MICROBIOLOGIA BACTERIANA

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Morfologia Bacteriana
As bactérias são seres unicelulares e apresentam formas
simples, apesar dos 4 bilhões de anos de evolução. Com o
microscópio ótico, a forma, tamanho e arranjo
(agrupamento) das bactérias são facilmente observados.
Invisíveis ao olho humano, as bactérias só podem ser visualizadas com auxílio
do microscópio, normalmente em aumentos de 1000 vezes, pois seu tamanho é
tão pequeno que sua medida é dada em micrômetros (mm), que são
equivalentes a 1/1000mm (10-3mm).
A maioria das bactérias varia de 0,2 a 2,0 (mm de diâmetro e de 2 a 8mm de
comprimento).
Cálculos mostram que aproximadamente 1 trilhão (1.000.000.000.000) de
células bacterianas pesariam somente um grama. Nem todas as bactérias são
iguais.Bactérias de interesse médico podem apresentar diferentes formas
básicas (esféricas ou cocóides, cilíndricas ou bastonetes e espirais) e diferentes
tamanhos. Algumas bactérias, ainda, se organizam formando arranjos.
Formas Básicas das Bactérias
As bactérias esféricas (cocóides) são denominadas cocos; redondos, alongados
ou achatados em uma das extremidades. Quando os cocos se dividem para se
reproduzir, as células podem permanecer unidas umas às outras, surgindo em
decorrência os arranjos. Os bastonetes também são conhecidos como bacilos e
correspondem a células cilíndricas pequenas ou longas, grossas ou delgadas,
pontudos ou com extremidades curvadas. Alguns bacilos são ovais e parecidos
com cocos, por isso recebem a denominação de cocobacilos. As bactérias em
espirais possuem uma ou mais curvaturas. As que lembram uma vírgula
recebem o nome de vibrião e outras, denominadas espirilos, apresentam forma
helicoidal, lembrando um saca-rolhas e uma estrutura bastante rígida. Outro
grupo de bactérias em espirais apresenta forma espiral e flexível e são
denominados espiroquetas. Ao contrário dos espirilos que utilizam flagelos
para locomoção as espiroquetas se movem por meio de filamentos axiais, que
lembram flagelos, mas estão contidos por uma bainha externa flexível.
Figura 01 - Formas Básicas das Bactérias
Divisão Bacteriana e Formação de Arranjos
A maioria das espécies bacterianas se reproduz através de um processo
conhecido como fissão binária. Algumas bactérias podem se reproduzir por
brotamento, formando uma pequena região que inicia um crescimento (broto),
que ao atingir o tamanho aproximado da célula parental, separa-se.
Observando esse processo, nota-se que algumas espécies de bactérias não se
separam completamente após a divisão celular, permanecendo unidas umas às
outras, formando agrupamentos denominados arranjos bacterianos. Enquanto
as bactérias espiraladas normalmente aparecem como células individualizadas,
outras espécies bacterianas podem se reproduzir e formar arranjos ou padrões
característicos.
Quando um coco se divide em um plano e permanece unido (aos pares)
forma-se um arranjo denominado diplococo. Isso caracteriza algumas espécies
deNeisseria, incluindo o agente etiológico da gonorréia (Neisseria
gonorrhoeae) e meningite (Neisseria meningitidis). Quando cocos unem-se
formando uma cadeia, permanecendo unidos após várias divisões, recebem a
denominação de estreptococos. Espécies de estreptococos como aquelas
responsáveis por infecções de garganta e pneumonia (Streptococcus
pneumoniae) apresentam este padrão. Se o coco se divide em mais de um
plano ou dimensão durante o crescimento, os arranjos tornam-se mais
complexos. Quando um coco tal como o Pediococcus se divide no ângulo direito
no primeiro plano de divisão, há formação de tétrades, ou grupos em forma de
um quadrado.
Uma divisão adicional no terceiro plano pode resultar em um arranjo em forma
de cubo com oito bactérias, conhecido como sarcina. Se houver divisão em
diversos planos, formando arranjo semelhante a cachos, estes recebem
denominação de estafilococos. Esse é o arranjo apresentado pelo
Staphylaococcus aureus.
Os bacilos se dividem ao longo de seu eixo curto; assim, existem menos
arranjos de bacilos do que de cocos. Os bacilos normalmente se apresentam
isolados, mas quando ocorrem aos pares após a divisão recebem o nome de
diplobacilos, e em cadeias, estreptobacilos.
Figura 02 - Divisão Bacteriana e Formação de Arranjos
A identificação da forma e arranjo bacteriano aliado ao processo de coloração
de Gram é de grande importância no diagnóstico laboratorial de uma infecção,
auxiliando o tratamento, uma vez que doenças infecciosas são causadas por
bactérias diferentes e apresentam uma variedade de cursos e conseqüências.
As figuras abaixo correspondem a fotomicrografias eletrônicas e de
microscopia óptica, apresentando exemplos de formas e arranjos de interesse
médico.
Veja abaixo imagem do arranjo dos cocos, os bacilos e as bactérias espirais.
Figura 03 - arranjo dos cocos Fonte - Tortora et al (2003: 78-9)
Figura 04 - Bacilos Fonte - Tortora et al (2003: 78-9)
Figura 05 - Bactérias espirais Fonte - Tortora et al (2003: 78-9)
Citologia bacteriana
Figura 01 - Estrutura da Célula Procarionte
A célula procarionte é mais simples que a eucarionte em todos os níveis, à
exceção da parede celular, que é mais complexa. Observando a estrutura
celular de uma bactéria, podemos encontrar as seguintes estruturas:
Cápsula e Glicocálice
Muitas bactérias sintetizam grandes quantidades de polissacarídeo
extracelulares, que podem ser encontrados por fora da parede celular. Quando
o polissacarídeo forma uma camada condensada e bem organizada,
circundando estreitamente a célula, é denominado cápsula; quando forma
uma rede frouxa de fibrilas que se estendem para fora da célula, é conhecido
por glicocálice (ou camada limosa). A cápsula contribui para a capacidade de
invasão das bactérias patogênicas, ficando as bactérias encapsuladas
protegidas da fagocitose.
Desempenha ainda um importante papel na aderência bacteriana às superfícies
em seu meio ambiente, incluindo células de hospedeiros animais e vegetais. O
Streptococcus mutans, por exemplo, é uma bactéria encontrada na região oral
e deve a seu glicocálice a capacidade de aderir firmemente ao esmalte dos
dentes, formando a camada conhecida como placa bacteriana na superfície
dentária e os produtos ácidos liberados por estas bactérias provocam as cáries.
Flagelos
São apêndices filamentoso longos, delgados e relativamente rígidos, compostos
por agregados de subunidades de uma proteína denominada flagelina,
entrelaçadas como uma corda e que estão relacionados com a locomoção das
bactérias que os possuem.
Os flagelos movimentam-se em velocidades muito elevadas, conferindo às
bactérias um movimento rotacional e permitindo o seu deslocamento ao longo
de distâncias muito superiores ao seu comprimento. O comprimento de um
flagelo é geralmente maior do que o da célula, mas seu diâmetro é uma
pequena fração do diâmetro celular. Bactérias flageladas são chamadas
móveis, enquanto bactérias que não apresentam flagelos são imóveis. De
acordo com a disposição e o número de flagelos, são conhecidos quatro tipos
bacterianos: Monotríquios (apresentando único flagelo polar), Lofotríquios
(apresentando um tufo de flagelos polares múltiplos), Anfitríquios (presença
de flagelos em ambas extremidades da célula) e Peritríquios (flagelos
distribuídos por toda a superfície da célula).
As flagelinas de diferentes espécies bacterianas diferem presumivelmente uma
das outras na sua estrutura primária, sendo altamente antigênicas (antígenos
H) e algumas das respostas imunológicas à infecção são dirigidas a essas
proteínas.
Figura 02 - Bactérias monotríquias: apresentando um único flagelo (indicado
pela seta) em uma das extremidades da célula. Fonte: Extraída de Tortora,
Microbiology, 1998.
Figura 03 - Bactérias anfitríqueas: apresentando flagelos (indicados pelas
setas) em ambas extremidades da célula. Fonte: Extraída de Tortora,
Microbiology, 1998.
Figura 04 - Bactérias lofotríqueas: apresentando vários flagelos (indicados pela
seta) na mesma extremidades dacélula. Fonte: Extraída de Tortora,
Microbiology, 1998.
Figura 05 - Bactérias peritríquias: apresentando flagelos (indicados pela seta)
em toda a superfície da célula. Fonte: Extraída de Tortora, Microbiology, 1998.
Pili (Fímbrias)
Presentes em algumas bactérias, correspondem a apêndices finos e rígidos,
mais finos e mais curtos do que os flagelos e compostos por subunidades
protéicas estruturais denominadas pilinas, distribuídas de modo helicoidal em
torno de um eixo central. A capacidade de causar doença de certas bactérias
depende da produção das pilis que conferem às células bacterianas
propriedades de aderência, não desempenhando nenhum papel relativo à
motilidade, pois são encontradas tanto em espécies móveis quanto em espécies
imóveis.
Um tipo de pili conhecida como pili F ou fímbria sexual participa de um
importante processo denominadoconjugação bacteriana, funcionando como
uma ponte para a transferência de material genético entre as bactérias.
Figura 06 - Pili (Fímbrias) Fonte: http://escience.ws/b572/
Parede Celular
A rígida camada celular externa, situada entre a cápsula e a membrana
celular, denomina-se parede celular. Esta estrutura corresponde a uma camada
de constituição complexa, responsável por manter a forma da célula
bacteriana, além de sua composição química variar de acordo com a espécie de
bactéria, permitindo-nos classificar as bacté-rias em dois grupos: Gram
positivas e Gram negativas.
O principal constituinte da maioria das paredes celulares bacterianas é um
complexo polímero macromolecular conhecido como peptidioglicano (ou
mureína), que consiste em muitas cadeias polissacarídicas unidas por pequenas
cadeias peptídicas.
A parede celular também apresenta importante papel no controle da pressão
osmótica do interior das bactérias, já que esta muitas vezes é superior à do
meio externo, impedindo a ruptura das células bacterianas.
Membrana Celular
Envolvendo o citoplasma encontramos a membrana celular (membrana
plasmática bacteriana). Trata-se de uma membrana típica, composta de
fosfolipídios e proteínas, mas diferencia-se da membrana celular eucarionte
pela ausência de esteróis.
A membrana celular funciona como uma barreira, impedindo o extravasamento
passivo dos constituintes citoplasmáticos.
São encontradas invaginações múltiplas na membrana plasmática formando
estruturas especializadas denominadas mesossomos, que são de dois tipos: os
septais, que desempenham importante papel na divisão bacteriana,
contribuindo para a formação de paredes transversais durante a divisão
celular; e os laterais, encontrados em algumas bactérias tendo como função a
concentração de enzimas envolvidas no transporte de elétrons.
As principais funções da membrana plasmática incluem:
● Permeabilidade Seletiva e Transporte de Solutos através de vários
mecanismos para transportar nutrientes para o interior da célula e produtos
de degradação para o exterior.
● Transporte de elétrons e fosforilação oxidativa em espécies aeróbicas
(respiração celular): Citocromos e outras enzimas e componentes da cadeia
respiratória localizam-se na membrana celular. Dessa maneira a membrana
celular bacteriana funciona de maneira semelhante às mitocôndrias das
cé-lulas eucariontes. Essa relação tem sido utilizada por muitos pesquisadores
para confirmar a teoria de que as mitocôndrias evoluíram a partir de bactérias
simbióticas.
● Localização das Enzimas e Moléculas Transportadoras que atuam na
biossíntese de DNA, dos polímeros da parede celular e lipídios da membrana
celular.
● Secreção de enzimas que rompem as macromoléculas presentes no
ambiente de maneira a fornecer subunidades que servirão como nutrientes.
Estruturas Citoplasmáticas
O citoplasma corresponde a uma solução semifluida limitada pela membrana
celular. As células procariontes não apresentam organelas membranosas como
mitocôndrias e cloroplastos. Dessa maneira, as enzimas de transporte de
elétrons localizam-se na membrana celular. Os pigmentos fotossintéticos das
bactérias que efetuam a fotossíntese localizam-se em vesículas encontradas
também na membrana celular. As estruturas microtubulares típicas de células
eucariontes também estão ausentes nos procariontes. No citoplasma da célula
eucarionte, encontramos muitas partículas insolúveis relacionadas com o
armazenamento de substâncias de reserva e subunidades de macromoléculas
para compor outras estruturas celulares, denominadas inclusões. As células
podem acumular nutrientes quando estes são abundantes e usa-los à medida
que se tornam escassos no ambiente.
Os únicos representantes de organelas presentes nas bactérias correspondem
aos ribossomos, pequenas partículas responsáveis pela síntese de proteínas,
composta por RNAr (RNA ribossômico) e proteínas. As células procariontes
apresentam ribossomos menores e menos densos do que os das células
eucariontes com coeficiente de sedimentação 70S compostos de duas
subunidades, 30S e 50S.
Esporos (Endósporos) Bacterianos
Algumas bactérias pertencentes ao gênero Clostridium e Bacillus, quando em
condições ambientais desfavoráveis, formam estruturas de repouso
termorresistentes denominadas endósporos (esporos) bacterianos. O endósporo
corresponde a um tipo de diferenciação celular que ocorre em resposta a uma
situação desfavorável do meio ambiente. O processo de formação do endósporo
dentro de uma célula vegetativa é denominado esporulação ouesporogênese.
Ocorrem profundas mudanças estruturais durante a diferenciação da bactéria
em endósporo. Um cromossomo duplicado e o citoplasma são isolados por um
crescimento da membrana plasmática, constituindo-se assim um pré-esporo
composto por uma dupla membrana que circunda o cromossomo e o
citoplasma. Camadas de peptidioglicano, são depositadas entre as duas
lâminas da membrana e forma-se uma espessa camada composta de proteínas
ao redor da membrana externa.
A célula sofre desidratação (elimina a água) ao final da esporogênese; dessa
maneira, o metabolismo bacteriano torna-se praticamente imperceptível. Após
a esporogênese, a parede celular vegetita se rompe e o endósporo é eliminado
no ambiente, podendo permanecer “dormente” por muitos anos sob condições
desfavoráveis.
Um endósporo retorna ao seu estado de célula vegetativa por um processo
denominado germinação. Enzimas do endósporo rompem as camadas extras
que o circundam, permitindo a entrada de água e a retomada do metabolismo
bacteriano.
Figura 07 - Endósporo bacteriano ainda no interior da célula bacteriana Fonte:
www.unb.br/ib/cel/microbiologia
Estudo da parede celular bacteriana
Para suportar a alta pressão osmótica da célula, devido a presença de grande
concentração de soluto interno, bactérias apresentam uma parede ceular
complexa e semirigida que circunda a membrana celular adjacente, também
responsável pela forma da bactéria.
A parede celular apresenta uma composição química complexa, composta por
uma rede de macromoléculas denominada peptidioglicano (mureína ou
mucopeptídeo), que está presente isoladamente ou em combinação com outras
substâncias.
http://www.unb.br/ib/cel/microbiologia
O peptidioglicano corresponde a um dissacarídeo repetitivo único e por
pelipeptídios que formam um “esqueleto” que circunda e protege toda a
célula. A estrutura básica do peptidioglicano pode ser definida como um
arcabouço onde as cadeias glicanas ligamse por ligações peptídicas cruzadas,
formadas pelos aminoácidos. A porção dissacarídica é composta por dois
derivados de monossacarídeos denominados N-acetilglicosamina (NAG) e ácido
N-acetilmurâmico (NAM), unidos alternadamente e ligados à glicose. Filas
adjacentes estão ligadas por polipeptídeos. Embora a estrutura da ligação
polipeptídica varie, ela sempre inclui cadeias laterais de tetrapetídeos, que
consistem em quatro amino-ácidos unidos aos NAMs do esqueleto. Os
aminoácidos ocorrem em um padrão alternado de formas L e D e consistem em
L-alanina, D-alanina, ácido D-glutâmico e lisina (ouácido diaminopimélico –
DAP). Esse padrão é único, pois os aminoácidos encontrados em outras
proteínas são formas L; desta maneira, os aminoácidos D-glutâmico, D-alanina
e DAP não são encontrados em qualquer outra proteína conhecida. As cadeias
laterais paralelas de tetrapeptídeo ligam-se diretamente umas às outras por
uma ponte cruzada peptídica, consistindo de uma cadeia curta de aminoácidos.
Assim, devido a esta complexa estrutura, o peptidioglicano confere rigidez à
parede, embora também apresente elasticidade e porosidade, permitindo a
passagem de substâncias.
Dependendo da organização da parede celular, as bactérias podem ser classificadas
em dois grandes grupos distintos, de acordo com sua resposta ao método de colora-
ção pelo método de Gram: Gram positivas1 e Gram negativas2.
Embora esta distinção tenha sido originalmente baseada em um procedimento
especial de coloração – processo de coloração de Gram – as diferenças
estruturais entre os dois grupos residem, essencialmente, na estrutura e
composição química da parede celular.
Parede Celular de Bactérias Gram positivas
Na maioria das bactérias Gram positivas, a parede celular consiste de muitas
camadas de peptidioglicano, formando uma estrutura espessa e rígida.
Também contém substâncias denominadas ácidos teicóicos, que consistem
principalmente em polímeros álcoois (glicerol ou ribitol), associados a
açúcares ou aminoácidos e conectados entre si por fosfato. Existem duas
classes de ácidos teicóicos: o ácido lipoteicóico, que atravessa a camada de
peptidioglicano e está ligado covalentemente aos lipídios da membrana
plasmática, e o ácido teicóico de parede, que apresenta ligação covalente com
o peptidioglicano.
Devido à carga negativa, os ácidos teicóicos são parcialmente responsáveis pela
carga negativa da superfície celular e podem permitir a passagem de cátions
através da parede celular, para dentro e para fora da célula. Também assumem
um papel no crescimento da célula, impedindo a ruptura da parede e lise
celular. Ainda, constituem importantes antígenos de superfície; portanto,
tornam possível identificar bactérias através de certos testes laboratoriais.
Figura 01 - Parede Celular de Bactérias Gram positivas Fonte: Adaptado de
Microbiologia de Brock, 10ª ed., 2003 ? figura extraída do site:
http://www.unb.br/ib/cel/microbiologia/morfologia1/morfologia1.html
Parede Celular de Bactérias Gram negativas
As paredes celulares de bactérias Gram negativas consistem de uma estrutura
bastante complexa, com poucas camadas de peptidioglicano, ausência de
ácidos teicóicos e uma camada adicional de parede, composta por
lipopolissacarídeo (LPS), denominada membrana externa. Essa camada
corresponde a uma segunda camada lipídica, diferente da membrana celular.
O peptidioglicano está ligado a lipoproteínas na membrana externa e está em
um espaço cheio de fluido entre a membrana celular e a membrana externa,
denominado espaço periplasmático (periplasma). O espaço periplasmático
contém uma alta concentração de enzimas de degradação (enzimas hidrolíticas
que promovem a degradação inicial dos nutrientes), proteínas de transporte
(que iniciam os processos de transporte de substratos) e quimiorreceptores.
A membrana externa consiste de LPS, lipoproteínas e fosfolipídios. Apresenta
várias funções específicas e sua forte carga negativa é um fator importante na
evasão da fagocitose e de ações do sistema imunológico do hospedeiro. A
membrana externa também fornece uma barreira para alguns antibióticos,
enzimas digestivas como a lisozima, detergentes, metais pesados, sais biliares
e certos corantes. Entretanto, não fornece uma barreira para substâncias
ambientais, pois nutrientes devem atravessá-la para manter o metabolismo
bacteriano. Parte da permeabilidade da membrana externa é devida a
proteínas denominadas porinas, que formam canais permitindo a passagem de
pequenas substâncias como nucleotídeos, dissacarídeos, peptídeos,
aminoácidos, vitaminas e ferro. Existem vários tipos de porinas que podem ser
classificadas como específicas, quando possuem sítio de ligação específica para
um grupo de substâncias estruturalmente relacionadas, ou não específicas,
quando formam canais preenchidos por água, pelos quais pequenas substâncias
podem passar.
O componente LPS da membrana externa consiste em duas porções: um
polissacarídeo interno e o polissacarídeo O (antígeno O), que atuam como
antígenos e são úteis para diferenciar as espécies de bactérias Gram negativas
e a porção lipídica do lipopolissacarídeo, denominada lipídio A, que é referida
como endotoxina, sendo tóxica quando presente no organismo do hospedeiro.
Um complexo lipoprotéico é encontrado na camada interna da membrana
externa. Essas lipoproteínas contêm pequenas proteínas que atuam ancorando
a membrana externa ao peptidioglicano. Os fosfolipídios são encontrados na
camada interna da membrana, enquanto na camada externa são substituídos
pelo LPS.
Figura 02 - Parede Celular de Bactérias Gram Negativas Fonte - Adaptado de
Microbiologia de Brock, 10ª ed., 2003 ? figura extraída do site:
http://www.unb.br/ib/cel/microbiologia/morfologia1/morfologia1.html
Bactérias desprovidas de Parede Celular
Algumas bactérias não apresentam parede celular ou apresentam muito pouco
material de parede. Essas são representadas por membros do gênero
Mycoplasma, as menores bactérias de vida livre conhecidas que podem crescer
e se reproduzir fora de células vivas de hospedeiros. Sua membrana celular
destaca-se das outras bactérias por possuírem lipídios denominados esteróis;
acredita-se que estes ajudem a protegê-las da lise. A falta da parede celular
parece facilitar a fusão da membrana celular com a célula hospedeira.
Destruição da Parede Celular por Antibióticos
Substâncias químicas que destroem a parede celular bacteriana, ou que
interferem com sua biossíntese frequentemente não causam dano as células
animais, pois a parede celular bacteriana é composta de substâncias diferentes
daquelas presentes nas células eucariontes.
Alguns antibióticos, portanto, atuam inibindo a síntese da parede celular
bacteriana, como a penicilina, um antibiótico que deriva de bolores
Penicillium obtidas por extração de culturas em meios especiais, descoberto
por Fleming em 1928.
Estrutura da Parede Celular e Coloração de Gram
As células podem ser submetidas a procedimentos de coloração que aumentam
o seu contraste e facilitam sua observação ao microscópio óptico de campo
claro. Os corantes utilizados para corar bactérias são compostos químicos que
se combinam fortemente aos constituintes celulares.
Em 1884 um bacteriologista dinamarquês chamado Hans Christian Gram
(1853-1938) desenvolveu um método de coloração bacteriana diferencial para
distinguir entre duas classes de bactérias. O método de coloração que recebeu
seu nome é um dos procedimentos de coloração fundamentais em
microbiologia, visto que está correlacionado com muitas outras propriedades
morfológicas em formas filogeneticamente correlatas, sendo considerado
essencial na identificação de uma bactéria desconhecida, pois classifica as
bactérias em dois grupos: Gram positivo ou Gram negativo.
Christian Gram observou que, após o processo de coloração com dois corantes
distintos as bactérias apresentavam reações diferentes em relação aos dois
corantes utilizados. As bactérias Gram positivas coram-se em roxo, enquanto
as bactérias Gram negativas coram-se em vermelho.
Um esfregaço bacteriano fixado pelo calor é recoberto inicialmente com um
corante básico roxo (cristal violeta), com o objetivo de corar todas as células
em roxo (coloração primária), e posteriormente o esfregaço é tratado com
uma solução de iodo (lugol), um mordente que forma um complexo insolúvel
de cristal violeta-iodo, que permanece dentro da célula, permitindo a
coloração de bactérias Gram positivas e Gram negativas em roxo.
Posteriormente, realiza-se o tratamento do esfregaço com álcool, sendo essecomplexo extraído de bactériasGram negativas devido à capacidade do álcool
em penetrar a membrana externa, rica em lipídios, removendo o complexo
cristal violeta-iodo, mas incapaz de descolorir bactérias Gram positivas. Como
as bactérias Gram negativas tornam-se incolores após o tratamento com
álcool, aplica-se sobre o esfregaço o corante safranina, um corante básico
vermelho, que cora as bactérias Gram negativas em uma tonalidade
avermelhada.
Tal reação à coloração de Gram se deve às diferenças na espessura e
composição química da parede celular de bactérias Gram positivas e Gram
negativas, que permite que o álcool descore as células Gram negativas, mas
não asGram positivas. Algumas bactérias, como os membros do gênero
Mycobacterium são mais frequentemente identificadas utilizando outro tipo de
coloração, conhecida como álcool-ácido-resistente, já que após o processo de
coloração de Gram não assumem a cor roxa ou vermelha, sendo referidas como
bactérias Gram-variáveis. Dessa maneira, em relação à composição química da
parede celular, temos:
Figura 03 - Gram Positivo e Gram Negativo Fonte - Adaptada a partir da figura
encontrada em
http://www.vet-yon.fr/ens/expa/images/micimm/TPE/gramstn.jpg
Figura 04 - Gram Positivas e Gram Negativas Fonte - Adaptação a partir das
figuras encontradas nos sites: http://virus.usal.es
http://upload.wikimedia.org
Fisiologia e Metabolismo Bacteriano
Para se desenvolver, um microrganismo necessita de todos os elementos que
compõem sua matéria orgânica e fonte de energia disponível para permitir a
síntese de macromoléculas.
Microrganismos possuem capacidade de realizar reações químicas e de
organizar as moléculas em macromoléculas específicas. Os precursores dessas
macromoléculas podem ser retirados do meio ambiente ou ser sintetizados
pelas bactérias a partir de compostos ainda mais simples, através de reações
químicas.
Bactérias heterótrofas são aquelas que utilizam compostos orgânicos diversos
como fonte de carbono e energia necessária para o seu crescimento, devendo
esse carbono estar numa forma passível de ser assimilada. Essas bactérias
podem ser cultivadas em laboratório. Algumas bactérias são autótrofas, ou
seja, capazes de sintetizar moléculas orgânicas a partir do dióxido de carbono
(CO2), obtendo sua energia a partir da luz, através da fotossíntese;
quimiolitótrofa, quando utilizam compostos inorgânicos como redutor e CO2
como fonte de carbono.
Nutrição Bacteriana
A célula necessita de nutrientes para o seu desenvolvimento, utilizados para
construir novos componentes celulares ou para obter energia. Quando supridas
com os nutrientes necessários, as bactérias são capazes de sintetizar todas as
unidades formadoras de macromoléculas. Diferentes espécies bacterianas
requerem nutrientes distintos, sendo geralmente necessários sob uma ou outra
forma específica. Nem todos os nutrientes são necessários nas mesmas
quantidades, embora todos sejam imprescindíveis; alguns denominados
macronutrientes são necessários em quantidades maiores por serem os
principais constituintes dos compostos orgânicos celulares, enquanto outros, os
micronutrientes, são requeridos em menores quantidades.
Macronutrientes
As bactérias necessitam de fatores de crescimento, ou seja, compostos
orgânicos que a célula utiliza para o seu crescimento (reprodução), mas que é
incapaz de sintetizar quando as bactérias são supridas.
As bactérias podem assimilar vários compostos orgânicos de carbono, sendo
este um macronutriente essencial, uma vez que se encontra presente na
maioria das substâncias que compõem as células. Aminoácidos, ácidos graxos,
ácidos orgânicos, açúcares, bases nitrogenadas e outros compostos orgânicos
por ser utilizados pelas bactérias como fonte de carbono. Após o carbono, o
elemento mais abundante na célula corresponde ao nitrogênio, um importante
componente de proteínas, ácidos nucléicos e outros compostos celulares. O
nitrogênio pode ser fornecido sob as formas orgânica ou inorgânica. No
entanto, a maior fonte de nitrogênio encontra-se na forma de nitrogênio
gasoso (N2) ou na forma de compostos inorgânicos combinados, como amônia
(NH3), nitrato (NO3-) e nitrito (NO2-). A maioria das bactérias é capaz de
utilizar a amônia como única fonte de nitrogê-nio, enquanto outras podem
utilizar também o nitrato. Por outro lado, o nitrogênio gasoso pode ser
utilizado apenas por algumas bactérias, denominadas bactérias fixadoras de
nitrogênio. O fósforo é encontrado na natureza na forma de fosfato orgânico
ou inorgânico e também é um macronutriente essencial para a síntese de
ácidos nucléicos, fosfolipídios e componentes da parede celular (ácido
teicóico). Algumas espécies bacterianas podem armazenar grânulos de fosfato
inorgânico, chamados grânulos metacromáticos ou de volutina. A exemplo do
nitrogênio, o enxofre é necessário devido ao seu papel estrutural nos
aminoácidos (cisteína e metionina) e também por estar presente em diversas
vitaminas e em proteínas importantes para o processo de respiração celular.
O oxigênio é requerido na forma molecular como aceptor final da cadeia de
transporte de elétrons aeróbica. E o hidrogênio, um componente muito
frequente da matéria orgânica e inorgânica, também constitui elemento
comum de todo material celular.
Micronutrientes
Necessários em pequena quantidade, mas extremamente importantes para o
funcionamento celular. Correspondem a minerais e muitos deles desempenham
papel estrutural em várias enzimas.
Alguns são requeridos em uma quantidade relativamente alta, quando
comparados a outros, dentre estes, potássio, magnésio, fósforo e ferro. As
bactérias requerem fontes de potássio, pois este está envolvido na atividade
de uma variedade de enzimas. O magnésio tem um importante papel na
estabilização de ribossomos, membranas celulares e ácidos nucléicos, também
sendo necessário à atividade de muitas enzimas. O cálcio que auxilia na
estabilização da parede celular e termoestabilidade dos endósporos. O sódio é
necessário a alguns microrganismos cujo ambiente natural é rico em sais. O
ferro é um elemento de extrema importância para a respiração celular, além
de ser componente de proteínas enzimáticas.
Outros micronutrientes (cobalto, níquel, molibdênio, selênio, zinco, dentre
outros) são necessários em quantidades muito pequenas.
Influência dos Fatores Ambientais
O metabolismo bacteriano é influenciado por fatores físicos e químicos do
meio ambiente. Para ser apropriado o meio de crescimento de uma bactéria
deve conter, além dos nutrientes essenciais ao desenvolvimento bacteriano,
condições físicas ideais, como pH, temperatura e aeração.
Temperatura
A faixa de temperatura ótima de crescimento para cada espécie de bactéria
varia amplamente. Em torno desta temperatura ótima, observa-se um
intervalo dentro qual o crescimento também ocorre, sem, no entanto, atingir
o seu máximo.
Quando o limite superior de temperatura ótima é ultrapassado, rapidamente
ocorre desnaturação do material celular e morte bacteriana. As temperaturas
inferiores à ótima levam a uma diminuição das reações metabólicas, com
conseqüente diminuição na reprodução bacteriana.
Por esta razão, utilizam-se baixas temperaturas para a preservação de culturas
bacterianas.
Quanto ao requerimento térmico, as bactérias apresentam variações, podendo
ser divididas em três grupos principais, segundo a temperatura ótima para seu
crescimento: psicrófilas (bactérias que se desenvolvem melhor em
temperaturas baixas, em torno de 10ºC), mesófilas (bactérias que se
desenvolvem desde uma temperatura ambiental até a temperatura do
organismo humano, entre 26ºC e 37ºC) e termófilas (bactérias que vivem em
temperaturas elevadas, em torno de 60ºC a 80ºC). A maioria das bactérias são
mesofílicas, sendo a temperatura ambiental favorável para o desenvolvimento
de formas livres e a temperatura do organismo humano ideal para o
desenvolvimento de bactérias patogênicas.
pH
Os valoresde pH mais adequados para o desenvolvimento bacteriano são
aqueles em torno da neutralidade. A maioria dos microrganismos crescem mais
adequadamente em pH de 6,0 a 8,0, sendo conhecidas por neutrófilas.
Existem, entretanto, grupos adaptados para sobreviver em ambientes ácidos e
alcalinos. As bactérias que se desenvolvem em pH ácido (em torno de 3,0) são
conhecidas como acidófilas e são capazes de regular seu pH interno dentro de
uma ampla faixa de valores do pH externo e outras (alcalófilos) possuem um
pH ótimo em torno de 10.
Oxigênio
O oxigênio pode ser indispensável, letal ou inócuo para as bactérias, o que
permite classificá-las em: aeróbicas estritas (exigem a presença de oxigênio
como aceptor final de elétrons para sobreviver), microaeróbilas (necessitam de
baixos teores de oxigênio), aerotolerantes (suportam a presença do oxigênio,
embora não o utilizem), anaeróbicas facultativas (utilizam oxigênio quando
disponível, mas também se desenvolvem em sua ausência, tendo a capacidade
de viver de forma aeróbica ou anaeróbica) e anaeróbicas estritas (não toleram
oxigênio e exigem uma substância diferente do oxigênio como aceptor de
hidrogênio).
Pressão Osmótica
Refere-se à concentração de sais em um meio. Para a maioria dos
microrganismos as propriedades dos meios comuns são satisfatórias,
entretanto, quando se deseja cultivar bactérias provenientes de ambientes
com altas concentrações salinas, conhecidas como halófitas (halofílicas)
deve-se elevar a concentração de sais em um meio de cultivo.
Metabolismo Bacteriano
Uma vez atendidas todas as necessidades nutricionais e condições físicas para o
desenvolvimento bacteriano, as bactérias utilizarão os nutrientes como fonte
de energia e síntese de estruturas celulares.
O conjunto de reações químicas realizadas pelos microrganismos para
obtenção, armazenamento e utilização de energia é denominado metabolismo.
As reações metabólicas envolvem tanto a liberação de energia, denominadas
reações catabólicas, como consumo de energia, denominadas reações
anabólicas. Todos os tipos de células, incluindo as bactérias, são constituídos
de cerca de 70% de água, indicando que as reações meatabólicas ocorrem em
meio aquoso.
Substâncias com alto valor energético são aquelas com elevado grau de
redução, e grande parte das bactérias vai obter toda energia de que necessita
por oxidação desses substratos. A energia produzida é utilizada para
transporte de nutrientes, movimento de flagelos e biossíntese de moléculas
celulares.
Respiração Aeróbica
O carboidrato mais abundante na natureza é a glicose, uma vez que faz parte
de vários dissacarídeos e polissacarídeos. A maioria das células é capaz de
oxidar completamente a molécula de glicose a CO2 e H2O, armazenando a
energia liberada em moléculas de ATP. O oxigênio gasoso (O2) é
frequentemente empregado como oxidante. O evento que leva à oxidação
total da glicose ocorre em três etapas: glicólise (quebra gradativa de glicose
em piruvato na ausência total de oxigênio), conversão de piruvato a acetil-CoA
e oxidação de actil-CoA pelo ciclo de Krebs (fases aeróbicas onde o oxigênio é
utilizado como aceptor final do hidrogênio após uma longa série de reações
moleculares controladas por enzimas específicas).
Em situações em que os carboidratos não estão disponíveis, as bactérias podem
utilizar proteínas, peptídios e aminoácidos como fonte de energia, ou ainda
converter proteínas e peptídios em aminoácidos que podem ser utilizados
diretamente pela célula como unidades para a síntese de suas proteínas.
Assim, a degradação de lipídios se restringe a certas bactérias como o
Staphylococcus presentes na pele humana, capazes de secretar lípases e
hidrolisar lipídios liberando ácidos graxos que podem ser assimilados e
incorporados aos lipídios bacterianos ou ser oxidados até acetil-CoA, sofrendo
posterior oxidação no ciclo de Krebs.
Fermentação
Em outras situações, bactérias podem utilizar lipídios, que apesar de
altamente energéticos são pouco utilizados devido ao seu caráter hidrofóbico
que os torna pouco disponíveis em meio aquoso.
Muitas bactérias anaeróbicas sobrevivem apenas em baixas concentrações ou
ausência total de oxigênio, realizando processo de respiração anaeróbica ou
fermentação, para obtenção de energia. Tais microrganismos realizam a
oxidação do substrato acompanhada da redução de coenzimas.
A falta de aceptor final de hidrogênio impede a completa oxidação do
substrato inicial e os produtos finais da fermentação são moléculas orgânicas
específicas à espécie bacteriana que são excretadas para o meio.
A produção de ATP não está acoplada à transferência de elétrons e fica restrita
às reações de fosforilação ao nível do substrato, garantindo um rendimento
energético menor do que o obtido pela respiração aeróbica.
Meios de Cultura - Semeadura e Crescimento Bacteriano
Meios de Cultura - Semeadura e Crescimento Bacteriano
Meios de Cultura (cultivo) são materiais nutritivos preparados em laboratório
que permitem o crescimento (aumento em quantidade) de microrganismos.
Consistem da associação qualitativa e quantitativa de substâncias que
fornecem os nutrientes necessários ao desenvolvimento (cultivo) de
microrganismos, procurando imitar o seu ambiente natural.
Algumas bactérias podem crescer normalmente em qualquer meio de cultura,
outras necessitam de meios especiais e existem aquelas que não são capazes de
crescer nos meios de cultura desenvolvidos. Quando microrganismos são
colocados em um meio de cultura para iniciar seu crescimento, são chamados
de inóculo. E, ao crescer, formam colônias (agrupamentos bacterianos) visíveis.
Para o crescimento dos microrganismos, alguns critérios devem ser observados.
O meio de culturadeverá conter todos os nutrientes necessários ao
desenvolvimento do microrganismo de interesse, além de quantidade de água
adequada, pH ajustado e quantidade específica de oxigênio, ou mesmo sua
ausência, além de ser mantido em temperatura apropriada. O meio deverá ser
estéril, ou seja, não deverá conter microrganismos vivos, no momento da
inoculação da amostra desejada; dessa forma, conterá somente os
microrganismo adicionados ao meios e sua geração.
Existem diversos meios de cultura utilizados em laboratório. A maioria destes
meios está disponível em forma comercial e contém todos os componentes
desejados, sendo necessária somente a adição de água e posterior
esterilização.
Meios Sólidos, Semi-Sólidos e Líquidos
Até cerca de 1880 os microrganismos eram mantidos em laboratório em
extratos (caldos nutritivos), até que Robert Koch e colaboradores introduziram
os meios de cultura sólidos, os quais permitiram o estudo de espécies isoladas
(culturas puras) de bactérias, separando-as de espécies contaminantes.
Quando se deseja o crescimento de bactérias em um meio sólido, um agente
solidificante denominado agar (polissacarídeo extraído de algas marinhas) é
adicionado ao meio que será posteriormente distribuído em tubos de ensaio ou
placas de Petri, e após a solidificação apresentará um aspecto semelhante a
uma gelatina.
Os meios de cultura são classificados então, quanto ao seu estado físico, em:
sólidos, quando contêm agentes solidificantes como o agar, sendo utilizados
para visualização de colônias; semi-sólidos, quando a quantidade de agar é
pequena, dando uma consistência intermediária de modo a permitir o
crescimento de microrganismos em concentrações variadas de oxigênio ou para
verificação da motilidade (presença de flagelos); e líquidos ou caldos, quando
não possuem agente solidificantes, apresentando-se de forma líquida,
utilizados para ativação (enriquecimento) das culturas, repiques de
microrganismos, entre outros.
Meio Quimicamente Definido
Os meios devem conter uma fonte de energia, bem como fontes de carbono,
nitrogênio, enxofre, fósforo e demais fatores orgânicos de crescimento que a
bactéria não é capaz de sintetizar. Um meio quimicamente definido é aquele
em que a procedênciados constituintes é conhecida e a composição química
exata é conhecida. Como o exemplo a seguir.
Meio Complexo
Muitas bactérias desenvolvem-se em meios complexos, cuja composição
química não é definida, compostos de nutrientes como extratos de levedura,
de carne, de vegetais, produtos de digestão protéica, sangue e outros. A
composição química exata pode conter pequenas variações em diferentes
culturas do produto.
Meio de Cultivo Seletivo e Diferencial
Na microbiologia clínica ou na saúde pública é freqüentemente necessária a
determinação da presença de um microrganismo específico associado com
doenças ou com baixas condições de saneamento. Para atingir esse objetivo, é
necessária a utilização de meios de cultura seletivos e diferenciais.
Os meios seletivos contêm substâncias que inibem o desenvolvimento de
determinados grupos de microrganismos, permitindo o crescimento de outros.
São elaborados com o objetivo de favorecer o crescimento da bactéria de
interesse e impedir o crescimento das outras bactérias; enquanto o meio
diferencial é aquele que contém substâncias que permitem estabelecer
diferenças entre bactérias parecidas, sendo utilizado para a fácil identificação
da colônia da bactéria de interesse quando existem outras bactérias crescendo
na mesma placa de meio de cultura.
Os microrganismos em cultura pura apresentam reações características (como
coloração da colônia) quando cultivados em tubos ou placas contendo meio
diferencial.
Fissão Binária e Crescimento Bacteriano
Oferecendo-se as condições de cultivo (nutrientes e fatores físicos) adequadas,
as bactérias poderão crescer, ou seja, aumentar em quantidade, pois o
crescimento bacteriano é considerado como aumento do número de indivíduos
e não o aumento em tamanho.
Algumas bactérias se reproduzem por brotamento, formando uma pequena
região que inicia um crescimento (broto) que ao atingir determinado tamanho,
separa-se da célula parental. Entretanto, a maioria das bactérias se reproduz
por fissão binária, ocorrendo a formação de duas células individuais a partir de
uma célula parental. Durante esse processo, há aumento no número dos
constituintes celulares, de maneira que uma bactéria se divida em duas
bactérias filhas idênticas que receberão um cromossomo completo e cópias
suficientes de todas as outras moléculas, garantindo assim sua existência como
célula independente. Em bactérias, o intervalo de tempo requerido para que
uma bactéria se divida é variável de acordo com a espécie bacteriana, fatores
ambientais e nutrientes disponíveis, sendo denominado tempo de geração. A
maioria das bactérias apresenta um tempo de geração entre 1 e 3 horas, mas
algumas bactérias podem necessitar apenas de 15 minutos e outras de 24 horas
para cada geração. O número de bactérias presentes em um meio de cultura
dobra a cada tempo de geração, e um grande número de bactérias será
produzido quando o processo de fissão binária ocorrer descontroladamente,
portanto são utilizadas escalas logarítmicas para representar graficamente o
crescimento bacteriano. Dessa maneira, se uma única bactéria sofrer fissão
binária, o aumento da população na cultura será:
Fases do Crescimento Bacteriano
O crescimento bacteriano em um meio fechado (com nutrientes controlados),
como um meio de cultura, durante um período de tempo pode ser
representado através de uma curva de crescimento bacteriano, obtida quando
se realiza a contagem da população bacteriana em intervalos de tempo após o
inóculo de um número pequeno de bactérias no meio. Existem basicamente
quatro fases de crescimento que seguem uma curva de crescimento definida e
característica. A curva de crescimento pode ser arbitrariamente dividida em
quatro fases.
● Fase Lag: Período inicial da curva de crescimento bacteriano
relacionado com pequenas variações, pois as bactérias não se reproduzem
imediatamente quando são colocadas em um novo meio de cultura. Esta fase é
considerada um período de adaptação bacteriana, e pode durar um tempo
variável. Neste período ocorre pouca ou nenhuma divisão celular. As bactérias
encontram-se em um estado de latência, mas metabolicamente muito ativas.
● Fase Log (Logarítmica ou Exponencial): A partir de um determinado
momento, as bactérias iniciam o processo de fissão binária, entrando no
período de crescimento logarítmico (dobrando em quantidade a cada tempo de
geração), em que a reprodução celular encontra-se extremamente ativa e o
tempo de geração atinge um valor máximo e constante. Esta fase termina
quando as condições do meio de cultura se alteram pela atividade metabólica
bacteriana, não provendo mais condições adequadas para manter o
crescimento constante.
● Fase Estacionária: Após a formação de um grande número de bactérias
na fase Log, a falta de nutrientes e o acúmulo de substâncias tóxicas no meio
podem cessar o crescimento de uma cultura. A velocidade de crescimento
diminui, a atividade da bactéria decresce, e o número de morte bacteriana
torna-se equivalente ao número de bactérias novas que surgem; assim, o
número de bactérias presentes por unidade de volume permanece constante
por um tempo determinado; a população torna-se estável.
● Fase de Morte Bacteriana (Declínio): Ocorre um decréscimo da
população e o número de bactérias mortas passa a exceder o número de
bactérias novas. Esta fase continua até que a população diminua
gradativamente, até que o número de bactérias da fase anterior tenha
desaparecido totalmente. A morte das bactérias depois de um período de
crescimento pode estar relacionada com a concentração dos fatores limitantes
de crescimento (falta de nutrientes e acúmulo de substâncias tóxicas).