Proteínas atualizado

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Unidade 2 – Proteínas
Nesta unidade vamos entender a cerca das características gerais dos aminoácidos e das proteínas, suas estruturas químicas, suas funções celulares e as diferentes técnicas de identificação, separação, purificação e análise destas moléculas.
Objetivos da Unidade
Identificar e compreender as propriedades dos aminoácidos, incluindo pK e pI
Conhecer as funções das proteínas
Estudar os diferentes níveis estruturais das proteínas
Conhecer as técnicas de identificação, separação, purificação e análise de proteínas
Caracterizar as enzimas 
Plano da Unidade
Os aminoácidos
Aminoácidos como ácidos e bases
Peptídeos
Estrutura e funções das proteínas
Desnaturação de proteínas
Técnicas de estudo das proteínas
Enzimas
As proteínas (ou também conhecidas como polipeptídeos) são as macromoléculas mais abundantes nas células vivas e com o maior número de funções. São instrumentos moleculares nos quais a informação genética é expressa. Todas as proteínas são formadas por moléculas menores chamadas aminoácidos. A quantidade e a ordem destes aminoácidos provêm uma quantidade enorme de diferentes proteínas celulares. 
Os aminoácidos
Os aminoácidos são as unidades formadoras das proteínas. São mais de 200 tipos de aminoácidos diferentes na natureza, mas somente 20 são encontrados nas proteínas. Estes aminoácidos possuem regiões em comum como um carbono central (α), no qual estão ligados um hidrogênio, uma região amina (NH2), uma região carboxila ou também conhecida como ácido carboxílico (COOH) e uma cadeia lateral (ou grupamento R), com exceção da prolina que é considerado um iminoácido e, portanto não apresenta uma amina. Em pH fisiológico (próximo de 7,0), os aminoácidos estão carregados na forma de íons dipolares (ou zwitterions) tendo a amina como NH3+ e a carboxila como COO-, no entanto, esta característica não interfere nas propriedades químicas dos aminoácidos (figura 1).
O carbono central dos aminoácidos formadores das proteínas é então considerado um centro quiral, no qual estão ligadas quatro regiões moleculares diferentes em um arranjo tetraédrico e assimétrico. Estas diferentes regiões podem ocupar duas posições espaciais distintas, sendo estas duas formas chamadas de estereoisômeros (ou enantiômeros). Nas proteínas, os aminoácidos têm sempre a forma L (levógiro), que por convenção, o grupo amino da molécula está na esquerda. No entanto, em peptídeos (pequenas sequências de aminoácidos) encontrados, por exemplo, nas paredes celulares de bactérias Gram+ como as do gênero Estafilococos, e em alguns antibióticos, os aminoácidos estão na forma D (dextrógiro), onde o grupo amino está na direita. 
Os aminoácidos são diferenciados entre si pelas suas cadeias laterais. As cadeias laterais variam em tamanho, forma, carga elétrica, reatividade química e definem os aminoácidos como polares ou apolares, no entanto esta denominação só funciona quando os aminoácidos estão incorporados nas proteínas, pois todos os aminoácidos livres são, a princípio, solúveis em água. Neste contexto, os aminoácidos glicina, alanina, prolina, valina, leucina, isoleucina, metionina, triptofano e fenilalanina são considerados apolares, enquanto os demais, por ter em suas cadeias laterais regiões capazes de interagir com a água, seja por pontes de hidrogênio ou por interações eletrostáticas, são aminoácidos polares (figura 1).
Figura 1: Os aminoácidos formadores das proteínas. As fórmulas acima mostram as formas zwitterion dos aminoácidos (em pH fisiológico). Acido glutâmico e ácido aspártico são aminoácidos comumente referidos respectivamente como glutamato e aspartato. A cadeia lateral da glicina está destacada das demais por ser a mais simples. Fonte: www.infoescola.com, acesso em 18/10/2014, adaptado.
Os aminoácidos podem apresentar algumas características funcionais interessantes: o aminoácido mais simples, a glicina, tem este nome por ter gosto doce, assim lembrando o nome glicose, além de ser um neurotransmissor; o glutamato e o triptofano são usados na produção dos neurotransmissores ácido γ-aminobutírico, serotonina e melatonina; leucina, isoleucina e valina são os aminoácidos conhecidos como BCAA (aminoácidos de cadeia lateral ramificada), muito procurado por praticantes de alguma atividade física, que serão estudados nas próximas unidades; aspartato e fenilalanina são usados na produção do adoçante aspartame; arginina participa do ciclo da uréia (importante via metabólica que ocorre no fígado e que será estudada nas próximas unidades); tirosina é usada na formação do hormônio tiroxina.
Além dos 20 aminoácidos descritos anteriormente, algumas raras proteínas podem conter aminoácidos modificados após a sua incorporação na cadeia polipeptídica. Dentre estes podemos incluir a 4-hidroxiprolina e a 5-hidroxilisina, encontradas no colágeno, a 6-N-metillisina, encontrada na miosina, a desmosina, encontrada na elastina e o γ-carboxiglutamato, encontrado na protrombina. 
Os aminoácidos podem também ser classificados como naturais (não-essenciais) e essenciais. Os naturais são os aminoácidos produzidos pelo organismo. Os essenciais não são produzidos pelo organismo e, portanto precisam ser adquiridos na alimentação. Os vegetais produzem todos os 20 aminoácidos que formam as proteínas e, portanto só possuem aminoácidos naturais. Os humanos produzem somente 11 (alanina, arginina, asparagina, aspartato, cisteina, glicina, glutamato, glutamina, prolina, serina e tirosina) do total de 20 aminoácidos. Deste modo, ao ingerir proteínas, os humanos obtêm os 20 aminoácidos, sendo alguns já produzidos pelo corpo e outros essenciais. É importante ressaltar que para formar as proteínas são necessários todos os 20 aminoácidos.
Aminoácidos como ácidos e bases
Como os aminoácidos possuem grupamentos amina e carboxila capazes de se ionizar, a forma iônica predominante dos aminoácidos é dependente do pH no qual este aminoácido se encontra. Os aminoácidos podem apresentar 2 ou 3 grupamentos ionizáveis referentes a amina, a carboxila e algumas cadeias laterais, ou seja 2 ou 3 regiões com poder tamponante (tabela 1).
Um aminoácido em solução cujo pH é muito ácido (entre 0 e 1), tem seus grupamentos ionizáveis totalmente protonados (com íons H+). À medida que o pH aumenta (com adição de base), os íons H+ são liberados, sempre primeiro os prótons das carboxilas e depois os prótons das aminas.
Tabela 1: Valores de pK e pI dos aminoácidos.
	Aminoácido
	pK
	pI
	Nome
	Abreviação de três letras
	Abreviação de uma letra
	COOH
	NH3+
	Cadeia lateral (grupamento R)
	
	Alanina
	Ala
	A
	2,34
	9,69
	
	6,01
	Arginina
	Arg
	R
	2,17
	9,04
	12,48
	10,76
	Asparagina
	Asn
	N
	2,02
	8,80
	
	5,41
	Aspartato
	Asp
	D
	1,88
	9,60
	3,65
	2,77
	Cisteína
	Cys (Cis)
	C
	1,96
	10,28
	8,18
	5,07
	Fenilalanina
	Phe (Fen)
	F
	1,83
	9,13
	
	5,48
	Glicina
	Gly (Gli)
	G
	2,34
	9,60
	
	5,97
	Glutamato
	Glu
	E
	2,19
	9,67
	4,25
	3,22
	Glutamina
	Gln
	Q
	2,17
	9,13
	
	5,65
	Histidina
	His
	H
	1,82
	9,17
	6,00
	7,59
	Isoleucina
	Ile
	I
	2,36
	9,68
	
	6,02
	Leucina
	Leu
	L
	2,36
	9,60
	
	5,98
	Lisina
	Lys (Lis)
	K
	2,18
	8,95
	10,53
	9,74
	Metionina
	Met
	M
	2,28
	9,21
	
	5,74
	Prolina
	Pro
	P
	1,99
	10,96
	
	6,48
	Serina
	Ser
	S
	2,21
	9,15
	
	5,68
	Tirosina
	Tyr (Tir)
	Y
	2,20
	9,11
	10,07
	5,66
	Treonina
	Ter
	T
	2,11
	9,62
	
	5,87
	Triptofano
	Trp
	W
	2,38
	9,39
	
	5,89
	Valina
	Val 
	V
	2,32
	9,62
	
	5,97
Duas abreviações de três letras para o mesmo aminoácido significam abreviação adotada no Inglês e no Português respectivamente. As demais são abreviações universais.
A titulação da glicina, um exemplo de aminoácido com 2 grupamentos ionizáveis, mostra que em pH muito ácido, a glicina tem ambos amina e carboxila protonadas (NH3+ e COOH respectivamente), iniciando a titulação com carga elétrica líquida +1. À medida que o pH vai aumentando, moléculas de glicina começam a liberar prótons da carboxila até que todas as moléculas estejam com a carboxila sem próton (COO-). Neste momento, a carga elétrica líquida da glicina é zero.À medida que o pH continua a aumentar, as moléculas de glicina perdem mais prótons, desta vez das aminas, até que todas estejam na forma de NH2. Neste momento todas as glicinas estarão com carga elétrica líquida -1 e seguirá assim até o fim da titulação. Entre a carga +1 e a zero, existirá um pK (pK1) onde 50% das moléculas de glicina estarão com a carboxila protonada (COOH) e 50% com a carboxila desprotonada (COO-) e assim a carga elétrica líquida será +0,5 e entre a carga zero e -1, existirá outro pK (pK2), onde 50% das moléculas de glicina estarão com a amina protonada (NH3+) e 50% com a amina desprotonada (NH2) e assim a carga elétrica líquida será -0,5. O somatório dos dois pKs dividido por 2 revelará o pI (ponto isoelétrico do aminoácido), que significa o valor de pH no qual o aminoácido está com carga absolutamente zero (figura 2).
A titulação de aminoácidos com 3 grupamentos ionizáveis como por exemplo o glutamato e a histidina mostra uma curva com três pKs. O glutamato, por ter duas carboxilas (incluindo a da cadeia lateral) e uma amina, inicia a sua titulação com carga elétrica líquida +1 e termina a titulação com carga elétrica líquida -2. A histidina por ter uma carboxila e duas regiões positivas (uma amina e um anel imidazol) inicia a titulação com carga elétrica líquida +2 e termina a titulação com carga elétrica líquida -1. Em ambos os casos o pI será a soma dos dois pKs mais próximos, dividido por 2 (figura 2).
Se a glicina for colocada em um ambiente com pH definido e submetida a um campo elétrico, esta se moverá para o lado positivo (anodo) em pHs acima do seu pI, pois pHs acima de 5,97 (pI da glicina) fará com que a molécula comece a adquirir carga elétrica líquida negativa. Em pHs abaixo do seu pI, a glicina, por adquirir carga elétrica líquida positiva, migrará para o lado negativo (catodo). Em pH 12,0 por exemplo ela migrará para o lado positivo com uma velocidade maior que em pH 9,6 pois em pH 12,0 a glicina está com carga elétrica líquida -1 e em pH 9,6 (valor referente ao seu pK2) a glicina estará com carga elétrica líquida -0,5. Em pH 5,97 (valor referente ao seu pI), a glicina não se deslocará no campo elétrico. 
Se glicina, histidina e glutamato forem submetidos a um campo elétrico em pH 5,97, a glicina não se deslocará, mas o glutamato, por ter pI 3,22 estará com carga negativa neste pH e migrará para o lado positivo. Já a histidina, por ter pI 7,59 estará com carga positiva neste pH e assim se deslocará para o lado negativo. Assim, diferentes aminoácidos podem ser separados em um campo elétrico com um pH definido, de acordo com seus pIs (esta técnica chamada de eletroforese será explicada ainda nesta unidade). Em resumo, pHs abaixo do pI do aminoácido fazem o aminoácido migrar para o lado negativo, pHs acima do pI fazem o aminoácido migrar para o lado negativo e pH igual ao pI não permite que o aminoácido se mova no campo elétrico. 
Figura 2: Curvas de titulação dos aminoácidos glicina, glutamato e histidina. O primeiro tem 2 grupamentos ionizáveis e os outros dois tem 3 grupamentos ionizáveis. As fórmulas predominantes ao longo da titulação são mostradas acima dos gráficos. Na curva de titulação da glicina os retângulos sombreados em vermelho indicam as duas regiões de tamponamento. Fonte: Lehninger, Princípios de Bioquímica.
Os aminoácidos se unem para formar proteínas através da ligação peptídica. Esta ligação covalente é formada a partir de uma reação entre o grupamento amina de um aminoácido e o grupamento carboxila do outro aminoácido, resultando na saída de uma molécula de água (figura 3). Esta reação química ocorre somente no citoplasma ou nas membranas do retículo endoplasmático rugoso das células, dentro de uma estrutura chamada ribossomo.
Figura 3: A ligação peptídica. Esta ligação (representada com um traço em vermelho) é formada a partir de uma reação de condensação entre o grupamento amina de um aminoácido e o grupamento carboxila do outro aminoácido. Fonte: www.colegiovascodagama.com, acesso em 18/10/2014.
Peptídeos
Os peptídeos são biomoléculas com uma quantidade pequena de aminoácidos. Diversos autores citam peptídeos como moléculas contendo 2 aminoácidos (dipeptídeos) ou de 3 até um máximo de 50 aminoácidos (oligopeptídeos). Acima de 50 aminoácidos a molécula já é considerada uma proteína. Peptídeos, apesar de pequenos, apresentam funções biológicas importantes: a ocitocina (com 9 aminoácidos), secretada pela hipófise, é responsável pelas contrações musculares do útero no parto e na produção de leite pelas glândulas mamárias; a bradicinina (com 9 aminoácidos) inibe inflamação nos tecidos; o glucagom (com 29 aminoácidos) é produzido pelo pâncreas em situações de hipoglicemia sanguínea; a glutationa (com 3 aminoácidos) atua como agente redutor e protege as células dos efeitos oxidantes de algumas substâncias como a água oxigenada; o hormônio antidiurético (com 9 aminoácidos) é sintetizado pelo hipotálamo e estimula os rins a reter água.
Estrutura e função das proteínas
Como descrito anteriormente, as proteínas são macromoléculas formadas por aminoácidos através de ligações peptídicas. As proteínas diferem quanto à quantidade e a sequência de aminoácidos que possuem. Por exemplo, duas proteínas contendo o mesmo número de aminoácidos não são necessariamente idênticas porque podem ter diferentes sequências de aminoácidos. O tamanho das proteínas varia desde moléculas pequenas como a insulina (com 51 aminoácidos de tamanho) até moléculas bem grandes como a hemoglobina (com 574 aminoácidos de tamanho).
As proteínas podem ser encontradas tanto intracelular quando extracelularmente e apresentam diversas funções, incluindo hormonal (ex: insulina, produzida pelo pâncreas e GH produzido na hipófise), nutricional (ex: caseína, a principal proteína do leite e ovalbumina, a principal proteína da clara do ovo), imunológica (ex: imunoglobulinas), contração (ex: actina e miosina, as principais proteínas de contração muscular), motilidade (ex: tubulina, encontrada no flagelo dos espermatozóides e cílios de protozoários), transporte (ex: hemoglobina, encontrada nas hemácias e albumina, transportadora de lipídios no plasma sanguíneo), estrutural (ex: colágeno e queratina) e enzimática (será detalhada no final desta unidade).
Baseada em sua composição as proteínas podem ser simples ou conjugadas. As simples apresentam somente aminoácidos na sua estrutura. As conjugadas apresentam, além de aminoácidos, outros componentes como íons (ex: ferro, zinco, cobre nas metaloproteínas) ou moléculas (ex: lipídios nas lipoproteínas, oligossacarídeos nas glicoproteínas e fosfato nas fosfoproteínas).
A estrutura das proteínas é bastante complexa. Distinguem-se quatro níveis de organização nas proteínas: estrutura primária, secundária, terciária e quaternária. A estrutura primária é a forma da proteína que acaba de ser sintetizada na célula. Esta forma contém aminoácidos unidos por ligações peptídicas e em algumas proteínas, também por pontes (ligações) dissulfeto. Esta ligação covalente (em alguns casos referida também como interação química) ocorre através de uma reação química entre os grupamentos sulfidrila (SH) das cadeias laterais dos aminoácidos cisteína que estão próximos na cadeia polipeptídica, criando uma ligação covalente entre dois átomos de enxofre (S-S). 
Cada estrutura primária é formada de acordo com a informação genética contida nos genes do organismo. Atualmente são conhecidas a estrutura primária de centenas de proteínas. A primeira a ter a sua estrutura elucidada foi a insulina, com 2 cadeias peptídicas, uma com 21 e outra com 30 aminoácidos, contendo 3 pontes dissulfeto. A forma primária de uma proteína ainda não tem função. Para ter função esta forma deverá assumir uma conformação final: secundária, terciária ou quaternária. Abaixo um modelo de dobramento de uma proteína sem forma definida e consequentemente sem função (estrutura primária) para uma forma terciária (figura 4).
Figura 4: Dobramento (enovelamento) de uma proteína. A estruturaprimária (proteína recém-sintetizada na célula) assumindo a forma final terciária. Esta figura é representada como modelo em fita. Fonte: www.dc205.4shared.com, acesso em 18/10/2014.
A estrutura secundária pode se apresentar como dois modelos: a α-hélice e a folha-β (ou β-pregueada). Em ambos os modelos a estrutura secundária é estabilizada por pontes de hidrogênio. Na estrutura α-hélice, as pontes de hidrogênio ocorrem entre o oxigênio da região C=O da ligação peptídica de um aminoácido e o hidrogênio da região N-H da ligação peptídica de outro aminoácido, distantes 4 aminoácidos entre si, criando uma forma helicoidal, daí o nome hélice (figura 5). Além disso, nesta conformação costumam ocorrer com freqüência interações eletrostáticas entre cadeias laterais de cargas opostas e interações hidrofóbicas entre cadeias laterais apolares dos aminoácidos, pois em ambos os casos estas cadeias laterais estão distantes 3 ou 4 aminoácidos, fazendo com que estas interações possam ocorrer e assim contribuir para a configuração da hélice. A folha-β é bem diferente da alfa hélice, pois é quase totalmente distendida ao invés de enrolada. A folha-β é estabilizada por pontes de hidrogênio entre grupos N-H e C=O de 2 ou mais moléculas polipeptídicas adjacentes, estas que podem estar paralelas (no mesmo sentido) ou antiparalelas (sentidos opostos), enquanto que nas α-hélices as pontes de hidrogênio entre grupos N-H e C=O são na mesma molécula (figura 5). 
As formas secundárias, também conhecidas como estruturas fibrosas, são conhecidamente insolúveis em água. A explicação se baseia no fato destas proteínas apresentarem muitos aminoácidos com cadeias laterais apolares, tanto no interior quanto na superfície da proteína assim como a maioria das cadeias laterais polares dos aminoácidos estarem no interior da proteína, escondidas da água, dificultando ainda mais a interação da água com a proteína. 
Figura 5: As conformações secundárias das proteínas. Na conformação A, encontra-se a α-hélice e na conformação B encontra-se a folha-β no modelo antiparalelo. Ambas as formas são estabilizadas por pontes de hidrogênio. As regiões R representam as cadeias laterais dos aminoácidos. Fonte: www.bioquimica.faculdade.zip.net, acesso em 19/10/2014.
O colágeno, proteína mais abundante dos vertebrados (representa mais de 30% do total de proteínas), encontrado na pele, dentina, córnea, tendões, cartilagens e ossos é uma proteína fibrosa. O colágeno é classificado em 12 tipos (I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI e XII), sendo o tipo I o mais comum, amplamente distribuído pelo corpo. Cada molécula de colágeno pode se apresentar como uma estrutura em hélice simples ou conter 3 cadeias polipeptídicas (tripla hélice) enroladas uma em torno da outra, criando uma estrutura chamada super-hélice (também referida como estrutura quaternária do colágeno), bastante resistente, estabilizadas por pontes de hidrogênio e algumas ligações covalentes cruzadas (figura 6). Analisando a sua composição química, encontram-se muitos aminoácidos com cadeia lateral apolar, incluindo 35% de glicina, 11% de alanina e 21% de prolina/4-hidroxiprolina, o que, em parte, explica sua insolubilidade em água. No corpo humano, o colágeno desempenha várias funções como, por exemplo, unir e fortalecer tecidos. A deficiência de colágeno no organismo leva a um quadro de colagenose, gerando má formação óssea, rigidez muscular, inflamação de juntas ósseas etc. Na formação do colágeno é necessária a participação da vitamina C. Sob deficiência desta vitamina pode ocorrer o escorbuto, uma doença cujos sintomas vão desde hemorragias na gengiva, fragilidade dos vasos sanguíneos até a morte. Mutações nos genes relacionados ao colágeno levam a produção de proteínas anormais. A osteogênese imperfeita é uma doença rara (1:25.000 nascimentos) relacionada a um defeito na síntese de colágeno tipo I, que leva a uma formação óssea anormal em bebês, com conseqüentes fraturas e deformidades ósseas. Já a doença Ehlers-Danlos (1:3.000.000 nascimentos) se caracteriza por um defeito na síntese de colágeno tipo I, III ou IV, levando a frouxidão em ligamentos, hipotonia muscular, desvios de coluna etc.
Figura 6: Estrutura do colágeno. Em A, está o colágeno evidenciando os seus principais aminoácidos. Em B, está a representação das 3 moléculas adjacentes de colágeno e em C a união das 3 moléculas, criando a super-hélice. Fonte: www.bifi.es, acesso em 19/10/2014.
A queratina, outra proteína fibrosa, é encontrada nos animais na pele, cabelos, unhas, garras, chifres, cascos e penas. Sua composição de aminoácidos revela um alto número dos aminoácidos hidrofóbicos alanina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina e metionina. A queratina apresenta duas cadeias polipeptídicas enroladas em espiral, contendo ligações covalentes cruzadas através de um grande número de pontes dissulfeto, conferindo à molécula alta resistência. 
A elastina é uma proteína fibrosa encontrada em vários locais do corpo dos animais vertebrados como no pavilhão auditivo, na epiglote, em algumas cartilagens e nas artérias elásticas. Tal como o colageno, ela é produzida pelos fibroblastos do tecido conectivo (derme). A elastina se caracteriza por formar fibras mais finas que aquelas formadas pelo colágeno. Essas fibras cedem bastante à tração, mas retornam à forma original quando é cessada a força, portanto a elastina confere a estas fibras elasticidade e resistência. Assim como o colágeno e a queratina, a elastina é uma proteína composta na sua maioria por aminoácidos com cadeia lateral apolar (glicina, valina, alanina e prolina).
A estrutura terciária das proteínas é conhecida como estrutura globular ou enovelada. As proteínas terciárias são solúveis em água por apresentarem a maioria das cadeias laterais de aminoácidos hidrofóbicos voltadas para o interior da proteína, enquanto a maioria das cadeias laterais polares está exposta facilitando a interação da água por pontes de hidrogênio e interações eletrostáticas. Proteínas enoveladas podem conter várias regiões α-hélice, várias regiões folha-β ou uma mistura das duas regiões. Encontramos neste modelo de proteína um alto número de interações entre as cadeias laterais dos aminoácidos, incluindo as pontes dissulfeto, interações hidrofóbicas, pontes de hidrogênio e interações eletrostáticas, isto porque os aminoácidos que estão distantes na proteína podem interagir nesta forma terciária devido ao enovelamento poder aproximar aminoácidos muito distantes, até mesmo o primeiro e o último aminoácido da cadeia polipeptídica.
A mioglobina, uma proteína pequena, com 153 aminoácidos e um grupo heme (consiste de uma estrutura orgânica cíclica, a protoporfirina, no qual se encontra um átomo de ferro no estado ferroso, Fe++, capaz de se ligar reversivelmente ao oxigênio) é um exemplo de estrutura terciária (figura 7). Sua estrutura molecular mostra 78% de regiões α-hélice e sem regiões folha-β. Presente no citoplasma das células musculares, a mioglobina é uma proteína transportadora e armazenadora de oxigênio nos músculos estriados do corpo (músculos esqueléticos e cardíaco). O interior da molécula é bastante apolar, contendo muitos aminoácidos leucina, valina, metionina e fenilalanina; já o exterior da molécula é bastante polar. Esta proteína não contém pontes dissulfeto, porém apresenta várias interações hidrofóbicas, interações eletrostáticas e pontes de hidrogênio. 
O citocromo C, uma proteína de 104 aminoácidos, é também uma proteína terciária contendo heme. A proteína está relacionada com a cadeia respiratória mitocondrial e funciona como uma transportadora de elétrons (esta função será estudada nas próximas unidades). Apenas cerca de 40% da proteína é formada por α-hélice; o restante da proteína não contém folhas-β, no entanto é composta por segmentos enovelados irregularmente e estendidos.
Diferente do observado na mioglobina e no citocromo C, a lisozima, uma proteína terciária de 129 aminoácidos, contém tanto regiões α-hélice quanto folhas-β. Enquanto as regiõesα-hélice são representadas por espirais, as regiões folhas-β são representadas por setas (figura 7). Esta proteína está presente na saliva, lágrima e na clara do ovo e atua como bactericida, quebrando ligações químicas de moléculas chamadas peptidoglicano, presentes na parede celular de bactérias Gram+, como por exemplo bactérias dos gêneros Estafilococos e Estreptococos.
A estrutura quaternária das proteínas se refere à união de duas ou mais cadeias polipeptídicas terciárias, podendo chegar a centenas de cadeias polipeptídicas terciárias agrupadas. Sendo assim, a estrutura quaternária é também chamada de globular, enovelada ou solúvel e possui as mesmas interações químicas encontradas na estrutura terciária. 
A primeira proteína quaternária a ter a sua estrutura decifrada foi a hemoglobina. Esta proteína, de 574 aminoácidos, presente nas hemácias, contém quatro cadeias terciárias, sendo duas de 141 aminoácidos (cadeias α) e duas de 146 aminoácidos (cadeias β), estabilizadas por pontes de hidrogênio e interações eletrostáticas (figura 7). Apesar das cadeias terem estas denominações, em nada se refere às estruturas secundárias estudadas anteriormente, pois a hemoglobina não apresenta regiões folha-β, mas somente regiões α-hélice. Cada cadeia polipeptídica contém um grupamento heme, capaz de ligar ao oxigênio. Sua função é a de transportar oxigênio dos pulmões para os tecidos e gás carbônico dos tecidos para os pulmões para liberação pela respiração. Enquanto a mioglobina apresenta alta afinidade pelo oxigênio, a hemoglobina apresenta afinidade que aumenta à medida que o primeiro oxigênio se liga, facilitando a ligação dos outros oxigênios. De modo inverso, a saída do primeiro oxigênio da hemoglobina para os tecidos facilita a liberação dos demais. A ligação dos oxigênios à hemoglobina é afetada por vários fatores: assim que o sangue atinge os tecidos, moléculas de CO2 se difundem para as hemácias, causando redução do pH nos tecidos. Esta redução do pH favorece a liberação do oxigênio da hemoglobina. Quando as hemácias chegam aos pulmões, o CO2 liberado aumenta o pH e consequentemente aumenta a ligação de novas moléculas de O2 à hemoglobina. Este efeito do pH e da concentração de CO2 sobre a ligação e liberação de O2 pela hemoglobina é chamada de efeito Bohr; o 2,3-BPG (2,3-bifosfoglicerato, produzido à partir do 1,3-bifosfoglicerato, que será estudado nas próximas unidades) regula a ligação do oxigênio à hemoglobina. Nas hemácias o 2,3-BPG diminui a afinidade do oxigênio à hemoglobina por se ligar a hemoglobina desoxigenada, mas não à hemoglobina já com oxigênio. Ao nível do mar, nos pulmões, a quantidade de O2 liberada nos tecidos está em 40% do máximo que pode ser transportada pelo sangue. Em grandes altitudes, a entrega de O2 diminui, entretanto um aumento na concentração de 2,3-BPG diminui a afinidade da hemoglobina pelo O2, facilitando a entrega do O2 da hemoglobina para os tecidos e melhorando a respiração no ambiente com pouco oxigênio.
Figura 7: As estruturas moleculares da mioglobina, lisozima e hemoglobina (representação em fita). A mioglobina (A) e a lisozima (B) são proteínas terciárias por serem somente formadas por uma única proteína enovelada. Já a hemoglobina (C) é uma proteína quaternária por ser formada por mais de uma proteína terciária (neste caso, formada por quatro proteínas terciárias representadas por cores diferentes). A estrutura heme da mioglobina e as cadeias laterais dos aminoácidos no local de ligação da lisozima à parede celular das bactérias Gram+ estão mostradas em vermelho. As regiões α-hélice são representadas por espirais enquanto as regiões folhas-β são representadas por setas. Fonte: Lehninger, Princípios de Bioquímica. 
Várias enfermidades são associadas a problemas relacionados à hemoglobina e são conhecidas como hemoglobinopatias: na anemia falciforme, uma mutação nos genes para as cadeias β da hemoglobina (localizados no cromossomo 11) faz com que estas cadeias apresentem uma modificação de ácido glutâmico (aminoácido com cadeia lateral polar) para valina (aminoácido com cadeia lateral apolar) no 6º aminoácido das duas cadeias β da hemoglobina. Em condições de baixa tensão de oxigênio as moléculas de hemoglobina agregam-se levando à formação de polímeros fibrosos de hemoglobina com precipitação destas moléculas e conseqüente deformação das hemácias para uma forma de foice, provocando isquemia local, hemólise acentuada, coágulos, acidentes vasculares cerebrais dentre outros problemas, levando em alguns casos a morte. Já as talassemias são doenças relacionadas à hemoglobina por serem caracterizadas pela redução ou ausência da síntese das cadeias α ou β da hemoglobina, levando a quadros de anemia desde leve até profunda, hepatomegalia, esplenomegalia e outros problemas também potencialmente fatais.
Desnaturação de proteínas
As proteínas podem sofrer desnaturação. A desnaturação é a perda da estrutura da proteína (através do rompimento de suas interações químicas, com exceção das ligações peptídicas) com conseqüente perda parcial ou total da sua função biológica. 
O aquecimento do ovo revela um modelo de desnaturação. A ovalbumina da clara do ovo é um exemplo de proteína que ao sofrer desnaturação não renatura mais. A clara do ovo antes de ser submetida à alta temperatura é líquida e incolor, mas ao ser aquecida se torna branca e sólida, evidenciando a desnaturação da proteína, no entanto ao resfriarmos o ovo, a clara não volta mais a ser líquida e transparente. A febre alta pode causar uma leve desnaturação de algumas proteínas do corpo. Vários agentes químicos e físicos podem causar desnaturação em uma proteína. Dentre eles, podemos citar:
a) alteração no pH: rompe interações eletrostáticas e pontes de hidrogênio na proteína;
b) alta temperatura: rompe interações eletrostáticas, interações hidrofóbicas e pontes de hidrogênio na proteína;
c) detergentes: rompem interações hidrofóbicas na proteína;
d) solventes orgânicos: rompem interações hidrofóbicas na proteína;
e) redutores: rompem pontes dissulfeto na proteína;
f) metais pesados: rompem interações eletrostáticas na proteína;
g) radiações: dependendo da radiação (U.V, X, gama) pode romper qualquer interação química na proteína.
A modelagem do cabelo em um salão de beleza é um processo que envolve desnaturação. O cabelo é submetido a um agente redutor (geralmente tioglicolato, guanidina, formol etc) e também à alta temperatura (com auxílio de touca térmica). Deste modo, rompem-se todas as interações (interações eletrostáticas, interações hidrofóbicas, pontes dissulfeto e pontes de hidrogênio) da queratina. Após certo tempo, remove-se o agente redutor, aplica-se um agente oxidante e resfria-se o cabelo, restaurando a conformação em α-hélice da queratina, mas com pontes dissulfeto em locais diferentes do usual na queratina, por isso consegue-se moldar o fio do jeito que se deseja.
Algumas proteínas podem, ao ser removido o agente redutor, sofrer renaturação, recuperando a sua forma nativa e consequentemente a sua função biológica. A ribonuclease, uma proteína terciária secretada pelo pâncreas e liberada no intestino delgado para a quebra de RNAs oriundos da dieta é um exemplo de proteína que consegue se renaturar. 
Técnicas de estudo das proteínas
Uma célula bacteriana, como a Escherichia coli, contém cerca de 3.000 proteínas diferentes. Uma célula humana produz mais de 50.000 proteínas. Como uma delas pode ser purificada e identificada no meio de tantas outras? Atualmente, várias técnicas de separação e purificação de proteínas são usadas rotineiramente em laboratórios que trabalham com proteínas. 
Para isolar uma proteína, é necessária uma fonte desta molécula, que pode ser um microorganismo como uma bactéria, protozoário ou fungo, tecidos vegetais ou animais ou até mesmo alimentos como leite.
O primeiro passo é o rompimento das células para a obtenção do extrato bruto ou também referido como extrato total. Com o extrato, pode-se fazer uma separação inicial por diferenças de solubilidadeatravés da técnica de “salting out” onde a adição de sal (geralmente sulfato de amônio) pode precipitar algumas proteínas enquanto outras permanecerão solúveis. No leite, por exemplo, não há a necessidade da etapa de obtenção do extrato bruto pelo fato de não haver células para serem rompidas, sendo assim o leite já é o extrato total.
Os métodos mais comuns utilizados em laboratórios para a separação e purificação de proteínas são a cromatografia em coluna e a eletroforese. Na cromatografia, uma resina (material sólido e poroso) é colocada em uma coluna contendo uma solução tampão. Uma solução de proteínas é adicionada no topo da coluna e migrada ao longo desta. Logo abaixo existem tubos para coletar frações de proteínas. As proteínas migram mais lentamente ou mais rapidamente na coluna dependendo das características das proteínas e do material contido na coluna, assim as proteínas podem se prender ou são liberadas da coluna (eluídas) em momentos distintos (figura 8). 
Várias cromatografias são conhecidas: a cromatografia de troca iônica contém na coluna uma resina com um polímero sintético carregado negativamente (resina aniônica) ou positivamente (resina catiônica). Se uma solução de proteínas for migrada em uma resina aniônica, as proteínas de carga positiva (contendo muitas cadeias laterais dos aminoácidos lisina, arginina e histidina) ficarão presas na matriz porosa enquanto as negativas (contendo muitas cadeias laterais dos aminoácidos glutamato e aspartato) migrarão mais facilmente e serão eluídas primeiro. Deste modo a cromatografia de troca iônica separa proteínas por carga elétrica; a cromatografia de gel filtração separa as proteínas pelo tamanho, onde a matriz da coluna contém poros por onde as proteínas menores entram e ficam mais tempo retidas e as proteínas maiores, por não entrar nestes poros passam mais facilmente, sendo então eluídas primeiro; a cromatografia de fase reversa separa proteínas pela sua hidrofobicidade, onde as mais hidrofóbicas ficam presas na resina da coluna e as mais hidrofílicas saem facilmente; a cromatografia de afinidade separa proteínas pelas suas especificidades de ligação, onde as proteínas retidas na coluna estão presas a um ligante (referido como anticorpo) para a proteína de interesse e as demais são liberadas da coluna. Deste modo esta cromatografia é a mais específica de todas, mas infelizmente não existem muitos anticorpos disponíveis para ligar às diferentes proteínas conhecidas. 
Figura 8: Modelos de cromatografias em coluna. Aqui estão mostrados três tipos comuns de cromatografias. Em A, a cromatografia de troca iônica, em B, a cromatografia de gel-filtração e em C, a cromatografia de afinidade. Fonte: Lehninger, Princípios de Bioquímica.
A eletroforese se baseia na migração de proteínas carregadas em um campo elétrico. A eletroforese pode atuar sozinha ou em conjunto com a cromatografia no sentido de revelar o número de proteínas e o grau de pureza em uma amostra. Além disso, os diferentes tipos de eletroforese fornecem o tamanho e o pI de uma proteína (figura 9). 
A eletroforese simples é geralmente executada em um gel de poliacrilamida, um polímero capaz de separar proteínas pelo tamanho. Na preparação do gel utiliza-se um detergente, o dodecil sulfato de sódio (SDS) que se liga por interações hidrofóbicas às proteínas e confere as mesmas, carga negativa, independente dos aminoácidos que a proteína possua, assim todas as proteínas inseridas no gel terão a mesma carga. Além disso, pelo fato do SDS ser um detergente, ele desnatura as proteínas que serão aplicadas no gel, facilitando a migração das mesmas. Uma corrente elétrica faz as proteínas irem em direção ao pólo positivo, onde as proteínas menores migram mais rapidamente e as maiores migram mais lentamente formando “bandas” que são reveladas após coloração do gel com um corante chamado azul Coomassie que cora proteínas, mas não cora o gel. Proteínas secundárias e terciárias formam apenas uma banda no gel, mas proteínas quaternárias formam um número de bandas que é dependente do tamanho e número de suas cadeias polipeptídicas. Se duas ou mais proteínas apresentam o mesmo tamanho ou tamanho muito aproximado, estas estarão praticamente na mesma localização no gel, criando uma banda mais forte. Para facilitar a determinação do tamanho de uma proteína de interesse, utiliza-se um padrão de peso molecular que é na verdade uma solução contendo proteínas conhecidas e com tamanhos definidos, esta que é aplicada no gel junto com a amostra de proteínas a ser identificada. É comum após a obtenção de um extrato bruto ou de uma cromatografia realizar uma eletroforese para saber o número de proteínas na amostra e verificar se este número diminui após as purificações.
A eletroforese bidimensional separa proteínas pelo tamanho e pI da proteína, sendo então mais eficiente na separação das proteínas que a eletroforese convencional, porém mais trabalhosa. Um gradiente de pH é criado através da adição de ácidos e bases sob ação de um campo elétrico ao longo de um gel. Quando proteínas são aplicadas, cada uma irá migrar até a região de pH idêntico ao seu pI. Em seguida as proteínas são migradas para separação por tamanho. Como as proteínas tem tamanhos e pIs diferentes, a separação é maior. Neste gel as proteínas não são vistas como bandas, mas como pontos (spots), onde cada ponto é referente a uma ou poucas proteínas. 
O pI de uma proteína é dependente dos valores de pK de todos os grupamentos ionizáveis dos aminoácidos. A maioria das proteínas apresenta pI na faixa de 4,0 à 7,0 mas algumas proteínas podem apresentar pIs muito baixos ou muito altos. Por exemplo, a pepsina, uma proteína estomacal tem pI aproximado de 1,5 por conter muitos aminoácidos ácidos (glutamato e aspartato) enquanto citocromo C apresenta pI próximo de 10,0 por apresentar muitos aminoácidos básicos (lisina, arginina e histidina).
Figura 9: A eletroforese. Em A, uma simulação de uma eletroforese simples onde um padrão de peso molecular e uma proteína com tamanho desconhecido são migradas em gel de poliacrilamida na presença de SDS. Em B, gel de eletroforese simples mostrando etapas da purificação da enzima RNA polimerase de Escherichia coli, onde a primeira faixa com proteína mostra o extrato total e as faixas sucessivas (da esquerda para a direita) mostram as proteínas restantes a cada passo de purificação. Na última faixa a proteína já está purificada, mas como a RNA polimerase tem 4 subunidades, é possível a visualização de 4 bandas, duas muito próximas de maior tamanho e duas mais afastadas. Em C, eletroforese bidimensional de proteínas intracelulares do fungo Cryptococcus neoformans. As proteínas foram separadas em um gradiente de pH entre 4,0 e 10,0 para depois serem separadas por tamanho. O padrão de peso molecular foi aplicado somente no segundo gel. Fontes: Lehninger, Princípios de Bioquímica e www.ufrgs.br, acesso em 19/10/2014.
Enzimas
As enzimas são moléculas capazes de acelerar reações químicas, catalisando reações tanto dentro quanto fora das células (por exemplo, em lúmen de órgãos). Com exceção de alguns RNAs com atividade catalítica, todas as enzimas são proteínas. As enzimas podem acelerar uma reação química no mínimo 106 vezes em relação à mesma reação não catalisada, sendo que algumas enzimas aceleram a reação na ordem de 1017 vezes. Alguns aspectos importantes sobre as enzimas incluem:
1. Alto grau de especificidade;
2. Catálise de reações de síntese e degradação de moléculas;
3. Conservação e transformação de energia química;
4. Algumas doenças são o resultado da ausência de uma ou mais enzimas e outras pelo excesso da atividade de uma determinada enzima;
5. Muitos medicamentos e toxinas exercem seu efeito biológico através da interação com enzimas;
6. Algumas enzimas são utilizadas no diagnóstico de doenças através da medida da sua atividade;
7. São ferramentas importantes na indústria química, no processamento de alimentos e na agricultura;
8. Possuem mecanismo de renovação, desempenhando amesma função consecutivamente, sem serem consumidas no processo.
Cada organismo vivo produz centenas de enzimas em pequenas quantidades. Os microorganismos podem produzir enzimas em quantidades muito altas e as excretar no ambiente como mecanismo de digestão extracelular. 
As enzimas são classificadas de acordo com as reações que catalisam em seis classes (tabela 2). Uma classe bastante conhecida é a das hidrolases. Estas enzimas utilizam a água para a quebra de ligações químicas. No tubo digestivo, praticamente todas as enzimas são hidrolases, quebrando, com o auxílio da água, proteínas, triglicerídeos, fosfolipídios, oligossacarídeos, polissacarídeos e outras moléculas. Nos lisossomos das células, existem cerca de 50 tipos diferentes de hidrolases, por isso esta organela tem a função primordial de digestão intracelular. 
Tabela 2: Classes de enzimas
	Classes
	Subclasses 
	Óxido-redutases
	desidrogenases, oxidases, peroxidases, catalase, oxigenases, hidroxilases
	Transferases
	transaldolases e transcetolases, acil, metil, glicosil e fosforiltransferases, quinases, fosfomutases
	Hidrolases
	esterases, glicosidases, peptidases, fosfatases
tiolases, fosfolipases, amidases, desamidases
ribonucleases
	Liases
	descarboxilases, aldolases, hidratases, desidratases
sintases, liases
	Isomerases
	racemases, epimerases, isomerases, mutases
	Ligases
	sintetases, carboxilases
As óxido-redutases catalisam reações de oxidação e redução entre moléculas; as transferases transferem grupos funcionais entre doadores e aceptores, sendo os grupos amino, acil, fosfato, carbono e glicosil, os principais resíduos transferidos; as hidrolases usam a água para a clivagem hidrolítica de ligações C-O, C-N, O-P e C-S; as liases adicionam ou removem os elementos da água, de amônia ou de dióxido de carbono para a formação ou rompimento de ligações duplas; as isomerases catalisam isomerizações de vários tipos, entre elas as interconversões cis-trans e aldose-cetose e as ligases estão envolvidas em reações de síntese, nas quais duas moléculas são unidas, às custas do ATP.
Como as enzimas funcionam? As enzimas atuam em moléculas específicas chamadas substratos. Devido à alta especificidade das enzimas, a maioria reage com apenas um substrato, no entanto algumas enzimas podem ter mais de um substrato. Durante a reação, os substratos se convertem em produtos. A ligação do substrato na enzima ocorre em uma região da enzima chamada sítio ativo (ou centro ativo), contendo várias cadeias laterais de aminoácidos capazes de ligação ao substrato por interações eletrostáticas, interações hidrofóbicas ou pontes de hidrogênio (figura 10). 
A reação enzimática é esquematizada como se segue:
E + S 
 ES 
 EP 
 E + P
onde E = enzima, S = substrato e P = produto. A enzima não se altera durante o curso da reação, somente o substrato, este que se torna produto.
Figura 10: Interação enzima-substrato. Na figura acima, o substrato se liga na enzima em um local chamado sítio ativo, formando o complexo ES. Em seguida ocorre a catálise, formando um produto da reação que é liberado do sítio ativo da enzima. Fonte: www.biologiaufsj.blogspot.com, acesso em 20/10/2014.
Existem dois modelos de interação enzima substrato: o modelo chave-fechadura e o modelo do ajuste induzido. No primeiro modelo, o substrato se encaixa perfeitamente no sítio ativo da enzima; no segundo modelo o substrato induz uma pequena alteração conformacional na enzima, promovendo o reposicionamento dos aminoácidos do sítio ativo para que o substrato se encaixe na enzima (figura 11).
 
Figura 11: Modelos de interação enzima-substrato. Fonte: www.docentes.esalq.usp.br, acesso em 19/10/2014.
Algumas enzimas são designadas pela incorporação do sufixo “ase” ao nome do substrato no qual elas atuam. Por exemplo, a enzima maltase atua quebrando a maltose, a amilase quebra o amido, a β-galactosidase (lactase) quebra a lactose etc. Em outros casos a designação é devido a reação que catalisa, por exemplo, glicose 6-fosfatase remove o fosfato do carbono 6 da glicose. 
Para uma enzima atuar são necessários alguns requerimentos: pH ideal, temperatura ideal, substrato disponível e em alguns casos a presença de um cofator, uma coenzima ou ambos. O pH e a temperatura ideais são necessários devido ao fato de alterações nestes parâmetros levarem a quebra de interações da proteína (desnaturação) e conseqüente perda da atividade enzimática. Enzimas humanas têm sua atividade ótima em temperaturas entre 36,5 e 37,5. Com relação ao pH, algumas enzimas como a pepsina tem atividade ótima em pH próximo de 2,0 enquanto tripsina (uma proteína do suco entérico) tem atividade ótima em pH próximo de 8,0. Deste modo, a influência da temperatura e do pH na atividade das enzimas pode ser vista em gráficos onde a atividade ótima de uma enzima ocorre em temperatura e pH ideais (figura 12). 
Figura 12: Influência da temperatura e do pH na atividade das enzimas. As enzimas são testadas em diferentes temperaturas e pHs, fornecendo gráficos onde as curvas mostram atividade ótima das enzimas em temperatura e pH específicos. Fora do ponto ótimo as enzimas vão perdendo a atividade por estarem sofrendo desnaturação. Fonte: www.dc347.4shared.com, acesso em 20/10/2014.
Os cofatores são íons importantes para o funcionamento de algumas enzimas (tabela 3). Estes íons alteram o sítio ativo da enzima ou finalizam o encaixe correto do substrato na enzima.
Tabela 3: Alguns enzimas e seus cofatores 
	Enzimas
	Cofatores (elementos inorgânicos)
	citocromo oxidase
	Cu+2
	catalase, peroxidase
	Fe+2 ou Fe+3
	piruvato quinase
	K+
	hexoquinase
	Mg+2
	arginase
	Mn+2
	urease
	Ni+2
	álcool desidrogenase
	Zn+2
As coenzimas são moléculas derivadas de vitaminas (daí a importância de muitas vitaminas na nossa dieta). As coenzimas, seus precursores e as reações nas quais estão envolvidas se encontram na tabela abaixo:
Tabela 4: Alguns enzimas e suas coenzimas
	Enzimas
	Coenzimas
	Precursores dietéticos
	Grupos químicos transferidos
	piruvato desidrogenase
	tiamina pirofosfato (TTP)
	tiamina (vitamina B1)
	aldeídos
	isocitrato desidrogenase
	nicotinamida adenina dinucleotideo (NAD)
	niacina (vitamina PP)
	íon hidreto (:H-)
	acetil CoA carboxilase
	coenzima A
	ácido pantotênico (vitamina B5)
	acilas
	piruvato carboxilase
	biocitina
	biotina (vitamina H)
	CO2
	succinato desidrogenase
	flavina adenina dinucleotideo (FAD)
	riboflavina (vitamina B2)
	elétrons e prótons
	glicogênio fosforilase
	piridoxal fosfato
	piridoxina (vitamina B6)
	grupos amino
	timidilato sintase
	tetrahidrofolato
	ácido fólico (vitamina B9)
	grupos de 1 C
De acordo com a termodinâmica, as enzimas aceleram as reações químicas convertendo substrato em produto através da diminuição da energia de ativação das reações químicas. Esta está relacionada com quanta barreira existe para o substrato se converter em produto. Mudança na energia de ativação (ou energia livre de ativação, representada por ΔG‡) acontece quando a enzima interage com substrato, estabilizando o substrato em uma forma que permitirá a formação de produto. Este é chamado estado de transição. Quanto mais estável é o estado de transição, menos energia será necessária para a conversão de substrato em produto e mais rápida será a reação. A velocidade de uma reação é então inversamente proporcional ao valor de sua energia livre de ativação: quanto maior o valor de ΔG‡, menor será a velocidade da reação (figura 13).
Figura 13: Diagrama de uma reação catalítica, mostrando o nível de energia em cada etapa da reação. Normalmente o substrato necessita de uma quantidade elevada de energia para conseguir chegar ao estado de transição, decaindo depois até a um produto final. A enzima estabiliza o estado de transição, diminuindo a energia de ativação, assim reduzindo o valor de energia necessário para que se formem os produtos. ΔG’o: energia livre padrão na bioquímica; ΔG‡: energia de ativação; cat: catalisada; não cat: não catalisada. Fonte: www.lookfordiagnosis.com, acesso em 20/10/2014.A cinética enzimática (estudo da atividade de uma reação enzimática) mostra indiretamente a especificidade das enzimas, o mecanismo de ação, os fatores que podem afetar a velocidade das reações, a concentração de substrato ideal para a dosagem de uma enzima etc. A relação entre a velocidade de uma reação enzimática (conversão de substrato em produto por tempo) e a concentração do seu substrato foi definida por Leonor Michaelis e Maud Menten. Em experimentos cinéticos, se mede a velocidade inicial (Vo) da reação em função do aumento do substrato. Em concentrações baixas de substrato, a Vo aumenta com o aumento do substrato até que a reação tenha uma quantidade de substrato na qual a enzima não consegue ser mais veloz na formação de produto, atingindo assim a velocidade máxima (Vmax) da reação (figura 14). 
A Vmax é a velocidade máxima de uma reação catalisada por uma enzima e reflete o momento em que todas as enzimas estão ocupadas com substrato (estão na forma ES) e a velocidade da reação não aumenta com a introdução de novos substratos. Existindo substrato em excesso na reação, a Vmax aumenta com a introdução de mais enzima, assim a velocidade inicial da reação enzimática (Vo) é diretamente proporcional à concentração de enzima em condições de excesso de substrato. Saber a Vmax das reações enzimáticas é importante na dosagem de enzimas principalmente na clínica, onde se escolhe uma concentração de substrato necessária para a enzima trabalhar na Vmax e assim garantir uma condição ótima para a dosagem da enzima. 
Um outro parâmetro, o Km, é a concentração de substrato necessária para a enzima trabalhar na metade da velocidade máxima (figura 14). A concentração da enzima não afeta o Km da reação, pois a afinidade da enzima pelo substrato será a mesma. Um baixo Km significa uma alta afinidade da enzima pelo substrato, onde a Vmax será atingida com pouca concentração de substrato. Um alto Km significa baixa afinidade da enzima pelo substrato. Na cinética, uma curva mais “em pé” terá um baixo Km assim como uma curva mais “deitada” terá um maior Km. Desse modo os dois parâmetros (Vmax e Km) são essenciais para determinar a atividade de uma enzima. O Km de algumas reações enzimáticas estão exemplificados abaixo (tabela 5). 
Tabela 5: Valor de Km para algumas reações enzimáticas
	Enzima
	Substrato
	Km (mM)
	hexoquinase
	ATP
D-glicose
D-frutose
	0.4
0.15
1.5
	anidrase carbônica
	HCO3-
	8
	treonina desaminase
	L-treonina
	5
Enzimas com mais de um substrato apresentam diferentes velocidades e afinidades, refletindo em mudanças na cinética (figura 14, tabela 5). Cada enzima tem uma Vmax e um Km específicos, levando-se em consideração as condições de temperatura e pH ideais.
Figura 14: Cinética enzimática. Em A, o efeito da concentração do substrato na velocidade inicial catalisada por uma enzima é mostrada em uma curva onde à medida que se aumenta o substrato, a velocidade da reação aumenta até que em um dado momento todas as enzimas estarão ocupadas com substrato (saturadas), atingindo assim a Vmax. O Km é a concentração de substrato necessária para a enzima trabalhar na metade da Vmax e reflete a afinidade da enzima pelo seu substrato. Um baixo Km significa uma alta afinidade da enzima pelo substrato e vice-versa. Em B, cinética da enzima hexoquinase com 2 substratos: glicose e frutose. O Km para glicose é de 0,15 mM e para frutose é de 1,5mM (ambos não mostrados). Isso significa que é necessária uma concentração de 0,15mM de glicose para que metade da enzima disponível encontre-se ligada a glicose, formando o complexo ES, no entanto é necessária uma concentração de frutose 10 vezes maior, ou seja, 1,5mM. A hexoquinase tem, portanto, afinidade muito maior pela glicose do que pela frutose. Fontes: www.dc349.4shared.com e www.ebah.com.br, acessos em 20/10/2014.
As enzimas intracelulares e extracelulares costumam trabalhar com concentrações baixas de substrato, ou seja, nunca estão saturadas de substrato. O Kcat (constante catalítica) avalia a eficiência catalítica de uma enzima, representando o número de moléculas de substrato convertidas em produto por segundo, por enzima. A constante catalítica de uma enzima pode ser desde muito baixa (Kcat S-1 = 299 para a enzima citidina desaminase) até muito alta (Kcat S-1 = 1.000.000 para a enzima anidrase carbônica). A relação Kcat/Km (constante de especificidade) relaciona a eficiência catalítica da enzima com a sua afinidade pelo substrato. Se Kcat S-1 for alto e o Km for baixo, o resultado será uma alta eficiência catalítica da enzima pelo seu substrato. Por exemplo, a enzima anidrase carbônica, tem valor de Kcat/Km alto (8,3 x 107), portanto alta eficiência, enquanto a urease tem valor de Kcat/Km baixo (4,5 x 105), portanto baixa eficiência.
As enzimas podem ser inibidas. Inibidores são substâncias que reduzem ou inibem completamente a atividade de uma enzima. Alguns medicamentos como analgésicos, antimicrobianos, antivirais, redutores de colesterol, assim como algumas moléculas encontradas em venenos de serpentes, cobras, escorpiões e plantas são conhecidamente inibidoras de enzimas. Os inibidores enzimáticos podem atuar como inibidores reversíveis e irreversíveis. 
A inibição reversível ocorre através de ligações não covalentes entre o inibidor e a enzima. As duas inibições reversíveis mais comuns são a competitiva e a não-competitiva (figura 15). Na inibição competitiva o inibidor é semelhante ao substrato e por isso compete com este pelo sitio ativo da enzima. Comparado com uma reação sem inibidor, a cinética na presença do inibidor competitivo mostra aumento de Km (figura 15), pois como o inibidor e o substrato competem pelo sítio ativo da enzima, mais substrato será necessário para atingir o Km. Assim, aumento de substrato é a medida a ser adotada para diminuir os efeitos da inibição competitiva. Esta inibição não altera a Vmax, mesmo quando a concentração de substrato é aumentada. O metotrexato é uma molécula com estrutura semelhante ao ácido fólico (figura 15). A enzima dihidrofolato redutase converte o ácido fólico (dihidrofólico) em ácido tetrahidrofólico, importante para a posterior formação de nucleotídeos. A inibição desta reação pela ligação do metotrexato à enzima inibe a síntese de DNA e consequentemente a divisão celular, por isso o metotrexato é usado como medicamento anticâncer. O problema é que assim como o metotrexato, vários outros quimioterápicos também afetam células sadias e por isso provocam os diversos sintomas indesejáveis da quimioterapia; o malonato é semelhante ao succinato e assim inibe competitivamente a enzima succinato desidrogenase. Esta enzima converte succinato em fumarato, importante passo na via metabólica conhecida como ciclo de Krebs (será estudada nas próximas unidades). 
Na inibição não competitiva, o inibidor não se assemelha ao substrato, portanto não se liga ao sitio ativo da enzima, porem ao se ligar em outro local da enzima, provoca uma distorção no sitio ativo da enzima, inativando-a. Este inibidor pode-se ligar tanto a enzima livre quanto ao complexo ES. Deste modo, o aumento da quantidade de substrato não reverte os efeitos desta inibição. Comparado com uma reação sem inibidor, a cinética tem diminuição de Vmax (provoca mais rapidamente a formação do complexo ES) sem alterar o Km (figura 15). Os medicamentos anti-HIV efavirenz e nevirapina são dois inibidores não competitivos que atuam inibindo a enzima transcriptase reversa do HIV causando a ruptura do sítio catalítico da enzima. 
Figura 15: Inibição reversível. Em A, esquemas de ligação do substrato à enzima na presença e na ausência de um inibidor. Em B, similaridade entre o quimioterápico metotrexato e o ácido fólico. Em C, cinéticas enzimáticas na ausência (azul) e na presença do inibidor competitivo (vermelho). Em D, cinéticas enzimáticas na ausência (azul) e na presença do inibidor não-competitivo (vermelho). Fontes: www.docentes.esalq.usp.br, www.essenciadavida-julianacorreia.blogspot.com e www.info-farmacia.com, acessos em 20/10/2014.Na inibição irreversível, o inibidor se liga tão fortemente a enzima (ligação covalente) que bloqueia permanentemente a atividade enzimática. Envolve modificações químicas na enzima levando a uma inativação definitiva. O ácido acetil salicílico, molécula com propriedade analgésica e antitérmica, encontrada em muitos medicamentos, incluindo a aspirina, inibe permanentemente a enzima ciclooxigenase por modificação covalente da enzima, resultante do ataque nucleofílico da hidroxila do aminoácido serina530 da enzima ao grupamento acetila presente no ácido acetil salicílico. O resultado é a redução da síntese de prostaglandinas, moléculas envolvidas com processos de inflamação e dor (figura 16). A penicilina, um antibacteriano, inibe, por modificação covalente, a atividade da enzima transpeptidase bacteriana, inpedindo a síntese da parede celular bacteriana e levando a bactéria a morte. Outros inibidores irreversíveis de enzimas incluem o paration (inseticida), o sarin (gas), etc.
Figura 16: Mecanismo de inibição irreversível da COX pelo ácido acetil salicílico. O ácido acetil-salicílico apresenta propriedades antiinflamatórias e analgésicas decorrentes do bloqueio da biossíntese de prostaglandinas, devido à inibição da enzima cíclooxigenase (COX). Esta interação é de natureza irreversível em função da formação de uma ligação covalente resultante do ataque nucleofílico da hidroxila do aminoácido serina530 ao grupamento acetila presente no ácido acetil salicílico. Fonte: http://qnint.sbq.org.br adaptado, acesso em 20/10/2014.
Algumas enzimas podem ter suas atividades reguladas, atuando assim como reguladoras do metabolismo celular. Esta regulação (reversível) é essencial na coordenação dos inúmeros processos metabólicos celulares. Existem 2 modelos de regulação enzimática: a regulação covalente ocorre quando há modificação covalente da enzima, com conversão entre formas ativa e inativa. As modificações covalentes mais comuns são a fosforilação, adenilação, metilação, uridilação e ADP-ribosilação. A enzima glicogênio fosforilase (será estudada nas próximas unidades), que catalisa a quebra do glicogênio é ativada quando fosforilada por uma enzima quinase e inativada quando desfosforilada por uma enzima fosfatase; a regulação alostérica ocorre nas enzimas que possuem dois sítios: um sítio ativo e um sitio de regulação (sitio alostérico), onde uma molécula se liga de forma não-covalente, podendo atuar como reguladora positiva (aumenta a afinidade da enzima pelo substrato e assim a velocidade da reação enzimática) ou negativa (diminui a afinidade da enzima pelo substrato e assim a velocidade da reação enzimática). A ligação do regulador induz modificações conformacionais na enzima, promovendo as tais mudanças na sua afinidade com o substrato. Um modelo comum de regulação alostérica é a retroalimentação (feed-back), onde o próprio produto da reação enzimática inibe momentaneamente a enzima.
Leitura complementar
DEVLIN, T. Manual de bioquímica com correlações clínicas. Edgard Blucher, 2007.
HARPER, H. A. Bioquímica. Atheneu, 2002.
LEHNINGER, A.L. Princípios de Bioquímica. Worth publishers, 2006.
STRYER, L. Bioquímica. Guanabara Koogan, 2004.
VOET, D., VOET, J.G., PRATT, C.W. Fundamentos de Bioquímica. Artmed, 2002.
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Lembre-se de realizar as atividades desta unidade de estudo, elas irão ajudá-lo a fixar o conteúdo, além de proporcionar sua autonomia no processo de ensino-aprendizagem. Caso prefira, redija as respostas no caderno e depois as envie através do nosso ambiente virtual de aprendizagem (AVA). Interaja conosco!
1. A glicoquinase e a hexoquinase são duas enzimas que reagem com o mesmo substrato, a glicose. Ambas são enzimas intracelulares que convertem a glicose em glicose 6–fosfato, primeiro passo para a obtenção de energia na célula ou para a síntese de glicogênio. Qual é a afirmativa correta: 
a) a hexoquinase tem maior afinidade pela glicose porque seu Km é maior que o da glicoquinase
b) a hexoquinase tem menor afinidade pela glicose porque seu Km é maior que o da glicoquinase
c) ambas apresentam a mesma afinidade pela glicose porque seus Km são similares
d) ambas apresentam a mesma afinidade pela glicose porque suas Vmax são similares
e) a glicoquinase tem menor afinidade pela glicose porque seu Km é maior que o da hexoquinase
2. Recentemente, houve grande interesse por parte dos obesos quanto ao início da comercialização do medicamento Xenical no Brasil. Esse medicamento impede a metabolização de um terço da gordura consumida pela pessoa. Assim, pode-se concluir que o Xenical inibe a ação da enzima: 
a) maltase
b) protease
c) lipase
d) amilase
e) sacaridase
3. As enzimas são proteínas com capacidade de acelerar reações químicas nas células e foram necessárias na atividade metabólica e na formação das primeiras células. Dentre as opções abaixo a única que NÃO é um requerimento para a atividade de uma enzima é: 
a) substrato 
b) pH ideal
c) temperatura ideal 
d) ambiente aquoso
e) solvente orgânico
4. Modificar a queratina e assim alterar a forma do cabelo é bioquímica pura!!! Na queratina existe um número grande de aminoácidos cisteína. Estes quando próximos uns dos outros interagem através do elemento enxofre de suas cadeias laterais. Para modificar a forma do cabelo, é necessário o rompimento destas interações para depois refaze-las de modo diferente ao anterior. Este tipo de interação entre os aminoácidos cisteína é chamada: 
a) ligação peptídica
b) ponte de hidrogênio
c) ponte dissulfeto 
d) interação eletrostática
e) interação hidrofóbica
5. As proteínas são formadas pela união de moléculas de aminoácidos e desempenham diversos papéis no organismo, como função estrutural, enzimática, imunológica, dentre outras. De acordo com os seus conhecimentos sobre as proteínas, marque a alternativa errada.
a) as proteínas podem diferir uma das outras nos seguintes aspectos: quantidade de aminoácidos na cadeia polipeptídica; tipos de aminoácidos presentes na cadeia polipeptídica e sequência de aminoácidos na cadeia polipeptídica
b) os aminoácidos essenciais são aqueles que um organismo não consegue produzir
c) a ligação entre dois aminoácidos vizinhos em uma molécula de proteína é chamada de ligação peptídica e se estabelece sempre entre um grupo amina de um aminoácido e o grupo carboxila do outro aminoácido
d) todas as enzimas são proteínas, sendo que muitas são proteínas simples e outras conjugadas
e) no final da reação, a molécula do produto se separa da enzima, que é descartada pelo organismo
6. Consideram-se aminoácidos essenciais para um determinado organismo, aqueles:
a) de que ele necessita e sintetiza a partir de vitaminas
b) de que ele necessita, mas não consegue sintetizar, tendo que recebê-los em sua dieta
c) de que ele necessita apenas na infância
d) resultantes da degradação de suas próprias proteínas
e) desnecessários para a produção das proteínas
7. As proteínas, formadas pela união de aminoácidos, são componentes químicos fundamentais na fisiologia e na estrutura celular dos organismos. Em relação às proteínas, assinale a proposição correta.
a) o colágeno é a proteína menos abundante no corpo humano apresentando forma enovelada (globular) como a maioria das proteínas
b) a ligação peptídica entre dois aminoácidos acontece pela reação do grupo carboxila de um aminoácido com o grupo amino de outro aminoácido
c) a ptialina (amilase salivar), enzima produzida pelas glândulas salivares, atua na digestão de proteínas
d) a insulina, envolvida no metabolismo da glicose, é um exemplo de hormônio lipídico
e) as proteínas caseína e ovalbumina são encontradas na carne e na clara do ovo, respectivamente
8. Considere as afirmações abaixo relativas a enzimas:
I. São proteínas com função catalisadora;
II. Todas as enzimas atuam quimicamente em diferentes substratos;
III. Continuam quimicamente intactas após a reação;
IV. Não se alteram com as modificações da temperatura e do pH do meio.
São verdadeiras:
a) I e III apenas
b) IIe IV apenas
c) I, III e IV apenas
d) II, III e IV apenas
e) I, II, III e IV
9. Aminoácidos provenientes da hidrólise de proteínas podem ser analisados por eletroforese. Sabendo-se que os dois aminoácidos abaixo possuem 03 grupamentos ionizáveis cujos pKs estão descritos abaixo, para que pólo migrariam esses aminoácidos em pH 7,0? Justifique.
 pKCOOH
pKNH3+
 pK R
lisina 2,18
 8,95
 10,53
arginina 1,82
 8,99
 12,48
10. As proteínas citoplasmáticas abaixo apresentam as seguintes características:
	PROTEÍNA
	PESO MOLECULAR (PM)
	PONTO ISOELÉTRICO
(pI)
	X
	48.000
	7,1
	Y
	126.000
	3,8
	Z
	31.500
	10,0
Pergunta-se:
a) Qual seria o padrão de bandeamento destas proteínas em uma eletroforese de proteínas simples?
b) Qual seria a ordem de eluição (saída da coluna) destas proteínas em uma coluna de gel filtração? 
11. De acordo com as curvas de titulação dos aminoácidos glutamato (a) e histidina (b), pede-se:
a) Qual é o pI do glutamato e da histidina?
b) Qual é a respectiva carga elétrica destes aminoácidos em pH 5,0
12. Um pesquisador isolou uma enzima chave de um microrganismo patogênico e resolveu testar a capacidade das drogas A e B em inibir esta enzima. Obteve os seguintes resultados.
	Concentração de Droga A
(mM)
	Km
	Vmax
	Concentração da Droga B
(mM)
	Km
	Vmax
	0
	100 
	600
	0
	100
	600
	10 
	100 
	300
	10
	200
	600
	20 
	100 
	150
	20
	400
	600
 Caracterize os tipos de inibição de A e B. Justifique
13. Durante um estudo da atividade catalítica de uma enzima intestinal com alta afinidade pelo substrato glicina, foram obtidos os seguintes resultados experimentais na ausência e presença de um composto inibidor. Baseado nesses dados, responda:
	glicina mM
	 1,5
	 2,0
	 3,0
	 4,0
	 5,0
	 6,0
	 7,0
	 8,0
	velocidade sem inibidor
mg prod/min
	 0,20
	 0,27
	 0,40
	 0,59
	 0,75
	 0,8
	 0,8
	 0,8
	velocidade com inibidor
mg prod/min
	 0,09 
	 0,19
	 0,27
	 0,40
	 0,52
	 0,63
	 0,71
	 0,8
a) Qual é a velocidade máxima das duas reações enzimáticas?
b) Qual é a concentração de substrato necessária para que a enzima trabalhe na metade de sua velocidade máxima nas duas situações?
c) Que tipo de inibição é causado pelo composto? Justifique
14. Quais são as ligações/interações químicas encontradas nas estruturas terciária e quaternária das proteínas? 
15. De acordo com a estrutura das proteínas responda:
a) Qual/quais estão na forma secundária?
b) Qual/quais estão na forma terciária?
c) Qual/quais estão na forma quaternária?
d) Quantas regiões alfa-hélice e folhas-beta existem nas proteínas B e D?
 
16. Após o cozimento, a clara do ovo adquire aparência e consistência completamente diferentes daqueles que apresentava antes de ser submetida ao tratamento com alta temperatura. Diga, a nível molecular, que tipo de alteração ocorreu. Cite também a nível molecular o que aconteceria se, ao invés de ser tratada a alta temperatura, a clara do ovo fosse tratada com uma solução contendo um agente redutor qualquer.
17. O sabor adocicado do milho recém-colhido é devido ao alto nível de monossacarídeos e oligossacarídeos nos grãos. O milho comprado no mercado (vários dias após a colheita) não é mais tão doce, porque cerca de 50% do açúcar livre do milho é convertido por um processo enzimático, em amido um dia após a colheita. Para preservar o gosto doce do milho fresco, logo após a colheita, as espigas descascadas são mergulhadas em água fervente por alguns minutos (“branqueamento”) e então imediatamente congeladas, mantendo assim o sabor adocicado. Qual é a base bioquímica deste procedimento?
18. De acordo com a sequencia de aminoácidos das proteínas abaixo (use a tabela abaixo para ajudar):
Proteína A: Arg-His-Iso-Asn-Leu-Ser-Leu-Asp-Arg-Lys-met
Proteína B: Leu-Met-Gli-Asp-Glu-Glu-Cys-Thr-Asp-Asn-Glu
Proteína C: Ala-His-Lys-Met-Phe-Pro-Glu-Gli-Arg-Phe-Iso-Leu-Leu-His-Trp-Val-Met-Glu-Pro-Trp-Asp-Met-Iso-Pro-Ala-Phe-Met-Arg-val-Thr-Gln-Glu-Met-Iso-Leu-Gli-Cys-His-Ala-Pro-Gln-Asn-Leu-Asp-Isso-Gli
Proteína D: Met-Cys-Arg-Lys-Iso-Glu-Phe-Met-Ala-Ser-Lys-Gln-Thr-Tyr-Glu-Ser-Ala-Met-His-Lys-Gln-Trp-val-His-His-Phe-Arg
	Cadeia lateral dos aminoácidos
	Polar com carga positiva
	Polar com carga negativa
	Apolar 
	Polar neutro
	Arginina (Arg)
	Aspartato (Asp)
	Alanina (Ala)
	Asparagina (Asn)
	Histidina (His)
	Glutamato (Glu)
	Isoleucina (Iso)
	Cisteína (Cys)
	Lisina (Lys)
	
	Leucina (Leu)
	Glutamina (Gln)
	
	
	Metionina (Met)
	Serina (Ser)
	
	
	Fenilalanina (Phe)
	Treonina (Thr)
	
	
	Prolina (Pro)
	Tirosina (Tyr)
	
	
	Triptofano (Trp)
	
	
	
	Valina (Val)
	
	
	
	Glicina (Gli)
	
a) Como estariam estas proteínas em eletroforese simples?
b) Explique, detalhando as etapas, como você faria para purificar a proteína A das demais?
19. Um pesquisador isolou uma enzima chave de um microrganismo patogênico e resolveu testar a capacidade das drogas A e B em inibir esta enzima. Obteve os seguintes resultados.
	Concentração de Droga A
(mM)
	Km
	Vmax
	Concentração da Droga B
(mM)
	Km
	Vmax
	0
	100 
	600
	0
	100
	600
	10 
	100 
	300
	10
	200
	600
	20 
	100 
	150
	20
	400
	600
 Caracterize os tipos de inibição de A e B. Justifique
20. A toxicidade do metanol está relacionada ao seu produto de metabolização, o formaldeído, que é formado pela ação da álcool desidrogenase. O formaldeído reage com as macromoléculas causando a perda das suas funções biológicas. Em casos de envenenamento com o metanol, é administrado como antídoto o etanol. Qual o fundamento desse tratamento?
21. A enzima hexoquinase é capaz de catalisar a fosforilação de diferentes monossacarídeos. Os gráficos abaixo mostram a variação da velocidade da enzima em função de diferentes concentrações de dois substratos destes substratos, glicose e frutose.
 vo vo
 200 200
 100 100
 1 2 3 4 5 10 15 20
 [glicose] mg [frutose] mg
Pede-se:
a) Defina a partir destes dois gráficos a afinidade da enzima por cada substrato. Justifique.
b) Para dosar esta enzima qual concentração mínima de glicose e frutose você usaria para obter a saturação da enzima?
c) Qual é o Km aproximado das duas reações?
22. Devido a problemas econômicos o laboratório de um Hospital Universitário ficou temporáriamente sem poder adquirir os kits para as dosagens das enzimas fosfogalactose uridiltransferase e fenilalanina hidroxilase. A determinação destas enzimas em recém-nascidos é essencial para detectar respectivamente a galactosemia e a fenilcetonúria. O chefe do laboratório pediu sua ajuda para estabelecer qual a concentração de substrato a ser utilizada para cada enzima, de modo que a reação ocorresse em velocidade máxima, e assim garantir uma condição ótima para as dosagens. Como dado ele deu a você os gráficos a seguir.
A-Fenilalanina hidroxilase B- Fosfogalactose uridiltransferase
V0 V0
 200 200
 100 100
 2 4 6 8 40 60 80 100 
 [fenilalanina]mM [fosfogalactose]mM
Pergunta-se:
a) Qual a concentração de S que poderia ser usada para medir cada enzima em velocidade máxima?
b) Qual das duas enzimas apresenta maior afinidade pelo seu substrato?
23. Um pesquisador isolou uma enzima chave de um microorganismo patogênico recém-identificado. Seus primeiros experimentos foram os testes da variação da atividade enzimática em diferentes condições, visandoestabelecer as condições ótimas de dosagem. Os resultados obtidos estão apresentados nos gráficos A e B. A partir da análise de cada gráfico, estabeleça as condições ótimas para a dosagem da enzima. 
GRÁFICO A GRÁFICO B
24. A placa bacteriana que aparece ligada à superfície do dente é composta de um tipo de bactéria que metaboliza os carboidratos de resíduos alimentares que permanecem na cavidade oral, excretando conseqüentemente produtos ácidos (ex.: ácido fórmico, ácido acético, ácido láctico, etc.). A enzima lisozima, presente nas secreções orais, é por sua vez responsável pela destruição de tais bactérias, por hidrolisar componentes da parede celular. Com a instalação da placa bacteriana, segue-se uma diminuição da atividade desta enzima, fato que não se deve à inibição. Com base nestas observações, como você explicaria a diminuição da atividade da lisozima?
A B
3,6 aminoácidos por volta
A B C
A B C
A B C
A B C
 A B
ΔG‡ cat
ΔG‡ não cat
ΔG’o
(S) (S) (S)
(E) (E) (E)
(I)
(I)
A B
C D 
COX
COX
Acido acetil salicílico
A) B) C) D)
moles produto/min 
pH 
 4 5 6 7 8 9
100
200
moles produto/min 
 Temperatura oC
 10 20 30 40 50 60 
100
200