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Roteiros Microbiologia e Micologia Básica Regras e normativas sobre segurança no laboratório 1. Durante a aula prática, mantenha sempre atenção ao roteiro, tendo-o sempre próximo a você. Pode ser efetuada marcação com caneta sob cada item realizado do experimento de forma a não se perder durante a execução. 2. Leia sempre o roteiro antes de iniciar a prática e mesmo antes das explicações do professor. 3. Observe a localização do material e dos equipamentos de emergência (chuveiro, lava-olhos etc.). 4. Não abra qualquer recipiente antes de reconhecer seu conteúdo pelo rótulo. 5. Não pipete líquidos diretamente com a boca, use pipetas adequadas. 6. Não tente identificar um produto químico pelo odor ou pelo sabor. 7. Não deixe de utilizar os equipamentos de proteção. 8. Não adicione água aos ácidos, mas os ácidos à água. 9. Não trabalhe com sandálias, chinelos ou sapatos abertos e com salto no laboratório. 10. Sempre identifique o conteúdo presente nos frascos ou nos tubos utilizados no experimento com caneta para vidros. Isso facilita seu descarte adequado por parte dos responsáveis pelo laboratório. 11. Mantenha os solventes em recipientes adequados e devidamente tampados, bem como materiais inflamáveis longe de fontes de calor (bico de Bunsen). 12. Utilize a capela sempre que manipular reagentes ou solventes que liberem vapores. 13. Conheça as propriedades tóxicas das substâncias químicas antes de empregá-las pela primeira vez no laboratório. Caso tenha dúvidas, consulte o professor ou o técnico a respeito. 14. Se tiver cabelo longo, prenda-o ao realizar qualquer experiência no laboratório. Não se alimente e nem ingira líquidos nos laboratórios. 15. O uso dos EPIs é obrigatório em qualquer laboratório e procedimento a ser realizado e é de responsabilidade do discente trazê-los consigo a cada aula prática a ser realizada. Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Microbiologia e Micologia Básica Título da Aula: Coloração de Gram ROTEIRO 1 Objetivo A avaliação da morfologia microbiana é muito importante para a execução da maior parte dos exames microbiológicos. A coloração de Gram também deve ser revisada dada sua grande importância no diagnóstico clínico das amostras microbiológicas. Técnica coloração de Gram 1. Em uma lâmina, pingar uma gota de solução salina estéril. 2. Recolher uma colônia pré-cultivada com alça bacteriológica. 3. Colocar a colônia selecionada junto à lâmina e homogeneizar. 4. Fixar o esfregaço no calor. 5. Cobrir o esfregaço com cristal de violeta por 1 minuto. 6. Lavar o esfregaço com água corrente removendo o excesso de corante. 7. Cobrir o esfregaço com lugol por 1 minuto. 8. Repetir o passo 6. 9. Descorar com álcool-acetona até remover o excesso de corante. 10. Repetir o passo 6. 11. Cobrir o esfregaço com safranina por 30 segundos. 12. Lavar e secar. 13. Examinar ao microscópio (1000x). Materiais Quantidades Solução salina 10 mL (por grupo) Corantes para a coloração de Gram 1 por grupo Cristal de violeta, lugol, álcool-acetona e safranina 1 por grupo Placas pré-cultivadas com S. aureus 1 por grupo Óleo de imersão 1 por grupo Equipamentos Quantidades Lâmina 5 por grupo Microscópio 1 por grupo Alça bacteriológica 1 por grupo Estufa 37 °C 1 Atenção: todas as práticas da presente disciplina devem ser executadas seguindo as boas práticas em microbiologia no que diz respeito à manipulação e ao descarte de microrganismos. Descarte do material utilizado conforme normas internacionais de segurança. Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Microbiologia e Micologia Básica Título da Aula: Preparo de meio de cultura ROTEIRO 2 Objetivos O procedimento de preparo de meio(s) de cultura bacteriana é importante para a execução da maior parte dos exames microbiológicos. A aula também deve abordar a questão da seletividade dos meios de cultura. Procedimento: preparo de meios de cultura 1. Leitura de rótulo do meio de cultura. 2. Pesagem do meio de cultura em papel-manteiga. Ágar sangue, ágar Mac Conkey e ágar chocolate. 3. Passar o pó para Erlenmeyer. 4. Dissolver o meio com água destilada e agitar lentamente. 5. Autoclavar. 6. Distribuir o meio na placa. Observação: solicitar ao técnico para ligar a autoclave 30 minutos antes do início da aula. Materiais Quantidades Água destilada Placa para preparar ágar sangue 2 por grupo Placa para preparar ágar chocolate 2 por grupo Placa para preparar ágar Mac Conkey 2 por grupo Erlenmeyer de 200 mL 3 por grupo Proveta de 100 mL 1 por grupo Papel-manteiga Equipamentos Quantidade Balança analítica Autoclave Bico de Bunsen Atenção: todas as práticas da presente disciplina devem ser executadas seguindo as boas práticas em microbiologia no que diz respeito à manipulação e ao descarte de microrganismos. Descarte do material utilizado conforme normas internacionais de segurança. Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Microbiologia e Micologia Básica Título da Aula: Semeadura bacteriana ROTEIRO 3 Objetivos O procedimento de semeadura bacteriana é importante para a execução da maior parte dos exames microbiológicos. A aula também deve abordar a questão da seletividade dos meios de cultura. Procedimento: semeadura por esgotamento 1. Flambar a alça bacteriológica. 2. Recolher de uma placa pré-cultivada uma colônia bacteriana. 3. Semear por esgotamento em placa de ágar chocolate, sangue e Mac Conkey. 4. Encubar por 48 horas. 5. Verificar o crescimento e o isolamento das colônias. Materiais Quantidades Solução salina 10 mL (por grupo) Placa com S. aureus pré-isolados para a aula 1 por grupo Placa ágar sangue 1 por grupo Placa ágar chocolate 1 por grupo Placa ágar Mac Conkey 1 por grupo Equipamentos Quantidades Alça bacteriológica 1 por grupo Estufa 1 Atenção: todas as práticas da presente disciplina devem ser executadas seguindo as boas práticas em microbiologia no que diz respeito à manipulação e ao descarte de microrganismos. Descarte do material utilizado conforme normas internacionais de segurança. Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Microbiologia e Micologia Básica Título da Aula: Quantificação bacteriana – contagem em placa ROTEIRO 4 Objetivo Nesta aula prática será utilizado o método de contagem em placa, que se baseia em três princípios: cada colônia é originada do crescimento e da multiplicação de uma única bactéria, o inóculo original é sempre homogêneo e não existem agregações de células. Como normalmente as populações bacterianas são muito grandes, devemos fazer diluições decimais seriadas. Procedimento (parte 1 – esta aula será continuada em aula posterior) Diluição decimal seriada Marcar tubos contendo 9 mL de salina estéril (10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , 10 -4 , 10 -5 , 10 -6 , 10 -7 , 10 -8 , 10 -9 ). Homogeneizar o tubo de cultura de Escherichia coli e, com pipeta estéril, transferir 1 mL para o tubo da salina marcado 10 -1 . Homogeneizar o conteúdo do tubo 10 -1 , transferindo 1 mL para o tubo de salina marcado 10 -2 . Repetir esse procedimento (diluições sucessivas) até o último tubo. 10 -1 1 mL 0,1 mL Cultura original Diluição Diluição Diluição Diluição Diluição 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 10 -8 10 -2 10 -9 10 -10 1:10 1:100 1:100000000 1:1000000000 1:10000000000 Transferir 0,1 mL de cada diluição em uma placa de ágar Mac Conckey (cada) (como sugestão, usar 3 placas promovendo a semeadura de cada tubo em uma meia placa, como no esquema a seguir). Levar as placas para estufa a 37 ºC. (Solicitar ao técnico que retire após período de incubação, embale em papel-filme e papel-kraft e mantenha em geladeira para visualização posterior). Materiais Quantidades Tubos contendo a cultura de Eschericha coli em caldo nutriente 1 por grupo Séries de tubos com 9 mL de salina estéril em cada um 6 por grupo Pipeta de 1 mL (automática) 1 por grupo *** Placas de Petri com ágar nutriente 6 porgrupo Ponteiras de 1 mL 6 por grupo *** Se necessário, podem ser feitas 3 por grupo e os alunos devem ser orientados a proceder conforme esquema anterior. Equipamentos Quantidades Alça bacteriológica 1 por grupo Estufa 1 Descarte do material utilizado conforme normas internacionais de segurança. Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Microbiologia e Micologia Básica Título da Aula: Controle da população microbiana ROTEIRO 5 Objetivos A pesquisa da microbiota das mãos deve ser feita periodicamente em médicos, enfermeiros, dentistas e outros profissionais da saúde que cuidam de pacientes queimados, com feridas cirúrgicas ou de recém-nascidos. Não é raro, profissionais que possuem bactérias patogênicas na microbiota residente das mãos, como Pseudomonas e o Staphylococcus aureus, o que apresenta um grande risco de contaminação externa para os pacientes. Portanto, é importante para o aluno identificar o risco que representa uma falta de assepsia no cuidar com o paciente ou com material biológico. Procedimento (parte 1 – esta aula será continuada em aula posterior) Com o uso de caneta de marcação permanente, dividir a parte externa do fundo de uma placa de Petri com ágar simples em 3 setores marcando: I, II e III. Sem lavar as mãos, abrir a placa próximo à chama do bico de Bunsen e tocar o dedo indicador no setor I e fechar a placa. Lavar as mãos demoradamente (3 a 5 minutos) com água e sabão neutro. Retirar o excesso de água das mãos ou enxugar com toalha estéril e tocar com o mesmo dedo indicador no setor II. Passar a solução antisséptica nas mãos (álcool iodado ou um antisséptico comercial). Tocar com o dedo indicador no setor III. Identificar o material e incubar a placa a 37 ºC. (Solicitar ao técnico que retire após período de incubação, embale em papel-filme e papel-kraft e mantenha em geladeira para visualização posterior). Equipamento Quantidade Estufa 1 Descarte do material utilizado conforme normas internacionais de segurança. Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Microbiologia e Micologia Básica Título da Aula: Suscetibilidade a antimicrobianos naturais e antibióticos ROTEIRO 6 Objetivo Verificar a suscetibilidade de bactérias frente a antimicrobianos naturais e antibióticos. Procedimento (parte 1 – esta aula será continuada em aula posterior) Materiais Quantidades Placas de ágar Mueller Hunton 2 por grupo Suspensão de Escherichia coli (suspensão preparada pelo técnico contendo colônias de Escherichia coli em meio líquido de caldo BHI) 1 tubo por grupo Pimenta-do-reino em pó 5-10 g por bancada Cravo-da-índia em pó 5-10 g por bancada Açafrão em pó 5-10 g por bancada Orégano triturado 5-10 g por bancada Alho triturado 5-10 g por bancada Canela em pó 5-10 g por bancada Discos de antibióticos (o que tiver disponível), ao menos 4 diferentes 1 disco de cada antibiótico por grupo Equipamentos Quantidades Lâmina 6 por grupo Microscópio 1 por grupo Alça bacteriológica 1 por grupo Procedimento (parte 1 – semeadura e inoculação) Semear a suspensão de Escherichia Coli por técnica de varredura (em todos os sentidos) utilizando swab estéril nas duas placas de ágar MH. Identificar as placas como A e B. Dividir a placa A em 6 áreas, como no esquema a seguir, distribuir nas áreas da placa A (uma pitada do condimento) um condimento diferente por área, tentando não espalhar. Na placa B (dividida em 4 partes), adicionar um disco de antibiótico em cada uma das áreas. Ver esquema a seguir: Placa A Placa B Placa A (representando condimentos) e placa B (representando a distribuição dos discos de antibiótico). (Solicitar ao técnico que retire após período de incubação, embale em papel-filme e papel-kraft e mantenha em geladeira para visualização posterior). Equipamento Quantidade Estufa 1 Descarte do material utilizado conforme normas internacionais de segurança. Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Microbiologia e Micologia Básica Título da Aula: Quantificação bacteriana – contagem em placa (continuação – parte 2) ROTEIRO 7 Objetivo Nesta aula prática será utilizado o método de contagem em placa, que se baseia em três princípios: cada colônia é originada do crescimento e da multiplicação de uma única bactéria, o inóculo original é sempre homogêneo e não existem agregações de células. Como normalmente as populações bacterianas são muito grandes, devemos fazer diluições decimais seriadas. Procedimento (parte 2 – contagem em placa) Retirar as placas da estufa. Fazer a contagem das unidades formadoras de colônias em cada placa. O resultado é expresso como número de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) por mL, de acordo com a seguinte fórmula: Método espelhamento em placa Número de colônias x 10 (fator de correção = volume: 0,1 x 10 = 1 mL) x inverso da diluição em que foi realizada a contagem de colônias � Anotar o número de colônias nas diluições 10 -7 e 10 -9 ou 10 -6 e 10 -8 e calcular o número de bactérias por mL de suspensão. Diluição Nº de colônias Nº UFC/mL 10 -6 10 -7 10 -8 10 -9 Descarte do material utilizado conforme normas internacionais de segurança. Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Microbiologia e Micologia Básica Título da Aula: Controle da população microbiana (continuação – parte 2) ROTEIRO 8 Objetivo Verificação de crescimento bacteriano e identificação do microrganismo isolado por técnica de Gram. Procedimento (parte 2 – verificação e identificação do microrganismo isolado) Retirar as placas de ágar simples da estufa e observar o crescimento bacteriano nas diferentes áreas da placa, caracterizando os tipos morfológicos das colônias e o seu número em cada um dos setores marcados. O crescimento na área I qualifica a microbiota transitória ou flutuante, principalmente. O crescimento na área II qualifica a microbiota residente ou permanente. O crescimento na área III qualifica a microbiota resistente ao antisséptico usado. � Escolher uma colônia isolada em cada setor da placa, realizar 3 esfregaços em lâmina de vidro; � Após secagem e fixação em chama; � Submeter as lâminas à coloração pelo método de Gram; � Observar arranjo, morfologia celular e aspecto tintorial em microscopia óptica com objetiva de imersão (aumento 1000x). Materiais Quantidades Solução salina 10 mL por grupo Corantes para a coloração de Gram 1 por bancada Placas pré-cultivadas e guardadas da aula anterior 1 por grupo Óleo de imersão 1 por grupo Equipamentos Quantidades Lâmina 6 por grupo Microscópio 1 por grupo Alça bacteriológica 1 por grupo Descarte do material utilizado conforme normas internacionais de segurança. Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Microbiologia e Micologia Básica Título da Aula: Suscetibilidade a antimicrobianos naturais e antibióticos (continuação – parte 2) ROTEIRO 9 Objetivo Verificar a suscetibilidade de bactérias frente a antimicrobianos naturais e antibióticos. Procedimento (parte 2 – verificação da sensibilidade aos antimicrobianos naturais e sintéticos) Verificar se houve formação de halos ou zonas de inibição de microrganismos aos antimicrobianos naturais e antibióticos utilizados. Discutir os conceitos de sensibilidade antimicrobiana. Discutir os mecanismos de resistência bacterianos frente aos antimicrobianos. Descarte do material utilizado conforme normas internacionais de segurança. Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Microbiologia e Micologia Básica Título da Aula: Introdução à micologia (micélios aéreos e micélios reprodutivos) ROTEIRO 10 Objetivo Reconhecer as estruturas fúngicas, hifas, conídeos e esporos. Procedimento Solicitar ao técnico com, pelo menos, uma semana de antecedência que umedeça fatias de pão de forma e as mantenha dentro de sacos plásticos para embolorar ou solicitar aos alunos que tragam pão ou fruta embolorada para a aula. Materiais Quantidades Fatia de pão ou fruta com bolor 1 por grupo Bisturiestéril para corte 1 por grupo Corante de azul de algodão lactofenol 1 por bancada Equipamentos Quantidades Lâmina 6 por grupo Lamínula 6 por grupo Microscópio 1 por grupo Alça bacteriológica 1 por grupo Com o auxílio do bisturi, retirar partes do material embolorado da fruta ou da fatia de pão, as mais finas possíveis. Depositar sobre uma lâmina de vidro. Cobrir com corante azul de algodão – lactofenol e prensar com o auxílio de uma lamínula. Observar em microscópio nos aumentos de 10X e 40X. Desenhar o que você observou. Descarte do material utilizado conforme normas internacionais de segurança. Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Microbiologia e Micologia Básica Título da Aula: Fermentação biológica ROTEIRO 11 Objetivo Observar a evidência da atuação de leveduras em uma mistura de água com açúcar. Materiais Quantidades Tubos de ensaio de 10 mL 4 por grupo Bexiga pequena 4 por grupo Fermento em pó 4 colheres (chá) por grupo Açúcar refinado comum 3 colheres (chá) por grupo Farinha de trigo comum (sem fermento) 3 colheres (chá) por grupo Água morna Bancada Elástico ou barbante para fixação das bexigas nos tubos de ensaio qsp Procedimento Cada grupo deverá montar os seguintes sistemas (a seguir, uma representação de como cada tubo deverá ser preparado): � Sistema 1 – 5 mL de água morna e 1 colher (chá) de fermento. � Sistema 2 – 5 mL de água morna e 1 colher (chá) de açúcar. � Sistema 3 – 5 mL de água morna, 1 colher (chá) de fermento e 1 colher (chá) de açúcar. � Sistema 4 – 5 mL de água morna, 1 colher (chá) de fermento e 1 colher (chá) de farinha de trigo. Fonte: Adaptado de: https://labecologiaanimal.wixsite.com/labecologiaanimal/paisagens Cada grupo deverá discutir os resultados observados com o docente. Descarte do material utilizado conforme normas internacionais de segurança. Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Microbiologia e Micologia Básica Título da Aula: Coloração de Gram (bacilos gram negativos e leveduras) ROTEIRO 12 Objetivo A avaliação da morfologia microbiana é muito importante para a execução da maior parte dos exames microbiológicos. A coloração de Gram também deve ser revisada dada sua grande importância no diagnóstico clínico das amostras microbiológicas. Técnica coloração de Gram Realizar o procedimento duas vezes fazendo uma lâmina a partir da cultura de bactéria e outra do tubo contendo fermento da aula de fermentação biológica. 1. Em uma lâmina pingar uma gota de solução salina estéril. 2. Recolher uma colônia pré-cultivada com alça bacteriológica e/ou 1 gota com pipeta Pasteur do tubo com fermento biológico. 3. Colocar a colônia selecionada junto à lâmina e homogeneizar. 4. Fixar o esfregaço no calor. 5. Cobrir o esfregaço com cristal de violeta por 1 minuto. 6. Lavar o esfregaço com água corrente removendo o excesso de corante. 7. Cobrir o esfregaço com lugol por 1 minuto. 8. Repetir o passo 6. 9. Descorar com álcool-acetona até remover o excesso de corante. 10. Repetir o passo 6. 11. Cobrir o esfregaço com fucsina por 30 segundos. 12. Lavar e secar. 13. Examinar ao microscópio (1000 x). Materiais Quantidades Solução salina 10 mL por grupo Corantes para a coloração de Gram 1 por bancada Placas pré-cultivadas com Escherichia coli 1 por grupo 1 dos tubos de ensaio contendo fermento da aula de fermentação biológica 1 por grupo Óleo de imersão 1 por grupo Pipeta Pasteur 2 por grupo Equipamentos Quantidades Lâmina 5 por grupo Microscópio 1 por grupo Alça bacteriológica 1 por grupo Estufa 37 °C 1 Atenção: todas as práticas da presente disciplina devem ser executadas seguindo as boas práticas em microbiologia no que diz respeito à manipulação e ao descarte de microrganismos. Descarte do material utilizado conforme normas internacionais de segurança. Nome do aluno: _____________________________________ RA: ______________ Data: ___/___/___ ATIVIDADE OBRIGATÓRIA 1 1. Na bacterioscopia, a combinação da morfologia observada com o resultado da coloração de Gram desempenha um papel essencial no diagnóstico clínico. Quais são as morfologias bacterianas que podem ser identificadas nesse processo? Discuta de que forma a distinção na composição da parede celular entre bactérias Gram positivas e Gram negativas impacta a interpretação dos resultados da coloração. Visto do docente: (solicita-se evitar rubricas e, se possível, adicionar carimbo) _____________________________ Nome do aluno: _____________________________________ RA: ______________ Data: ___/___/___ ATIVIDADE OBRIGATÓRIA 1 2. Explique as diferenças entre meios de cultura seletivos e diferenciais. É possível combinar essas capacidades em um único meio? Forneça exemplos e justifique a importância dessas abordagens na identificação e na interpretação das características das colônias de microrganismos cultivadas in vitro. Visto do docente: (solicita-se evitar rubricas e, se possível, adicionar carimbo) _____________________________ Nome do aluno: _____________________________________ RA: ______________ Data: ___/___/___ ATIVIDADE OBRIGATÓRIA 2 1. Descreva os métodos de semeadura por esgotamento e espalhamento em meios de cultura sólidos, destacando as diferenças entre semeadura qualitativa e semeadura quantitativa. Quando e por que cada abordagem é preferível em contextos clínicos ou de laboratório? Visto do docente: (solicita-se evitar rubricas e, se possível, adicionar carimbo) _____________________________ Nome do aluno: _____________________________________ RA: ______________ Data: ___/___/___ ATIVIDADE OBRIGATÓRIA 3 1. Qual é o método de divisão realizado pelas bactérias? Em um ambiente controlado e favorável, as bactérias exibem uma curva de crescimento característica. Complete a imagem a seguir, escrevendo os nomes das fases 1, 2, 3 e 4. Posteriormente, forneça uma descrição concisa das características de cada fase. Visto do docente: (solicita-se evitar rubricas e, se possível, adicionar carimbo) _____________________________ Nome do aluno: _____________________________________ RA: ______________ Data: ___/___/___ ATIVIDADE OBRIGATÓRIA 4 1. Em contextos de assistência à saúde, a crescente multirresistência bacteriana representa uma preocupação significativa. Quais são os principais mecanismos de resistência desenvolvidos pelas bactérias diante da pressão seletiva dos antibióticos? Além disso, discuta como a produção de biofilme por algumas bactérias contribui para a disseminação e a persistência das infecções resistentes aos antibióticos. Visto do docente: (solicita-se evitar rubricas e, se possível, adicionar carimbo) ____________________________ Nome do aluno: _____________________________________ RA: ______________ Data: ___/___/___ ATIVIDADE OBRIGATÓRIA 4 2. Explique as diferenças entre respiração aeróbia restrita, anaeróbia restrita e anaeróbia facultativa. Discuta a fermentação e o rendimento energético associado a cada processo. Adicionalmente, mencione os principais fatores que podem influenciar o crescimento bacteriano em ambientes controlados. Visto do docente: (solicita-se evitar rubricas e, se possível, adicionar carimbo) _____________________________ Nome do aluno: _____________________________________ RA: ______________ Data: ___/___/___ ATIVIDADE OBRIGATÓRIA 5 1. Explique a diferença entre as morfologias fúngicas (leveduras e fungos filamentosos) e o fenômeno de dimorfismo fúngico. Discuta como a compreensão dessas características morfológicas é fundamental na investigação e na evolução das infecções fúngicas. Visto do docente: (solicita-se evitar rubricas e, se possível, adicionar carimbo). ____________________________ Nome do aluno: _____________________________________ RA: ______________ Data: ___/___/___ ATIVIDADE OBRIGATÓRIA 6 1. Explique as principais diferenças nos tipos de divisão celular observadas nos fungos. Como essas diferenças impactam a morfologia e o comportamentodesses microrganismos? Discuta a relevância desses processos no estudo das características e no diagnóstico de infecções fúngicas em contextos clínicos. Visto do docente: (solicita-se evitar rubricas e, se possível, adicionar carimbo). ____________________________