Yuri-DISSERTACAO

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO 
CENTRO DE TECNOLOGIA 
INSTITUTO DE QUÍMICA 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DOS ALIMENTOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
YURI PEREIRA SOUZA 
 
 
 
 
 
 
AFLATOXINAS EM CASTANHA-DO-BRASIL (Bertholletia excelsa H. B. K): ANÁLISE, 
OCORRÊNCIA NO MERCADO DE VAREJO NO RIO DE JANEIRO E 
DESCONTAMINAÇÃO DE SEU EXTRATO POR VIA BIOTECNOLÓGICA 
 
 
 
 
 
 
 
Rio de Janeiro 
2016 
 
 
 
 
 
 
 
YURI PEREIRA SOUZA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Aflatoxinas em castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa H. B. K.): análise, ocorrência no 
mercado de varejo no Rio de Janeiro e descontaminação de seu extrato por via biotecnológica 
 
 
 
 
 
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciência dos Alimentos, Universidade 
Federal do Rio de Janeiro, como requisito parcial 
para obtenção do título de Mestre em Ciências 
 
Orientador: Prof. Dr. Alexandre Guedes Torres 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Rio de Janeiro 
2016 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Souza, Yuri Pereira. 
Aflatoxinas em castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa H. B. 
K.): análise, ocorrência no mercado de varejo no Rio de Janeiro e 
descontaminação de seu extrato por via biotecnológica / Yuri Pereira 
Souza. Rio de Janeiro: UFRJ/PPGCAL, 2016. 
 
106f. 
 
Dissertação (Mestrado em Ciência dos Alimentos) – 
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Química, 2016. 
 
Orientador: Alexandre Guedes Torres. 
 
1. Castanha-do-Brasil. 2. Aflatoxinas. 3. Validação. 4. 
Descontaminação biológica. I. Torres, Alexandre Guedes (orient.). II. 
Universidade Federal do Rio de Janeiro. Programa de Pós-graduação 
em Ciência dos Alimentos. III. Aflatoxinas em castanha-do-Brasil 
(Bertholletia excelsa H. B. K.): análise, ocorrência no mercado de 
varejo no Rio de Janeiro e descontaminação de seu extrato por via 
biotecnológica. 
. 
 
 
 
 
 
AGRADECIMENTOS 
 
À minha noiva, Imira, pelo incentivo e principalmente pela paciência em todos os momentos 
do mestrado. Todo o seu apoio foi fundamental nesta etapa da minha vida. Obrigado por 
sempre estar ao meu lado, alegrando a minha vida até nos momentos mais difíceis. Te amo; 
 
Ao meu orientador, Prof. Dr. Alexandre Guedes Torres, pela orientação, incentivo, 
compreensão, confiança e conhecimentos transmitidos. Muito obrigado por tudo; 
 
À minha irmã Thainá Souza, por todo carinho e risadas proporcionadas nos finais de semana; 
 
Aos meus amigos, do Laboratório de Bioquímica Nutricional e de Alimentos (LBNA) pelos 
momentos de amizade, apoio e diversão compartilhados; 
 
À Maria Heloísa por ceder as instalações do laboratório de Resíduo de micotoxinas (INCQS-
FIOCRUZ) para a realização das etapas de validação e das análises de monitoramento da 
castanha-do-Brasil; 
 
Ao Dr. André Sartori pelo apoio e sugestões durante a validação do método, além da sua 
inestimável amizade; 
 
À Rosana Santos por sua grande amizade e apoio durante todo o mestrado; 
 
À Profª Drª Karen Signori Pereira por ceder as instalaçõesdo laboratório de Microbiologia de 
alimentos (EQ-UFRJ) para a realização dos ensaios de descontaminação biológica. 
 
Ao João Paulo Pontes por toda a paciência e ajuda nas realizações dos ensaios utilizando 
micro-organismos. 
 
À CAPES, pelo auxilio financeiro que possibilitou a realização deste trabalho. 
 
 
 
 
 
RESUMO 
SOUZA, Yuri Pereira. Aflatoxinas em castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa H. B. K.): 
análise, ocorrência no mercado de varejo no Rio de Janeiro e descontaminação de seu extrato 
por via biotecnológica. Rio de Janeiro, 2016. Dissertação (Mestrado em Ciência dos 
Alimentos) – Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 
2016. 
 
A castanheira-do-Brasil (Bertholletia excelsa H. B. K.) é uma das plantas mais importantes da 
Amazônia devido ao seu valor ecológico, social, econômico e alimentar. Durante o período de 
pós-colheita da castanha-do-Brasil, fungos podem estar presentes naturalmente no ambiente 
de sua produção. Algumas espécies de fungos são produtoras de micotoxinas, no caso da 
castanha, as aflatoxinas (AF). Micotoxinas são metabólitos secundários tóxicos produzidos 
por fungos denominados toxigênicos. Métodos analíticos utilizados para o monitoramento de 
micotoxinas devem apresentar resultados precisos e confiáveis. A validação de métodos 
analíticos é desta forma uma importante ferramenta para dar suporte às análises dando 
qualidade e confiabilidade aos resultados gerados. Além disso, Alimentos contaminados por 
AF podem ser descontaminados através de métodos físicos, químicos e biológicos. O presente 
trabalho apresenta uma validação intralaboratorial de análise de AF em castanha-do-Brasil por 
Cromatofrafia Líquida de Alta Eficiência por detector de Fluorescência (CLAE-F). 21 
amostras de castanha-do-Brasil provenientes do comércio varejista do Rio de Janeiro foram 
analisadas. Ensaios de descontaminação biológica foram realizados nos extratos 
hidrossolúveis de castanha-do-Brasil naturalmente contaminados utilizando cepas de 
Lactobacillus rhamnosus (ATCC 10863) e Rhodococcus erythropolis (ATCC 4277) por 
períodos de 24 e 48 h. O método foi validado e considerado adequado. Das 21 amostras 
analisadas três amostras (14%) estavam acima dos Limites Máximos Toleráveis (LMT) 
estabelecidos pela legislação brasileira. Os valores de AF totais encontrados nessas amostras 
foram 28,17 µg/kg, 45,49 µg/kg e 54,41 µg/kg. O extrato da castanha-do-Brasil hidrossolúvel 
incubado com o Lactobacillus. rhamnosus (ATCC 10863) não apresentou redução na 
concentração das AFB e G em nenhum dos períodos de incubação estudados. Resultados 
diferentes foram observados para o extrato hidrossolúvel de castanha-do-Brasil incubados 
com o Rhodococcus erythropolis (ATCC 4277) que apresentaram uma redução 
estatisticamente significativa na concentração de AF G1 (17%) após 24 h de incubação, 
 
 
 
 
dobrando após 48 h de incubação (34%). Quanto à AF G2, sua concentração tendeu a sofrer 
redução após 24h de incubação. Contudo, só houve uma redução estatisticamente significativa 
(20%) após 48h de incubação não ocorrendo reduções nos níveis das AFB1 e B2. 
 
 
Palavras-chave: castanha-do-Brasil, aflatoxinas, validação, descontaminação biológica.
 
 
 
 
ABSTRACT 
 
SOUZA, Yuri Pereira. Aflatoxins in Brazil nuts (Bertholletia excelsa H. B. K.): analysis, 
occurrence in the retail market in Rio de Janeiro and decontamination of your extract by 
biotechnological processes. Rio de Janeiro, 2016. Dissertation (Master in food science) – 
Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2016. 
 
 
The Brazil nut (Bertholletia excelsa H. B. K.) is one of the most important products from 
Amazon region due of its ecological, social, economic and nutritional aspects. In post-harvest 
Brazil nut can be affected by fungi on its system of production. Some species of fungi are 
producers of mycotoxins in the case of Brazil nuts, aflatoxins. Mycotoxins are secondary 
metabolites produced by fungi called toxigenic. These substances are highly toxic 
compounds. Analytical methods used for the monitoring of these products must provide 
accurate and reliable results. The validation of analytical methods is thus an important tool to 
support the analysis giving quality and reliability to the results generated. In addition, foods 
contaminated with aflatoxins (AF) can be decontaminated through physical, chemical and 
biological methods. This work presents in house validation analysis of aflatoxins in Brazil 
nuts by High Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detection (HPLC-FD). 
21 samples of Brazil nuts from Brazil in Rio de Janeiro retail were analyzed. Biological 
decontamination tests were carried out in aqueous extracts of the Brazil nutnaturally 
contaminated using Lactobacillus rhamnosus strains (ATCC 10863) and Rhodococcus 
erythropolis (ATCC 4277) for periods of 24 and 48 h. The method was validated and deemed 
appropriate. Of the 21 samples analyzed three samples (14%) were above of Maximum 
Tolerable Limit (MTL) established by Brazilian law. The values of total aflatoxins found in 
these samples were 28,17 µg/kg, 45,49 µg/kg e 54,41 µg/kg. The extract of Brazil nut 
incubated with Lactobacillus rhamnosus (ATCC 10863) showed no reduction in the 
concentration of AF B and G in any of the studied incubation periods. Different results were 
observed for the soluble extract of Brazil nut incubated with Rhodococcus erythropolis 
(ATCC 4277) which showed a statistically significant reduction in the concentration of G1 
(17%) after 24 h of incubation, doubling after 48 h of incubation (34%). As for AF G2 
concentration tended to be reduced after 24 hours of incubation. However, there was only a 
 
 
 
 
statistically significant reduction (20%) after 48 hours of incubation not going reductions in 
the levels of AFB1 and B2. 
 
 
Keywords: Brazil nuts, aflatoxins, validation, biological decontamination. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
Figura 1.Castanheira-do-Brasil ............................................................................................................ 18 
Figura 2.Ouriço aberto com as castanhas-do-Brasil com casca em seu interior .................................. 19 
Figura 3.Principais áreas de extração de castanha-do-Brasil ............................................................... 20 
Figura 4.Produção de castanha-do-Brasil realizada por Brasil, Bolívia e Peru entre 1998 e 2013. .... 24 
Figura 5.Total de castanha-do-Brasil exportada por Brasil, Bolívia e Peru entre 1998 e 2013. .......... 24 
Figura 6.Estruturas químicas das AFB1, B2, G1, G2 M1 e M2 ............................................................... 30 
Figura 7.Metabolismo da aflatoxina B1 no fígado. .............................................................................. 32 
Figura 8.Curva analítica final de aflatoxina B1 em solvente após avaliação do teste Jacknife. ........... 70 
Figura 9.Curva analítica final de aflatoxina B2 em solvente após avaliação do teste Jacknife. ........... 70 
Figura 10.Curva analítica final de aflatoxina G1 em solvente após avaliação do teste Jacknife. ......... 71 
Figura 11.Curva analítica final de aflatoxina G2 em solvente após avaliação do teste Jacknife. ......... 71 
Figura 12.Gráfico dos resíduos obtidos na análise de variância da regressão para a curva de aflatoxina 
B1 em solvente. ...................................................................................................................................... 75 
Figura 13.Gráfico dos resíduos obtidos na análise de variância da regressão para a curva de aflatoxina 
B2 em solvente. ...................................................................................................................................... 75 
Figura 14.Gráfico dos resíduos obtidos na análise de variância da regressão para a curva de aflatoxina 
G1 em solvente. ..................................................................................................................................... 76 
Figura 15.Gráfico dos resíduos obtidos na análise de variância da regressão para a curva de aflatoxina 
G2 em solvente. ..................................................................................................................................... 76 
Figura 16.Cromatograma típico obtido na análise de uma amostra branco de castanha-do-Brasil por 
CLAE-F ................................................................................................................................................. 77 
Figura 17.Cromatograma típico obtido na análise de uma amostra fortificada de castanha-do-Brasil 
por CLAE-F .......................................................................................................................................... 78 
file:///C:\Users\Imira\Desktop\Dissertacao_Yuri%20corrigida.docx%23_Toc459863381
file:///C:\Users\Imira\Desktop\Dissertacao_Yuri%20corrigida.docx%23_Toc459863382
 
 
 
 
Figura 18.Descontaminação biológica por L. rhamnosus (24h) de AFB1, B2, G1 e G2 (µg/kg) em 
extrato hidrossolúvel de castanha-do-Brasil.,........................................................................................ 86 
Figura 19.Descontaminação biológica por L. rhamnosus (48h) de AFB1, B2, G1 e G2 (µg/kg) em 
extrato hidrossolúvel de castanha-do-Brasil.......................................................................................... 86 
Figura 20.Descontaminação biológica por R. erythropolis (24h) de AFB1, B2, G1 e G2 (µg/kg) em 
extrato hidrossolúvel de castanha-do-Brasil.......................................................................................... 88 
Figura 21.Descontaminação biológicapor R. erythropolis (48h) de AFB1, B2, G1 e G2 (µg/kg) em 
extrato hidrossolúvel de castanha-do-Brasil.......................................................................................... 88 
Figura 22.Descontaminação biológica por R. erythropolis (após incubação por 24 e 48h) de AF totais 
(µg/kg) em extrato hidrossolúvel de castanha-do-Brasil. ...................................................................... 89 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE TABELAS 
 
Tabela 1. Composição nutricional da amêndoa da castanha-do-Brasil. ............................................... 21 
Tabela 2. Composição de ácidos graxos de óleos de 10 tipos de amêndoas e da castanha-do-Brasil. . 22 
Tabela 3. Etapas da cadeia produtiva da castanha-do-Brasil................................................................ 27 
Tabela 4. Limites Máximos Tolerados para AF em alimentos ............................................................ 35 
Tabela 5. Massa molar e coeficientes de absortividade molar das AF B e G .................................... 55 
Tabela 6. Preparo da curva de calibração utilizada na avaliação da linearidade do método analítico . 56 
Tabela 7. Análise de variância para significância da regressão e do desvio da linearidade. ................ 63 
Tabela 8. Locais de aquisição e dados gerais das amostras comerciais de castanha-do-Brasil obtidas 
no mercado varejista no estado do Rio de Janeiro e analisadas no presente trabalho. .......................... 49 
Tabela 9.Parâmetros da qualidade do ajuste da regressão linear para as AFB1, B2, G1 e G2................ 68 
Tabela 10.Resíduos relativos da curva analítica de AFB1, B2, G1 e G2. ............................................... 69 
Tabela 11.Normalidade dos resíduos da regressão (Teste de Ryan-Joiner) . ....................................... 72 
Tabela 12.Homoscedasticidade dos resíduos de regressão (Teste de Levene) encontrados para as 
AFB1e B2. .............................................................................................................................................. 73 
Tabela 13.Homoscedasticidade dos resíduos de regressão (Teste de Levene) encontrados para as AF 
G1 e G2 ................................................................................................................................................... 73 
Tabela 14.Análise de variância para a significância da regressão e do desvio de linearidade para 
aflatoxina B1. ......................................................................................................................................... 74 
Tabela 15. Análise de variância para a significância da regressão e do desvio de linearidade para 
aflatoxina B2. ......................................................................................................................................... 74 
Tabela16.Análise de variância para a significância da regressão e do desvio de linearidade para 
aflatoxina G1. ......................................................................................................................................... 74 
Tabela 17. Análise de variância para a significância da regressão e do desvio de linearidade para 
aflatoxina G2. ......................................................................................................................................... 75 
Tabela 18.Independência dos resíduos da regressão (Durbin-Watson) para as AFB1, B2, G1 e G2...... 77 
 
 
 
 
Tabela 19.Tempos de retenção médio das AFB1, B2, G1 e G2 nas amostras de castanha-do-Brasil 
analisadas por CLAE-F. ........................................................................................................................ 79 
Tabela 20. Exatidão das análises de AFB1, B2, G1 e G2 em castanha-do-Brasil, a partir dos dados de 
recuperação de padrões analíticos. ........................................................................................................ 80 
Tabela 21. Precisão Intermediária da análise de AF em castanha-do-Brasil. ....................................... 81 
Tabela 22. Limites de detecção e quantificação obtidos pelo método das curvas de calibração dos 
padrões analíticos .................................................................................................................................. 82 
Tabela 23. Limites de detecção e quantificação obtidos pelo método da relação sinal-ruído de amostra 
branco .................................................................................................................................................... 82 
Tabela 24. Concentração de AF B e G em castanha-do-Brasil comercializadas na região metropolitana 
do Rio de Janeiro. .................................................................................................................................. 83 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
SUMÁRIO ............................................................................................................................... 19 
INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 14 
JUSTIFICATIVA ................................................................................................................... 16 
CAPÍTULO 1: CASTANHA-DO-BRASIL .......................................................................... 17 
1.1. Distribuição geográfica ................................................................................................. 19 
1.2. Composição nutricional ................................................................................................. 20 
1.3. Importância econômica ................................................................................................. 23 
1.4. Cadeia produtiva da castanha-do-Brasil ...................................................................... 25 
CAPÍTULO 2: MICOTOXINAS .......................................................................................... 28 
2.1. Aflatoxinas ..................................................................................................................... 29 
CAPÍTULO 3. VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS ......................................... 40 
3.1. Faixa de trabalho ........................................................................................................... 40 
3.2. Curva analítica e linearidade ........................................................................................ 41 
3.3. Seletividade .................................................................................................................... 41 
3.4. Repetibilidade ................................................................................................................ 42 
3.5. Precisão intermediária .................................................................................................. 42 
3.6. Limites de quantificação e detecção .............................................................................. 42 
 
 
 
 
CAPÍTULO 4. MÉTODOS DE DESCONTAMINAÇÃO DE AF NOS ALIMENTOS .. 44 
5.OBJETIVO GERAL ........................................................................................................... 46 
5.1 Objetivos específicos ....................................................................................................... 46 
6. MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................................. 47 
6.1.Material .......................................................................................................................... 47 
6.2.Equipamentos .................................................................................................................. 47 
6.3. Reagentes e padrões ...................................................................................................... 48 
6.4. Aquisição das amostras de castanha-do-Brasil ............................................................. 48 
6.5. Análise de AF na castanha-do-Brasil e no extrato hidrossolúvel por CLAE-F ............ 50 
6.7.Análise Estatística e Validação do Método Analítico .................................................... 56 
7. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................................... 68 
7.2.Seletividade do método analítico .................................................................................... 77 
7.3.Exatidão e precisão ........................................................................................................ 79 
7.4.Precisão Intermediária ................................................................................................... 81 
7.5.Limites de detecção e quantificação ............................................................................... 82 
7.7..Descontaminação Biológica .......................................................................................... 85 
CONCLUSÃO ......................................................................................................................... 91 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
14 
 
 
 
INTRODUÇÃO 
 
 A castanheira-do-Brasil (Bertholletia excelsa H. B. K.) é uma das plantas mais 
importantes da Amazônia e, atualmente, é o produto vegetal extrativo mais importante da 
Amazônia por seu valor ecológico, social, econômico e alimentar. A exploração deste produto 
é majoritariamente extrativista e é uma importante fonte de renda para a população local, 
contribuindo também para o reflorestamento de áreas desmatadas da Amazônia (SILVA; 
ASCHERI; SOUZA, 2010). 
 É encontrada principalmente no planalto que separa a bacia formada pelos afluentes do 
baixo Amazonas, alto Tocantins e alto Moju, e também ao norte do rio Jari no estado do Pará, 
além do Acre, indo até o alto Beni na Bolívia (MULLER et al., 1995). Nutricionalmente, a 
castanha-do-Brasil é uma importante fonte de proteínas (constituindo de 15 a 20% da sua 
composição), de lipídios (60 a 70% da sua composição), de fibras, de vitaminas como tiamina 
(B1), niacina, tocoferol (E), piridoxina (B6), de minerais como o selênio, o magnésio, o 
fósforo, o cálcio, o potássio, o zinco e o cobre – que apresentam variadas funções fisiológicas 
e metabólicas; além de compostos fenólicos, fitoesteróis e flavonóides (YANG, 2009). 
A castanha-do-Brasil é a principal fonte de selênio provinda de alimentos de origem 
vegetal. O selênio é importante para o funcionamento da tireoide e do sistema imunológico, 
além de ser um importante agente antioxidante (YANG, 2009). 
 O conteúdo lipídico da castanha-do-Brasil é composto principalmente por ácidos 
graxos insaturados (monoinsaturados e poliinsaturados). Os ácidosgraxos predominantes no 
óleo da castanha-do-Brasil são os ácidos linolênico (ômega -3) e linoleico (ômega-6). Eles 
oferecem diversos benefícios à saúde, principalmente com relação aos níveis sanguíneos de 
lipídios, pois promovem redução dos níveis de colesterol-LDL e aumento dos níveis de 
colesterol-HDL (VENKATACHALAM; SATHE, 2006). 
Durante o período de pós-colheita ou mesmo durante o processamento da castanha-do-
Brasil, fungos podem estar presentes naturalmente no ambiente de sua produção. O controle 
destes no processo de produção é importante porque algumas espécies são produtoras de 
micotoxinas, no caso da castanha, as aflatoxinas (ALVARES et al., 2012). 
Micotoxinas são metabólitos secundários produzidos por fungos denominados 
toxigênicos. Essas substâncias são compostos altamente tóxicos. Sua toxicidade é 
influenciada pela quantidade e duração da exposição, idade e estado nutricional do indivíduo 
exposto, além de fatores ambientais (SANI et al., 2012). 
15 
 
 
 
Estes metabólitos possuem efeitos tóxicos agudos, subagudos ou até mesmo crônicos, 
levando a ocorrência de doenças em humanos e animais. O efeito crônico é resultante da 
ingestão moderada ao longo do tempo, dificultando assim, o reconhecimento da associação 
entre a doença e as toxinas (LINDSAY, 1997). Entre as dezessete AF já descritas em 
alimentos, apenas quatro são bem conhecidas e estão relacionadas com surtos de intoxicação. 
São as aflatoxina B1 (AFB1), aflatoxina B2 (AFB2), aflatoxina G1 (AFG1) e aflatoxina G2 
(AFG2) (PERAICA et al., 2000). 
Alimentos contaminados por AF podem ser descontaminados através de métodos 
físicos, químicos e biológicos. Dentre as três formas de descontaminação os métodos 
biológicos vêm ganhando destaque, pois não deixam resíduos tóxicos nos alimentos, não 
causam perdas nutricionais e possuem boa efetividade na descontaminação dos 
alimentos (PAULÍN et al., 2013). 
Na América do Sul, os alimentos destinados ao consumo interno não são submetidos a 
um padrão de controle de qualidade tão elevado quanto aqueles adotados para os alimentos 
voltados para a exportação. Somente alguns países sul-americanos têm estabelecido normas 
de segurança alimentar e leis de regulamentação para o controle de micotoxinas para o 
abastecimento interno como, por exemplo, o Brasil, Argentina, Colômbia, Venezuela e 
Uruguai (SCUSSEL, 2004). 
No Brasil, algumas micotoxinas, dentre elas as AF, têm os seus limites máximos 
toleráveis (LMT) estabelecidos. O LMT estabelecido para castanha-do-Brasil com casca para 
consumo direto é de 20µg/kg, para a castanha sem casca para o cosumo direto é de 10 µg/kg e 
para a castanha utilizada para algum processamento é de 15 µg/kg para o somatório das AF B 
e G (BRASIL, 2011). 
Portanto para auxiliar no monitoramento dos teores de micotoxinas presentes nos 
alimentos os métodos analíticos utilizados para este fim devem apresentar resultados precisos 
e confiáveis. A validação de métodos analíticos é desta forma uma importante ferramenta para 
dar suporte às análises dando qualidade e confiabilidade aos resultados gerados 
(THOMPSON, ELLISON, WOOD, 2002). 
 
 
 
16 
 
 
 
JUSTIFICATIVA 
 
A castanha-do-Brasil possui um grande potencial comercial muitas vezes limitado pela 
contaminação por AF que podem ocorrer em diversas etapas da sua cadeia produtiva, assim 
metodologias para a análise quantitativa dessas substâncias devidamente validadas 
contribuem para a melhoria da eficiência do monitoramento da contaminação deste produto 
auxiliando na melhora da qualidade da castanha oferecida ao consumidor, principalmente ao 
mercado interno. 
O desenvolvimento de tecnologias de descontaminação de AF na castanha-do-Brasil 
pode contribuir para a melhoria da qualidade do alimento contribuindo na diminuição do 
descarte de produtos rejeitados no mercado, reduzindo perdas econômicas e melhorando a 
capacidade competitiva do mercado brasileiro frente a outros mercados de exportação e 
comercialização da castanha. 
Nesse sentido, a descontaminação biológica através da fermentação da castanha-do-
Brasil por micro-organismos pode surgir como uma alternativa na redução da contaminação 
por AF neste produto (caso os métodos preventivos como as boas práticas de fabricação não 
sejam suficientes para evitar a contaminação) sem afetar as qualidades nutricionais da 
castanha e de maneira economicamente viável frente aos métodos físicos e químicos de 
descontaminação. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
17 
 
 
 
 
CAPÍTULO 1: CASTANHA-DO-BRASIL 
 
A castanheira-do-Brasil, também chamada de castanheira-do-Pará (figura 1) é uma 
árvore de grande porte, que pode chegar até 50 m de altura e 2 m de diâmetro na base. Possui 
caule cilíndrico, liso, desprovido de ramos até a fronde além de casca escura e fendida, folhas 
esparsas, alternadas e pecioladas, oblongas ou ovalado-oblongas, curto acuminadas, 
onduladas, verde-escuras na parte superior e pálidas na parte inferior (BRASIL, 1976). 
A castanheira-do-Brasil é uma árvore nativa da Amazônia e foi descrita pela primeira 
vez pelos pesquisadores Humboldt, Bompland e Kunth em 1808. Recebeu a denominação 
botânica de árvore majestosa da Amazônia (Bertholletia excelsa H. B. K) devido ao seu porte 
e destaque do dossel entre as demais árvores da floresta e homenagem ao químico francês 
Claude Louis Berthollet (PACHECO, SCUSSEL, 2006). 
A castanheira-do-Brasil é classificada botanicamente da seguinte forma: divisão 
Angiospermae, classe Dicotiledônea, ordem Myrtiflorae, família Lecythidaceae, gênero 
Bertholletia e espécie excelsa. A castanheira-do-Brasil é a única espécie do gênero 
Bertholletia (BRASIL 2002). A castanheira-do-Brasil pode ser encontrada em locais com 
solos pobres bem como solos estruturados, argilosos ou argilo-arenosos. Contudo, sua maior 
ocorrência se dá em solos de textura média a pesada, desenvolvendo-se bem em solos firmes e 
altas da bacia Amazônica, nas proximidades dos rios e litoral. Suas condições de crescimento 
predominam em locais de clima quente e úmido em que a temperatura média anual varie entre 
19,2°C a 32,6°C e com precipitações média variando entre 1400 a 2800 mm/ano (PACHECO, 
SCUSSEL, 2006). 
18 
 
 
 
 
Figura 1. Castanheira-do-Brasil 
 
A castanheira frutifica entre 8 e 12 anos de idade, com sua floração ocorrendo 
geralmente nos meses de agosto a outubro. Seus frutos são pixídios denominados de ouriços 
(Figura 2) e apresentam entre 8 a 16 cm de diâmetro com casca espessa, lenhosa, dura e com 
coloração castanha. A massa do fruto da castanheira-do-Brasil varia entre 0,5 kg e 5 kg e 
contém entre 12 a 24 sementes, com forma angulosa e aguda, próximo a triangular, 
transversalmente rugosa, estreitamente comprimida, envoltas em polpa branca, dispostas em 
três séries (BRASIL, 2002; YANG, 2009). 
As sementes denominadas castanhas (Figura 2), possuem tamanho entre 4 e 7 cm 
envolvidas por uma casca dura e rugosa que abrigam as amêndoas comestíveis, conhecidas 
como castanha-do-Pará ou castanha-do-Brasil. Esta última denominação passou a ser utilizada 
para o comércio exterior conforme estabelecido no decreto de lei Nº 51.209, de 18 de 
setembro de 1961. (BRASIL, 1961; BRASIL, 2002). 
 
19 
 
 
 
 
Figura 2. Ouriço aberto com as castanhas-do-Brasil com casca em seu interior 
 
 
1.1.Distribuição geográfica 
 
 As florestas contendo as castanheiras cobrem uma superfície de aproximadamente 325 
milhões de hectares (STOIAN, 2004), que abrange as Guianas, Venezuela, Colômbia, 
Equador, Peru, Bolívia e Brasil. 
A castanheira-do-Brasil é encontrada principalmente no planalto que separa a bacia 
formada pelos afluentes do baixo Amazonas, alto Tocantins e alto Moju e também ao norte do 
Rio Jarí, no Pará e no Acre até o alto Beni localizado na Bolívia. As formações mais 
numerosas e compactas estão no Brasil, situadas nos estados do Pará, Mato Grosso, 
Amazonas,Amapá e Acre (MULLER, 1981). 
20 
 
 
 
 
Figura 3.• Principais áreas de extração de castanha-do-Brasil 
Fonte: Pacheco (2007) 
 
 
1.2. Composição nutricional 
 
 Os componentes mais abundantes na castanha-do-Brasil são os lipídios (60 – 70%), 
seguido pelas proteínas (15 – 20%), carboidratos (0,69 – 10,3%) e fibras. Assim, o valor 
energético da castanha é bastante elevado. Estes valores nutricionais podem variar de acordo 
com o tamanho da castanha e também da sua origem (MOODLEY, KINDNESS, 
JONNALAGADDA, 2007; VENKATASHALAM, SATHE, 2006). Estas variações podem 
ser observadas na tabela 1. 
 
 
 
 
 
21 
 
 
 
Tabela 1.Composição nutricional da amêndoa da castanha-do-Brasil. 
Resultados em 100 g de amostra integral Autores 
Valor calórico 
(kcal) 
Lipídios (g) Proteínas (g) Carboidratos (g) Fibra (g) 
676,56 67,30 14,29 3,42 8,02 Souza, Menezes 
(2004) 
Nd 66,7 19,93 0,69 Nd Venkatashalam, 
Sathe (2006) 
Nd 66,8 13,6 10,3 Nd Moodleyet al., 
(2007) 
695,73 65,33 18,22 8,72 4,85 Santos (2008) 
680,20 61 15,60 17,12 7,79 Neto et al., (2009) 
643,00 63,5 14,5 15,10 7,9 TACO (2011) 
 Nd – não determinado 
 
 A fração protéica da castanha-do-Brasil tem elevado teor de aminoácidos sulfurados, 
como a metionina e cisteína. Os teores médios desses aminoácidos são de 18% e 8% 
aproximadamente. Estes aminoácidos essenciais encontram-se, geralmente, em baixas 
concentrações nas proteínas de origem vegetal (VENKATASHALAM, SATHE, 2006). 
 A elevada concentração de proteínas na castanha-do-Brasil após a extração do óleo 
tem se tornado atrativa para a indústria de alimentos, pois tem demonstrado importantes 
características como capacidade de absorção de água e óleo, formação e estabilidade de 
espuma, proporcionando uma interessante capacidade emulsificante (RAMOS, BORA 2004; 
RAMOS, BORA, 2005; SANTOS, 2008). 
 O perfil de ácidos graxos da castanha-do-Brasil é composto de aproximadamente 15% 
de ácidos graxos saturados, 25% de ácidos graxos monoinsaturados (MUFAs) e 21% de 
ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) os ácidos graxos saturados majoritários, são os ácidos 
palmítico e esteárico. A castanha-do-Brasil possui quantidades consideráveis de ômega 6 
(linoleico) e 9 (oleico) além de concentrações importantes de ômega 3 (ácido α-linolênico), 
como pode ser observada na Tabela 2 (YANG, 2009). 
 
 
 
 
 
 
 
22 
 
 
 
Tabela 2. Composição de ácidos graxos de óleos de 10 tipos de amêndoas e da castanha-do-
Brasil. 
Ácidos graxos (%) 
Amostras 14:0 16:0 16:1 17:0 18:0 18:1 18:2 18:3 20:0 20:1 22:0 22:1 
Amêndoa 0,06 6,85 0,63 Nd 1,29 69,24 21,52 0,16 0,16 Nd 0,05 Nd 
Castanha-
do-Brasil 
0,06 13,5 0,33 0,22 11,77 29,09 42,80 0,20 0,54 0,21 0,12 0,34 
Castanha 
de caju 
0,07 9,93 0,36 0,14 8,70 57,24 20,80 0,23 0,97 0,25 0,39 0,28 
Avelã 0,13 5,82 0,29 Nd 2,74 79,30 10,39 0,46 0,16 Nd Nd Nd 
Macadâmia 0,95 8,37 17,28 Nd 3,17 65,15 2,31 0,06 2,28 Nd 0,20 Nd 
Amendoim 0,03 11,0 0,15 Nd 2,66 38,41 44,60 0,58 1,57 Nd 0,10 Nd 
Nogueira Nd 4,28 0,09 0,10 1,80 40,63 50,31 0,65 Tr 1,21 0,16 0,25 
Pinho Nd 6,87 0,14 0,10 4,48 39,55 45,41 0,63 1,04 1,06 0,33 0,40 
Pistache 0,09 7,42 0,70 Nd 0,86 58,19 30,27 0,44 0,59 0,60 0,34 0,57 
Noz 0,13 6,70 0,23 Nd 2,27 21,0 57,46 11,58 0,08 Nd 0,07 Nd 
Fonte: Yang (2009). 
Nd, não detectdado; Tr, traços. 
 
Além da sua reconhecida constituição de macronutrientes, a castanha-do-Brasil possui 
uma fração importante de antioxidantes com elevado teor de vitamina E, em que o percentual 
de α, β e γ-tocoferol está diretamente relacionado aos compostos fenólicos presentes na 
castanha, dentre os quais se pode citar o ácido gálico, encontrado em níveis elevados nas 
castanhas comparados a outras amêndoas. A castanha-do-Brasil também apresenta um 
elevado teor de fitosteróis que ajudam a potencializar a função imune no organismo 
(PHILIPS, RUGGIO, ASHRAF-KHORASSANI, 2005; KORNSTEINER, WAGNER, 
ELMADFA, 2006). 
Os minerais presentes na castanha-do-Brasil seguem quantitativamente a seguinte 
ordem: Mg> Ca > Fe > Cu > As > Se e os níveis destes minerais podem variar por fatores 
intrínsecos e extrínsecos ao fruto (MOODLEY, KINDNESS, JONNALAGADDA, 2007). 
 O mineral de maior relevância na castanha-do-Brasil devido ao seu alto teor e 
importância é o Selênio, um mineral que possui ação antioxidante e é relacionado à redução 
de alguns tipos de câncer, manutenção da glândula tireóide e manutenção da normalidade 
funcional do sistema imune devido aos seus efeitos preventivos em processos metabólicos 
degenerativos no organismo por atuar como um cofator da enzima glutationa peroxidase, uma 
das enzimas mais importantes no mecanismo de defesa antioxidante (CHUNHIENG, 2004; 
SEIFRIED et al., 2007; YANG 2009). 
 Uma amêndoa pode fornecer aproximadamente 120 µg de Selênio. Essa quantidade é 
superior a necessidade diária recomendada deste mineral para homens e mulheres, que é de 
23 
 
 
 
aproximadamente 75 µg e 55 µg por dia respectivamente (FAO 2002; MOODLEY, 
KINDNESS, JONNALAGADDA, 2007; YANG, 2009). 
 
1.3. Importância econômica 
 
A exploração e comercialização da castanha-do-Brasil desempenha importante papel na 
organização socioeconômica nas grandes áreas extrativistas da floresta amazônica 
especialmente no estado do Acre. Representam um grande valor no comércio internacional, 
representando uma fonte de renda para os seringueiros e extrativistas da região amazônica 
(SILVA, 2002; SOUZA, 2003). 
No Brasil, a região Norte é onde se concentra a maior parte da produção da castanha-do-
Brasil (95,9%). Em 2014 o Brasil produziu 37499 toneladas. O estado do Acre foi o principal 
produtor, responsável por uma produção de 13684 toneladas, seguido por Amazonas (12901 
toneladas), Pará (6903 toneladas), Rondônia (1854 toneladas), Mato Grosso (1524 toneladas), 
Amapá (466 toneladas) e Roraima (166 toneladas) (IBGE, 2014). 
Brasiléia, Rio Branco, Xapuri e Sena Madureira são os principais municípios produtores 
de castanha-do-Brasil no estado do Acre. Oriximiná e Óbidos são os destaques no Pará e os 
municípios de Beruri e Humaitá são os destaques do estado do Amazonas. Dos 20 municípios 
que mais produziram castanha-do-Brasil em 2014 sete são do Acre, nove do Amazonas, três 
do Pará e um de Rondônia representando 67, 1% da produção nacional (IBGE, 2014). 
 A castanha-do-Brasil é um produto muito apreciado nos Estados Unidos e também na 
Europa. Os principais países produtores são o Brasil, a Bolívia e o Peru. O Brasil dominou o 
mercado internacional até o início da década de 90, mas atualmente a Bolívia desponta como 
o maior produtor e exportador da castanha-do-Brasil. Desta forma, o Brasil ocupa a segunda e 
terceira (além da Bolívia, está atrás do Peru) posição em produção e exportação, 
respectivamente. Nas figuras 4 e 5, é possível observar a distribuição dos números de 
produção e exportação (FAOSTAT, 2016). 
 
24 
 
 
 
 
Figura 4. Produção de castanha-do-Brasil (toneladas) realizada por Brasil, Bolívia e Peru entre 1998 e 2013. 
Fonte: FAOSTAT, 2016. 
 
 
Figura 5. Total de castanha-do-Brasil exportada (toneladas) por Brasil, Bolívia e Peru entre 1998 e 2013. 
Fonte: FAOSTAT, 2016. 
 
Há uma diferença entre os produtos exportados por Brasil e Bolívia. A Bolívia controla 
71% do mercado de exportação da castanha descascada – produto de maior valor no mercado 
externo – enquanto o Brasil é o maior exportador de castanha com casca. A castanha se 
configura como o principal produto florestal de exportação (BOJANIC, 2001). 
Para aumentar a competitividade do produto nacional, surgiram diversas políticas de 
incentivo, como o Projeto de Manejo dos territórios quilombolas no Pará e a parceria entre o 
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
50000
To
n
e
la
d
as
Ano
Brasil
Bolívia
Peru
0
5000
10000
15000
20000
25000
To
n
e
la
d
as
Ano
Brasil
Bolívia
Peru
25 
 
 
 
estadodo Acre com o Programa de Alimentos Seguros. Esses programas possibilitaram a 
implantação de cultivos comerciais da castanheira, pesquisas de melhoramento genético e de 
técnicas aprimoradas de manejo e cultivo e beneficiamento da castanha (EMBRAPA 2004, 
PIMENTEL et al., 2007). 
Nacionalmente, o Projeto de monitoramento e controle de micotoxinas na castanha-do-
Brasil (BRASIL 2002) e o Plano Nacional de Segurança e Qualidade dos Produtos de Origem 
Vegetal – PNSQV (BRASIL 2003) surgiram com o objetivo de ajudar no controle de 
contaminantes químicos e biológicos para agregar valor ao produto final e evitar perdas 
econômicas. 
 
1.4. Cadeia produtiva da castanha-do-Brasil 
 
Ao longo dos anos, as exportações de castanha-do-Brasil pelo Brasil têm diminuído. 
Uma das causas, além da diminuição da oferta do produto e destruição dos castanhais nativos 
da floresta brasileira, foi a imposição de padrões fitossanitários muito mais rígidos pelos 
principais países importadores como os países pertencentes a União Européia. Assim as 
empresas de beneficiamento tiveram que procurar aprimorar os seus padrões de qualidade e 
passaram também a buscar novos mercados, já que a tecnologia de processamento da 
castanha-do-Brasil usa grande contingente de mão-de-obra (PERES et al., 2003; EU, 2003; 
BRASIL, 2002). 
Nos locais extrativistas o manejo, transporte e a quebra da castanha são artesanais, 
possuindo condições de higiene muitas vezes precárias. A coleta dos ouriços inicia-se entre os 
meses de Janeiro e Maio, quando os ouriços caem no solo na estação chuvosa. Nesta etapa, o 
extrator coloca os ouriços em cestos transportando-os posteriormente aos barracões (de palha 
ou cobertos por lonas), chamados de “região de quebramento” encarregados da extração das 
amêndoas. A segunda parte é a quebra manual dos ouriços para a retirada das castanhas. Após 
esta etapa as castanhas são lavadas, classificadas e armazenadas a granel para transporte e 
beneficiamento. O produtor colhe entre 2000 a 3000 ouriços com o auxílio de duas a três 
pessoas. Todo este processo dura um período de aproximadamente 20 dias. Após isso a 
produção é vendida geralmente no mercado local (BRASIL, 2002). 
O produto é armazenado em barracões e levados aos portos primários para a 
comercialização e depois para a sede do município. O transporte é realizado por pequenas 
26 
 
 
 
embarcações devido a difícil navegabilidade dos rios, mas este transporte também pode ser 
feito por via terrestre como ocorre no Estado do Acre (PACHECO, SCUSSEL, 2006). 
Dos portos de convergência, a castanha é levada por embarcações maiores para a usina 
de beneficiamento. A tabela 3 demonstra um esquema que sintetiza a cadeia produtiva da 
castanha-do-Brasil no país (BRASIL, 2002). 
Nas usinas de beneficiamento, ocorre principalmente a seleção e secagem da castanha 
para que os lotes sejam preparados em temperaturas controladas. Após a etapa de 
beneficiamento, a castanha com casca é acondicionada em big bags de 1000 kg, normalmente 
em sacos de juta ou de polietileno. Já a castanha sem casca é colocada em embalagem 
aluminizada a vácuo ou em sacos revestidos com caixa de papelão e posteriormente 
transportadas para containers em navios para exportação. A castanha descascada quebrada ou 
ferida tem como destino o mercado interno abastecendo as indústrias de alimentos e também 
mercados de varejo (PACHECO, 2003). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
27 
 
 
 
Tabela 3. Etapas da cadeia produtiva da castanha-do-Brasil. 
Etapa Fase 
Etapa 1. Desde a caída natural dos ouriços 
até a venda ao intermediário ou à 
cooperativa, compondo-se de cinco fases: 
1- Preparo do castanhal 
2- Colheita 
a) Coleta 
b) Amontoa 
3- Pré-beneficiamento 
a) Corte 
b) Lavagem 
4- Primeiro transporte 
a) Terrestre 
b) Fluvial 
5- Primeiro armazenamento 
Etapa 2. Inicia com o segundo transporte, 
realizado pelo intermediário que compra as 
castanhas do extrativista. Composta por duas 
fases: 
1- Segundo transporte 
a) Fluvial 
b) Terrestre 
2- Segundo armazenamento 
 
Etapa 3. O beneficiamento da castanha com 
casca inicia com a chegada para o 
beneficiamento. Composta por 3 fases: 
1- Recepção 
2- Terceiro armazenamento 
3- Beneficiamento 
a) Lavagem e peneiramento 
b) Secagem 
c) Resfriamento 
d) Primeira seleção (manual) 
e) Ensaque das castanhas com casca 
Etapa 4. O beneficiamento da castanha sem 
casca é a etapa mais demorada e possui o 
maior número de fases: 
1- Autoclavagem 
2- Segundo resfriamento 
3- Descascamento 
4- Segunda seleção por tamanha 
(mecânica ou manual) 
5- Desidratação 
6- Terceiro resfriamento 
7- Terceira seleção 
8- Embalagem 
Etapa 5. Industrialização da amêndoa: 
realizada com as castanhas sem casca. 
Considerada a última etapa da cadeia 
produtiva, tendo em vista que com o 
processo de industrialização se obtém os 
subprodutos e derivados (óleo, torta, farinha, 
biscoitos etc). Possui as seguintes fases: 
1- Recepção 
2- Seleção 
3- Armazenamento 
Etapa 6. Considerada a mais importante para 
a valorização do produto destinando-se a dois 
segmentos: mercado externo e interno 
 
Fonte: Brasil (2002) 
 
28 
 
 
 
CAPÍTULO 2: MICOTOXINAS 
 
Micotoxinas são metabólitos secundários produzidos por fungos toxigênicos. As 
micotoxinas possivelmente possuem a função de limitar a competição com outro micro-
organismo, auxiliando no crescimento e desenvolvimento do fungo que a produz no alimento. 
São produzidas quase que exclusivamente quando o fungo atinge a maturidade. Possuem 
estruturas que variam de anéis heterocíclicos simples com peso molecular de até 50 Da, a 
grupos que possuem de 6 a 8 anéis heterocíclicos dispostos irregularmente com peso 
molecular total maior que 500 Da (BETINA, 1984). 
A contaminação dos alimentos por micotoxinas varia de acordo com as condições 
ambientais (umidade, temperatura, armazenamento, métodos de processamento e produção) 
em que o alimento é submetido. Dentre estes, a temperatura é um dos principais fatores 
envolvidos na produção de micotoxinas. A faixa ideal de produção varia entre 11 e 37 ºC 
(ZLOTOWSKI et al., 2004). 
As micotoxinas podem entrar na cadeia alimentar do homem direta ou indiretamente. A 
contaminação por forma indireta decorre da utilização de um ingrediente contaminado com 
fungo toxigênico. Durante o processamento do alimento, o fungo pode ser eliminado, mas a 
micotoxina é mantida e o produto final é contaminado. Em contrapartida, a contaminação 
direta ocorre quando o desenvolvimento do fungo e produção de micotoxina acontece já no 
produto final (FREIRE et al., 2007). 
Estes metabólitos possuem efeitos tóxicos agudos, subagudos ou até mesmo crônicos, 
levando a ocorrência de doenças em humanos e animais. O efeito crônico é resultante da 
ingestão moderada ao longo do tempo, dificultando assim, o reconhecimento da associação 
entre a doença e o efeito da micotoxina no organismo. Sua toxicidade é influenciada pela 
quantidade e duração da exposição, idade e estado nutricional do indivíduo exposto, além de 
fatores ambientais (LINDSAY, 1997; SANI et al., 2012). 
A ausência da presença de fungos no alimento não significa ausência de micotoxinas, 
pois o fungo pode estar ausente, mas a toxina pode estar presente e ativa no alimento. A 
maioria das micotoxinas são termorresistentes mantendo a sua toxicidade mesmo após o 
alimento passar por processos que utilizam altas temperaturas (SOARES, FURLANI, 1996). 
De acordo com uma estimativa feita pela Food and Agriculture Organization (FAO) das 
Nações Unidas os alimentos mais suscetíveis a contaminação por AF são os cereais, onde as 
perdas destes alimentos situam-se próximo de 25% dos grãos produzidos (FAO, 1995). 
29 
 
 
 
 
2.1. Aflatoxinas 
 
 
As AF são produzidas, principalmente, por fungos das espécies Aspergillus flavus, 
Aspergillus parasiticus e Aspergillus nomius. Estes fungos ocorremmajoritariamente em 
regiões tropicais e subtropicais onde a temperatura e umidade são elevadas, aumentando 
assim a incidência de alimentos contaminados por AF nessas regiões (MOSS, 1998; VARGA 
et al., 2011). 
As AF mais estudadas e importantes são as AFB1, B2, G1, G2, M1 e M2. Esta 
importância é dada em função do potencial tóxico que estas AF possuem assim como pela alta 
ocorrência em alimentos. As AF M1 e M2 são metabólitos das AFB1 e B2, respectivamente. 
Apresentam como particularidade a possibilidade de serem formadas no metabolismo de 
mamíferos expostos a alimentação contaminada por AFB1 e B2. Sendo assim encontradas 
principalmente no leite, mastambém podem ser produzidas por fungos (BRÄSE et al., 2009; 
FILAZI, SIRELI, 2013). 
 
2.1.1. Estrutura química 
 
As AF são substâncias fluorescentes. As AFB1 e B2 apresentam fluorescência azul 
enquanto as AF G1 e G2 apresentam fluorescência verde quando expostas a luz ultravioleta. 
As características dessas fluorescências identificam as AF (B = blue e G = Green). As AF são 
bisfuranoculmarinas derivadas de decacetídeos formadas pela via biossintética dos 
policetídeos (HUSSEIN, BRASEL, 2001; SMITH, MOSS, 1985). 
As AF da série G diferem quimicamente das AF da série B devido a presença de um 
anel 3-lactona no lugar do anel ciclopentanona. As AFB1 e G1 diferem das AF B2 e G2 por 
possuírem uma ligação dupla 8,9 no anel terminal furano. As AF M1 e M2 são metabólitos 
hidroxilados das AFB1 e B2, respectivamente (Figura 6). Essas diferenças estruturais estão 
ligadas ao nível toxicidade das AF sendo as AFB1 e G1 mais tóxicas que as AF B2 e G2 
(JAIMEZ et al., 2000). 
 
30 
 
 
 
 
 
 
Figura 6. Estruturas químicas das AFB1, B2, G1, G2 M1 e M2 
 
As AF são solúveis em solventes moderadamente polares como clorofórmio e metanol e 
a solubilidade das AF em água varia de 10 a 20 mg/L. São muito estáveis a altas temperaturas, 
porém são sensíveis a luz e a radiação UV e também são destruídas na presença de soluções 
fortemente alcalinas como amônia e hipoclorito (WHO, 1979). 
 
2.1.2. Toxicidade 
 
As AF apresentam o maior nível de toxicidade comparada aos demais grupos de 
micotoxinas. A aflatoxina B1 é considerada como a mais tóxica e comprovadamente 
carcionogênica em humanos pertencendo ao grupo 1. Há evidências de que uma mistura das 
AFB1, B2, G1, G2 naturalmente produzidas seja carcinogênica para humanos (IARC, 1993; 
IARC, 2002). 
Aflatoxicose é o termo utilizado para denominar um conjunto de efeitos tóxicos que as 
AF podem provocar na saúde humana e animal. A severidade da intoxicação depende do 
tempo de exposição às AF, da idade e estado nutricional individual e também de possíveis 
efeitos sinérgicos com outras micotoxinas e/ou outros agentes químicos para os quais o 
indivíduos foi exposto (PERAICA et al., 1999). 
31 
 
 
 
A aflatoxina B1 tem efeito genotóxico, considerada um dos mais potentes agentes 
mutagênicos naturais. A carcinogênese hepática é uma das principais doenças causadas pela 
exposição prolongada as AF (BUSBY, WOGAN, 1984). Efeitos agudos como hemorragias, 
edemas e lesões hepáticas seguidas de mortes tem sido associados ao consumo de alimentos 
com níveis elevados de contaminação por AF (AZZIZ-BAUMGARTNER et al., 2004). 
Alguns trabalhos na literatura têm associado ocorrência de efeitos imunossupressores em 
humanos, devido a exposição às AF (TURNER et al. 2003; JIANG et al. 2008). Também está 
comprovado que doenças como a hepatite B e Kwashiorkor tem relação com a exposição as 
AF (HENDRICKSE, 1991; GONG et al. 2004; TURNER et al. 2007). Todos os efeitos 
tóxicos provocados pelas AF irão depender da quantidade e da freqüência de ingestão de 
alimentos contaminados por AF (TEIXEIRA, 2008). 
A aflatoxina B1 quando ingerida através de alimentos contaminados é metabolizada pelo 
fígado pelo citocromo P450, podendo seguir 4 diferentes vias metabólicas: O-desalquilação 
formando a aflatoxina P1, quetoredução gerando o aflatoxicol, epoxidação gerando a AFB1-8-
9-epóxido (AFBO) – metabólito altamente tóxico, mutagênico e carcinogênico e a 
hidroxilação formando a aflatoxina M1 (substância é altamente tóxica), a aflatoxina Q1 (que 
pode ser transformado em aflatoxicol H1 no fígado) e a aflatoxina B2a (substâncias menos 
tóxicas) (WU et al., 2009) figura 7. 
 
32 
 
 
 
 
Figura 7. Metabolismo da aflatoxina B1 no fígado. 
Fonte: Inchem (1979) 
 
Após ser metabolizada a AFBO pode se ligar a macromoléculas celulares e material 
genético como o DNA formando adutos com os ácidos nucléicos. Estes adutos se 
transformam em um anel aberto estável derivado da formamidopirimidina levando ao 
aparecimento de mutações genéticas e de câncer. Os metabólitos hidroxilados e as demais AF 
não sofrem a reação de epoxidação sendo menos mutagênicos e carcinogênicos (MURPHY et 
al., 2006). 
 
 
 
33 
 
 
 
2.1.3. Fatores ligados a produção das AF 
 
A produção de AF no alimento está diretamente ligada a fatores intrínsecos e 
extrínsecos dos alimentos. Dentre os fatores intrínsecos dos alimentos pode-se destacar a 
composição nutricional, o teor de umidade e a atividade de água (aw) dos alimentos. Já como 
fatores extrínsecos que afetam diretamente a produção de AF destacam-se a temperatura, a 
umidade relativa (UR%), tempo de armazenamento, microclima e o uso de fungicidas. 
 
2.1.3.1. Fatores intrínsecos 
 
Na composição nutricional dos alimentos, tanto os macronutrientes quanto os 
micronutrientes influenciam diretamente na curva de crescimento dos micro-organismos 
assim como no processo de deterioração e possível produção de AF nos alimentos (KABAK, 
DOBSON, VAR, 2006). 
O teor de umidade nos alimentos influencia no desenvolvimento de fungos e possível 
produção de AF. Fungos são mais tolerantes que as bactérias aos meios com baixa umidade. 
Apesar desta maior resistência, não há certeza que o armazenamento de alimentos em locais 
com baixo teor de umidade seja totalmente seguro ao crescimento de fungos. Portanto, é 
fundamental manter o teor de umidade o menor possível, preferencialmente abaixo de 2%, 
além de garantir uma condição de aeração adequada dos alimentos (LORINE, MIIKE, 
SCUSSEL,2002). 
 A atividade de água (aw) do alimento também interfere no metabolismo de fungos e é 
medida em uma escala que varia de 0 a 1, refletindo o grau em que a água está ligada aos 
compostos do substrato. Desta forma, a água não se encontra disponível para reações 
bioquímicas e para o crescimento de micro-organismo. Grande parte das leveduras não cresce 
em aw abaixo de 0,65 e os fungos em aw abaixo de 0,70. Logo pode-se afirmar que, de forma 
geral, os alimentos estão seguros quanto ao crescimento fúngico e possível produção de AF 
quando aw < 0,70. Quanto ao pH, os fungos encontram condições favoráveis de crescimento e 
produção de AF em uma faixa de pH entre 5 e 6 (CODEX ALIMENTARIUS, 2006). 
 
 
 
 
34 
 
 
 
2.1.3.2. Fatores extrínsecos 
 
O fator extrínseco que mais afeta diretamente o desenvolvimento fúngico é a 
temperatura. Diversas espécies de fungos produtores de AF crescem durante o 
armazenamento do alimento com temperatura média de 30 ºC em regiões tropicais, tendo 
como faixa de temperatura ótima entre 25 e 28 ºC. O teor UR% é a umidade de equilíbrio 
entre o ambiente e o alimento. Está relacionada com a aw e resulta em ganho ou perda de 
umidade do alimento, favorecendo ou impedindo o crescimento de fungos (ARRUS, 2005; 
TANIWAKI, SILVA, 1996). 
O microclima (como composição gasosa) que envolve o alimento também interfere no 
crescimento e proliferação de fungos. Alguns fungos podem crescer em baixas concentrações 
de oxigênio sendo somente afetados quando as concentrações atingem níveis menores a 0,2%, 
como em ambientes com altas concentrações de dióxido de carbono ou nitrogênio 
(SCUSSEL, 1998). 
O tempo de armazenamento do alimento também pode favorecer o crescimento defungos que exigem baixa umidade e tempo prolongado para se desenvolver, ou seja, quanto 
maior o período de armazenagem maior a chance de ocorrer crescimento fúngico e 
possivelmente produção de AF (LOPEZ et al., 2000). 
 
2.1.4. Legislação para AF 
 
De acordo com dados publicados pela FAO (2004), Egmonde colaboradores (2007) e 
Erkekoglue colaboradores (2008), mais de 100 países possuem legislação com limites 
máximos toleráveis para a presença de AF em alimentos. A população total desses países 
representa aproximadamente 87% da população mundial. 
Vários fatores são levados em consideração para se estabelecer os LMT para 
micotoxinas em alimentos, como dados toxicológicos e ocorrência das micotoxinas nos 
alimentos e fatores socioeconômicos e comerciais. Os dados são utilizados para a realização 
de estudos de avaliação de risco que são fundamentais para a determinação dos limites, 
permitindo desta forma a disponibilidade de alimentos adequados a população (MAGAN, 
OLSEN, 2004; FAO, 2011). 
A primeira resolução publicada no Brasil para o controle de micotoxinas em alimentos 
foi a resolução 34/76 de 19 de janeiro de 1977 publicada pelo Ministério da Saúde através da 
35 
 
 
 
Comissão Nacional de Normas e Padrões para Alimentos (CNNPA) estabelecendo o LMT de 
30 µg/kg para o somatório das AFB1 e G1 em alimentos para o consumo humano (BRASIL, 
1977). 
O Ministério da Agricultura do Abastecimento e da Reforma Agrária publicou a portaria 
nº 183 de 21 de março de 1996 adotando os LMT estabelecidos no regulamento técnico do 
Mercado Comum do Sul (Mercosul) para o controle de micotoxinas em alimentos para 
consumo humano sob forma da Resolução nº 56/95 de 12 de janeiro de 1995. Os LMT 
definidos foram de 20 µg/kg para o somatório das AFB1, B2, G1 e G2 em amendoim e milho e 
de 0,5 µg/L para a aflatoxina M1 em leite fluído e 5µg/kg para aflatoxina M1 em leite em pó 
(BRASIL, 1996). 
No dia 15 de outubro de 2002, o Ministério da Saúde através da Agência Nacional de 
Vigilância Sanitária (ANVISA) publicou a RDC nº 274 que internalizou a resolução GMC nº 
25/02 do Mercosul mantendo os LMT preconizados pela resolução em vigor no Mercosul. A 
resolução nº 34/76 foi então revogada (BRASIL, 2002; MERCOSUL, 2002). 
Em 2011 o Ministério da Saúde, através da ANVISA publicou a resolução RDC nº 07 
de 18 de fevereiro de 2011 (BRASIL, 2011) onde determina os LMT para diversas 
micotoxinas em diversos alimentos contemplando inclusive a castanha-do-Brasil e também 
alimentos infantis. Esta resolução possui prazos para adequação que foram prorrogados por 
meio da Resolução RDC nº 59 de 26 de dezembro de 2013. 
Como apontado, vários países possuem LMT estabelecidos para AF em alimentos, 
porém os valores dos LMT variam bastante entre os países. Na tabela 4 podem ser observados 
os valores dos LMT estabelecidos para AF nos alimentos voltados para o consumo humano 
em diversos países. 
 
Tabela 4. Limites Máximos Tolerados para AF em alimentos (µg/kg) 
País AFB1 (AFB1+AFB2+AFG1+AFG2) 
Brasil
1* 
- 10 
União Européia
2* 
5 10 
Canadá
3* 
- 15 
Estados Unidos
3 
- 20 
Japão
3 
10 10 
China
3 
 20 
Austrália/Nova Zelândia
3 
 15 
Mercosul
4 
 20 
Fonte: 
1
 Anvisa, 2011; 
2 
CE, 2010; 
3
 FAO, 2004, 
4
 Mercosul, 2002. 
*Valores específicos para AF em castanha-do-Brasil pronta para consumo. 
36 
 
 
 
 
2.1.5. Principais Métodos utilizados na análise de AF em alimentos 
 
Diversos métodos têm sido utilizados para a análise de AF nos alimentos. Na maioria 
das vezes, são compostos por etapas de extração, limpeza, separação, detecção, quantificação 
e confirmação (SCOTT, 1991). 
Na década 1960, a cromatografia em camada delgada (CCD) foi muito utilizada na 
detecção de AF. Com o avanço tecnológico, ao longo dos anos surgiram novas metodologias 
bem como estudos sobre amostragem e validação culminando com uma maior precisão e 
confiabilidade dos resultados (GILBERT, ANKLAM, 2002; WHITAKER, 2003). 
Os métodos utilizados atualmente na determinação de AF em alimentos são: 
cromatografia em camada delgada, fluorimetria, cromatografia a gás acoplada a 
espectrometria de massas ou ao detertor por ionização em chama, cromatografia líquida de 
alta eficiência, imunoensaios (ELISA), cromatografia de imunoafinidade e cromatografia 
líquida acoplada à espectrometria de massas (AOAC, 2012, REN et al., 2007). 
 
2.2. Contaminação da castanha-do-Brasil por fungos e Aflatoxinas 
 
Os primeiros relatos na literatura foram na década de 1960 em que observou-se a 
contaminação da castanha-do-Brasil por fungo do gênero Aspergillus e a associação deste 
gênero com a produção de AF na castanha (ALMEIDA, 1963; MENESES, 1968). 
Dentre os fatores que favorecem a contaminação da castanha-do-Brasil por AF, podem-
se citar os danos mecânicos. Eles podem ocorrer por diversos motivos: queda do ouriço no 
solo, ação de roedores, pássaros e insetos, durante o transporte da floresta até os locais de 
armazenamento, na recepção pelas usinas de beneficiamento ou ainda, na etapa de transporte 
na exportação quando a castanha já foi beneficiada. Estes danos permitem a absorção de 
umidade do ambiente e a invasão, penetração e proliferação dos esporos de fungos no interior 
das castanhas (meio altamente nutritivo) levando ao crescimento dos fungos e possível 
produção de AF (PACHECO, SCUSSEL, 2006; PACHECO, 2003). 
Durante o processo de secagem, pode ocorrer uma distribuição heterogênea do calor 
distribuído no interior da castanha levando a uma secagem ineficiente ocasionando um teor de 
umidade na castanha maior do que o adequado, favorecendo o crescimento fúngico. O teor de 
37 
 
 
 
umidade considerado seguro para a estabilidade da castanha-do-Brasil é 13%, abaixo da 
umidade crítica que é 15% (BRASIL, 2004). 
A atividade de água (aw) é outro fator intrínseco muito importante devido ao fato de 
existir fungos que toleram aw < 0,70. As amêndoas de castanha-do-Brasil desidratadas, ou 
seja, com baixo teor de aw (< 0,70) permanecem estáveis por um longo período de tempo na 
etapa de armazenamento (até 180 dias) principalmente quando embaladas a vácuo. Sua 
estabilidade neste caso não depende do processo de secagem utilizado (ARRUS, 2005; 
SILVA, MARSAIOLI, 2003). 
O período que a castanha fica armazenada também é relevante quanto ao crescimento de 
fungos e produção de AF. O tempo que a castanha leva durante toda a sua cadeia produtiva, 
ou seja, desde a coleta, transporte e beneficiamento pode ser superior a 50 dias. Visto que 
estas etapas ocorrem em ambientes que possuem umidade e temperatura elevadas e, portanto, 
favoráveis a contaminação fúngica e produção de AF, devem ser utilizadas todas as medidas 
de boas práticas de fabricação a fim de se evitar este problema (BRASIL, 2002). 
 
2.2.1. Ocorrência de AF na castanha-do-Brasil 
 
A contaminação da castanha-do-Brasil por AFB1, B2, G1 e G2 tem sido frequentemente 
relatada na literatura nos últimos anos. As pesquisas desenvolvidas nas últimas três décadas 
apontam para alto índice de contaminação. 
Em um estudo realizado com castanhas in natura (49 amostras) e processadas (71 
amostras) analisadas por cromatografia em camada delgada (CCD) foi observado a ocorrência 
de contaminação por AF apenas nas amostras in natura com faixa de contaminação entre 2,4 
µg/kg a 8,8 µg/kg (MORALES, FLORES, 1997). 
Na República do Chipre foram analisadas 51 amostras de castanha-do-Brasil com casca 
(20 kg cada amostra) importadas da Holanda entre 1992 e 1996 e 10 amostras estavam 
contaminadas por AF com uma faixa de contaminação variando entre 8,3 µg/kg a 20 µg/kg 
(IOANNOU-KAKOURI et al., 1999). 
Thunvanderet al. (2001) analisaram 17 amostras de castanha-do-Brasil comercializadas 
no mercado sueco e constataram que 41% destas amostras estavam contaminadas, possuindo 
valores de AF totais que variaram de 0,01 a 2500 µg/kg. 
Caldas et al. (2002), ao analisarem 9 amostrasde castanha-do-Brasil comercializadas no 
Distrito Federal no período que antecede o Natal, detectaram que ⅓ das amostras estavam 
38 
 
 
 
contaminadas por AF acima do Limite Máximo Tolerado (LMT) permitido pela legislação 
brasileira. Os teores de AF totais variaram de 48 µg/kg a 294 µg/kg. 
 Pacheco e Scussel (2007) analisaram 80 amostras de castanha-do-Brasil das regiões 
leste e oeste da bacia amazônica e encontraram 68,75% de amostras contaminadas por AF 
com níveis entre 1,2 µg/kg e 11,5 µg/kg e verificaram que as amostras obtidas da região leste 
da Amazônia continham um maior número de amostras contaminadas (29 amostras) e 
também um nível mais alto de contaminação (faixa de contaminação entre 2,0 µg/kg e 11,5 
µg/kg) comparado a região oeste (26 amostras contaminadas com concentrações entre 1,2 
µg/kg a 4,5 µg/kg). 
 Pacheco et al. (2010) analisaram 120 amostras provenientes da cidade de Manaus – 
AM coletadas no período de 2003 a 2006 em diferentes etapas da cadeia produtiva: recepção 
(60 amostras), varejo (30 amostras) e após secagem em indústria de beneficiamento (30 
amostras). Foram encontradas quatro amostras contaminadas (6,7%) por AF nas etapas de 
recepção, e 5 amostras contaminadas na etapa de varejo (16,7%) onde 2 e 3 amostras 
encontravam-se acima da legislação brasileira respectivamente, não foram encontradas 
amostras contaminadas na etapa pós secagem. Os valores encontrados nessas amostras 
variaram de 8 µg/kg a 686 µg/kg. 
Castanhas-do-Brasil comercializadas por cooperativas localizadas nos estados do 
Amazonas, Acre, Amapá e Pará foram analisadas quanto a contaminação por AF em trabalho 
realizado por Reis et al. (2012). Foram coletadas 50 amostras por estado totalizando 200 
amostras analisadas. Foram detectadas AF nas amostras provenientes de todos os estados. 
Foram encontradas quatro amostras contaminadas (8%) provenientes do Acre, 9 amostras 
contaminadas (18%) provenientes do Amazonas, 5 amostras contaminadas (10%) 
provenientes do Amapá e 4 amostras contaminadas (8%) provenientes do Pará. Os valores 
encontrados para AF totais variaram de 1,7 µg/kg a 1655 µg/kg e as amostras provindas do 
Amazonas foram as que apresentaram o maior número de amostras acima da legislação (8 de 
9 amostras). 
Iamanakaet al. (2014) analisaram 95 amostras de castanha-do-Brasil com casca (2 kg 
por amostra) e sem casca (1 kg por amostra) coletadas em supermercados de São Paulo e em 
feiras localizadas em Belém e no Pará. AF foram encontradas em 52% das amostras 
provenientes de São Paulo, masem baixas concentrações (entre 0,25 µg/kg e 0,26 µg/kg de 
AF totais). As amostras oriundas de Manaus e Belém apresentaram um número de amostras 
positivas um pouco menor (39% e 48% respectivamente), porém com níveis maiores de 
39 
 
 
 
contaminação, apresentando concentrações de AF totais variando entre < LD e 0,72 µg/kg e 
5,48 µg/kg e 14,90 µg/kg respectivamente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
40 
 
 
 
CAPÍTULO 3. VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS 
 
A validação é um aspecto relevante a ser considerado principalmente em ações de 
vigilância sanitária, pois garantem confiabilidade nas medições analíticas realizadas pelo 
laboratório. 
O desempenho adequado de qualquer método analítico depende principalmente da 
qualidade das medidas instrumentais e da confiabilidade estatística dos cálculos utilizados no 
processo de análise. Uma forma de assegurar a aplicabilidade do método em sua plenitude é 
através do processo de validação (RIBEIRO et al., 2008). 
A validação de métodos analíticos assim é uma importante ferramenta para dar suporte 
às analises químicas dos produtos e com isso garantir a qualidade dos produtos nas indústrias, 
também sendo fundamental para garantir a qualidade dos resultados analíticos gerados nas 
análises laboratoriais (ESTEVES et al., 2007; THOMPSON, ELLISON, WOOD, 2002). 
O Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia (INMETRO) determina 
que todos os parâmetros de validação sejam verificados para métodos de análises de traços 
(100 mg/kg). Estes parâmetros são: a linearidade e faixa de trabalho, a precisão (repetibilidade 
e precisão intermediária), robustez, efeito de matriz e os limites de detecção e quantificação 
(INMETRO, 2011). 
 
3.1.Faixa de trabalho 
 
A faixa de trabalho de um método analítico é o intervalo entre o nível inferior e o nível 
superior da concentração do analito a ser definido de acordo com o tipo de amostra e método 
que se pretende trabalhar e estes níveis tem que demonstrar precisão, exatidão e linearidade 
adequada (HUBER, 1998). 
Para a determinação da faixa de trabalho se faz necessário observar os limites de 
restrição impostos pela legislação vigente. A concentração do limite de restrição deve estar 
preferencialmente no centro da faixa de trabalho, onde se apresenta a menor incerteza para a 
determinação da concentração do analito e os níveis de concentração da curva deve ser 
equidistantes e preparados em triplicatas (THOMPSON, ELLISON, WOOD, 2002). 
 
 
 
41 
 
 
 
 3.2. Curva analítica e linearidade 
 
 A confecção de curvas analíticas para a realização de análises laboratoriais é de 
extrema importância, pois grande parte dos métodos analíticos utilizam relações lineares para 
quantificação dos analitos de interesse. Isso faz com que o exame de uma função de 
calibração para a linearidade seja uma importante figura de desempenho na validação de 
métodos analíticos (SOUZA, JUNQUEIRA, 2005). A quantificação dos analitos de interesse 
pode ser feita por padronização externa, padronização interna, superposição de matriz e 
adição de padrão (INMETRO, 2011). 
 A linearidade é a capacidade que uma metodologia possui de demonstrar que os 
resultados analíticos obtidos são diretamente proporcionais a concentração do analito presente 
na amostra em uma dada faixa de concentração (ANVISA, 2003; INMETRO,2011). 
 A linearidade pode ser testada por meio de um gráfico de resíduos gerado por uma 
regressão linear das respostas nas concentrações em uma curva de calibração. Um teste de 
significância pode ser utilizado por meio da comparação da variância da falta de ajuste devido 
ao erro puro, pois qualquer padrão de curva sugere uma falta de ajuste devido a uma função 
de calibração não linear (THOMPSON, ELLLISON, WOOD, 2002). 
 Devido à importância da avaliação da linearidade da curva analítica em um método 
analítico foi proposto por Souza e Junqueira (2005) um procedimento para a avaliação da 
linearidade das curvas de calibração através do método dos mínimos quadrados ordinários 
(MMQO), que inclui o delineamento experimental, a estimativa dos parâmetros e o 
tratamento dos valores extremos. 
 
 
3.3. Seletividade 
 
 Seletividade de um método analítico é a capacidade do mesmo em quantificar o 
analito de interesse na presença de outros analitos, de matrizes e outros interferentes. A 
seletividade de um método analítico pode ser verificada através da análise de amostras branco 
obtidas com a mesma matriz a ser analisada devendo-se observar ausência de picos na região 
do tempo de retenção das substâncias de interesse (BRATINOVA, RAFFAEL, SIMONEAU, 
2009; LANÇAS, 2004; RUELA, 2005). 
 
42 
 
 
 
3.4. Repetibilidade 
 
A repetibilidade pode ser definida como o grau de concordância obtido entre os 
resultados de testes independentes realizados em situações de repetibilidade. Consideram-se 
condições de repetibilidade ensaios realizados no mesmo laboratório utilizando o mesmo 
método analítico, material idêntico, o mesmo equipamento, realizados pelo mesmo operador 
em um curto período de tempo. 
De acordo com o INMETRO (2011), a repetibilidade pode ser expressa 
quantitativamente em termos da característica da dispersão dos resultados e pode ser 
determinada por da análise de padrões, de materiais de referência ou através da adiçãodo 
analito de interesse em uma amostra branco. 
 
3.5. Precisão intermediária 
 
Precisão intermediária é quando a precisão de um método analítico é avaliada sobre 
uma mesma amostra, amostras idênticas ou padrões, utilizando um mesmo método, no mesmo 
laboratório variando uma ou mais condições de análise. As condições podem ser: analistas 
diferentes, equipamentos diferentes ou tempos entre análises diferentes (EURACHEM, 1998; 
INMETRO, 2011). 
 
3.6.Limites de quantificação e detecção 
 
3.6.1. Limites de detecção 
 
Limite de detecção (LD) é a menor concentração do analito de interesse presente em 
uma amostra que pode ser detectado, porém não pode ser quantificado, sob condições 
experimentais definidas (ANVISA, 2003). 
O LD pode ser expresso utilizando três métodos: método visual, método da relação 
sinal-ruído e método baseado em parâmetros da curva analítica (RIBANI et al., 2004). 
O método visual é utilizado para determinar o limite de detecção em matrizes com a 
adição do analito de interesse em níveis conhecidos, onde assim se possa diferenciar ruído de 
sinal pela visualização da menor concentração detectável (RIBANI et al., 2004). 
43 
 
 
 
O método da relação sinal-ruído é realizado comparando as medições dos sinais das 
amostras contendo concentrações baixas do analito de interesse e um branco desta mesma 
amostra. A relação sinal-ruído pode ser de 3:1 ou até 2:1 são aceitas como estimativa do 
limite de detecção (RIBANI et al., 2004). 
Ribani e colaboradores (2004) afirmam que para o método baseado nos parâmetros da 
curva analítica, uma curva analítica deverá ser confeccionada utilizando matriz contendo o 
analito de interesse na faixa de concentração próxima ao limite de detecção. O LD é expresso 
como: 
𝐿𝐷 = 3,3 ×
𝑠
𝑆
 onde, 
s é a estimativa do desvio padrão do branco, da equação da linha da reta ou do coeficiente 
linear da equação e S é o coeficiente angular da curva. 
 
 3.6.2.Limite de quantificação 
 
 O limite de quantificação (LQ) é definido como o menor nível de concentração da 
substância de interesse que o método analítico consegue quantificar com um nível de 
incerteza adequado (BRATINOVA, RAFFFAEL, SIMONEAU, 2009). 
 Os mesmos critérios utilizados para o LD podem ser adotados para o LQ, porém deve-
se usar a relação a ser 10:1. O LQ pode ser calculado através dos três métodos utilizados para 
o cálculo do LD (RIBANI et al., 2004). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
44 
 
 
 
CAPÍTULO 4. MÉTODOS DE DESCONTAMINAÇÃO DE AF NOS ALIMENTOS 
 
Os alimentos contaminados por AF podem ser descontaminados através de métodos 
físicos, químicos e biológicos. Os principais métodos físicos empregados para a 
descontaminação de AF em alimentos são o calor, a irradiação e a extrusão. A maior 
dificuldade em aplicar o calor como método de descontaminação é a característica de 
termoestabilidade das AF. Elas são destruídas apenas em temperaturas iguais ou superiores a 
250 ºC. Em geral, maiores valores de temperatura e de tempo resultam em descontaminação 
do alimento (SHAPIRA; PASTER, 2004). Entretanto, o uso de temperaturas muito elevadas 
pode levar a alterações nas características químicas e nutricionais dos alimentos, como 
observado por Hale e Wilson (1979). 
A utilização da irradiação como forma de descontaminação de AF em alimentos ainda 
é controversa, porque as doses necessárias para a descontaminação são maiores que o valor 
considerado seguro para a ingestão humana. Além disso, doses acima de 20 kGy não tiveram 
efeito sobre o nível de aflatoxina B1 em milho, trigo e soja, necessitando de doses entre 50 a 
100 kGy para remover as propriedades tóxicas e mutagênicas desta aflatoxina 
(HOOSHMAND; KLOPFENSTEIN, 1995;TEMCHAROEN; THILLY, 1982). Applegate e 
Chipley (1974) observaram que fungos irradiados podem produzir grandes quantidades de 
AF. Reforçando este estudo, Niles (1978), demonstrou que a produção de micotoxinas em 
grãos irradiados é mais elevada do que em grãos que não foram irradiados. 
A extrusão possui uma boa efetividade quanto à descontaminação de AF nos 
alimentos, porém os maiores inconvenientes da utilização deste método são as alterações nas 
características químicas e nutricionais nos alimentos submetidos a essa técnica (SAALIA & 
PHILIPS, 2011). 
A principal forma de realização da descontaminação de AF nos alimentos por métodos 
químicos se dá através da utilização de solventes orgânicos (acetona, hexano, isopropanol), 
ácidos (clorídrico e sulfúrico) e bases (hidróxido de sódio e amônia). Os maiores problemas 
na utilização deste método são a alteração da matriz, destruição dos compostos nutricionais e 
permanência de resíduos tóxicos nos alimentos descontaminados (BORRELL & GIMENO, 
2002). 
A descontaminação biológica de AF em alimentos é realizada principalmente pelos 
mecanismos de ligação da aflatoxina à parede bacteriana e pela transformação das AF em 
substâncias de menor toxicidade ou não tóxicas através do metabolismo enzimático 
45 
 
 
 
bacteriano. O processo de descontaminação biológica por probióticos através da fermentação 
ácido-lactica ocorre através de ligações nãocovalentes entre os peptideoglicanos presentes na 
parede celular do microrganismo e as AF (NASRABADI et al.,2013). 
Os probióticos têm demonstrado uma boa efetividade na descontaminação dos 
alimentos contaminados por AF através da ligação. Estudos vêm mostrando que os 
probióticos removem de maneira eficaz a aflatoxina B1 em soluções aquosas. Além disso, 
estudos em vivo vêm demonstrando que animais suplementados previamente com probióticos 
têm uma redução na absorção da aflatoxina B1 no trato gastrointestinal (TOPCU et al.,2010; 
NASRABADI et al.,2013). 
Peltonenet al.(2001) estudou a efetividade da descontaminação por ligação de AFB1 
realizada por 20 cepas de Lactobacillus, 5 cepas de Bifidobacterium e 3 cepas de 
Lactococcus, em que ficou evidenciado que a cepa de Lactobacillus rhamnosus apresentou 
uma das melhores capacidades de ligação (54%) e a melhor estabilidade (liberou 27,8% de 
AF totais ligadas). 
Dentre os microrganismos utilizados na descontaminação pela via metabólica, a bactéria 
Rhodococcus erythropolis vem apresentando os melhores resultados. 
Em estudo realizado por Teniolaet al. (2005) para avaliar a degradação de aflatoxina 
B1 por Rhodococcus erythropolis e Mycobacterium fluoranthenivorans foi observado que 
ambos os microrganismos reduziram em 90% a concentração de aflatoxina B1 após quatro 
horas de incubação, apresentando resultados semelhantes em diferentes condições de 
temperatura. Em 2006, Alberts e colaboradores demonstraram que a bactéria Rhodococcus 
erythropolis foi capaz de reduzir 68 % de aflatoxina B1 após 71 h de incubação em meio 
aquoso. 
Portanto, dentre as três formas de descontaminação, os métodos biológicos vêm 
ganhando destaque, uma vez que não deixam resíduos tóxicos nos alimentos, não causam 
perdas nutricionais e possuem uma boa efetividade na descontaminação dos alimentos 
(PAULÍN et al., 2013). 
 
 
 
 
 
46 
 
 
 
5.OBJETIVO GERAL 
 
Validar método para análise de AF em castanha-do-Brasil por cromatografia líquida de 
alta eficiência, aplicar o método validado no monitoramento de castanha-do-Brasil pronta 
para consumo no mercado de varejo e também análise da contaminação por AF no seu extrato 
hidrossolúvel liofilizado. Avaliação do uso de Lactobacillus rhamnosus (ATCC 10863) e 
Rhodococcus erythropolis (ATCC 4277) na descontaminação biológica das AFB1, B2, G1 e G2 
na castanha. 
 
5.1 Objetivos específicos 
 
 Validar método para análise de AF em castanha-do-Brasil por cromatografia líquida 
de alta eficiência, com derivatização pós-coluna e detecção por fluorescência; 
 Aplicar o método validado no monitoramento de castanha-do-Brasil pronta para 
consumo, no mercado de varejo do Município do Rio de Janeiro; 
 Aplicar o método validado na avaliação da contaminação