Quantificacao em analises toxicologicas 2021_2

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Análise 
Quantitativa em 
análises 
toxicológicas
Alguns parâmetros de validação
Quais analitos???
Quanto de cada 
analito???
Validação de metodologia
Verificações precisam ser realizadas para:
• garantir que as características de desempenho
de um método sejam entendidas;
• demonstrar que o método seja cientificamente
coerente, sob as condições nas quais ele deve
ser aplicado.
Essas verificações são coletivamente
conhecidas como validação.
A validação de um método estabelece,
através de estudos sistemáticos de
laboratório, que o método é adequado à
finalidade, isto é, suas características de
desempenho são capazes de produzir
resultados correspondentes às
necessidades do problema analítico.
Com o objetivo de confirmar que os
métodos são apropriados para o uso pretendido,
o laboratório deve validar:
• Métodos não normalizados;
• Métodos criados/desenvolvidos pelo próprio 
laboratório;
• Métodos normalizados usados fora dos escopos 
para os quais foram concebidos;
• Ampliações e modificações de métodos 
normalizados.
• No caso de metodologia analítica não descrita em 
farmacopéias ou formulários oficiais (Res 899)
ANVISA E INMETRO
• RDC Nº 166, DE 24 DE JULHO DE 2017;
• GUIA Nº 10/2017;
• Norma ABNT ; 
Agencias Credenciadoras para verificar a 
competência de laboratórios de ensaios
As principais características de 
desempenho incluem:
• Especificidade e Seletividade;
• Faixa de trabalho e Faixa linear de trabalho;
• Linearidade;
• Sensibilidade;
• Limite de detecção;
• Limite de quantificação;
• Exatidão e tendência (bias);
• Precisão;
• Robustez;
• Incerteza de medição;
Essas características são inter-
relacionadas, muitas delas contribuindo
para a incerteza total de medição...
e os dados gerados podem ser usados
para avaliar a incerteza de medição
durante a validação.
Não existe um acordo unânime
sobre a interpretação de alguns dos
termos acima, nem sobre as convenções
usadas na sua determinação.
Assim, ao mencionar dados de
validação, é recomendável mencionar
quaisquer convenções adotadas.
• Curva padrão: sucessão crescente ou
decrescente de pontos.
• Curva de resposta, de quantificação,
analítica ou curva de calibração
analítica: busca a linearidade do sinal
obtido como resultante da concentração
analisada no sistema analítico.
Dentro da faixa de trabalho
pode existir uma faixa de
resposta linear e dentro desta, a
resposta do sinal terá uma relação
linear com o analito ou valor da
propriedade.
A faixa linear é definida como a faixa de
concentrações na qual a sensibilidade pode ser
considerada constante e é normalmente
expressa nas mesmas unidades do resultado
obtido pelo método analítico.
Método quantitativo: existe uma faixa de
concentrações do analito ou valores da
propriedade no qual o método pode ser
aplicado.
No limite inferior da faixa de concentração,
os fatores limitantes são os valores dos limites
de detecção e de quantificação.
No limite superior, os fatores limitantes
dependem do sistema de resposta do
equipamento de medição.
Linearidade
É a habilidade de um método analítico em
produzir resultados que sejam diretamente
proporcionais à concentração do analito em
amostras, em uma dada faixa de concentração.
A quantificação requer que se conheça a
dependência entre a resposta medida e a
concentração do analito.
Gráfico representativo de resposta linear dentro do intervalo operacional
especificado (linha azul) e de resposta não linear (linha verde).
Qual resposta é linear ?
Carbamazepina
33,6 1042690
16,8 573049,5
11,2 353795,3
5,6 208219,8
2,8 101021,5
1,12 39790,25
Conc ug/L área
Caso Clínico
João deu entrada no Hospital de Barra do
Garças devido a ingestão de uma quantidade
desconhecida de Ácido Salicílico (AS). Você
como analista toxicológico deverá confirmar
essa intoxicação e quantificar o analito.
1) Você realizou um teste colorimétrico para
confirmar a presença do AS e a resposta foi
positiva. Portanto, você deverá realizar a
quantificação desse analito.
2) A partir de uma solução estoque de ácido
salicílico de 100 mg/dL foram preparadas 5 soluções
de trabalho: 10, 20, 30, 40 e 50 mg/dL. Após leitura
em um espectrofotômetro foram obtidas as seguintes
respostas para as concentrações preparadas (abs):
0,117; 0,251; 0,398; 0,517 e 0,655 , respectivamente.
a) Faça a análise de regressão linear determinando: 
coeficiente angular, coeficiente linear, equação da reta 
e coeficiente de correlação de Pearson.
a.1 Faça utilizando o excell;
a.2 Faça o cálculo manualmente
Exercício
b) Calcule a concentração de salicilato de uma amostra do
João que deu entrada no Hospital intoxicado e após ser
efetuado a análise a resposta encontrada foi uma
absorvância média de 0,432.
c) Na amostra biológica da Maria foi encontrado uma
resposta de 0,056. Qual é a concentração. Interprete o
resultado.
Tabela base
Construir uma planilha
• x y xy x2 y2
mg/dL A 
10
20
30
40
50
x médio y médio
Σ = Σ = Σ = Σ = Σ = 
• Obs.: cada calibrador deve ser feito em triplicata e tira-se a média
A equação da reta que relaciona as duas variáveis é:
y = ax + b 
Onde:
y = resposta medida (absorbância, altura ou área do pico, etc.);
x = concentração;
a = inclinação da curva de calibração = sensibilidade;
b = interseção com o eixo y. 
• [14/5/2014 22:35 "/Graph1" (2456791)]
• Linear Regression for Data1_B:
• Y = A + B * X
• Parameter Value Error
• ------------------------------------------------------------
• A -0,015 0,00724
• B 0,01342 2,18174E-4
• ------------------------------------------------------------
• R SD N P
• ------------------------------------------------------------
• 0,9996 0,0069 5 <0.0001
• ------------------------------------------------------------
Coeficiente de Correlação linear r
O significado de correlação diz que existe uma
correlação entre duas variáveis, quando uma
delas está, de alguma forma, relacionada com a
outra.
Assim, o coeficiente de correlação linear r mede
o grau de relacionamento linear entre os
valores emparelhados x e y em uma amostra.
Coeficiente de correlação linear (r) 
Quanto mais próximo de 1:
- menor é a dispersão do conjunto de
pontos experimentais;
- menor a incerteza dos coeficientes de
regressão estimados.
• O coeficiente de correlação linear (r) é freqüentemente
usado para indicar o quanto pode ser considerada
adequada a reta como modelo matemático.
• Um valor maior que 0,90 é usualmente, requerido.
ou
• [22/7/2013 15:24 "/Graph1" (2456495)]
• Linear Regression for Data1_B:
• Y = A + B * X
• Parameter Value Error
• ------------------------------------------------------------
• A -0,015 0,00724
• B 0,01342 2,18174E-4
• ------------------------------------------------------------
• R SD N P
• ------------------------------------------------------------
• 0,9996 0,0069 5 <0.0001
• ------------------------------------------------------------
[15/5/2009 09:28 "/Graph1" (2454966)]
Linear Regression for Data1_B:
Y = A + B * X
Parametro Desvio padrão
------------------------------------------------------------
A 20941,24019 13449,7275
B 30834,06368 829,58381
------------------------------------------------------------
R SD N P
------------------------------------------------------------
0,99856 22476,75126 6 <0.0001
------------------------------------------------------------
O método pode ser considerado como livre de
tendências (unbiased) se o corredor de confiança da reta
de regressão linear contiver a origem.
LIMITE DE DETECÇÃO
LIMITE DE DETECÇÃO
• Quando são realizadas medidas em
amostras com baixos níveis do analito ou
de uma propriedade, como por exemplo
análise de traços, é importante saber qual o
menor valor de concentração do analito ou
da propriedade que pode ser detectado
pelo método.
LIMITE DE DETECÇÃO
LD= 3,3 * SDa / B
Considerando Y = a + bx
Segundoparâmetros da curva analítica
No caso de métodos não instrumentais (CCD, titulação, comparação
de cor), esta determinação pode ser feita visualmente, onde o limite
de detecção é o menor valor de concentração capaz de produzir o
efeito esperado (mudança de cor, turvação, etc).
LIMITE DE DETECÇÃO
É a concentração que produziria um valor do sinal medido 3 vezes maior 
que o nível do ruído médio medido com a solução controle ou branco.
Segundo a relação sinal-ruído
O limite de detecção do equipamento (LDE) é
definido como a concentração do analito que produz um
sinal de três a cinco vezes a razão ruído/sinal do
equipamento.
O limite de detecção do método (LDM) é definido
como a concentração mínima de uma substância
medida e declarada com 95% ou 99% de confiança de
que a concentração do analito é maior que zero.
O LDM é determinado através de análise completa
de uma dada matriz contendo o analito.
Limite de Quantificação
Limite de Quantificação
• É a menor concentração do analito que
pode ser determinada com um nível
aceitável de precisão e veracidade.
LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO
LQ= 10 * SDa / B
Considerando Y = a + bx
Segundo parâmetros da curva analítica
• Limite inferior de quantificação;
• Limite superior de quantificação;
LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO
Seletividade
EXATIDÃO
Exercício:
2
1 3
4
Fonte:
EXATIDÃO
É a concordância entre o resultado de
um ensaio e o valor de referência aceito
como convencionalmente verdadeiro.
Fonte:
Fonte:
Os processos normalmente utilizados
para avaliar a exatidão de um método
são, entre outros:
⮚ uso de materiais de referência;
⮚ participação em comparações
interlaboratoriais;
⮚ realização de ensaios de recuperação;
⮚ Adição padrão.
Ensaios de recuperação
É definido como a proporção da
quantidade da substância de interesse,
presente ou adicionada na porção
analítica do material teste, que é extraída
e passível de ser quantificada.
Ensaios de recuperação
A recuperação mede a eficiência do
procedimento de extração de um método
analítico dentro de um limite de variação.
• Valores próximos a 100% são desejáveis;
• Geralmente 3 valores (dentro da faixa linear);
Recuperação depende da concentração da 
substância
Recuperação
Fármaco conc teórica conc enc rec obtida SD
(ug/L) (ug/L) (%)
Ibuprofeno 10,00 11,55 115,51 4,63
20,00 17,35 86,77 2,33
30,00 33,53 111,76 0,14
Ensaios de recuperação
Para análise de resíduos:
Intervalos aceitáveis de recuperação:
70 a 120% com precisão de até 20%
Utilizar a faixa esperada para definir valores.
Exatidão
Fonte:
Depende da matriz, processamento da 
amostra e concentração do analito. 
PRECISÃO
PRECISÃO
Precisão é um termo geral para avaliar
a dispersão de resultados entre ensaios
independentes, repetidos de uma mesma
amostra, amostras semelhantes ou padrões,
em condições definidas.
PRECISÃO
É normalmente determinada para circunstâncias
específicas de medição e as formas mais comuns de
expressá-la são:
repetitividade;
reprodutibilidade;
precisão intermediária.
Sendo usualmente expressa pelo desvio padrão ou
desvio padrão relativo.
Fonte:
Métodos que quantificam compostos
em macroquantidades requerem um
RSD de 1 a 2%.
Em análise de traços e impurezas são
aceitos RSD de até 20%
Repetitividade
(precisão intra-ensaio ou intracorrida)
Concordância entre os resultados dentro de um curto 
período de tempo com o mesmo analista e mesma 
instrumentação. 
Condições de Repetitividade
É o grau de concordância entre os
resultados de medições sucessivas de um
mesmo mensurando, efetuadas sob as
mesmas condições de medição, chamadas
de condições de repetitividade.
Repetitividade
Inmetro: Repetitividade
Anvisa: Repetibilidade
Condições de Repetitividade
São obtidas usando: 
❖ Mesmo procedimento de medição;
❖ Mesma amostra;
❖ No mesmo laboratório;
❖ Pelo mesmo operador;
❖ Mesmo instrumento usado sob mesmas condições;
❖ Repetições em curto espaço de tempo.
Repetitividade
A repetitividade pode ser expressa
quantitativamente em termos da característica
da dispersão dos resultados e pode ser
determinada por meio da análise de padrões,
material de referência ou adição a branco em
várias concentrações na faixa de trabalho.
Sugere-se 7 ou mais repetições para o
cálculo do desvio padrão para cada
concentração, chamado desvio padrão de
repetitividade.
Coeficientes de variação obtidos 
para repetitividade: 
Precisão intermediária
Indica o efeito das variações dentro do
laboratório devido a efeitos como diferentes dias ou
diferentes analistas ou diferentes equipamentos ou uma
combinação desses fatores.
OBJ: verificar que no mesmo laboratório o método
fornecerá os mesmos resultados.
Também expressa por meio da estimativa do
desvio-padrão relativo (RSD).
Reprodutibilidade
Reprodutibilidade
É o grau de concordância entre os
resultados das medições de um mesmo
mensurando, efetuadas sob condições
variadas de medição (mudança de
operador, local, equipamentos, etc.).
Condições de Reprodutibilidade
São obtidos usando-se:
• O mesmo método;
• Para a mesma amostra;
• Em diferentes laboratórios;
• por diferentes operadores;
• Diferentes equipamentos.
Reprodutibilidade
Embora a reprodutibilidade não seja um
componente de validação de método executado por
um único laboratório, é considerada importante
quando um laboratório busca a verificação do
desempenho dos seus métodos em relação aos dados
de validação obtidos através de comparação
interlaboratorial.
ROBUSTEZ
A robustez de um método de ensaio
mede a sensibilidade que este
apresenta face a pequenas variações.
Um método diz-se robusto se revelar
praticamente insensível a pequenas
variações que possam ocorrer quando
esse está sendo executado.
ROBUSTEZ
Pode ser avaliada por exemplo por:
• Concentração de solvente orgânico;
• pH e força iônica;
• Programação do gás de arraste;
• Tempo de extração, agitação;
• Qualquer mudança introduzida
ROBUSTEZ
Exemplo de fatores que podem ser
variados e suas respectivas faixas para o
teste de robustez.
pH : 5,7 a 6,1
Tempo de agitação: 13 - 18 min
Temperatura ambiente: 18 a 22 °C
ROBUSTEZ
Também pode-se variar :
• Fornecedores;
• Marcas ;
• Equipamentos;
• Lotes de reagentes;
Se manteve sua resposta em meio a 
mudanças de ambiente de análise o método 
possui robustez.