Enumeração de Populações Microbianas

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 
Instituto de Biociências – Campus de Rio Claro 
Departamento de Bioquímica e Microbiologia 
1 
 
ENUMERAÇÃO DE POPULAÇÕES MICROBIANAS 
 
Disciplina: Microbiologia Geral e Aplicada Prática 08 
Prof. Dr. André Rodrigues 
 
• Objetivos 
 
a) Estimar o número de bactérias e fungos por grama de amostra utilizando a técnica de “pour plate”. 
 
• Considerações 
 
Semelhante a técnica de espalhamento em superfície, “pour plate” é um método empregado na 
enumeração de micro-organismos viáveis em uma amostra. O diferencial desta técnica está no emprego de 
volumes maiores de amostra (até 1 mL) inoculado nas placas de Petri, além da amostra ser misturada ao 
meio de cultura. Nesta aula, os alunos terão a oportunidade praticar este método na enumeração da carga 
microbiana em varias amostras de alimentos. 
 
• Procedimento 
 
A) Identificação 
 
- Marque os tubos de diluição (contendo solução salina 0,85 %) conforme orientações do professor 
(diluições 10-1, 10-2, 10-3 e 10-2). 
- Desembrulhe as placas de Petri que estão estéreis (não abra a placa) e identifique nas tampas as diluições 
a serem empregadas (conforme as orientações do professor), o tipo de amostra e o nome do grupo. 
 
B) Preparo e diluição da amostra 
 
- Pesar em papel alumínio, 10 g da amostra a ser analisada. 
- Se necessário, amassar a amostra com auxílio do cadinho estéril. 
- Adicionar a amostra no frasco Schott com 90 ml de solução salina 0,85 % (Diluição: 10-1). Agitar durante 2 
minutos. 
- Em seguida, com uma ponteira estéril (azul), pipetar 1 mL para o tubo marcado 10-2. 
- Com a mesma ponteira, pipetar 1 mL da diluição 10-1 nas placas de Petri correspondentes. Descartar 
ponteira. 
- Agitar o tubo 10-2 no vortex (durante 2 minutos) e com auxílio de outra ponteira, transferir 1 mL para o 
tubo 10-3. Com a mesma ponteira, transferir 1 mL do tubo 10-2 para as respectivas placas. Descartar 
ponteira. 
- Proceder do mesmo modo para as outras diluições. 
 
C) Verter meio de cultura 
 
- Remover do banho-maria (ajustado para 60° C), o frasco com meio de cultura para resfriar o meio. A 
temperatura ideal para verter o meio nas placas é entorno de 50 – 45° C (verifique a temperatura 
encostando o frasco no pulso). 
 2
- Estando o meio na temperatura ideal, verter até 20 mL no centro da placa tomando cuidado para não 
transbordar ou verter fora da placa. 
- Em seguida, gentilmente homogeneizar o meio e as placas realizando movimentos em forma de “oito” 
(não faca movimentos bruscos, pois o meio poderá vazar da placa) 
- Esperar o ágar solidificar e incubar as placas de PCA na estufa 25° C e as placas de AS na estufa 25° C. 
 
• Resultados 
 
Anote o resultado das contagens na tabela abaixo: 
 
Tipo de 
substrato 
Diluições 
UFC/g 
 Bactérias heterotróficas Bolores e leveduras 
 Réplica 1 Réplica 2 Média Réplica 1 Réplica 2 Média 
 10-1 
 10-2 
 10-3 
 10-4 
 
 
• Questões 
 
1.) Quais as vantagens da técnica de “pour plate” comparada à técnica de espalhamento em 
superfície? 
 
• Referências 
 
ALCÂNTARA, F.; CUNHA, M. A.; ALMEIDA, M. A. Microbiologia: práticas laboratoriais. 2ª ed. Aveiro: 
Universidade de Aveiro, 2001. 297 p. 
LACAZ-RUIZ, R. Manual Prático de Microbiologia Básica. Edusp: São Paulo, 2000. 129p. 
NEDER, R. N. Microbiologia: Manual de Laboratório. Editora Nobel: São Paulo, 2000. 144p. 
PEPPER, I. L.; GERBA, C. P. Environmental microbiology: a laboratory manual. 2nd ed. Elsevier Press: 
Amsterdam, 2004. 209 p. 
RIBEIRO, M. C.; SOARES, M. M. S. R. Microbiologia Prática: Roteiro e Manual. Editora Atheneu: São Paulo, 
2000. 112p. 
SEELEY JR., H. W.; VANDERMARK, P. J.; LEE, J. J. Microbes in action: a laboratory manual of microbiology. 
4th ed. W. H. Freeman and Company: New York, 1991. 450 p.