2010-dis-tclopes

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ 
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DO MAR – LABOMAR 
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MARINHAS TROPICAIS 
 
 
 
 
 
TALLITA CRUZ LOPES TAVARES 
 
 
 
 
 
 
PROTEÍNAS DE TINTAS DE MOLUSCOS MARINHOS: 
COMPOSIÇÃO, FUNÇÃO E MECANISMO DE AÇÃO 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fortaleza – CE 
2010
 
 
TALLITA CRUZ LOPES TAVARES 
 
 
 
 
 
PROTEÍNAS DE TINTAS DE MOLUSCOS MARINHOS: 
COMPOSIÇÃO, FUNÇÃO E MECANISMO DE AÇÃO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fortaleza – CE 
2010 
Dissertação submetida à Coordenação do Curso de Pós-
graduação em Ciências Marinhas Tropicais do Instituto 
de Ciências do Mar da Universidade Federal do Ceará, 
como requisito parcial para obtenção do grau de mestre. 
Orientadora: Profª Drª Vânia Maria Maciel Melo 
 
 
AGRADECIMENTOS 
À Profª Vânia Maria Maciel Melo, por me inspirar com seu talento e com sua competência e 
dedicação sem limites e por me incentivar com sua disciplina e entusiasmo sem tamanho. Seu 
amor pela ciência é fiel e dos mais dignos que já vi. 
À Profª Helena Matthews Cascon, possuidora de grandes disposição e energia na incessante 
busca pelo saber, agradeço pela participação na minha formação como bióloga (com certeza, 
aprendi mais do que todos aqueles filos de invertebrados nas aulas de Zoo 1) e por aceitar 
participar da avaliação de minha dissertação de mestrado. 
À Profª Ilka Maria Vasconcelos, pelas colaborações concedidas e por aceitar participar da 
avaliação de minha dissertação de mestrado. 
À Vanessa Lúcia Rodrigues Nogueira, que mesmo em sua correria diária, achou tempo para me 
ajudar. Quero dizer que a considero em alta conta e que sempre estarei a seu dispor quando 
precisar. Obrigada por tudo e por sua presença em todas as fases desse trabalho. 
Aos demais professores do programa de Pós graduação em Ciências Marinhas Tropicais e do 
Departamento de Biologia, que muito contribuíram para a minha formação. Em especial, à Profª 
Ana de Fátima Fontenele Urano Carvalho, pelo exemplo que é de discernimento e pelas 
inspiradoras aulas de Fisiologia Animal. 
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa concedida. 
À grande família do LEMBIOTECH - Alysson Angelim, Bárbara Cibelle, Denise Hissa, Elis 
Alencar, Geórgia Barguil, Glauber Melo, Júlio Ximenes, Kizeane Fajardo, Laís Feitosa, Lidianne 
Leal, Lilian Pâmela, Lucas Macêdo, Luína Benevides, Natália Falcão, Raphaela Barrêto, Técia 
Carvalho, Vanessa Câmara, Vanessa Nogueira e Walderly Melgaço – muito unida e ouriçada. 
Muito obrigada pela colaboração, amizade e convivência agradável. Vocês ajudaram a tornar 
minha rotina mais leve, alegre e agradável, mesmo com todas as correrias para marcar horário 
no fluxo laminar e com todos os decibéis produzidos! Fico feliz quando olho ao meu redor e me 
vejo cercada de pessoas que, além de competentes, são tão especiais para mim. 
Agradeço também ao Sr. Valdenor, funcionário de grande dedicação, parte essencial do nosso 
laboratório. Obrigada por ser sempre prestativo e por nunca reclamar, mesmo quando, pela 
décima quinta vez, mais uma vidraria era quebrada... 
À minha família 
 
 
Aos colegas do Laboratório de Fisiologia Animal, agradeço pela convivência agradável e pela 
ajuda prestada sempre que necessária. 
Ao pessoal do Laboratório de Invertebrados (LINCE) pela convivência muitíssimo agradável. 
Aos colegas do Instituto de Ciências do Mar, especialmente Elthon Ferreira e Geórgia Barguil, 
pelo convívio agradável durante as disciplinas e aulas de campo. 
Aos meus amigos do curso de Ciências Biológicas. Dentre chegados, próximos e distantes, todos 
foram importantes no meu crescimento, seja por meio da ajuda imediatamente prestada, seja pela 
discussão acalorada... Todos são especiais de alguma forma. Espero sinceramente que 
consigamos perseverar e encontrar nosso lugar ao sol, onde quer que este esteja. 
Aos meus amigos do Colégio GEO e especiais agregados, Bruna Mendes, Carolina Gress, Diego 
Maia, Igor Vieira, Juliana Brilhante, Kassiane Costa, Romário Fernandes e Rodrigo Faria, 
agradeço por serem meu recanto de loucura e diversão, meus consultores das ciências da vida 
pública e privada e dos direitos certos e errados. Quando penso no tempo que passou e olho para 
todos nós, compreendo o porquê de amizade tão duradoura e sem arestas. 
À minha amiga Maria Lina Carvalho, pela nossa amizade “à distância sempre próxima” apesar 
do passar dos anos. Ontem compartilhávamos o sonho de brilhar nos palcos, hoje dividimos a 
luta para achar nosso lugar. Boa sorte para nós! 
A Leonardo Normando, minha contraparte fiel. Agradeço por viver comigo este complexo 
mutualismo. 
À minha família e especialmente a minha avó Marieta – uma das pessoas mais lindas que 
conheço. 
A minha mãe, Lúcia de Fátima Tavares, e a minhas irmãs Thaís Tavares e Tainan Tavares. São 
vocês que dividem seu dia a dia comigo, com tudo dando certo ou errado. Obrigada por 
respeitarem essa minha escolha de querer saber... Espero recompensá-las o mais breve possível! 
A meu pai, João Eudes Tavares, que continue olhando por mim daí de cima. Eu, aqui embaixo, 
não te esqueço um só instante. 
Ao grande Deus, sopro de Vida. Que tudo que surja de mim seja digno de Sua divina expressão. 
 
 
 
“Se podes olhar, vê. Se podes ver, repara.” 
 
José Saramago 
 
 
RESUMO 
 Nos moluscos sem concha ou naqueles em que a mesma está presente na forma 
vestigial, como cefalópodes e gastrópodes opistobrânquios, a falta dessa proteção externa 
conduziu à evolução de mecanismos de defesa dominados pela secreção ou incorporação de 
substâncias químicas bioativas. Proteínas sintetizadas de novo são bons exemplos dessas 
moléculas, tendo sido encontradas nas tintas de várias espécies de lesmas do mar, 
particularmente do gênero Aplysia. Muitas já revelaram pertencer a famílias de proteínas com 
atividade oxidásica de L-aminoácidos (LAAOs), grupo do qual fazem parte também proteínas 
bioativas encontradas nos venenos de serpentes. A caracterização, portanto, das atividades 
biológicas e do perfil bioquímico dessas proteínas é muito útil para que possamos entender 
como se dão os mecanismos defensivos desses animais e quão difundidos esses são, além de 
proporcionar subsídios para sua aplicação biomedicinal. Esse estudo visou a elucidação dos 
mecanismos de ação da dactilomelina-P, proteína antibacteriana purificada da tinta de Aplysia 
dactylomela, e a comparação da composição protéica e das atividades antimicrobianas das 
tintas liberadas por dois gastrópodes, A. dactylomela e Bursatella leachii, e por um 
cefalópode, Octopus sp.. O estudo revelou que a dactilomelina-P é uma L-aminoácido oxidase 
capaz de oxidar L-lisina e L-arginina, com maior afinidade por L-arginina, com Km de 0,22 ± 
0,16 mM/L para a L-lys e de 0,015 ± 0,01 Mm/L para a L-arg. Demonstrou também que sua 
atividade antibacteriana é mediada por esta propriedade, tendo o peróxido de hidrogênio, 
gerado na oxidação enzimática, grande participação na inibição bacteriana. A proteína se 
comporta de maneira bacteriostática quando em meio não suplementado com L-lisina e L-
arginina, sendo bactericida na presença destes. Além disso, a atividade antibacteriana mostrou 
ser dependente da concentração de aminoácidos disponibilizados para oxidação pela proteína. 
A atividade contra Staphylococcus aureus deve ocorrer por meio de mecanismos que não 
induzam danos na morfologia celular, uma vez que não foi observada qualquer alteração 
morfológica por microscopia de força atômica. Já a análise das três tintas por PAGE-SDS 
revelou a presença, em todas elas, de bandas protéicas de cerca de 60 kDa, além de bandas de 
pesos moleculares mais baixos. Por Western blot pôde-se observar a existência de identidade 
imunológica entre proteínas das três tintas, visto que anticorpos policlonais produzidos contra 
a dactilomelina-P reconheceramproteína(s) de cerca de 60 kDa na tinta de B. leachii e de 
cerca de 30 kDa na tinta de Octopus sp. Dentre as três tintas, somente a tinta de A. 
dactylomela apresentou atividades antibacteriana e antifúngica. 
 
 
Palavras chave: Aplysia dactylomela, Bursatella leachii, Octopus sp., tinta, atividade 
antimicrobiana, defesa química, LAAO. 
 
 
ABSTRACT 
On shell-less or vestigial shelled molluscs, like cephalopods and opisthobranchs, the 
absence of the shell has lead to the evolution of defense mechanisms dominated by the 
secretion or incorporation of bioactive molecules that act in the protection of those animals. 
De novo synthesized proteins are excellent exemplars of these molecules, and are encountered 
on the ink of several sea hare species, particularly on the genus Aplysia. Many of those 
proteins belong to the L-amino acid oxidizers family of proteins, similarly to some well 
studied proteins found on snake venoms. In the sense of understanding the functionality and 
irradiation of these proteins on the defenses mechanisms is very important the description of 
their biological activities and biochemical profiles, providing also subsidies for biomedical 
applications. This study aimed the elucidation of its mechanisms of action and the comparison 
of the protein composition and the antimicrobial activity of the inks released by two 
gastropods, A. dactylomela and Bursatella leachii, and by a cephalopod, Octopus sp.. The 
study revealed that dactylomelin-P is an L-amino acid oxidase able of oxidizing L-lysine and 
L-arginine, with greater affinity to L-arginine, with Km of 0,22 ± 0,16 mM/L for L-lys and 
0,015 ± 0,01 Mm/L for L-arg. It demonstrated also that its antibacterial activity is mediated 
by the hydrogen peroxide generated in the enzymatic oxidation. The protein can be both 
bacteriostatic, when in a L-lysine and L-arginine non-supplemented medium, or bactericide in 
the presence of such amino acids. Moreover, the antibacterial activity showed being 
dependent on the amino acid concentration. The activity against Staphylococcus aureus must 
occur by some mechanisms that not induce cell morphological injuries as no morphological 
alteration have been observed by atomic force microscopy. The analysis of the three inks by 
SDS-PAGE revealed the presence on all inks of protein bands of c.a. 60 kDa, along with 
bands of lower molecular weight. By Western blot the existence of immunological identity 
between proteins of all inks could be observed, as polyclonal antibodies produced against 
dactylomelin-P recognized proteins of about 60 kDa on B. leachii ink and of c.a. 30 kDa on 
Octopus sp. ink. However, only the ink of A. dactylomela exhibited antibacterial and 
antifungal activities. 
Keywords: Aplysia dactylomela, Bursatella leachii, Octopus sp., ink, antimicrobial activity, 
chemical defense, LAAO 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
FIGURA 1 – Lesmas do mar. A. A. californica; B. Bursatella leachii; C. Dolabella 
auricularia; D. Aplysia brasiliana; E. Aplysia kurodai; F. Aplysia punctata 
(http://www.seaslugforum.net/, acessado em 8 de janeiro de 2010). ............................... 19 
FIGURA 2 - Fotografias de Aplysia dactylomela. A. Liberação da tinta púrpura 
(http://www.seaslugforum.net/); B. Aspecto morfológico geral (fotografia de Tallita 
Tavares). ........................................................................................................................... 28 
FIGURA 3– Atividade L-aminoácido oxidásica das tintas de A. dactylomela, B. leachii e do 
polvo Octopus sp. e do extrato da desova e da glândula opalina de A. dactylomela. O 
controle negativo consistiu da mistura reacional não acrescida da fonte de L-aminoácido 
oxidase testada. Os valores representam médias de três experimentos independentes. Os 
asteriscos indicam que a diferença entre os valores indicados não é significativa (� > 
0,05). ................................................................................................................................. 47 
FIGURA 4 – PAGE-tricina-SDS das tintas de A. dactylomela, B. leachii e Octopus sp. e da 
dactilomelina-P. Legenda: MM – marcador molecular; AL – tinta de A. dactylomela 
liofilizada; BL – tinta de B. leachii liofilizada; D – dactilomelina-P; P – tinta bruta de 
Octopus sp.. O marcador de massa molecular consistiu de fosforilase B (97,4 kDa), 
albumina sérica bovina (66,2 kDa), aldolase (39,2 kDa), triose fosfato isomerase (26,6 
kDa), inibidor de tripsina (21,5 kDa) e lisozima (14,4 kDa). Concentração de 
proteínas/poço: gel 1 – 10 µgP/poço (AL), 10 µgP/poço (BL), 30 µgP/poço (P), 10 
µgP/poço (D). As setas indicam as regiões de cerca de 60 e de 30 kDa. ......................... 48 
FIGURA 5 – Western blot das tintas das lesmas A. dactylomela e B. leachii e do polvo 
Octopus sp. Legenda: A – tinta de A. dactylomela; B – tinta de B. leachii; D – 
dactilomelina-P; P – tinta de Octopus sp.. As setas indicam as regiões de cerca de 60 e de 
30 kDa que reagiram com o anticorpo anti-dactilomelina-P. ........................................... 48 
FIGURA 6 – Atividade antifúngica das tintas contra o fungo filamentoso Mucor sp. 
Legenda: A – tinta de A. dactylomela; B – tinta de B. leachii; P – tinta de Octopus sp.; D 
– dactilomelina-P. ............................................................................................................. 49 
 
 
FIGURA 7 - Efeito antibacteriano da dactilomelina-P em meio suplementado com L-
aminoácidos após 24 horas de incubação a 37° C. Legenda: cont+ - controle positivo, 
prot+lys - proteína (100 µg/mL) acrescida de L-lys (100 mM), prot+arg - proteína (100 
µg/mL) acrescida de L-arg (100 mM), prot - proteína (100 µg/mL). Os valores 
representam médias de três experimentos independentes. O controle positivo consistiu do 
crescimento da cultura em caldo LB sem a adição de dactilomelina-P e/ou aminoácidos. 
Os asteriscos indicam que a diferença entre os valores indicados não é significativa 
(� >0,05). .......................................................................................................................... 52 
FIGURA 8 – Curva de crescimento de S. aureus ATCC 25923 obtida a partir de sua 
absorbância a 620nm sob diferentes condições, evidenciando a inibição do crescimento 
quando da incubação da bactéria com a dactilomelina-P na presença ou ausência dos 
aminoácidos L-lisina e L-arginina. (♦) Controle positivo; (■) grupo adicionado de 
dactilomelina-P após 10 h de crescimento; (▲) grupo adicionado de dactilomelina-P e L-
lisina após 10 h; (○) grupo adicionado de dactilomelina-P e L- arginina após 10 h; (●) 
controle negativo (caldo LB). O controle positivo consistiu do crescimento da cultura em 
caldo LB sem a adição de dactilomelina-P e/ou aminoácidos. A seta indica o momento 
em que foram adicionados os tratamentos testados, após a cultura ter atingido a fase 
exponencial de crescimento. ............................................................................................. 52 
FIGURA 9 – Curva de crescimento da bactéria S. aureus ATCC 25923 crescida em meios 
acrescidos ou não da dactilomelina-P e dos aminoácidos L-lisina e L-arginina, 
evidenciando os efeitos bacteriostáticos e bactericidas da dactilomelina-P. (♦) controle 
positivo; (○) grupo adicionado de dactilomelina-P e L-lisina após 10 h de crescimento; 
(▲) grupo adicionado de dactilomelina-P e L-arginina após 10 h; (x) grupo adicionado 
somente de dactilomelina-P após 10 h. O controle positivo consistiu do crescimento da 
cultura em caldo LB sem a adição de dactilomelina-P e/ou aminoácidos. A seta indica o 
momento em que foram adicionados os tratamentos testados, após a cultura ter atingido a 
fase exponencial de crescimento. ..................................................................................... 53 
FIGURA 10 – Efeito concentração-dependente dos aminoácidos L-lisina e L-arginina na 
atividade antibacteriana da dactilomelina-P. Osvalores representam médias de três 
experimentos independentes. Legenda: cont+ - controle positivo, prot+lys - proteína (100 
µg/mL) acrescida de L-lys (100 mM), prot+arg - proteína (100 µg/mL) acrescida de L-
arg (100 mM). ................................................................................................................... 53 
 
 
FIGURA 11 – Efeito da peroxidase na atividade antibacteriana da dactilomelina-P. Legenda: 
p – proteína (100 µg/mL), p+px – proteína e peroxidase (100 µg/mL, ambas), aa – L-lys 
e L-arg (100 mM), cont+ - controle positivo. O controle positivo consistiu do 
crescimento da cultura somente em caldo LB tratado com dactilomelina-P e peroxidase. 
Os valores representam médias de três experimentos independentes. Os asteriscos 
indicam que a diferença entre os valores indicados não é significativa (� >0,05). .......... 54 
FIGURA 12 – Aspecto morfológico das colônias de S. aureus verificado por microscopia de 
força atômica (AFM) (A) Controle positivo, em destaque o diâmetro celular de 947,04 
nm. (B) Grupo tratado com dactilomelina-P e L-lisina, diâmetro celular de 1,035 µm. .. 54 
FIGURA 13 - Atividade L-aminoácido oxidásica da dactilomelina-P. O controle negativo 
consistiu da mistura reacional não acrescida da potencial L-aminoácido oxidase, 
dactilomelina-P. Os valores representam médias de três experimentos independentes. .. 55 
 
 
 
LISTA DE TABELAS 
TABELA 1 – Caracterização bioquímica e atividades biológicas das proteínas isoladas de 
lesmas do mar (NOGUEIRA et al., 2010)........................................................................ 32 
TABELA 2 – Concentração de proteínas das tintas pelo método de Bradford (1976)............ 46 
TABELA 3 – Atividades antimicrobianas das tintas. .............................................................. 49 
 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS 
AFM – Microscopia de Força Atômica (do inglês Atomic Force Microscopy) 
ATCC – American Type Culture Collection 
ATGE – Ágar Triptona, Glucose e Extrato de Levedura 
BSA – Albumina Sérica Bovina (do inglês Bovine Serum Albumin) 
Km – Constante de Michaelis-Menten 
Caldo LB – Caldo Luria Bertani 
NBT/BCIP – 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato p-toluidina / Cloreto de 4-nitro-azul de 
tetrazólio (do inglês (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyphosphate p-Toluidine / Nitro-Blue 
Tetrazolium Chloride) 
PAGE-SDS – Eletroforese em Gel de Poliacrilamida na presença de SDS 
SDS – Dodecil Sulfato de Sódio (do inglês Sodium Dodecyl Sulphate) 
ufc – Unidades Formadoras de Colônia 
 
 
SUMÁRIO 
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 17 
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................. 18 
2.1. LESMAS DO MAR E O ESTUDO DA ECOLOGIA QUÍMICA ....................................... 18 
2.2. A TINTA PÚRPURA ............................................................................................... 19 
2.3. A DEFESA QUÍMICA EM MOLUSCOS ..................................................................... 22 
2.4. APLYSIA DACTYLOMELA ........................................................................................ 27 
2.5. PROTEÍNAS DE LESMAS DO MAR .......................................................................... 29 
2.6. L-AMINOÁCIDO OXIDASES ................................................................................... 33 
2.7. A DACTILOMELINA -P .......................................................................................... 34 
2.8. RELEVÂNCIA ....................................................................................................... 35 
3. OBJETIVOS .......................................................................................................... 37 
3.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................................... 37 
4. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................. 38 
4.1. COLETA DOS MATERIAIS BIOLÓGICOS ................................................................. 38 
4.2. PURIFICAÇÃO DA DACTILOMELINA -P .................................................................. 38 
4.3. COMPOSIÇÃO E FUNÇÃO DAS PROTEÍNAS DAS TINTAS DE A. DACTYLOMELA, B. 
LEACHII E OCTOPUS SP. ...................................................................................................................... 39 
4.3.1. Tratamento das tintas .................................................................................. 39 
4.3.2. Determinação da concentração de proteínas ............................................. 39 
4.3.3. Atividade L-aminoácido oxidásica .............................................................. 39 
4.3.4. Caracterização das tintas por PAGE-SDS .................................................. 40 
 
 
4.3.5. Semelhança entre proteínas relacionadas à dactilomelina-P nas tintas ... 40 
4.3.5.1. Produção de anticorpos policlonais e determinação dos títulos ............. 40 
4.3.5.2. Western blot............................................................................................ 41 
4.3.6. Atividade Antimicrobiana ........................................................................... 41 
4.4. DETERMINAÇÃO DO MECANISMO DE AÇÃO ANTIBACTERIANA DA 
DACTILOMELINA -P ................................................................................................................ 42 
4.4.1. Atividade antibacteriana em meio suplementado com L-aminoácidos ..... 42 
4.4.2. Microscopia de força atômica (AFM)......................................................... 44 
4.4.3. Atividade L-aminoácido oxidásica da dactilomelina-P .............................. 44 
5. RESULTADOS ........................................................................................... 46 
5.1. COMPOSIÇÃO E FUNÇÃO DAS PROTEÍNAS DAS TINTAS DE A. DACTYLOMELA, 
B. LEACHII E OCTOPUS SP. ...................................................................................................... 46 
5.1.1. Determinação da concentração de proteínas ............................................. 46 
5.1.2. Atividade L-aminoácido oxidásica das tintas ............................................. 46 
5.1.3. Caracterização das tintas por PAGE-SDS .................................................. 47 
5.1.4. Atividade Antimicrobiana ........................................................................... 49 
5.2. DETERMINAÇÃO DO MECANISMO DE AÇÃO ANTIBACTERIANA DA 
DACTILOMELINA -P ................................................................................................................ 50 
5.2.1. Atividade antibacteriana em meio suplementado com L-aminoácidos ..... 50 
5.2.2. Microscopia de força atômica (AFM)......................................................... 54 
5.2.3. Atividade L-aminoácido oxidásica da dactilomelina-P .............................. 55 
6. DISCUSSÃO ............................................................................................... 56 
 
 
7. CONCLUSÕES .......................................................................................... 63 
8. REFERÊNCIAS ......................................................................................... 64 
17 
TAVARES, T. C. L. – Proteínas de tintas de moluscos marinhos... 
1. INTRODUÇÃO 
Apesar dos esforços de caracterização das atividades biológicas de proteínas 
presentes em secreções e tecidos de lesmas do mar, pouco se sabe a respeito de seu papel 
ecológico-evolutivo para os organismos possuidores ou mesmo sobre seu modo de ação. Que 
semelhanças possuem essas proteínas que as permitiram continuar existindo em meio a 
pressões ecológicas tão duras como as existentes em ambientes intertidais e em animais a 
quem falta a defesa mecânica da concha? Perguntas desse tipo ainda permanecem sem 
respostas completas, mas alguns passosjá foram dados nessa direção. 
Os animais se utilizam de uma gama de defesas contra predadores e patógenos, 
dentre essas, as defesas químicas. Muitos desses são moluscos, incluindo lesmas do mar, 
polvos e sépias, os quais exibem um interessante comportamento de liberação de tinta quando 
atacados. Esse comportamento e as secreções liberadas, mesmo não refletindo homologias, 
têm grande importância na sobrevivência desses animais. 
Muitas das principais proteínas encontradas em fluidos, secreções e partes do 
corpo de lesmas do mar já tiveram suas seqüências de aminoácidos e, em alguns casos, os 
genes responsáveis pela sua expressão elucidados. Além desses, outros estudos revelam a 
natureza dessas proteínas, ajudando na elucidação de seus mecanismos de ação, tanto para o 
proveito biotecnológico dessas moléculas como para o clareamento dos possíveis efeitos que 
exercem sobre os outros componentes da comunidade intertidal. 
Dessa forma, a comparação de como atuam na sua defesa e dos componentes 
envolvidos nesses mecanismos é de grande utilidade para determinar se animais de linhagens 
diferentes, com mecanismos de proteção semelhantes, possuem moléculas com perfis também 
próximos. A realização desses estudos e a tentativa de resolução dos questionamentos acima 
propostos para a espécie Aplysia dactylomela é, portanto, muito importante, estando também 
bem localizada em um contexto internacional já que, no mundo, as pesquisas com proteínas 
de lesmas do mar são pontuadas e pouco difundidas. 
 
18 
TAVARES, T. C. L. – Proteínas de tintas de moluscos marinhos... 
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 
2.1. Lesmas do mar e o estudo da Ecologia Química 
Lesmas do mar são moluscos marinhos bentônicos pertencentes à classe Gastropoda, 
subclasse Opisthobranchia, ordem Anaspidae, família Aplysiidae. Essa família possui nove 
gêneros com 80 espécies atualmente conhecidas, tendo distribuição mundial, principalmente 
sobre regiões intertidais e subtidais (CAREFOOT, 1987). Essas lesmas possuem somente 
conchas vestigiais em sua cavidade do manto, expondo seu corpo mole para o meio ambiente 
(Figura 1). Apesar disso, possuem poucos predadores, fato que vem atraindo o interesse de 
muitos pesquisadores ao redor do mundo há muito tempo. Até hoje, muitos compostos 
bioativos foram isolados de várias secreções e tecidos de lesmas do mar, principalmente de 
sua glândula digestiva. São compostos lipofílicos e de baixo peso molecular derivados de sua 
dieta algal, possivelmente relacionados à defesa química desses animais contra predadores e 
microorganismos patogênicos. Além desses, essas lesmas também possuem potentes proteínas 
citotóxicas em vários tecidos e secreções (TAKAMATSU et al., 1995). Esses compostos 
possivelmente fazem parte da mais antiga forma de comunicação existente no planeta: a 
comunicação química. 
A comunicação química tem papel central na história evolucionária de vários táxons, se 
apresentando como moléculas que contêm informações, como biorreguladores, receptores, 
transdutores, efetores e mensageiros secundários – todos universalmente presentes (STOKA, 
1999). 
O uso da perspectiva filogenética para reconstruir a história evolucionária se tornou de 
grande importância e proporciona soluções para questões básicas na área da comunicação 
química já que os biorreguladores, as células secretoras e os tecidos-alvos não deixam 
registros fósseis. Assim, podemos explorar essa importante área através do estudo 
comparativo dos organismos vivos atuais, pois as células de hoje guardam informações 
importantes acerca de seu passado na forma de seqüências de aminoácidos nas proteínas ou 
mesmo na composição dos ácidos nucléicos (DNA e RNA) (STOKA, 1999). O entendimento, 
portanto, dos princípios básicos e das variações dos mecanismos de defesa química requer 
uma abordagem comparativa e uma perspectiva evolucionária, considerando a diversidade de 
animais relacionados filogeneticamente e fenotipicamente em relação a determinadas 
características das defesas químicas (DERBY, 2007). 
TAVARES, T. C. L. – Proteínas d
Segundo Derby (2007), esse tipo de investigação, assim como os estudos de ecologia 
química em geral, são particularmente fáceis de serem realizados em lesmas do mar, pois elas, 
como animais de regiões inter e submareais, são bem acessíveis para coleta ou estudos no 
campo. Uma espécie de lesma do mar 
criada e vendida comercialmente nos Estados Unidos, estando disponível em vários estágios 
de crescimento durante todo o ano
http://aplysia.miami.edu. Acessado em 14
 
Figura 1 – Lesmas do mar. 
D. Aplysia brasiliana
(http://www.seaslugforum.net/
2.2. A tinta púrpura 
A maioria das lesmas do mar (especialmente 
gêneros da família, como Dolabella
tinta especial em uma glândula na cavidade do manto 
característica muito distintiva desses animais.
aplisioviolina, um éster de coloração violeta derivado da ficoeritrobi
juntamente com as algas ve
PENNINGS; DANKO, 1999)
Os componentes algais são muito importantes para a formação da tinta, tendo sido 
demonstrado que quando as algas vermelhas são ex
Proteínas de tintas de moluscos marinhos... 
Segundo Derby (2007), esse tipo de investigação, assim como os estudos de ecologia 
química em geral, são particularmente fáceis de serem realizados em lesmas do mar, pois elas, 
ões inter e submareais, são bem acessíveis para coleta ou estudos no 
campo. Uma espécie de lesma do mar – Aplysia californica Cooper 1863
criada e vendida comercialmente nos Estados Unidos, estando disponível em vários estágios 
de crescimento durante todo o ano (National Source for Aplysia –
. Acessado em 14 de dezembro de 2009). 
. A. A. californica; B. Bursatella leachii; C. Dolabella auricularia
brasiliana; E. Aplysia kurodai; F. 
http://www.seaslugforum.net/, acessado em 8 de janeiro de 2010). 
A maioria das lesmas do mar (especialmente Aplysia Linnaeus 1767
Dolabella Lamarck 1801 e Stylocheilus Gould 1852
tinta especial em uma glândula na cavidade do manto – a glândula de tinta 
característica muito distintiva desses animais. O componente orgânico principal da tinta é a 
aplisioviolina, um éster de coloração violeta derivado da ficoeritrobilina 
juntamente com as algas vermelhas das quais as lesmas se alimentam
, 1999). 
Os componentes algais são muito importantes para a formação da tinta, tendo sido 
que quando as algas vermelhas são excluídas de sua dieta, as lesmas deixam de 
19 
Segundo Derby (2007), esse tipo de investigação, assim como os estudos de ecologia 
química em geral, são particularmente fáceis de serem realizados em lesmas do mar, pois elas, 
ões inter e submareais, são bem acessíveis para coleta ou estudos no 
Cooper 1863 – é até mesmo 
criada e vendida comercialmente nos Estados Unidos, estando disponível em vários estágios 
– endereço eletrônico: 
Dolabella auricularia; 
Aplysia punctata 
Linnaeus 1767, mas também outros 
Gould 1852) produz uma 
a glândula de tinta – uma 
O componente orgânico principal da tinta é a 
lina – pigmento ingerido 
se alimentam (CAREFOOT; 
Os componentes algais são muito importantes para a formação da tinta, tendo sido 
eta, as lesmas deixam de 
20 
TAVARES, T. C. L. – Proteínas de tintas de moluscos marinhos... 
produzi-la. Em A. californica a tinta consiste, basicamente, de água e algumas substâncias 
voláteis, com menos de 2% de substâncias orgânicas e 5% de minerais (COELHO; PRINCE; 
NOLEN, 1998). Bezerra e colaboradores (2004) relatam que a tinta da espécie Aplysia 
dactylomela Rang 1828 é composta de 99,5% de água, sendo sua massa seca composta de 
mais de 60% de proteínas, e o restante de carboidratos, lipídios e cinzas. Essa composição da 
tinta mostrou ser independente da dieta visto que animais oriundos de locais onde consumiam 
algas verdes em maior abundância apresentaram tinta semelhante à obtida de animais 
consumidores majoritariamente de algas vermelhas. Isso ocorre porque mesmo quantidades 
mínimasde algas vermelhas podem levar a produção de tinta. Em laboratório, a tinta só não 
foi produzida quando os animais foram totalmente privados da ingestão de algas vermelhas 
(BEZERRA et al., 2004). 
Com relação à composição de aminoácidos presentes na tinta, Bezerra e colaboradores 
(2004) encontraram altos níveis de aminoácidos ácidos, principalmente ácido aspártico e 
ácido glutâmico, e baixas quantidades de aminoácidos sulfurados. Esses dados são bem 
interessantes, pois a análise da composição de aminoácidos da dactilomelina-P, principal 
proteína presente na tinta liberada por A. dactylomela, mostra igualmente uma predominância 
dos aminoácidos ácidos, além de prolina, serina e tirosina. Outro aminoácido abundante na 
proteína é a metionina. Trata-se de um aminoácido sulfurado que, juntamente com a cisteína, 
são essenciais para a estrutura secundária da proteína (NOGUEIRA, 2005). 
Derby et al. (2007), estudando a composição química de diversas secreções de defesa de 
nove moluscos marinhos, dentre eles A. dactylomela e A. californica também encontrou altos 
níveis dos aminoácidos ácido glutâmico e ácido aspártico. Os autores sugerem que esses 
aminoácidos livres encontrados nas tintas atuam na defesa química dessas lesmas por meio de 
impedimento químico do ato alimentar, disrupção sensorial ou fagomímica – todos esses 
mecanismos resultando na interrupção do ato predatório. 
Segundo Carew e Kandel (1977), a liberação da tinta tem um limiar de excitação muito 
alto, com uma típica resposta de “tudo ou nada”, ou seja, a tinta somente será liberada após 
um limiar excitatório mínimo ser alcançado. Em laboratório a liberação da tinta é comum, 
podendo ser causada por manuseio inadequado ou grosseiro e pela separação de indivíduos 
copulando, por exemplo. Já no campo, foi Willan (1979) quem primeiro relatou a liberação de 
tinta por A. dactylomela, quando esta estava sob o ataque da estrela-do-mar Coscinasterias 
calamaria Gray 1840 (CAREFOOT; PENNINGS; DANKO, 1999). 
Muitas hipóteses foram propostas para a função da tinta para Aplysia e outras lesmas 
relacionadas, desde quando pouco se sabia acerca da composição da tinta até hoje: 
21 
TAVARES, T. C. L. – Proteínas de tintas de moluscos marinhos... 
 
• Eliminação de pigmentos indesejáveis da dieta (CHAPMAN; FOX, 1967); 
• Formação de uma cortina de fumaça, protegendo visualmente o animal de 
predadores (CAREW; KANDEL, 1977); 
• Advertência aos predadores da presença de compostos tóxicos (AMBROSE et al., 
1979); 
• Ação de sinal de alarme intraespecífico (GILLY, LUCERO, 1992); 
• Presença de compostos impalatáveis, proporcionando gosto ruim às lesmas 
(PENNINGS, 1994); 
• Irritação quimicossensorial (CAREFOOT; PENNINGS; DANKO, 1999); 
• Ação anti predatória por fagomímica ou disrupção sensorial (KICKLIGHTER et 
al., 2005); 
• Ações antipredatórias múltiplas contra diferentes predadores juntamente com a 
secreção opalina (KICKLIGHTER; DERBY, 2006); 
 
Assim, é proposto que as tintas de lesmas do mar atuem por meio de efeitos químicos e 
visuais. Por um lado, em analogia com o comportamento de liberação da tinta por 
cefalópodes, a tinta deve agir como um “mímico visual” ou mesmo um distrator contra 
predadores, dando às lesmas uma oportunidade de fuga enquanto o predador enfoca 
visualmente na tinta. O problema desta hipótese é que, diferentemente da maioria dos 
cefalópodes, as lesmas movem-se lentamente. Assim, o efeito puramente visual parece ter 
pouca finalidade para esses moluscos, sendo acoplado a mecanismos químicos, para os quais 
não faltam evidências de comprovação (DERBY, 2007). 
Mesmo para os cefalópodes, rápidos em sua fuga, efeitos meramente visuais parecem não 
ser suficientes. MacGinitie e MacGinitie (1968) sugeriram que a real ação da tinta do polvo 
Octopus sp. seria a de anestesiar as habilidades quimicossensoriais de peixes predadores, um 
claro exemplo do uso de estratégias químicas. Entretanto, estudos sobre a tinta de cefalópodes 
ocorreram enfocando basicamente a busca por novas drogas, tendo sido relatada sua 
toxicidade contra microorganismos, retrovírus e linhagens celulares cancerosas. Dentre os 
compostos estudados, a tirosinase, presente na tinta de lulas e sépias, parece ser a responsável 
por suas propriedades tóxicas (DERBY, 2007). Uma tirosinase presente na tinta de Sepia 
officinalis Linnaeus 1758, por exemplo, mostrou ser tóxica a várias linhagens celulares, 
atuando provavelmente por indução de apoptose (RUSSO et al., 2003). 
22 
TAVARES, T. C. L. – Proteínas de tintas de moluscos marinhos... 
Cefalópodes são famosos por suas defesas já que possuem fuga rápida, mudam sua 
coloração de críptica a aversiva rapidamente, realizam a autotomia de braços e possuem 
secreções venenosas em seu bico, além de liberarem a tinta. Particularmente suas tintas são 
secreções químicas produzidas e liberadas do saco de tinta, estrutura oriunda da modificação 
de outro órgão - a glândula hipobranquial (DERBY, 2007). 
2.3. A defesa química em moluscos 
Existem muitos exemplos de como a tinta e outras secreções são usadas para a proteção 
contra a predação dentre os moluscos, muitos desses apreciados como comida por alguns dos 
maiores predadores do mar, como peixes, crustáceos, estrelas do mar e anêmonas. Em 
contrapartida, de sua parte na corrida evolucionária, os moluscos adotaram uma gama 
impressionante de estratégias de defesa para evitarem ser detectados ou capturados. Nesse 
sistema, em geral, alguns são protegidos por conchas; outros, não. Esses últimos 
desenvolveram defesas químicas muito efetivas, objetos de estudo da ecologia química, da 
neuroecologia e da química de produtos naturais (DERBY, 2007). 
A concha tem um papel muito importante para os moluscos conchíferos (portadores de 
conchas), já que é dentro dela que eles se retraem, protegendo-se tanto de predadores como da 
dessecação durante o período de maré baixa (MARIN et al., 1999). Contrariamente, moluscos 
com conchas vestigiais ou mesmo sem conchas se encontram, aparentemente, menos 
protegidos, sendo, possivelmente, menos resistentes às pressões de predação existentes na 
natureza. 
Dentre os opistobrânquios, a presença de uma concha externa é um estado plesiomórfico 
ou primitivo, sendo sua internalização visível na maioria dos componentes da família 
Aplisiidae. Nesse caso, tanto a internalização como a redução ou perda da concha representam 
processos evolucionários graduais e aparentemente únicos (KLUSSMAN-KOLB, 2004), 
tratando-se de uma das maiores tendências evolucionárias dentre os opistobrânquios. Foi este 
processo que permitiu que muitas partes do corpo, como a cabeça, o pé ou o manto, se 
tornassem mais elaboradas. Tal redução e posterior perda da proteção física externa foram 
acompanhadas da evolução de outras estratégias de defesa, como a aquisição de glândulas 
repugnatórias e de colorações aposemáticas (GRANDE et al., 2004). 
O estudo da perda ou da manutenção da concha isoladamente, contudo, pode levar ao 
estabelecimento de muitas homoplasias, resultantes de convergência evolutiva, que podem 
23 
TAVARES, T. C. L. – Proteínas de tintas de moluscos marinhos... 
dificultar ou levar a erros no entendimento das relações filogenéticas entre esses moluscos. 
Muitos caracteres foram reduzidos ou perdidos durante a evolução desses grupos, como a 
concha, o opérculo, o ctenídio, a rádula e os dentes ou as placas da moela. Assim, se faz 
necessária a utilização de outras características como evidências na elucidação das relações 
filogenéticas entre os opistobrânquios. Nesse sentido, a utilização de marcadores moleculares, 
como regiões-chave do DNA mitocondrial e ribossomal ou compostos orgânicos conservados, 
pode ter um papel acessório muito importante nesse tipo de estudo (MARIN et al., 1999; 
MEDINA, WALSH, 2000). 
Os gastrópodes são relativamente bem estudados em termos de suas defesas químicas. O 
muco de muitas espécies é ricoem compostos impalatáveis e inibidores que podem deter 
ataques predatórios de muitas naturezas. Muitos desses compostos são derivados da dieta; 
outros são sintetizados de novo pelo próprio animal – uma condição provavelmente mais 
derivada evolutivamente (WÄGELE, KLUSSMAN-KOLB, 2005). 
Também o sistema imune proporciona proteção contra uma variedade de patógenos. Um 
componente da imunidade, a imunidade inata, é filogeneticamente antiga e é amplamente 
encontrado em plantas e animais. Esta confere proteção ampla contra patógenos, sendo parte 
essencial do sistema de proteção da maioria dos organismos multicelulares contra infecções 
(FROY, GUREVITZ, 2003). 
Contudo, é de conhecimento geral que existem diferenças entre as defesas de vertebrados 
e invertebrados, a principal sendo a presença de mecanismos dependentes de anticorpos nos 
vertebrados, e sua ausência nos invertebrados. A imunidade dependente de anticorpos é de 
grande importância para o reconhecimento ou rejeição do que é próprio ou do que não é 
próprio do organismo. Dessa forma, é esperado que invertebrados possuam um mecanismo 
alternativo para esta importante função. Em invertebrados, muitas lectinas e proteínas 
antibacterianas e antifúngicas encontradas são tidas como responsáveis pelas funções de 
reconhecimento e rejeição na defesa desses animais (IIJIMA, KISUGI, YAMAZAKI, 1995). 
Algumas proteínas que parecem desempenhar tais funções foram descritas para lesmas do 
mar. Em A. kurodai, proteínas com atividades antibacterianas, antifúngicas e antineoplásicas 
(KAMIYA; MURAMOTO; YAMAZAKI, 1986; YAMAZAKI et al., 1990; KISUGI et al., 
1992) foram relacionadas à defesa dessas lesmas, já que fatores contra organismos 
infecciosos, assim como fatores com propriedades antiproliferativas, são essenciais em 
qualquer fase da vida de um organismo. 
Nas últimas décadas, várias moléculas foram investigadas bioquimicamente, tendo sido 
avaliadas quanto a suas atividades biológicas e/ou estruturas moleculares e unidades 
24 
TAVARES, T. C. L. – Proteínas de tintas de moluscos marinhos... 
constituintes. Esses recentes avanços tornaram possíveis várias discussões acerca da evolução 
e filogenia dessas moléculas em nível molecular, assim como a comparação com moléculas 
originadas em vertebrados. 
No tocante à defesa química, muitos animais, especialmente invertebrados, secretam 
produtos secundários de plantas, algas e animais ingeridos ou compostos de fabricação 
própria como uma defesa contra patógenos e predadores, a qual pode ocorrer de forma passiva 
ou ativa. 
Nas espécies que acumulam compostos secundários não palatáveis oriundos de sua dieta, 
os distribuindo ao longo do corpo, pode ser observada a defesa química passiva. Esta não se 
limita, contudo, ao muco e à pele, pois alguns gastrópodes possuem compostos inibitórios em 
suas massas de ovos e cápsulas de modo a prevenir sua ingestão por outros animais. 
Dentre os compostos produzidos pelos próprios organismos como parte de sua defesa 
ativa, podem ser destacadas moléculas com funções antimicrobianas que impedem a infecção 
da desova por patógenos. Enzimas oxidativas presentes na glândula de albúmen e na massa de 
ovos da lesma Aplysia kurodai Baba 1937 são bons exemplos desses antimicrobianos. Outros 
organismos podem ainda utilizarem-se desses compostos numa defesa química tão efetiva 
que, como resultado, podem chegar a alocar somente pequena parcela de sua energia para se 
esconderem, se utilizando de colorações aposemáticas como advertência para seus 
mecanismos de defesa (COELHO; PRINCE; NOLEN, 1998). Algumas glândulas presentes na 
superfície da pele de alguns moluscos liberam ácido sulfúrico em resposta a perturbações, 
tendo efeitos inibitórios diretos sobre predadores e atuando também como parte de uma alça 
de retro-alimentação positiva que reforça o comportamento aversivo ou outros tipos de 
defesas (DERBY, 2007). 
As lesmas do mar do gênero Aplysia, particularmente, possuem um arsenal químico muito 
rico. Como resultado, a exemplo de outras espécies quimicamente defendidas, possuem 
poucos predadores. Na defesa passiva, compostos halogenados encontrados em algas 
vermelhas, mas não em verdes, se acumulam na pele e em alguns órgãos das lesmas, 
tornando-as impalatáveis para peixes e outros predadores (PENNINGS; NASTISCH, PAUL, 
1990). Complementando a defesa passiva, a defesa ativa age através da secreção da tinta 
púrpura e da secreção opalina, secreções complexas capazes de gerar subprodutos ricos em 
mecanismos de ação variados contra uma gama de predadores (KICKLIGHTER et al., 2007; 
DERBY, 2007). 
Das 37 espécies descritas para o gênero Aplysia, por exemplo, 30 liberam a tinta quando 
importunadas ou ameaçadas (NOLEN et al., 1995). A tinta é liberada, muitas vezes, 
25 
TAVARES, T. C. L. – Proteínas de tintas de moluscos marinhos... 
juntamente com outra secreção produzida pela glândula opalina, de aparência leitosa, que se 
torna altamente viscosa em contato com a água. Quando simultaneamente liberadas, essas 
secreções se misturam na cavidade do manto, sendo então expelidas por um sifão na direção 
da origem do ataque (KICKLIGHTER et al., 2005). É importante ressaltar que, embora a tinta 
seja constituída principalmente de ficoeritrobilina, ela também contém algumas proteínas de 
alta massa molecular associadas à ficoeritrina (MACCOLL et al., 1990). Durante o 
processamento do pigmento ficoeritrina, derivado de algas vermelhas da dieta do animal, 
células especializadas na glândula digestiva fagocitam os cloroplastos das algas vermelhas 
(rodoplastos) e os digerem, liberando o pigmento. Seu cromóforo é, então, separado de seus 
componentes protéicos, e os pigmentos modificados seguem pela hemolinfa, circulando por 
todo o corpo do animal até a glândula de tinta, onde são armazenados em células 
especializadas. Quando do estímulo, são liberados juntamente com os demais componentes da 
tinta (COELHO; PRINCE; NOLEN, 1998). 
Ao contrário dos pigmentos, as proteínas presentes na tinta não são derivadas das algas 
(MACCOLL et al., 1990; BEZERRA et al., 2004), sendo o modo de ligação dessas proteínas 
ao pigmento ou mesmo sua importância para a sobrevivência do animal pontos pouco 
conhecidos (COELHO; PRINCE; NOLEN, 1998). Bezerra et al. (2004) observaram a 
inexistência de reações imunológicas entre extratos de algas comumente ingeridas pela 
espécie A. dactylomela e o anticorpo policlonal produzido contra a tinta bruta, demonstrando 
que as proteínas presentes na tinta não são oriundas da dieta do animal. Essas proteínas são 
provavelmente sintetizadas de novo, evidenciando possivelmente a inexistência de variações 
geográficas relacionadas a sua dieta na defesa química desses moluscos (MARIN et al., 
1999). Nogueira (2005) demonstrou que a dactilomelina-P, principal proteína presente na tinta 
de A. dactylomela, era encontrada somente na glândula de tinta do animal, confirmando a 
inexistência de relações entre a principal proteína da tinta com proteínas algais e indicando a 
glândula de tinta como um sítio de síntese de proteínas bioativas. A proposta de que o animal 
produz as proteínas da tinta e que essas não são obtidas diretamente da dieta, como é o caso 
dos pigmentos, está de acordo com o observado por Coelho, Prince e Nolen (1998) para A. 
californica. 
A histologia da glândula de tinta é muito singular, apresentando dois tipos principais de 
células, além de três tipos de vesículas envolvidas com o comportamento de liberação de tinta 
(KLUSSMAN-KOLB, 2004). Os tipos celulares principais são as células ricas em retículo 
endoplasmático rugoso (RER) e as células granulosas. Essas últimas, segundo Prince e 
Johnson (2006), atuam no armazenamento do excesso de produtos algais transferidos a partir 
26 
TAVARES, T. C. L. – Proteínas de tintas de moluscos marinhos... 
da glândula digestiva para a glândula de tinta em períodos de grande disponibilidade 
alimentar.Já as células ricas em RER atuam na síntese protéica. Quanto às vesículas, podem 
ser do tipo âmbar, vermelho-púrpura e vazias. Johnson e colaboradores (2006), estudando a 
espécie A. californica, evidenciaram através do uso de anticorpos policlonais contra a 
escapina, principal proteína da tinta de A. californica, que é nas vesículas âmbar que a 
escapina é encontrada, estando ausente nas vesículas vermelho-púrpura. 
Além da glândula de tinta, as lesmas possuem as glândulas opalina e digestiva, que 
secretam substâncias tóxicas. A glândula opalina está situada na parte anterior da cavidade 
paleal e secreta um fluido leitoso que, em algumas espécies, possui um odor nauseante. A 
glândula digestiva, ou hepatopâncreas, elimina suas secreções diretamente no estômago e, 
além da função digestiva, parece armazenar metabólitos de defesa obtidos a partir da dieta 
(ROGERS; STEINBERG; DE NYS, 1995). 
As atividades da tinta e da secreção da glândula opalina foram testadas frente a potenciais 
predadores, como a lagosta Panulirus interruptus Randall 1842 e a anêmona do mar 
Anthopleura sola Brandt 1835. Os compostos químicos presentes nessas secreções parecem 
“manipular” os sistemas quimicossensoriais desses predadores, induzindo comportamentos 
anti-predatórios, como de inibição da ingestão, fagomímica e disrupção funcional dos 
sensores químicos dos predadores, impedindo-os de realizar o comportamento alimentar 
(KICKLIGHTER et al., 2005, KICKLIGHTER, DERBY, 2006). O interessante é que para a 
lagosta tanto a tinta como a secreção opalina resultam em respostas aversivas, enquanto a 
anêmona responde somente à tinta. Isso indica que uma gama de mecanismos está presente, 
defendendo esses animais de uma complexa rede de predadores (DERBY, 2007). 
Os compostos inibitórios da ingestão, tipicamente impalatáveis ou tóxicos, atuam 
inibindo o comportamento alimentar por predadores enquanto os disruptores sensoriais 
estimulam massivamente seu sistema quimicossensorial, prevenindo que funcionem 
normalmente e levando à confusão e à interrupção do ataque. Já na fagomímica, os 
predadores são atraídos para a secreção liberada uma vez que esta simula a composição da 
presa, atraindo-o para ela enquanto o animal que a liberou fica livre para escapar. 
Os compostos envolvidos na disrupção sensorial e na fagomímica incluem 
aminoácidos livres e amônio, os quais se encontram altamente concentrados na tinta e na 
secreção opalina da lesma A. californica, atuando como poderosos estimulantes dos neurônios 
sensoriais e do comportamento alimentar da lagosta P. interruptus (DERBY et al., 2007). 
Além disso, as formas jovens também se mostraram protegidas. Juvenis de A. californica se 
mostraram sensíveis ao estímulo das tintas de outras espécies de lesmas (Aplysia juliana 
27 
TAVARES, T. C. L. – Proteínas de tintas de moluscos marinhos... 
Quoy e Gaimard 1832 e A. dactylomela) e de outros grupos relacionados (a lula Lolliguncula 
brevis de Blainville 1823 e o polvo Octopus vulgaris Cuvier 1797), exibindo comportamentos 
aversivos em resposta (KICKLIGHTER et al., 2007). 
Foi demonstrado recentemente que muitas proteínas de lesmas do mar têm a 
capacidade de oxidar L-aminoácidos, liberando peróxido de hidrogênio como um de seus 
produtos (DERBY, 2007). Essa atividade, conhecida como L-aminoácido oxidásica, parece 
ser importante na maior parte dos comportamentos aversivos. Escapina, por exemplo, isolada 
da tinta de A. californica, gera peróxido de hidrogênio a partir de sua atividade oxidásica, e 
este por sua vez já foi comprovado isoladamente como inibidor dose-dependente do 
comportamento alimentar de P. interruptus (AGGIO, DERBY, 2008). 
2.4. Aplysia dactylomela 
A espécie A. dactylomela Rang 1828 (Figura 2) pertence ao Filo Mollusca, Classe 
Gastropoda, Subclasse Opistobranchia, Ordem Anaspidae, Família Aplisiidae, Subfamília 
Aplisiinae, Gênero Aplysia. Pode ser encontrada no mundo inteiro, especialmente em regiões 
tropicais, sendo uma das três espécies cosmopolitas do gênero, além de A. parvula e A. 
juliana (CAREFOOT, 1987). Na América do Norte, ocorre no sul da Flórida e no Caribe; no 
Brasil, é encontrada desde o Maranhão até São Paulo, juntamente com as espécies A. 
brasiliana, A. parvula e A. juliana (RIOS, 1994). 
As aplísias são herbívoras, alimentando-se de macroalgas verdes e vermelhas. 
Geralmente são encontradas enterradas em poças durante a maré baixa e são mais ativas no 
período noturno (CAREFOOT, 1989). No litoral cearense, a espécie A. dactylomela é 
encontrada, em geral, nas regiões intertidal e sublitoral, onde macroalgas do gênero Ulva, das 
quais se alimenta, ocorrem abundantemente. Entretanto, alimentam-se também de macroalgas 
vermelhas, dependendo da disponibilidade no ambiente (BEZERRA et al., 2004). 
O sistema nervoso dos aplisídeos é muito utilizado em experimentos de 
neurofisiologia, pelo fato de seus neurônios serem muito grandes, o que facilita a 
experimentação. São hermafroditas simultâneos ou protândricos, podendo ocorrer cópula com 
dois ou mais indivíduos. A fertilização e a postura de ovos ocorrem na forma de uma fita 
mucilaginosa larga (RUPPERT, BARNES, FOX, 2005). 
28 
TAVARES, T. C. L. – Proteínas de tintas de moluscos marinhos... 
O ciclo de vida de Aplysia tem início com a fertilização dos ovos, seguido do período 
de desenvolvimento embrionário, eclosão dos ovos, desenvolvimento da larva véliger, 
metamorfose larval e fase juvenil, chegando, enfim, à fase adulta (KANDEL, 1979). 
Essas lesmas não possuem estruturas de proteção mecânica externa e, além disso, 
possuem estruturas semelhantes a nadadeiras, os parapódios, originadas de projeções laterais 
amplas de seu corpo freqüentemente colorido, tornando-se muito visíveis a potenciais 
predadores. Todavia, esses animais, aparentemente desprotegidos e apetitosos, possuem 
poucos predadores. Tal fato desperta o interesse em se desvendar suas estratégias de defesa 
(NOLEN et al., 1995), resultando no achado de uma rica variedade de substâncias químicas 
utilizadas para a defesa contra predadores e para a comunicação intra e interespecífica 
(CUMMINS et al., 2004; KICKLIGHTER et al., 2005; BARSBY, 2006). 
A lesma A. dactylomela foi utilizada em vários estudos investigando o papel ecológico 
e o potencial biotecnológico de sua tinta. Melo e colaboradores (1998) descreveram as 
atividades tóxica, antimicrobiana e hemaglutinante desta secreção, além de sugerir a natureza 
protéica da(s) molécula(s) responsável(is) por tais propriedades. Posteriormente, da mesma 
tinta, foi purificada uma proteína com potente atividade antibacteriana e hemaglutinante, a 
dactilomelina-P (MELO et al., 2000). Esses estudos foram de grande importância no 
entendimento do papel da tinta e de seus componentes para o animal já que as atividades 
biológicas encontradas nessa tinta puderam ser relacionadas à defesa química do animal. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2 - Fotografias de Aplysia dactylomela. A. Liberação da tinta púrpura 
(http://www.seaslugforum.net/); B. Aspecto morfológico geral (fotografia de Tallita Tavares). 
A 
B 
29 
TAVARES, T. C. L. – Proteínas de tintas de moluscos marinhos... 
2.5. Proteínas de lesmas do mar 
Várias proteínas têm sido isoladas de lesmas do mar, de diferentes órgãos e secreções, 
exibindo uma variedade de atividades biológicas, destacando-se, dentre elas, as atividades: 
antitumoral, citotóxica, antiviral, antibacteriana, antifúngica e hemaglutinante, listadas na 
Tabela 1. 
Inicialmente, Kamiya e Shimizu (1981) isolaram uma lectina, proteína que se liga a 
carboidratos, específica para o ácido D-galacturônico e D-galactose, a partir da massa de ovos 
de algumas espécies de Aplysia. Esta foi uma das primeiras proteínas bioativas a ser 
purificada desses moluscos, constituindo o começo do isolamento e caracterização de uma 
série de proteínas antimicrobianas e citotóxicas, com possível papel primário na defesaquímica dessas lesmas. 
Em 1984, Kamiya, Muramoto e Ogata, pesquisando atividades antibacterianas ou 
hemaglutinantes em extratos salinos de vários órgãos de A. kurodai, espécie de lesma comum 
no Japão, China e Coréia, encontraram nos extratos da massa de ovos e da glândula de 
albúmen potente atividade contra bactérias gram-positivas e gram-negativas. Essas 
observações desencadearam uma série de pesquisas que culminaram com a descoberta de 
novas proteínas antitumorais e antimicrobianas. Dessa forma, as lesmas do mar passaram a ser 
reconhecidas como uma fonte rica, não somente de metabólitos secundários, mas também de 
proteínas com novas atividades biológicas (KAMIYA; SAKAI; JIMBO, 2006). 
Em A. kurodai, de sua massa de ovos, foi isolada uma glicoproteína de 250 kDa, 
composta de 3 subunidades, denominada aplisianina E. Essa proteína possui atividade contra 
Escherichia coli e contra as leveduras Saccharomyces cerevisiae e Candida albicans. Além 
disso, possui atividade contra várias linhagens de células tumorais murinas e humanas 
relacionadas a leucemias e a carcinomas mamários (KAMIYA; MURAMOTO; OGATA, 
1984; KISUJI; KAMIYA; YAMAZAKI, 1987; IIJIMA; KISUGI; YAMAZAKI, 1995). 
A partir da glândula de albúmen da lesma Dolabella auricularia Lightfoot 1786, habitante 
dos oceanos Pacífico e Índico, e de A. kurodai foram isoladas as proteínas dolabelanina A e 
aplisianina A, respectivamente. Oriundas do mesmo tipo de glândula, essas proteínas 
compartilham algumas características. Dolabelanina A é uma glicoproteína de 250 kDa com 3 
subunidades, que apresenta atividade citolítica contra uma variedade de tumores, muitos 
resistentes ao Fator de Necrose Tumoral (YAMAZAKI; KISUGI; KAMIYA, 1989a), além de 
atividade fungicida (IIJIMA; KISUGI; YAMAZAKI, 1994) e bacteriostática (KISUJI et al., 
1992). Já a aplisianina A, também uma glicoproteína, possui uma massa molecular de 320 
30 
TAVARES, T. C. L. – Proteínas de tintas de moluscos marinhos... 
kDa distribuída em quatro subunidades, apresentando igualmente atividades antibacteriana e 
citolítica (KAMIYA; MURAMOTO; YAMAZAKI, 1986). 
Devido às atividades apresentadas por tais proteínas, essas passaram a ser vistas como 
potenciais candidatos ao desenvolvimento de novos fármacos. A ciplasina, e.g., proteína com 
atividade tumoral isolada da glândula de albúmen de Aplysia punctata Cuvier 1803, está 
atualmente passando por testes pré clínicos avaliando seu potencial de utilização como droga 
antitumoral. A atividade citotóxica da ciplasina é irreversível, levando à morte celular 
irreparavelmente. Ela age sobre as redes de actina, despolimerizando-as e levando a seu 
completo desaparecimento após 30 minutos de incubação (PETZELT et al., 2002). 
Merecem destaque as proteínas isoladas da tinta de lesmas do mar: aplisianina P, isolada 
de A. kurodai (YAMAZAKI et al., 1989b), APIT de A. punctata (BUTZKE et al., 2005), 
escapina de A. californica (YANG et al., 2005), dactilomelina-P de A. dactylomela (MELO 
et al., 2000), dolabelanina-P, de D. auricularia (YAMAZAKI et al., 1989c) e bursatelanina-P, 
de Bursatella leachii de Blainville 1817 (RAJAGANAPATHI; KATHIRESAN; SINGH, 
2002). 
Comparando essas proteínas percebe-se que compartilham algumas propriedades, como 
produção e/ou armazenamento na glândula de tinta, massa molecular em torno de 60 kDa, 
número de subunidades, estabilidade a variações de pH, resistência a proteases e desnaturação 
entre 55 e 70 °C. Entretanto, diferem quanto a composição de aminoácidos, grau de 
glicosilação e tipos de atividade biológica. Dactilomelina-P e escapina, por exemplo, não são 
consideradas glicoproteínas, pois possuem menos de 0,05% e 0,03% de açúcar em suas 
moléculas, respectivamente, enquanto aplisianina-P, e dolabelanina-P são consideradas 
glicoproteínas, com teores de carboidratos de 18% e 0,8%, respectivamente. Esses resultados 
demonstram que, possivelmente, a glicosilação não é um fator essencial para atividade 
biológica dessas proteínas. 
Essas proteínas apresentam atividade citotóxica de amplo espectro, com ação 
antibacteriana contra patógenos, como E. coli, S. aureus, Pseudomonas aeruginosa, C. 
albicans, Schizosaccharomyces pombe, S. cerevisiae, e/ou citolítica contra células tumorais, 
como células cancerosas murinas e linhagens Jurkat e HeLa, por exemplo. Adicionalmente, 
bursatelanina-P e dactilomelina-P apresentam atividades antiretroviral contra a polimerase 
reversa do HIV tipo I e hemaglutinante, respectivamente. 
Como a interação primária entre proteínas e células alvo ocorre ainda não é entendido. 
Estudos recentes proporcionaram evidências de que tais interações se dão por meio da 
produção de peróxido de hidrogênio a partir da oxidação de L-aminoácidos pelas proteínas 
31 
TAVARES, T. C. L. – Proteínas de tintas de moluscos marinhos... 
(BUTZKE et al., 2004). Subsequentemente, o sequenciamento de algumas dessas proteínas 
pôde caracterizá-las como membros da família das L-aminoácido oxidases (LAAOs) (JIMBO 
et al., 2003; IIJIMA; KISUGI; YAMAZAKI, 2003b; BUTZKE et al., 2005; YANG et al., 
2005). 
Algumas das proteínas isoladas de lesmas do mar tiveram suas seqüências de aminoácidos 
determinadas e seus graus de similaridade identificados. Aplisianina A (TAKAMATSU et al., 
1995) foi a primeira proteína a ter a sequência completa de aminoácidos determinada, sendo 
seguida da ciplasina (PETZELT et al., 2002), escapina (YANG et al., 2005) e APIT 
(BUTZKE et al., 2005). Com as seqüências determinadas foi possível traçar o grau de 
similaridade entre elas e especular o papel das mesmas na defesa desses animais. 
Foi verificada uma similaridade de 93% entre escapina e APIT, refletindo sua 
origem semelhante, assim como suas características bioquímicas e de ação (YANG et al., 
2005). Estudos de homologias entre escapina e as proteínas ciplasina L, aplisianina A (de A. 
kurodai) e a homóloga desta última de A. californica, mostraram identidades em torno de 
60%. Também foram encontrados 48% de identidade entre as seqüências da escapina e a da 
LAAO da lesma gigante africana Achatina fulica Férussac 1821, a achatina. É interessante 
destacar que a escapina possui 21% de identidade com a apoxina I, uma LAAO isolada da 
glândula de veneno da cobra Crotalus acrox Baird e Girard 1853 (YANG et al., 2005). 
Vallon (2000) e Yang e colaboradores (2005) sugeriram que aplisianina A e escapina 
pertencem à família das flavoproteínas, pois possuem os motivos GG altamente conservado 
(RxGGRxxS/T) e βαβ ligante de dinucleotídeo em suas sequências de aminoácidos. Proteínas 
com esses motivos estruturais são freqüentemente descritas como L-aminoácido oxidases. As 
propriedades bioquímicas e filogenéticas dessas proteínas reforçam a idéia de que elas 
pertencem a uma mesma família, ressaltando a conservação dessas seqüências ao longo da 
evolução. 
É, portanto, de grande interesse determinar, de um ponto de vista comparativo, se as 
proteínas antibacterianas de lesmas do mar possuem sequências em comum com outros 
fatores antibacterianos presentes em invertebrados. Além disso, entender como as aplisianinas 
(grupo de proteínas presentes em Aplysia, segundo Kamiya, Sakai e Jimbo (2006)), achatina e 
outras proteínas antibacterianas estão distribuídas na natureza pode ser muito importante para 
o esclarecimento da evolução dessas moléculas de defesa em gastrópodes especificamente 
(TAKAMATSU et al., 1995). A obtenção da estrutura primária dessas proteínas, assim como 
o seqüenciamento dos cDNAs responsáveis por sua expressão, se fazem, portanto, muito 
32 
TAVARES, T. C. L. – Proteínas de tintas de moluscos marinhos... 
necessários para que se possa inferir sobre a distribuição dessas proteínas antibacterianas de 
invertebrados e para o entendimento da evolução de tais moléculas de defesa. 
Tabela 1 – Caracterização bioquímica e atividades biológicas das proteínas isoladas de lesmas 
do mar (NOGUEIRA et al., 2010).Espécies kDa Subunidades Carbohidratos 
(%) 
Atividades Referências 
Aplysia kurodai 
aplisianina E 250 3 8 antibacteriana 
antifúngica 
citolítica 
Kamiya et al., 
1984; Kisuji et 
al., 1987; Iijima 
et al., 1995 
aplisianina A 320 4 9,8 antibacteriana 
citolítica /LAAO 
Kamiya et al., 
1986; Jimbo et 
al., 2003 
aplisianina P 60 1 18 antibacteriana 
citolítica 
Yamazaki et al., 
1986 
Aplysia juliana 
julianina E-1 375 4 15,9 antibacteriana 
citolítica 
Kamiya et al., 
1988 
julianina G-1 375 4 9,9 antibacteriana 
citolítica 
Kamiya et al., 
1988 
julianina S 67 1 nda antibacteriana 
citolítica 
Kamiya et al., 
1989 
Aplysia punctata 
ciplasina nda ? nda citotoxicidade Petzelt et al., 
2002 
APIT 60 1 nda citotoxicidade 
/LAAO 
Butzke et al., 
2005 
Aplysia californica 
escapina 60 1 0,03 antibacteriana 
antifúngica 
/LAAO 
Yang et al., 2005 
Aplysia dactylomela 
dactilomelina-P 60 1 0,05 antibacteriana 
hemaglutinante 
/LAAO 
Melo et al., 2000 
Bursatella leachii 
bursatelanina-P 60 1 nda antibacteriana 
antiviral 
Rajaganapathi et 
al., 2002 
Dolabella 
auricularia 
 
dolabelanina A 250 4 10,9 antibacteriana 
antifúngica 
citolítica /LAAO 
Yamazaki et al., 
1989a, Kisuji et 
al., 1992; Iijima 
et al., 1994, 2003 
dolabelanina P 60 1 0,8 citolítica Yamazaki et al., 
1989b 
dolabelanina C 215 3 10,9 citolítica Kisugi et al., 
1989 
Legenda: E – massa de ovos, G – massa genital, S – superfície corporal, P – tinta, A – 
glândula de albúmen, C – celoma, ndª – não determinado. 
33 
TAVARES, T. C. L. – Proteínas de tintas de moluscos marinhos... 
2.6. L-aminoácido oxidases 
L-aminoácido oxidases (LAAOs) são flavoenzimas que catalisam a desaminação 
estereoespecífica de L-aminoácidos, na presença de oxigênio, produzindo cetoácidos, amônia 
e peróxido de hidrogênio (EHARA et al., 2002; IIJIMA; KISUGI; YAMAZAKI, 2003b), 
dentre outros produtos tóxicos ainda pouco conhecidos. 
As LAAOs ocorrem em muitos organismos diferentes, como bactérias (do gênero 
Corynebacterium e Proteus), fungos (da espécie Neurospora crassa), cianobactérias (do 
gênero Synechococcus), algas verdes (Chlamydomonas rheinhardtii) e animais, 
principalmente serpentes venenosas. As LAAOs de cobras são particularmente bem estudadas 
e estão presentes em crotalídeos, elapídeos e viperídeos, sendo conhecidas como SV-LAAOs, 
i.e., LAAOs de serpentes venenosas – as proteínas mais bem estudadas deste grupo 
(MACHEROUX et al., 2001; DU, CLEMETSON, 2002). 
Apesar de suas estruturas, especificidade quanto ao substrato e funções mostrarem 
importantes variações, todas as LAAOs apresentam algumas propriedades em comum. Dentre 
estas, destacam-se as atividades citotóxicas e antibacterianas devido à formação de peróxido 
de hidrogênio. 
O peróxido de hidrogênio é sabidamente um mensageiro intracelular e está envolvido na 
lise oxidativa de fagócitos, levando à eliminação de microorganismos invasores. Além disso, 
apresenta vários efeitos sobre o metabolismo celular, incluindo inibição do crescimento, 
apoptose e necrose. As LAAOs são bastante promissoras, pois, enquanto o peróxido de 
hidrogênio sozinho é instável e tende a se difundir rapidamente, enzimas que o produzem 
proporcionam seu suplemento contínuo (BUTZKE et al., 2005). 
Até os anos 90, tais enzimas eram utilizadas principalmente para a produção de 
α−cetoácidos, sendo a especificidade de substrato, estabilidade e outras características físico-
químicas os principais focos de pesquisa. Desde o fim do século passado, têm se tornado 
interessantes objetos de estudo para a bioquímica, fisiologia e medicina devido a seus efeitos 
sobre vários tipos de células, como células cancerosas, plaquetas e microorganismos 
(TÕNISMÄGI et al., 2006). 
Das proteínas de lesmas do mar, várias já foram confirmadas como LAAOs, incluindo 
aplisianina A (JIMBO et al., 2003), APIT (BUTZKE et al., 2005), dolabelanina A (IIJIMA; 
KISUGI, YAMAZAKI, 2003b) e escapina (YANG et al., 2005). Essas proteínas possuem 
seqüências de aminoácidos bastante similares as de LAAOs de organismos terrestres, como a 
34 
TAVARES, T. C. L. – Proteínas de tintas de moluscos marinhos... 
glicoproteína antibacteriana isolada da lesma A. fulica (EHARA et al., 2002). Além disso, foi 
demonstrado que tais proteínas são possuidoras de atividade biológicas comprovadamente 
influenciadas pelas propriedades oxidásicas (DERBY, 2007). 
Muitas LAAOs preferem como substratos aminoácidos hidrofóbicos e neutros ou 
mesmo aromáticos, como a L-leucina, L-fenilalanina e L-isoleucina, exibindo uma afinidade 
muito baixa para aminoácidos básicos. Entretanto, algumas dessas enzimas apresentam altas 
afinidades para aminoácidos básicos, como L-lisina e L-arginina (YANG et al., 2005; 
JOHNSON et al., 2006; GOMEZ et al., 2006). Este é o caso das LAAOs de lesmas do mar, 
cuja afinidade por lisina e arginina foi previamente demonstrada pelo aumento da atividade 
biológica dessas proteínas na presença especificamente desses aminoácidos (JIMBO et al., 
2003, BUTZKE et al., 2005, IIJIMA, KISUGI, YAMAZAKI, 2003b, YANG et al., 2005). 
De fato, LAAOs são encontradas largamente na natureza, geralmente com papéis 
defensivos ou ofensivos já que seus produtos causam danos a células ou a tecidos. São 
utilizadas por um grande número de organismos de vários filos como defesa contra patógenos 
ou potenciais atacantes; ou ainda como moléculas de ataque presentes em venenos de 
serpentes e aracnídeos (EHARA et al., 2002). 
O interessante é que todas essas proteínas, como já mencionado, possuem atividades 
antibacterianas ou citolíticas, e, em alguns casos, ambas as atividades. Várias pesquisas 
recentes indicam que, possivelmente, a defesa química baseada em LAAOs é comum, 
independente da classificação do organismo. Dessa forma, proteínas com atividade oxidásica 
de L-aminoácidos, ubíquas na natureza e, particularmente, dentre os gastrópodes, 
desempenhando papéis importantes na sua defesa química (JIMBO et al., 2003), caracterizam 
interessantes objetos de estudo, podendo serem utilizadas também como marcadores 
quimiotaxonômicos (MARIN et al., 1999). 
As estruturas moleculares de uma grande quantidade de LAAOs já foram caracterizadas, 
permitindo comparações de suas seqüências. Em geral, contudo, sua função ecológica 
permanece pouco conhecida, já que a maioria dos estudos é dirigida por interesses puramente 
biomedicinais, desacoplados da ecologia química (DERBY, 2007). 
2.7. A dactilomelina-P 
A dactilomelina-P é a proteína mais abundante presente na tinta liberada pela 
lesma do mar A. dactylomela. É uma molécula monomérica de 59,8 kDa, com pI 5.0, que 
35 
TAVARES, T. C. L. – Proteínas de tintas de moluscos marinhos... 
possui alto teor de metionina e menos de 1% de carboidratos. Quando aquecida a 60 °C por 
10 minutos ou quando submetida a pHs menores que 2, perde sua atividade antibacteriana, 
apesar de resistir bem a pHs entre 3-12. Foi capaz de aglutinar eritrócitos de coelho, de ratos e 
de camundongos, mas não apresentou atividades anticoagulante, hemolítica e citotóxica. 
Apresenta uma DL50 em camundongos entre 60-100 mg/Kg, sendo considerada como 
moderadamente tóxica (NOGUEIRA, 2005). 
Essa proteína possui um amplo espectro de ação antibacteriano, inibindo 
eficientemente o crescimento de várias espécies de bactérias gram-positivas e gram-negativas, 
patogênicas ou não ao homem. Merece destaque a ação da dactilomelina-P sobre S. aureus, 
contra o qual apresenta um efeito bacteriostático com Concentração Inibitória Mínima de 0,2 
µg/mL (NOGUEIRA, 2005). Batista (2004) testou a ação da dactilomelina-P frente a 100 
cepas de S. aureus resistentes a vários antibióticos, isoladas de diferentes casos clínicos de 
hospitais de Fortaleza. Os resultados mostraram que 100% das cepas foram sensíveis à 
dactilomelina-P. Esse resultado se reveste de grande importância quando comparado àqueles 
produzidos porantibióticos comercializados, como a eritromicina e a nitrofurantoína, para os 
quais mais de 50% das cepas se mostraram resistentes. Os isolados foram 100% sensíveis à 
vancomicina e aos antibióticos de última geração quinupristina/dalfopristina e linezulida. A 
eficácia da dactilomelina, portanto, é comparável a desses antibióticos. 
A avaliação de seu potencial alergênico mostrou que a mesma possui moderado 
potencial alergênico quando inoculada por via subcutânea em camundongos, sendo este 
potencial inexistente por via oral, indicando esta via como uma possível rota de veiculação da 
proteína (TAVARES, 2007). 
A dactilomelina-P possui suas atividades biológicas bem descritas, mas, apesar 
disso, ainda não é conhecido o mecanismo pelo qual atua, nem seu grau de relacionamento 
com as demais proteínas de lesmas do mar e de outros moluscos. A elucidação dessas 
questões seria muito útil para o entendimento do papel ecológico que essa proteína 
desempenha para o animal. 
2.8. Relevância 
A defesa química e seus componentes constituem agentes que unificam muitos animais, 
apesar de sua distância filogenética. Assim, o estudo comparativo de suas secreções de defesa 
pode ser muito útil no entendimento dos principais mecanismos e constituintes de suas 
36 
TAVARES, T. C. L. – Proteínas de tintas de moluscos marinhos... 
defesas químicas. 
Além disso, no caso de moléculas tão interessantes como as proteínas de lesmas do mar, o 
entendimento dos mecanismos pelos quais se dão suas atividades biológicas pode ser útil 
tanto para auxiliar no esclarecimento das funções ecológicas de tais compostos como também 
no descobrimento de novas estruturas e arcabouços biológicos passíveis de serem utilizados 
biotecnologicamente. 
 
 
37 
TAVARES, T. C. L. – Proteínas de tintas de moluscos marinhos... 
3. OBJETIVOS 
Este trabalho teve por objetivo estudar a proteína dactilomelina-P no que diz respeito a 
seu mecanismo de ação e comparar a composição protéica e função da tinta de Aplysia 
dactylomela (Gastropoda, Opisthobranchia) com as tintas de outros dois moluscos, a lesma do 
mar Bursatella leachii (Gastropoda, Opisthobranchia) e o polvo Octopus sp. (Cephalopoda, 
Coleoidea). 
3.1. Objetivos específicos 
1. Avaliar a atividade L-aminoácido oxidásica nas tintas de A. dactylomela, B. leachii e 
Octopus sp.; 
2. Comparar a composição protéica das tintas de A. dactylomela, B. leachii e Octopus 
sp.; 
3. Comparar as atividades antimicrobianas das tintas de A. dactylomela, B. leachii e 
Octopus sp.; 
4. Estudar o mecanismo de ação antibacteriana da dactilomelina-P; 
5. Observar a ação da dactilomelina-P sobre Staphylococccus aureus por microscopia de 
força atômica; 
6. Avaliar a atividade L-aminoácido oxidásica da dactilomelina-P. 
 
 
38 
TAVARES, T. C. L. – Proteínas de tintas de moluscos marinhos... 
4. MATERIAIS E MÉTODOS 
4.1. Coleta dos materiais biológicos 
A tinta púrpura e os exemplares de A. dactylomela (Mollusca; Gastropoda; 
Orthogastropoda; Apogastropoda; Heterobranchia; Euthyneura; Opisthobranchia; 
Aplysiomorpha; Aplysioidea; Aplysiidae) utilizados no trabalho foram coletados durante 
marés de sizígia de 0,0 – 0,2, na Praia de Paracuru, no município de São Gonçalo do 
Amarante (Ceará, Brasil), conforme descrito por Melo et al. (2000). A tinta foi coletada por 
manipulação do animal até a liberação da secreção, a qual foi acondicionada em recipientes 
esterilizados por autoclavação a 121 °C por 15 minutos. A tinta de B. leachii (Mollusca; 
Gastropoda; Orthogastropoda; Apogastropoda; Heterobranchia; Euthyneura; Opisthobranchia; 
Aplysiomorpha; Aplysioidea; Aplysiidae) foi coletada de forma semelhante à utilizada para a 
coleta da tinta de A. dactylomela, na Lagoa da Tabuba, município de Caucaia (Ceará, Brasil). 
A tinta do polvo Octopus sp. (Mollusca; Cephalopoda; Coleoidea; Neocoleoidea; 
Octopodiformes; Octopoda; Incirrata; Octopodidae) foi coletada de animais capturados em 
alto-mar, por meio de sua dissecação, retirada dos sacos de tinta e coleta da tinta presente 
nessas estruturas. 
4.2. Purificação da dactilomelina-P 
A dactilomelina-P foi purificada a partir do pool de tinta bruta como descrito por 
Nogueira (2005). A tinta bruta foi dialisada exaustivamente contra água destilada em 
membrana de diálise com poros de 12 kDa de abertura a 4°C e submetida à centrifugação a 
18000 g por 30 minutos para retirada de impurezas e areia oriundas da coleta. Em seguida, 
essa tinta pré-tratada foi submetida à precipitação com sulfato de amônio para obtenção da 
fração 30/60% de saturação. Essa fração passou, em seguida, por uma cromatografia de troca 
iônica em coluna DE 52 dietilaminoetil cellulose (15,5 x 3,5 cm), tendo o tampão Tris-HCl 
com gradiente de concentração de cloreto de sódio como eluente, para obtenção do pico com 
atividade antibacteriana. O pico obtido, após ser dialisado contra água destilada para retirada 
do tampão de eluição, foi liofilizado. O material resultante da liofilização foi caracterizado 
como constituído majoritariamente de dactilomelina-P, tendo sido utilizado em todos os 
ensaios. 
39 
TAVARES, T. C. L. – Proteínas de tintas de moluscos marinhos... 
4.3. Composição e Função das Proteínas das tintas de A. dactylomela, B. leachii e 
Octopus sp. 
4.3.1. Tratamento das tintas 
As tintas dos moluscos A. dactylomela, B. leachii e Octopus sp. foram 
inicialmente centrifugadas a 10000 g por 30 minutos. Em seguida, para retirar sais e 
pigmentos das amostras e concentrá-las, foram dialisadas exaustivamente em membranas de 
diálise com 12 kDa de cut off e liofilizadas. Somente a tinta de polvo não foi liofilizada 
devido a sua baixa disponibilidade. 
4.3.2. Determinação da concentração de proteínas 
As determinações de proteínas solúveis foram realizadas pelo método proposto 
por Bradford (1976), utilizando-se a albumina sérica bovina (BSA) como padrão. 
4.3.3. Atividade L-aminoácido oxidásica 
A atividade L-aminoácido oxidásica foi determinada em tampão Tris fosfato 0,1 M, 
pH 7,8 a 25° C utilizando um ensaio enzimático acoplado (MACHEROUX et al., 2001). 
Nesse ensaio, o peróxido de hidrogênio gerado pela atividade oxidásica foi utilizado pela 
peroxidase (Horseradish Peroxidase Tipo 1, Sigma) para oxidar a o-dianisidina ao seu radical 
cátion, o qual foi monitorado por absorbância a 450 nm. Uma quantidade de 1 mL de mistura 
reacional continha 10 µL de peroxidase (1 mg/mL em tampão Tris fosfato 0,1 M pH 7,8), 50 
µL de uma solução de o-dianisidina (8mM em Triton X-100 a 20%) e 10 µL da solução de 
aminoácidos a 100 mM também em tampão Tris fosfato. As misturas reacionais foram 
mantidas em banho de gelo até a leitura das absorbâncias. 
A reação foi iniciada pela adição de 10 µL da solução possivelmente contendo a 
LAAO e foi imediatamente monitorada a cada 5 minutos durante 60 minutos. Foram testados 
como fontes de oxidases as tintas de A. dactylomela, de B. leachii e de Octopus sp., e o 
extrato da glândula opalina e da desova de A. dactylomela. Já os aminoácidos L-lisina e L-
arginina foram utilizados como substratos para a ação enzimática. Também o extrato da 
glândula opalina foi utilizado como possível fonte de aminoácidos e, portanto, substrato para 
40 
TAVARES, T. C. L. – Proteínas de tintas de moluscos marinhos... 
a ação enzimática. Cada dado foi representado como o resultado da média ± desvio padrão de 
três replicatas. 
4.3.4. Caracterização das tintas por PAGE-SDS 
As tintas brutas e liofilizadas foram submetidas eletroforese em gel de 
poliacrilamida de três fases, em presença de tricina (SDS-Tricina-PAGE) para determinação 
do perfil unidimensional das proteínas presentes, segundo o método de Schagger e Jagow 
(1987). O gel de três fases (separação, 16,5% T e 3,0% C, pH 8,9; espaçamento, 9,9% T e 
3,0% C, pH 8,9; concentração, 5,12% T e 2,6% C, pH 6,8) foi desenvolvido com tampão do 
catodo contendo Tris-base 0,1 M, Tricina 0,1 M e SDS