Principios Analiticos Farmacêutico Postagem_2

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FARMÁCIA 
 
PRINCÍPIOS ANALÍTICOS FARMACÊUTICOS (PAF) 
 
POSTAGEM 2 
 
ATIVIDADE 2 – RELATÓRIO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Resumo 
 Neste segundo relatório iremos demonstrar um processo de validação 
utilizando um princípio ativo piroxicam (PIR), um fármaco amplamente usado 
na terapêutica como agente anti-inflamatório, o que mostra a importância de 
fazer o controle de qualidade, para assegurar sua eficácia no trata mento. 
Dentro desse contexto, iremos utilizar a validação desse princípio ativo 
através da espectrofotometria ultravioleta visível UV, onde iremos mostrar 
as metodologias para quantificar os ativos em produtos ou matérias-
primas, que devem ser validadas pela legislação vigente ou órgãos 
competentes ao objetivo desejado. Esse processo de validação cabe 
determinar a capacidade do método em questão para estar apto a gerar 
resultados satisfatórios e confiáveis sobre o determinado ativo. Além 
disso, pode ser considerado um dos principais instrumentos de garantia da 
qualidade dos produtos. 
 No Brasil, esta metodologia é descrita pela resolução da ANVISA 
através da RDC 166/2017, dessa forma, foram avaliados os parâmetros de 
especificidade, seletividade, limite de quantificação, linearidade, intervalo, 
precisão (repetibilidade e precisão intermediária) e exatidão do princípio 
ativo piroxicam. Foi feito um precisão intermediária) e exatidão do princípio 
ativo piroxicam. Foi feito um aprofundamento de cada parâmetro, e sua 
utilização, com posterior discussão sobre esses parâmetros . Pode-se 
considerar esta metodologia adequada para determinar a concentração do 
piroxicam em cápsulas. 
 Palavras-chave: validação de metodologia analítica; espectrofotometria 
ultravioleta; piroxicam 
 
 
 
 
 
1. INDRODUÇÃO 
 Os anti-inflamatórios são amplamente utilizados, pois as reações 
inflamatórias estão presentes em quase todas as lesões produzidas no 
organismo humano. Dentre os fármacos mais empregados para o alívio 
destes processos destaca-se o piroxicam (PIR) (SILVA,2010). 
O piroxicam é um fármaco que pertence à classe dos anti inflamatórios 
não esteroidais e é amplamente utilizado no tratamento de artrite 
reumatóide, osteoartrite, artrite gotosa aguda, condrocalcinose, espondilite 
anquilosante e inflamação não reumática (KOROLKOVAS, 1994; RAFFA 
2006). Por esse fármaco ter um largo espectro terapêutico, este trabalho 
objetivou verificar a qualidade desse princípio ativo. 
Porque validar? 
 A validação do método é feita para garantir que a metodologia 
analítica é exata, reprodutível e flexível sobre uma faixa específica que 
uma substância será analisada. 
 É uma avaliação que garante conformidades com as exigências legais 
ou interesses de terceiros do método analítico. 
 Já o processo de validação tem como primordial a definição se uma 
metodologia desenvolvida mostra-se capaz de atingir os objetivos a que 
propõem, a satisfatória(BRITO, 2002). Envolve o desenvolvimento de um 
método analítico, afim de gerar-se resultados confiáveis que possam ser 
interpretados de forma uma adaptação ou implementação de um método 
conhecido e um processo de avaliação que estime sua eficiência. 
 A quantificação de um fármaco em uma formulação é considerada um 
aspecto vital da garantia da qualidade de medicamentos (USP, 2003). As 
diretrizes para a determinação de um ativo, principalmente de um fármaco 
de caráter humano ou veterinário, devem seguir uma referência. No Brasil 
utilizamos a Farmacopéia Brasileira, Farmacopéia Americana (USP) e 
Resoluções da ANVISA 
(Agência Nacional de Vigilância Sanitária). A atual resolução vigente é a RDC 
166/2017, como a mais atual legislação de diretrizes para o processo de 
validação metodológica para âmbito nacional (BRASIL ANVISA, 2017; 
ELLISON, 2002). 
 Na validação de métodos analíticos, deverá ser utilizada Substância 
Química de Referência Farmacopeica (SQF) oficializada pela Farmacopeia 
Brasileira, preferencialmente, ou por outros compêndios oficialmente 
reconhecidos pela Anvisa. (BRASIL ANVISA, 2017). 
 Nesse trabalho será descrito a validação da metodologia analítica utilizada 
para quantificar o piroxicam em cápsulas gelatinosas, determinando os 
parâmetros descritos na RDC 166/2017, onde citam os parâmetros de 
especificidade e seletividade, linearidade, limite de quantificação, precisão, 
e exatidão. Ficaram excluídas da validação os parâmetros de limite de 
detecção (LD) e a robustez. 
Objetivo Geral 
Validar a metodologia analítica para quantificação de piroxicam; 
Determinar a especificidade, linearidade, quantificação, precisão e exatidão. 
2. DESENVOLVIMENTO 
 Este trabalho será conduzido através de dados literários observados 
pela biblioteca digital da faculdade do Paraná, sobre validação de 
metodologia analítica para quantificar o princípio ativo piroxicam em 
cápsulas gelatinosas, onde primeiro será apresentados os métodos e o 
aprofundamento do parâmetro, e posteriormente a discussão dos resultados 
encontrados. Seguindo os parâmetros exigidos pela RDC 166/2017, será 
comprovada a validação do método analítico escolhido 
(ESPECTROFOTOMETRIA UV). 
 
2.1 Métodos 
Especificidade e Seletividade 
 Na realização da técnica de espectrofotometria UV para determinação 
do teor de piroxicam, utiliza-se varredura entre 200 e 400 nm em 
espectrofotômetro UV, sendo uma varredura com uma solução padrão de 
piroxicam, e outra com u ma solução contendo somente os excipientes 
utili zados nas cápsulas. As soluções são preparadas dissolvendo-se o 
conteúdo pesado em álcool etílico e uma quantidade de ácido clorídrico 
suficiente para completar o volume do balão utilizado. 
 O teste de especificidade pode ser realizado ao comparar as medidas 
de uma amostra fortifica da e não fortificada que contenha os possíveis 
interferentes com uma solução da amostra padrão. (CASSINI et al, 2013). 
 A seletividade do método analítico deve ser demonstrada por meio 
da sua capacidade de identificar ou quantificar o analito de interesse, 
inequivocamente, na presença de componentes que podem estar presentes 
na amostra, como impurezas, diluentes e componentes da matriz. (ANVISA 
RDC n°166). 
Linearidade e Intervalo 
 A linearidade do método analítico através da espectrofotometria é 
verificada através da leitura em espectrofotômetro na região do UV (333 
nm) de soluções de padrão secundário d e piroxicam num intervalo que 
compreende concentrações entre 2 - 8 μ g/ mL. Através dos valores de 
absorbância obtidos, pode se construir um gráfico d e concentração versus 
absorbância utilizando-se como critério de aceitação um coeficiente de 
correlação (R 2) maior ou igual a 0,9 9. A partir dessa curva de 
calibração, calcula-se o coeficiente angular da reta e o seu ponto de 
inter secção no eixo y. 
 A linearidade de um método deve ser demonstrada por meio da sua 
capacidade de obter respostas analíticas diretamente proporcionais à 
concentração de um analito em uma amostra. (ANVISA RDC n°16 6) . 
Limites de Quantificação 
 O limite de quantificação (LQ) é baseado no desvio padrão (σ) da 
resposta e no coeficiente angular (S) da curva de calibração. LQ = 10. σ.O limite de quantificação é a menor quantidade do analito em uma a 
mostra que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob 
as condições experimentais estabeleci das. (ANVISA RDC n°166). 
Precisão 
 Deve separar uma amostra do princípio ativo do padrão secundário 
de piroxicam e pesados e dissolvidos em determinada quantidade de 
álcool etílico e quantidade suficiente de ácido clorídrico para completar o 
volume de um balão volumétrico de 100 mL. A partir dessa solução devem 
ser preparadas, através de diluições, algumas replicatas contendo 
piroxicam na concentração. Este parâmetro é avaliado em dois níveis: 
Repetibilidade (precisão intracorrida) 
 A repetibilidade do método é determinada através de 3 repetições, 
contendo seis replicatas a 100 % da concentração do teste realizadas pelo 
mesmo analista, no mesmo laboratório, em períodos alternados (manhã, 
tarde e noite), verificando s e os resultados encontram-se dentro da máxima 
diferença aceitável. 
Precisão intermediária 
 A precisão intermediária é expressa através de variações dentro do 
mesmo laboratório, em dias diferentes e por analistas diferentes. O ensaio é 
realizado com 6 replicatas a 100 % da concentração do teste em 2 dias 
diferentes co m 2 analistas diferentes. 
 A precisão expressa o grau de concordância entre uma série de 
medidas realizadas e m condições determinadas. Ela pode ser calculada 
através da determinação do desvio padrão, do intervalo de confiança da média 
ou pelo desvio padrão relativo (ou coeficiente de variação). (VALDERRAMA ET 
al, 2009) . 
 
Exatidão 
 Pode se averiguar a exatidão do método utilizando-se o método de 
adição padrão. Quantidade conhecida de diferentes concentrações do padrão 
secundário de piroxicam é adiciona da a concentrações preparadas com as 
cápsulas manipuladas do fármaco em questão. 
 Exatidão pode ser definida como a concordância entre a média do valor 
observado ou estimado e o valor teórico tido como verdadeiro ou como 
referência. (VALIDAT ION, 1995) Ela é expressa em termos do erro absoluto 
ou erro relativo. 
(SKOOG et al, 2008, p. 86). Os métodos mais utilizados para avaliar a exatidão 
de um método analítico são: materiais de referência, comparação de métodos, 
ensaios de recuperação, adição de padrão. (VALDERRA MA et al, 2009). 
 Após a preparação das soluções mede-se a absorbância das mesmas no 
espectrofotômetro na região do UV em 333 n m. A exatidão é expressa pela 
relação entre a concentração média determinada experimentalmente e a 
concentração teórica correspondente. 
 A exatidão de um método analítico deve ser obtida por meio do grau de 
concordância entre os resultados individuais do método e m estudo em 
relação a um valor aceito como verdadeiro. (ANVISA RDC n°166). 
 Fica de fora da validação os limites de detecção e robustez para o 
trabalho atual, mesmo assim esses parâmetros são de grande importância 
como descrito abaixo. 
Limite de detecção (LD) 
 Limite de detecção deve ser demonstrado pela obtenção da menor 
quantidade do analito presente em uma amostra que pode ser detectado, 
porém, não necessariamente quantificado, sob as condições experimentais 
estabelecidas. 
(ANVISA RDC n°16 6). 
 Robustez é um parâmetro tipicamente realizado no desenvolvimento do 
método analítico que indica a sua capacidade em resistir a pequenas e 
deliberadas variações das condições analíticas. (ANVISA RDC n°166) 
 
2.2 Discussões dos resultados 
Especificidade e Seletividade 
 Especificidade e seletividade é a capacidade que o método possui de 
medir exatamente um composto em presença de outros componentes, tais 
como, impurezas, produtos de degradação e componentes da matriz. Nesse 
teste de avaliação da influência na amostra padrão, os resultados demonstram 
que o método é adequado em relação ao parâmetro avaliado. Quando não 
ocorre o pico de absorção dos excipientes na faixa de luz próximo a 333 nm 
como exemplo na figura 1, é a conclusão da especificidade onde mostra o 
comprimento de onda de absorção máxima do piroxicam. 
 
Figura 1 – Demonstração da não presença de absorbância no comprimento de 
onda do pico alvo, com relação à parte placebo no produto. 
 
Limite de Quantificação 
 Através de uma análise de regressão linear pode se determinar o desvio 
padrão da linha de regressão, através de um cálculo da equação descrito no 
item do parâmetro de limite de quantificação . O limite de quantificação é 
estabelecido por meio de análises das soluções contendo concentrações 
decrescentes de piroxicam até o menor nível determinável com precisão e 
exatidão aceitáveis. 
Linearidade e Intervalo 
 A linearidade de uma metodologia analítica é a capacidade de 
demonstrar que os resultados obtidos são proporcionais à concentração do 
analito dentro de um intervalo especificado. Sendo este, a faixa entre os limites 
de quantificação superior e inferior de um método analítico. 
 A curva de calibração deve apresentar os dados estatísticos de 
intersecção, da equação da regressão linear, o coeficiente de correlação e a 
concentração conhecida do analito. Esta pode ser construí da usando-se, no 
míni mo, cinco valores de concentração enquadrados no intervalo definido e é 
usada para calcular a concentração do fármaco nas amostras, utilizando-se a 
mesma matriz biológica proposta para o mínimo de aceitação do coeficiente de 
correlação (R2) deve ser igual a 0,990. 
 De acordo com o exemplo de linearidade da figura 2, observa-se que um 
método apresenta linearidade no intervalo da concentração testada. Onde se 
determina que o coeficiente angular (A) corresponde a 0,08103 e o valor do 
intercepto obtido (B) foi diferente de zero. 
 
Figura 2 – Curva de calibração demonstrando a linearidade do método. 
Precisão 
 A precisão é a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma 
série de medidas de uma mesma a mostra. Pode ser classificada em três 
níveis: repetibilidade, precisão intermediária e reprodutibilidade. Para poder 
fazer a validação da metodologia do princípio ativo analisado , utilizando 
somente dois parâmetros sendo um deles repetibilidade (concordância entre os 
resultados dentro de um curto período de tempo com o mesmo analista e 
mesma instrumentação) como exemplo na Figura 3, e a precisão intermediária 
(concordância entre os resultados de um mesmo laboratório, mas obtidos em 
dias diferentes, com analistas diferentes e/ou equipa mentos diferentes), onde 
trouxe mos um ensaio em forma de tabela. 
 
 
 
 
 
 Balã
o 
Absorbância 
(nm) 
Resultado 
(%) 
 1 0,5169 95,94 
 2 0,5161 96,12 
Repetibilida
de 
3 0,4991 92,62 
(manhã) 4 0,5019 93,15 
 5 0,5007 92,92 
 6 0,4989 92,60 
 1 0,4575 92,27 
 2 0,4667 94,12 
Figura 3 – Repetibilidade – Precisão intracorrida. 
 O resultado do ensaio de repetibilidade foi expresso como desvio padrão 
relativo (DPR). O DPR calculado foi de 0,48 %, o que demonstra que o método 
não sofre influências do período em que é realizado, uma vez que o DPR 
máximo permitido pela legislação é d e 5 % (R DC nº 166 de 24 de julho de 
2017 ). 
 Balã
o 
Absorbância 
(nm) 
Resultado 
(%) 
 1 0,5169 95,94 
 2 0,5161 96,12 
Analista 1 3 0,4991 92,62 
 4 0,5019 93,15 
 5 0,5007 92,92 
 6 0,4989 92,60 
 1 0,4711 95,02 
 2 0,4805 96,85 
Analista 2 3 0,4696 94,72 
 4 0,4638 93,53 
 5 0,5000 100,87 
 6 0,4747 95,75 
Figura 4 – Repetibilidade - Precisão intermediaria. 
 O resultado do ensaio de precisão intermediário também foi expresso 
como desvio padrão relativo (DPR). O DPR calculado f oi de 1,6 6 %, s endo o 
DPR máximo permitido igual a 5 % (RDC nº 166 de 24de julho de 2017). 
 
Exatidão 
 Através do parâmetro de exatidão é possível comprovar a proximidade 
dos resultados obtidos pelo método em estudo, em relação ao valor verdadeiro. 
 Nos casos em que amostras de todos os componentes do medicamento 
estão disponíveis, aceita se a análise pelo método de adição do padrão, no 
qual adicionam se quantidades conhecidas do padrão de referência aos 
excipientes da formulação. A Figura 5 apresenta os valores encontrados para 
recuperação do piroxicam nas diferentes concentrações. 
 
Figura 5 – Recuperação do piroxicam no método proposto 
3. CONCLUSÃO 
 Pode-se concluir que os resultados obtidos após o processo de validação 
da metodologia analítica exigida estão de acordo com a legislação vigente no 
país, como a específica, seletiva, a estudada através da literatura, de 
mostraram ser apropriados à finalidade pretendida, pois os parâmetros de 
validação que os órgãos reguladores linear, precisa e exatidão. Dentro dos 
parâmetros estudados, a metodologia analítica demonstrou ser reprodutível e 
adequada ao controle de qualidade de formulações que contenham piroxicam. 
 Além disso, trata-se de uma metodologia simplificada, envolvendo poucas 
etapas de preparação de amostras e reagentes, com baixa complexidade de 
preparo e ser rápida. 
 Neste trabalho exibimos à importância da prática de validação do princípio 
ativo, mostrando a necessidade de qualificação do profissional e sua 
capacidade técnica para realizar esse processo. Pois, para garantir que a 
metodologia analítica seja exata e precisa, além de estável, reprodutível e 
flexível para uma faixa específica de uma substância que se espera identificar 
ou quantificar, é necessário a correta interpretação da literatura, o 
domínio de técnicas de laboratórios exigidas em determinados métodos, o 
correto manuseio de equipamentos e a capa cidade de reguladores vigentes 
também específicos para realização dos testes e sua condução, e 
posteriormente para a interpretação de dados estatísticos obtidos. 
 Desta for ma, dependendo do propósito do método, alguns dos 
parâmetros apresentados podem deixar de ser avaliados. 
 Com isso, pode-se concluir a importância da validação que é essencial 
para definir se métodos desenvolvidos estão completamente adequados aos 
objetivos a que se destinam, a fim de se obter resultados confiáveis, e do 
conhecimento. 
 
 
 
 
 
 
 
4. BIBLIOGRAFIA 
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Sanitária. Brasília: Anvisa, 2019. 
N. M. BRIT O , O. P. A. JUNIOR, L. POLESE, M. L. RIBEIRO, Ecotoxicol . e 
Meio Ambiente. 13 (2003) 129 – 146. C. B. BARROS, Revista Biológico. 64 
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ANVISA. Agencia Nacional de Vigilância Sanitária. Brasil, 1999. 
RDC 166 de 24 de Junho de 2017. Dispõe sobre a validação de métodos 
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The United States Pharmacopeia 26. ed., Rockville: United States 
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VALDERRA MA, P.; BRAGA J. W . B.; POPPI, R. J. Estado da arte de figuras 
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