcentagem de neutrófilos retornam aos valores normais comparáveis 
no grupo vimblastina em comparação com o grupo controle. Resultados expressos como média 
± erro de cada grupo. Teste ANOVA de uma via, seguida pelo pós-teste de Bonferroni. 
 
 
47 
 
4.4. Avaliação dos níveis da citocina pró-inflamatória IL-1β na medula espinhal 
de animais tratados com PTX 
 
Dentre os mediadores inflamatórios envolvidos na inflamação espinhal a 
citocina pró-inflamatória IL-1β é uma das principais implicadas em participar da dor 
neuropática (PINHEIRO-RIBEIRO et al., 2017). Neste sentido avaliamos o possível 
aumento dos níveis da citocina IL-1β na medula espinhal dos camundongos após o 
tratamento com o PTX. Os níveis de IL-1β na medula espinhal foram quantificados 
em diferentes períodos experimentais. Conforme ilustrado na Figura 9, os níveis de 
IL-1β na medula espinhal dos animais tratados com veículo ou PTX foram 
semelhantes. 
 
0
20
40
60
Veículo 8h 24h 7d 14d
Tempo após tto com PTX
IL
-1

 (
p
g
/m
L
)
 
Figura 9. Avaliação dos níveis da citocina pró-inflamatória IL-1β na medula espinhal 
de camundongos submetidos a neuropatia induzida por quimioterápico. Os níveis de 
IL-1β foram quantificados por ELISA entre 8h e 14 dias após a primeira administração do 
paclitaxel (PTX). Cada grupo representa a média de 5 animais, e as barras verticais indicam 
o erro padrão da média (EPM). Teste de Kruskal-Wallis seguido do pós-teste de 
comparações múltiplas de Dunn. 
 
 
 
48 
 
 
4.5. Avaliação de gliose na medula espinhal de animais tratados com PTX 
 
Estudos sugerem que a micro e/ou astrogliose da medula espinhal apresenta 
papel importante na dor crônica (GAO YJ e JI RR, 2010; TSUDA et al., 2005; INOUE 
K. e TSUDA M, 2018). Portanto, realizamos a análise quantitativa para a proteína 
glial fibrilar ácida (GFAP) presente no citoplasma dos astrócitos, nos cortes 
histológicos de medula espinhal dos animais tratados com veículo ou com PTX. A 
Figura 10 demonstra que o tratamento com o PTX induziu um aumento significativo 
na expressão de GFAP na medula espinhal dos animais 24 h após a primeira 
administração (Figura 10). 
Também realizamos imunohistoquimica para avaliação da expressão da 
molécula adaptadora de cálcio ionizado (Iba-1), classicamente utilizada como 
marcador de células microgliais. A Figura 11 mostra que o tratamento com o PTX 
não alterou o número de positivas para Iba-1 (micróglia) na medula espinhal dos 
animais tratados com PTX nos diferentes tempos avaliados (Figura 11). 
49 
 
 
Figura 10. Análise da imunoexpressão de astrócitos (GFAP) na medula espinhal de 
animais tratados com paclitaxel (PTX). Imagens representativas (aumento de 400x) da 
imunoreatividade para os astrócitos (GFAP) na medula espinhal de animais controle que 
receberam apenas veículo, e paclitaxel (8 h, 24 h – 7d e 14d) após a indução do modelo. O 
gráfico representa a avaliação quantitativa do número de células positivas nos tempos de 8 
h, 24 h, 7 dias e 14 dias após a primeira administração do PTX. Cada grupo representa a 
média de 2 animais (9 imagens de cada lâmina analisada contendo 03 cortes histológicos) e 
as barras verticais indicam o erro padrão da média (EPM). Teste de Kruskal-Wallis seguido 
do pós-teste de comparações múltiplas de Dunn. *P< 0,05. 
 
50 
 
 
Figura 11. Análise da imunoexpressão de microglia (iba-1) na medula espinhal de 
animais tratados com paclitaxel (PTX). Imagens representativas (aumento de 400x) da 
imunoreatividade para microglia (iba-1) na medula espinhal de animais controle que 
receberam apenas veículo, e paclitaxel (8 h, 24 h – 7d e 14d) após a indução do modelo. O 
gráfico representa a avaliação quantitativa do número de células positivas nos tempos de 8 
h, 24 h, 7 dias e 14 dias após a primeira administração do PTX. Cada grupo representa a 
média de 3 animais (9 imagens de cada lâmina analisada contendo 03 cortes histológicos) e 
as barras verticais indicam o erro padrão da média (EPM). Teste de Kruskal-Wallis seguido 
do pós-teste de comparações múltiplas de Dunn. 
 
51 
 
4.6. Efeito do tratamento com minociclina sobre a hipersensibilidade mecânica 
causada pelo PTX 
 
Para avaliar a possível participação da microglia na hipersensibilidade 
mecânica causada pelo PTX, os animais foram tratados com diferentes doses de 
minociclina, um inibidor de ativação microglial, nos dias 0 e 6 do protocolo 
experimental descrito acima (Pagina 35). O tratamento com a minociclina na menor 
dose (30 mg/kg) mostrou uma tendência em reduzir a hipersensibilidade mecânica 
causada pelo PTX (Figura 12A). Então nos perguntamos se o tratamento com este 
inibidor em uma maior dose produziria um efeito mais pronunciado; assim, 
realizamos o tratamento com minociclina na dose de 100 mg/kg e observamos que 
este tratamento preveniu significativamente o desenvolvimento da hipersensibilidade 
mecânica causada pelo PTX (Figura 12B). 
52 
 
 
Figura 12. Bloqueio da microglia reduziu a hiperalgesia mecânica induzida por PTX: O 
tratamento preventivo com a minociclina 30 mg/kg resultou numa tendência em reduzir a 
sensibilidade mecânica, quando comparada ao grupo veículo (A). O tratamento com a 
minociclina na dose de 100 mg/kg reduziu significativamente a sensibilidade mecânica dos 
animais quando comparada ao grupo que recebeu apenas o veículo nos dias 7 e 8 do 
protocolo (B). Cada grupo representa a média de 8 animais, e as barras verticais indicam o 
erro padrão da média (EPM) (*p<0,05, ANOVA de duas vias, seguido pelo teste de 
Bonferroni). B, limiar basal. 
 
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5. DISCUSSÃO 
 
A dor neuropática é uma condição clínica que reduz a qualidade de vida dos 
pacientes acometidos pois o desconforto gerado leva a distúrbios do sono, do 
apetite e psíquicos. As opções de tratamentos farmacológicos disponíveis 
atualmente são ineficazes, com diversos efeitos adversos e podendo levar a 
dependência de alguns fármacos. Além disso, a dor crônica gera muitos custos aos 
sistemas de saúde, especialmente por ter um diagnóstico complexo, e estima-se que 
pacientes com dor crônica usam os serviços de saúde cinco vezes mais que o 
restante da população (SERETNY et al., 2014; McWILLIAMS et al., 2003; BREIVIK 
et al., 2006; KAMALERI et al., 2008; VAN HECKE et al., 2013; KALIRA et al., 2013). 
Ainda, tem sido relatado que pacientes com dor crônica também tem uma redução 
em sua produtividade no trabalho (VAN LEEUWEN et al., 2006). Neste contexto, o 
conhecimento acerca da fisiopatologia da dor crônica facilitaria o desenvolvimento 
de novos medicamentos específicos e eficazes para o seu tratamento e, 
consequentemente, levaria a um melhor manejo clínico destes pacientes e melhoria 
na qualidade de vida dos mesmos. 
A neuropatia periférica induzida por quimioterápico (NPIQ) é um efeito 
adverso dose-limitante no tratamento do câncer, e assim como as demais etiologias 
de dor neuropática, não possuí tratamento eficaz e seguro. Sendo assim, é 
importante que se invista na busca