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1 Fertilidade do Solo e Nutrição de Plantas DISCIPLINA: Microbiologia do Solo 2 PROFESSOR: Glaciela Kaschuk Conteúdo UNIDADE 1. Introdução à microbiologia do solo 1.1 Definição de micro-organismos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1.2 Tipos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 1.3 Importância agronômica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 1.4 Demandas atuais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 UNIDADE 2. Fixação Biológica de Nitrogênio em Leguminosas 2.1 Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 2.2 Formação e Fisiologia do nódulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 2.3 Eficiência e fatores que afetam a simbiose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 2.4 Produção de inoculantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 2.5 Recomendações técnicas para inoculação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 UNIDADE 3. Bactérias promotoras de crescimento vegetal 3.1 Definições . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 3.2 Mecanismos de ação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 3.3 Bactérias recomendadas para inoculantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 3.4 Alguns produtos disponíveis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 UNIDADE 4. Fungos micorrízicos 4.1 Fungos ectomicorrízicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 4.2 Fungos micorrízicos arbusculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 4.3 Inoculantes micorrízicos no Brasil . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 4.4 Manejo do solo para obter benefícios da micorrizas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 UNIDADE 5. Biomassa microbiana do solo 3 5.2 Biomassa microbiana do solo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 5.3 Amostragem do solo para biomassa microbiana do solo . . . . . . . . . . . . . . . . . 62 4 UNIDADE 1. Introdução à microbiologia do solo 1.1 Definição de micro-organismos Micro-organismos são organismos microscópicos quando observados individualmente, maioria unicelulares, alguns multicelulares; procariotos ou eucariotos; que realizam nutrição absortiva ou fagocitose. Os micro-organismos constituem-se na maior massa biológica do Planeta; são encontrados em todos os ecossistemas da Terra; têm versatilidade metabólica na obtenção de energia e carbono; e, modificam as condições ambientais dos sítios onde habitam. Tabela 1. Classificação dos Seres Vivos Atual (2016/2017) Domínio Bacteria Archaea Eukarya Reino Eubacteria Archaebacteria Protista Fungi Plantae Animalia Célula Procarionte Procarionte Eucarionte Eucarionte Eucarionte Eucarionte Estrutura celular Parede celular com peptideoglicano Parede celular, se presentes, não possuem peptideoglicano Parede celular com celulose em alguns; alguns tem cloroplasto Parede celular com quitina Parede celular com celulose; tem cloroplasto Sem parede celular, sem cloroplasto Número de células Unicelulares Unicelulares Maioria unicelulares; alguns formam colônias; alguns multicelulares Maioria multicelulares; alguns unicelulares Multicelulares Multicelulares Forma de nutrição autotrófico ou heterotrófico autotrófico ou heterotrófico autotrófico ou heterotrófico heterotrófico autotrófico heterotrófico Exemplos Escherichia coli, Rhizobium metanogênicas halófitas protozoários, algas, fungos gelatinosos Leveduras, bolores e cogumelos musgos, samambaias, coníferas e plantas com flores esponjas, vermes, insetos e vertebrados 5 Figura 1. Estrutura da célula microbiana Figura 2. Tipos de micro-organismos 1.2 Tipos de micro-organismos 6 No solo, os micro-organismos compõe a biomassa microbiana do solo, que é formada principalmente por fungos, bactérias e protozoários do solo. Figura 3. Micro-organismos do solo. 1.3 Importância dos micro-organismos Os micro-organismos são importantes porque contribuem nos processos e situações que causam as doenças infecciosas em humanos e outros animais; contribuem para a nutrição humana; participam na produção de alimentos, energia e bioprodutos; de poluição da água e do solo; de biorremediação de ambientes; de ciclagem de nutrientes; biofertilizantes; no controle biológico; na biopedogênese, entre outros. 1.4 Demandas atuais As principais demandas da microbiologia do solo atualmente são: Inoculantes e bioestimulantes Recuperação de áreas degradadas Aplicação de biossólidos e resíduos industriais Manejo da fertilidade biológica do solo 7 UNIDADE 2. Fixação Biológica de Nitrogênio em Leguminosas 2.1 Introdução O nitrogênio (N) é um dos nutrientes mais requeridos pelas plantas e fator limitante para crescimento rápido e obtenção de altas produtividades. É por isso que produtores rurais aplicam doses elevadas de fertilizantes nitrogenados à maioria dos cereais produzidos sob alta tecnologia. As leguminosas também possuem uma elevada demanda de N, mas essa passa despercebida pelo produtor rural porque essas plantas são capazes de suprir quase a totalidade de sua demanda por N através da simbiose com rizóbios, bactérias simbióticas que realizam a fixação biológica do N (FBN). A FBN é realizada por rizóbios e por outros diferentes grupos de bactérias que têm em comum o fato de sintetizarem um complexo enzimático denominado nitrogenase, com a qual quebram a tripla ligação que existe no N2 gasoso, existente no ar atmosférico e/ou solo, conforme a seguinte reação: → Os gêneros de bactérias mais comuns são Rhizobium, Bradyrhizobium e Mezorhizobium, entretanto, muitas novas espécies e gêneros poderão ser descritos à medida que se avançam os estudos sobre a diversidade de rizóbios (Tabela 1). Tabela 1. Exemplos de gêneros de rizóbios e seus respectivos hospedeiros. Gênero (espécies) Planta Hospedeira Rhizobium (por exemplo, R. etli, R. gallicum, R. leguminosarum, R. tropici, R. freirei, R. paranaense) feijão, caupi, ervilha, trevo, etc Mesorhizobium (M. loti) cornichão Bradyrhizobium (B. japonicum, B. elkanii, B. diazoefficiens) soja, acácia negra, Sinorhizobium (=Ensifer) (E. freedi) soja, luzerna Azorhizobium sp. Sesbania virgata Allorhizobium Neptunia natans Methylobacterium (M. nodulans) crotalária Phyllobacterium feijão e cornichão Microvirga caupi Ochrobactrum, Shinella e Devosia acácia-negra Cupriavidus e Paraburkholderia Minosa sp. Fonte: adaptado de Kaschuk e Hungria (2017) 8 Figura 1. Produção de fertilizantes nitrogenados a partir da reação promovida pela técnica de Haber-Bosch. O primeiro produto estável, a NH3, é volátil. A forma sólida de fertilizante é obtida pela adição de outros componentes, como o O2, o CO2, H3PO4 ou H2SO4. O N2 também pode ser transformado em amônia (NH3) através do processo industrial Haber-Bosch, o qual é responsável por parte significativa dos fertilizantes nitrogenados usados em sistemas agrícolas e florestais. Embora a matéria primado processo seja abundante, já que o N2 representa cerca de 80% dos gases da atmosfera, o fertilizante nitrogenado é vendido a preços elevados devido ao seu elevado custo de produção. Para romper a ligação tripla do NN, o processo industrial utiliza temperaturas maiores que 400 ºC e pressões elevadas (>107 Pascal) e consome seis barris de petróleo para cada tonelada de NH3 produzida. Essa NH3 é em seguida estabilizada com outros componentes com preços variáveis e pode dar origem a diferentes fertilizantes nitrogenados, entre eles, uréia, nitrato de amônio e fosfato de amônio (Figura 1). A eficiência de utilização de fertilizantes nitrogenados aplicados ao solo é baixa, pois cerca de 50% do N aplicado é perdido por volatilização ou lixiviação. A volatilização resulta da oxidação do NH4 + com produção de NH3, um gás com alto poder de consumo da camada de ozônio na atmosfera. A lixiviação resulta da nitrificação das formas amoniacais por bactérias nitrificantes, ou seja, a conversão do NH4 + em NO3 -, o qual é altamente solúvel e móvel por fluxo de massa no solo. As perdas de N no caso da fertilização artificial são decorrentes do fato de que é muito difícil aplicar as doses necessárias de fertilizante nitrogenado em tempo real de consumo, de acordo com as demandas graduais de utilização de N em função do crescimento da planta. Portanto, na comparação com fertilizantes, a FBN é uma 9 tecnologia mais barata e contribui para a redução da emissão de gases de efeito estufa e a contaminação de lençóis freáticos e demais corpos d´água. Tabela 2. Estimativa de taxas de fixação de N2 em leguminosas. Leguminosa granífera kg ha -1 ano -1 Arachis hypogaea (amendoim) 32-206 Cajanus cajan (guandu) 68-88 Cicer arietinum (grão de bico) 0-141 Glycine max (soja) 0-450 Lens culinaris (lentilha) 5-191 Phaseolus vulgaris (feijão) 0-165 Pisum sativum (ervilha) 4-244 Pueraria phaseoloides (kudzu tropical) 115 Vigna mungo (feijão da Índia) 119-140 Vigna radiata (feijão mungo) 58-107 Vigna unguiculata (feijão de corda) 9-201 Fonte: adaptado de Ormeño-Orrillo et al. 2012 Figura 2. Resposta da soja inoculada a diferentes doses de fertilização nitrogenada. Note que a aplicação de N inibe a formação de nódulos (colunas) e também abaixa a produtividade da soja. Figura extraída de Kaschuk et al. (2016). 10 É importante notar, que embora a FBN seja comum em diversos ambientes (solo, em corpos d´água, no trato intestinal de alguns animais como ruminantes, cupins, etc.) são os rizóbios as bactérias que garantem as maiores taxas de FBN no planeta e representam a maior expressividade econômica proveniente desse processo. Estima-se que a FBN é capaz de suprir quase totalmente a demanda de N de diversas culturas agrícolas (Tabela 2). No caso da soja, as taxas de FBN são tão elevadas e suficientes para suprir a demanda de N que se dispensa a aplicação de fertilizantes nitrogenados sob qualquer situação (Figura 2). Além de contribuir para o alto rendimento de grãos, os resíduos das leguminosas deixados no solo podem contribuir para o maior aporte de N orgânico do solo, favorecer a atividade biológica do solo e a sustentabilidade da produtividade agrícola. 2.2 Formação e Fisiologia do nódulo Os rizóbios são bactérias do solo que colonizam o interior das células das raízes das leguminosas, induzem à formação de nódulos radiculares e, a partir dessas estruturas, estabelecem uma parceria simbiótica. Os nódulos são protuberâncias do córtex das raízes contendo células infectadas por rizóbios em conexão com os tecidos vasculares das plantas (Figura 3). Quando em simbiose, as leguminosas entregam parte dos carboidratos, recém sintetizados, na fotossíntese aos rizóbios. Estas bactérias sofrem alterações morfológicas e fisiológicas quando penetram a raiz das leguminosas, sendo então denominadas bacteroides. Por sua vez, retribuem a planta com íons de NH3, o primeiro produto estável obtido pelo processo de FBN (Figura 4). O NH3 é assimilado em duas etapas pela célula vegetal com as enzimas glutamina sintetase e glutamato sintase, podendo ocorrer variações com as enzimas em caso de estresse como seca ou alta temperatura. A seguir, o N incorporado em glutamina ou glutamato serve de base para a síntese de outros compostos orgânicos que são exportados pelo xilema da planta. Com relação ao transporte de N assimilado, existem plantas associadas à FBN que transportam principalmente ureídos (alantoína, ácido alantóico e citrulina), que é o caso da soja, do feijão e do feijão caupi; outras que transportam principalmente amidas (asparagina e glutamina), que é o caso da lentilha e da ervilha, e outras ainda, que transportam outras formas de N orgânico tipo aminoácidos. 11 Figura 3. Anatomia dos nódulos. Os números representam os seguintes componentes: (1) Sistema vascular da raiz; (2) Vasos condutores: importação de açúcar e exportação de N fixado; (3) Células não infectadas: este é o local onde ocorre assimilação de NH3; (4) Células infectadas: local onde ocorre a redução de N2 em NH3 pelos bacteróides (pontos escuros); (5) Zona central: formado por células infectadas e não- infectadas e pelo espaço intercelular preenchido com O2: a concentração de O2 é baixa, mas este gás é rapidamente transportado pela atividade da leghemoglobina; (6) Barreira de difusão de gases: onde o O2 é limitado pela difusão. Figura 4. Funcionamento do nódulo e fixação de N2. A NH3 (amônia) é um gás tóxico à atividade celular do rizóbio, por isso é rapidamente removido para a célula vegetal, onde é assimilado por enzimas do metabolismo do N. Figura extraída de Kaschuk (2009). 12 Os rizóbios oxidam os carboidratos absorvidos pelo metabolismo das pentoses, consumindo entre 6-12 g de C por g de N fixado, o que significa em torno de 20-30% da fotossíntese atual da planta. Os fotossintatos geram força redutora e ATP para o sistema nitrogenase, que são substratos para crescimento e manutenção das células microbianas, e, suprem esqueletos de carbono, ATP e força redutora para a assimilação da NH3. O aparente desperdício de fotoassimilados por rizóbios em simbiose é simultaneamente compensado por aumentos nas taxas fotossintéticas. Dessa maneira, apesar do custo energético da FBN, as plantas noduladas costumam ter maiores rendimentos do que as plantas que são somente nutridas pela fertilização artificial. A capacidade fotossintética das plantas permite inclusive que os rizóbios acumulem reservas em grânulos vesiculares de polihidroxibutirato (PHB) dentro de suas células, podendo utilizá-las para a FBN ou para sobrevivência após a conclusão do ciclo da cultura. Embora os nódulos pareçam estruturas simples, ao serem destacados das raízes, são arranjos complexos de células corticais ao serem analisados em detalhe. Em termos anatômicos, o nódulo na sua camada mais externa é formado por células corticais bem adensadas com espaços intercelulares preenchidos com água, o que resulta numa barreira física para o fluxo de gases no interior do nódulo (Figura 3). Essa barreira é necessária para proteger a nitrogenase da ação deteriorante do O2. O complexo nitrogenase é composto de duas unidades proteicas: a dinitrogenase redutase (componente II ou Fe-proteína) e a dinitrogenase (componente I ou MoFe proteína). As duas unidades atuam simultaneamente durante a FBN. Existem pelo menos três tipos de nitrogenase conhecidos: (1) nitrogenase que possui molibdênio (Mo; nitrogenase-1) e ferro (Fe); (2) possui vanádio (V) no lugar de Mo (nitrogenase-2); e (3), possui apenas Fe (nitrogenase-3). Aqui vale esclarecer que a nitrogenase é dominada por um paradoxo biológico. Por um lado, a sua atividade depende de uma alta atividade respiratória oxidativa, cuja função é gerar energia metabólica; por outro lado, a própria enzimaé danificada pela presença de O2. Assim, a barreira física protege a nitrogenase por inibir a difusão de O2 até o seu sítio de atividade. Nos nódulos senescentes, a barreira física protetora é afrouxada e os rizóbios são liberados para o meio externo. A quebra da tripla ligação (NN) requer um elevado consumo de energia metabólica na FBN, e esta deriva da atividade respiratória aeróbica. Como a concentração de O2 dos nódulos é diminuída pela barreira de difusão de gases e consumo desse componente, as células vegetais, estimuladas pelos rizóbios, sintetizam a leghemoglobina, uma enzima que atua em série transportando moléculas de O2 (em baixa concentração nas células, embora sob fluxo intenso) da membrana 13 externa da célula bacteriana até a membrana citoplasmática onde ocorre a respiração celular. Essa proteína é frequentemente utilizada como indicador de atividade dos nódulos. É a leghemoglobina que dá tons avermelhados ao interior do nódulo, que afinal indica que o nódulo está ativo biologicamente e realizando FBN. Estabelecimento da simbiose Os rizóbios são bactérias Gram-negativas que sobrevivem no solo na fração da biomassa microbiana da matéria orgânica do solo. No solo, os rizóbios competem com outras bactérias do solo por carbono mineralizável e outros fatores de crescimento. Os rizóbios não realizam FBN quando vivem no solo, pois vivem como bactéria saprofítica decompondo matéria orgânica. A única exceção conhecida ocorre com o gênero Azorhizobium, que nodula plantas aquáticas do Pantanal. Sob simbiose nas leguminosas, os rizóbios são capazes de crescer em elevado número de células e realizar FBN. A simbiose é estabelecida em etapas sequentes de pré-infecção, reconhecimento dos simbiontes e interações entre superfícies da bactéria e da planta, infecção da planta pela bactéria, metamorfose do rizóbio para bacteroide, uma célula modificada morfologicamente (inchada) e habilitada bioquimicamente para fixar N dentro do nódulo, induzir a formação do nódulo, promover o funcionamento do nódulo e realizar FBN. Todas as etapas, anteriormente citadas, dependem e podem variar em função dos genótipos da planta e do rizóbios envolvidos, bem como, dos fatores ambientais. Já são conhecidos mais de 60 genes envolvidos no reconhecimento da planta hospedeira pela estirpe de rizóbio até o transporte de substrato carbonáceo da planta para o bacteroide dentro do nódulo. O reconhecimento inicial dos simbiontes é realizado através de moléculas exsudadas pela planta que ativam os genes de nodulação (genes nod) da bactéria. Exemplos dessas moléculas são flavonoides, chalconas, betaínas e isoflavonoides. Uma vez ativados os genes nod, a bactéria começa a sintetizar os fatores NOD, que induzem o início da infecção no hospedeiro o qual leva à nodulação. Os fatores NOD são lipoquitooligossacarídeos e podem ser citocinas, ácido N-acetil-glutâmico e diacilglicosil diglicosil. Esses compostos estimulam a divisão e elongação celular para formação dos nódulos. Moléculas de lectinas determinam o processo de aderência dos rizóbios à superfície da raíz. As lectinas são muito específicas e em sistemas compatíveis, capazes de promover o reconhecimento dos parceiros da simbiose entre rizóbios e 14 leguminosas. Isso não significa necessariamente que cada uma das leguminosas tem afinidade com apenas um grupo taxonômico de rizóbios (estirpes da mesma espécie ou espécies). Na verdade, essa afinidade se refere à aderência de rizóbios e não de qualquer bactéria do solo. Normalmente, as leguminosas nodulam com mais de um grupo taxonômico rizobiano. Por isso, os rizóbios mais eficientes na FBN precisam competir com rizóbios do solo, potencialmente menos eficientes, para ocupar a superfície radicular. O processo de infecção pode ocorrer através da epiderme, de feridas ou de pelos radiculares, sendo os dois primeiros, com ou sem cordão de infecção (Figura 5). Primeiro, ocorre a multiplicação das bactérias ao redor do pelo absorvente e ligação das mesmas à superfície, o que resulta no encurvamento dos pelos. Após infecção seletiva do hospedeiro, ocorre a formação e crescimento do cordão de infecção e liberação das bactérias nas células do córtex. Figura 5. Formação dos nódulos e estabelecimento da simbiose. Fonte: Brock 2016 Se os rizóbios estiverem presentes no sistema radicular e as condições previstas (baixa disponibilidade de NO3 - no solo, boa disponibilidade de água e de nutrientes), os nódulos de culturas leguminosas graníferas (feijão, soja, caupi) começam a ser formados logo após a expansão dos primeiros trifólios, período que corresponde ao início da atividade fotossintética da planta. A FBN se inicia após a maturação dos nódulos, o que significa após um período de 7-10 dias após o processo de formação de nódulos ter se iniciado. As culturas anuais suportam a atividade dos nódulos até a sua fase de formação de grãos, mas sessam a partir dessa fase, pois, nessa fase, as plantas entram num processo de redistribuição de N das folhas para os grãos e senescência. 15 A razão entre células infectadas e não infectadas no nódulo pode variar, e além disso, as células do nódulo podem ou não sofrer mitose durante a formação do mesmo. O rizóbio, uma bactéria com formato bastonete no solo, assume a forma de bacteróide quando se aloja dentro da célula vegetal, e passa, a partir desse ponto, realizar a síntese e atividade da nitrogenase. Existem diferentes nódulos, cujos formatos são determinados pela espécie vegetal envolvida. Assim, algumas leguminosas (por exemplo, soja, feijão, amendoim) formam nódulos esféricos de crescimento determinado (Figura 6), enquanto outras (por exemplo, alfafa e trevo) formam nódulos de crescimento indeterminado com formas alongadas, ramificadas ou não. O formato do nódulo não afeta a eficiência da FBN. Entretanto, é importante reconhecer os diferentes tipos a fim de distingui-los das galhas, que podem ser formadas por parasitas e patógenos, como os nematoides, por exemplo. Figura 6. Diferenças entre nódulos e galhas em raízes de leguminosas. (1) Galhas de soja produzidas por nematoides. (2) Nódulos de feijão produzidos por R. tropici. Note que nódulos formam estruturas nodulares individualizadas enquanto galhas lembram um aspecto tumoroso dos tecidos. De maneira geral, o número de nódulos e a FBN são regulados de acordo com a demanda da planta por N e atingem seus picos na fase de florescimento nas culturas anuais. Por exemplo, uma planta de soja bem nodulada provavelmente formará entre 15 e 50 nódulos, 50 e 250 mg de matéria seca nodular. Porém, não basta apenas contar quantos nódulos a planta formou; é bom observar se os nódulos formados são vistosos e têm coloração avermelhada na sua fração interna. Além disso, a eficiência na inoculação pode ser verificada através da distribuição de nódulos no sistema 16 radicular. Os nódulos formados a partir da inoculação da semente crescem prioritariamente na coroa da planta, no eixo central das raízes, enquanto os nódulos formados com rizóbios do solo aparecem nas raízes secundárias da leguminosa. 2.3 Eficiência e fatores que afetam a simbiose A literatura clássica dispunha de três argumentos para explicar a regulação da FBN nos nódulos. Eram eles: 1) limitação no suprimento de O2; 2) limitação no suprimento de fotoassimilados; 3) Limitação na demanda de N pela planta, ou retro- regulação pelo excesso de N no floema. Os autores que defendiam a regulação da FBN pela limitação de O2 determinaram relações diretas entre a ausência de O2 (por inibição da leghemoglobina, por exemplo) e a inibição da nitrogenase. Esse argumento não foi totalmente descartado, entretanto, notou-se que é provavelmente um mecanismo fisiológico complementar aos demais, que ocorre em função de um evento preliminar. Os autoresque defendiam a regulação pela limitação de fotoassimilados mediram a inibição da nitrogenase em condições em que a fotossíntese era inibida (ausência de luz ou de CO2). Nesse segundo modelo de regulação, as leguminosas não poderiam obter toda a sua demanda de N pela FBN sem que comprometessem a produtividade. Entretanto, ficou provado mais tarde que a fotossíntese pode ser estimulada em condições simbióticas, que os nódulos usualmente acumulam PHB numa demonstração de que fotoassimilados não são recursos escassos, e, que outros fatores determinam a regulação de FBN nos nódulos. De acordo com o terceiro argumento, a FBN é regulada pelo excesso de N do floema que retorna ao nódulo. O N é um elemento móvel na planta, pois as moléculas que abrigam o N (proteínas, aminoácidos, outros compostos nitrogenados) podem ser degradados e reciclados na planta toda vez que não são utilizadas no local onde foram inicialmente depositadas. Assim, se a planta para de crescer por um fator qualquer (que não seja a deficiência de N), o N é devolvido ao floema e realocado na planta, podendo ser transferido para o nódulo. O acúmulo de compostos nitrogenados no nódulo leva à inibição das enzimas ligadas à FBN e à senescência do nódulo. Diversos eventos, além daquele relacionado ao menor crescimento vegetal, podem resultar em incrementos das concentrações de N no tecido da planta, e consequentemente, na inibição da FBN, entre outros: fertilizantes nitrogenados, estresses ambientais (seca e temperaturas elevadas) e limitada disponibilidade de outros nutrientes. 17 Fatores ambientais que limitam a eficiência da simbiose entre leguminosas e rizóbios a) pH do solo e disponibilidade de nutrientes O pH baixo inibe a formação de nódulos e a atividade da nitrogenase, provavelmente por fatores indiretos relacionados à disponibilidade de nutrientes. O pH baixo restringe a disponibilidade de fósforo (P) e molibdênio (Mo) na solução do solo. O P é componente essencial ao metabolismo energético do funcionamento do nódulo; a sua ausência resulta em redução de crescimento da planta e menores taxas de fotossíntese. Por sua vez, o Mo é um dos nutrientes que formam a estrutura da molécula de nitrogenase. Além disso, o pH baixo é acompanhado de baixa disponibilidade de Ca+2 e Mg+2, essenciais ao metabolismo celular, e à elevada disponibilidade de Al e Mn. O pH baixo resulta em aumento da solubilidade do Al+3 e Mn+2 que causam toxicidade nas plantas, induzindo ao baixo desenvolvimento das raízes e dos pelos radiculares absorventes. Outro elemento indispensável à boa atividade da nitrogenase é o cobalto (Co), que atua como cofator da enzima, entretanto, esse fica mais solúvel em baixo pH do solo. Sua deficiência pode ocorrer em situações de cultivo contínuo sem reposição ou em solos que tenham baixa disponibilidade natural deste elemento ou de elevado pH. No caso da soja, as doses de Co e Mo a serem aplicadas são de 2 a 3 g de Co e 12 a 30 g de Mo por hectare via semente ou em pulverização foliar, nos estádios de desenvolvimento V3-V5. b) Nitrogênio mineral A aplicação de N mineral ao solo reduz drasticamente a nodulação e a atividade da nitrogenase. Como o N mineral aplicado ao solo é solúvel e móvel, a planta consegue absorver N com mais rapidez do que faria com a FBN. Uma vez que o N é suprido em quantidades adequadas, a leguminosa diminui a FBN pelo mecanismo de regulação retroativa pelo excesso de N na seiva, discutido anteriormente neste capítulo. A resposta da aplicação de N mineral à produtividade é variável entre as diferentes leguminosas. A soja responde negativamente à aplicação de N mineral em soja, resultando em menor nodulação, menor acúmulo de N na parte aérea e menor produtividade. A eficiência simbiótica da soja decorre do fato de que as cultivares foram e têm sido melhoradas somente na presença de rizóbios eficientes. Nos EUA, o 18 melhoramento de soja sempre ocorreu na presença de N no solo e não considerou a inoculação. Portanto, as cultivares selecionadas não apresentam uma resposta satisfatória à inoculação com rizóbios. Além disso, a pesquisa brasileira tem periodicamente realizado seleção de estirpes mais eficientes para a FBN em condições de campo e estirpes de ótima performance têm sido recomendadas para produção de inoculantes. O feijão é uma cultura que ainda não desenvolveu seu potencial genético em vários aspectos de produtividade, o que inclui, a sua capacidade de FBN simbiótica. Por isso, os manuais de recomendação de adubação e calagem no país ainda indicam a aplicação de uma dose de N de arranque. Por exemplo, no Paraná, a recomendação de fertilização do feijão é de 15 a 25 kg de N ha-1 durante o plantio e 30 a 60 kg de N ha-1 quando as plantas apresentarem entre dois e quatro trifólios desenvolvidos. Contudo, os produtores rurais têm verificado baixas respostas da inoculação com rizóbios em relação à aplicação de N mineral. Isso se deve à inoculação ineficiente ou outros fatores que por si só, limitam a produtividade, como a baixa disponibilidade hídrica e a baixa fertilidade do solo. O feijão, diferente da soja, é na maioria dos casos cultivado por produtores que não utilizam um alto padrão de tecnologia. O mesmo vale para o feijão caupi, comumente cultivado nas regiões mais áridas do país. É provável que o cenário mude a partir do momento que essas culturas recebem o mesmo nível de tecnologia agrícola que a cultura da soja. Sobretudo, é importante considerar que pesquisadores de órgãos de administração estatal do Brasil têm investido recursos a fim de identificar as cultivares e estirpes que se sobressaem sobre a aplicação de N mineral. c) Elementos tóxicos O efeito prejudicial de elementos tóxicos, principalmente, metais pesados é bem documentado nas simbioses entre rizóbios e leguminosas, inclusive com referência a concentrações menores do que os limites estabelecidos pela legislação vigente em países da comunidade europeia. Em áreas agrícolas, a contaminação pode ocorrer pela aplicação de resíduos orgânicos, como lodo de esgoto ou lodo industrial, que contém metais pesados como o chumbo (Pb), alcatrão e compostos carcinogênicos. Uma premissa válida é que todos os fatores limitam o crescimento das plantas também limitam o desenvolvimento e atividade das simbioses. Em áreas contaminadas pela mineração, os elementos tóxicos podem limitar a restauração de ecossistemas florestais. Contudo, a pesquisa para recuperação das áreas contaminadas tem apontado para a alternativa de coinoculação de rizóbios e 19 fungos micorrízicos arbusculares (FMA) em leguminosas pioneiras (ver Capítulo 3). Um ponto interessante é que as simbioses formadas com rizóbios e FMA dão melhores condições fisiológicas para sobrevivência e crescimento das plantas em solos contaminados. A médio e longo prazo, a biomassa vegetal produzida resulta em incremento nos resíduos orgânicos do solo e consequente aumento da biomassa microbiana do solo, que por sua vez, imobiliza os constituintes tóxicos e mitiga a poluição ambiental. d) Defensivos agrícolas Não é possível fazer generalizações, pois dependendo do tipo de fungicida, herbicida ou inseticida, a aplicação sobre a cultura pode ter efeito prejudicial, não exercer nenhum efeito ou até mesmo ter efeito benéfico (raramente) sobre os rizóbios e suas simbioses. É possível que o defensivo agrícola aplicado sobre a cultura instalada traga algum benefício por favorecer a cultura em relação às plantas daninhas e pragas. Assim, os nódulos formados anteriormente à infestação poderão manter um bom nível de atividade devido à melhor situação da cultura. Por outro lado, o tratamento de sementes de soja com fungicidas (contato + sistêmico) mesmo que realizados antes da aplicação do inoculante reduz a nodulação e afeta a eficiência da FBN, o que aotermo da cultura, pode comprometer a produtividade (Figura 8). O efeito da aplicação de defensivos agrícolas pode ser ainda mais severo quando associada à aplicação de cobalto e molibdênio, ofertados na forma de sais, durante o tratamento de sementes. Contudo, é preciso verificar se além do princípio ativo, o pH e os solventes usados na formulação não causam mortalidade nas bactérias inoculadas. 20 Figura 8. Plantas de soja inoculadas com rizóbios cujas sementes foram tratadas (à direita) ou não (à esquerda) com fungicidas. Note que o desenvolvimento das plantas sem fungicida foi melhor do que das plantas com fungicida devido à inibição da formação de nódulos e menores taxas de FBN. Foto extraída de Campo & Hungria (2000). Quando as condições de campo não são adequadas à germinação das sementes (por exemplo, as sementes têm baixo vigor; o solo está seco, etc.), e que o apodrecimento de sementes pode comprometer a produtividade da lavoura, o produtor deve optar pelo tratamento de sementes com fungicidas. No caso da soja, a Embrapa- soja recomenda o uso preferencial de Carboxin + Thiram, Difenoconazole + Thiram, Carbendazin + Captan, Thiabendazole + Tolylfluanid ou Carbendazin + Thiram, os quais parecem ser os menos tóxicos para o Bradyrhizobium (Embrapa Soja, 2013). No caso de outras culturas, é importante que o profissional tenha conhecimento se os produtos a serem utilizados têm registro no MAPA (Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento) e se são recomendados para tratamento de sementes sob inoculação. e) Umidade e Salinidade A deficiência hídrica ou a salinização do solo limitam o crescimento de nódulos e a atividade da nitrogenase em leguminosas cultivadas. O ponto crítico para suprimento de água é a fase reprodutiva da planta. Já foi comprovado que plantas de 21 soja e de feijão que desenvolvem uma boa nodulação, mas são submetidas ao estresse hídrico no período de florescimento ou enchimento de grãos têm suas taxas de fotossíntese diminuídas e param de suprir carboidratos aos nódulos. Assim, os nódulos param sua atividade e entram em senescência. Nessa situação, a produtividade das culturas é seriamente comprometida. Caso as culturas mencionadas (soja e feijão) sofram o estresse hídrico em período anterior ao florescimento e sejam irrigadas novamente, elas reiniciam o processo de formação de nódulos e podem recuperar a FBN. Entretanto, a recuperação da atividade nodular não compensa o período de produção fotossintética e FBN perdidos e as plantas provavelmente perdem capacidade de produção de grãos. Para superar a limitação de crescimento vegetal sob deficiência hídrica (onde não é possível realizar irrigação) e temperaturas elevadas, os pesquisadores do melhoramento genético de soja, feijão e caupi, principais leguminosas graníferas do Brasil, tem feito seleção massal de cultivares tolerantes à seca ou tentado manipular a genética da planta através de transgenia e inclusão de genes que conferiram resistência ou tolerância aos fatores abióticos mencionados. As cultivares geneticamente modificadas para tolerância à seca possivelmente produzem menos do que as cultivares não transgênicas em condições de bom suprimento de água, mas poderiam ser uma alternativa tecnológica viável em regiões com frequentes veranicos ou em situação de safrinha, que normalmente tem um período menor de produção. A salinidade é outro fator limitante à nodulação. A salinidade traz os mesmos efeitos que a deficiência hídrica, ou seja, dessecação das células. A dessecação decorre do movimento da água da célula para o exterior em função do gradiente de solutos da solução do solo. Os solos salinos são casos raros no Brasil, a princípio, só em algumas regiões do Nordeste, mas são muito comuns em países de clima árido e semi-árido (por exemplo, Espanha e Israel) ou em regiões com nível do lençol freático ao nível do mar (por exemplo, Austrália). Os efeitos da salinidade podem ser observados em rizóbios dessecados em função da aplicação de fertilizantes nas linhas de plantio em contato com as sementes inoculadas. Por isso, se o solo requerer doses elevadas de fertilizantes, o produtor rural deve, sempre que possível, fazer uma fertilização corretiva do solo ou parcelar a dose total aplicada. É possível também valer-se da inoculação em sulco que impede o contato direto dos rizóbios com as sementes tratadas com sais provenientes de fungicidas e micronutrientes. A inundação também afeta a nodulação de leguminosas de terra firme porque impedem a difusão de O2 em fluxo suficiente para manter a elevada atividade respiratória do nódulo. Além disso, a anaerobiose do solo leva à indução de hormônios sinalizadores de estresse, como o etileno e a ácido abscísico, que induzem a 22 senescência dos nódulos. Algumas leguminosas adaptadas à pântanos podem suprir O2 aos nódulos através de aerênquimas (vasos condutores especializados para transporte de gases) nos seus caules. Esse é o caso de espécies de Sesbania, muito utilizadas para criação de gado no Pantanal. No caso das inundações temporárias, a nodulação pode ser favorecida se o solo voltar a ser drenado, provavelmente devido à alta lixiviação do nitrato do solo. Entretanto, da mesma maneira que a deficiência hídrica, a inundação deve ocorrer em período anterior ao florescimento da planta e, de forma alguma, a reiniciação da formação dos nódulos compensará totalmente o período perdido de atividade simbiótica. f) Temperatura A alta temperatura pode afetar vários estágios importantes da infecção, formação e função dos nódulos, no entanto, seus efeitos podem variar tanto em função da espécie leguminosa quanto do rizóbio. Como a FBN e a fotossíntese estão estreitamente relacionadas, os limites de temperatura para FBN e para a fotossíntese devem convergem entre si. No caso do feijoeiro, uma leguminosa tropical, a FBN é limitada aos 34 ºC do ambiente e completamente inibida em temperaturas superiores a esta, por exemplo a 39 ºC. Outras leguminosas tropicais, como a soja e o caupi devem tolerar temperaturas até essa magnitude enquanto leguminosas de origem em climas temperados provavelmente interrompem a FBN em temperaturas mais baixas do que as mencionadas para o feijão. A primeira consequência da elevação da temperatura é o acúmulo de NH4 + (o primeiro produto não volátil da FBN) nos nódulos. As elevadas concentrações de NH4 + decorrem da diminuição da atividade metabólica de enzimas que realizam a assimilação de NH4 + em N-orgânico. O processo de regulação retroativa de enzimas é um mecanismo bem conhecido nos sistemas biológicos. Um importante ponto neste aspecto é que normalmente a temperatura alta e deficiência hídrica ocorrem simultaneamente. Por isso, é comum as plantas sob altas temperaturas limitarem a transpiração. Por exemplo, plantas de soja, feijão e caupi sob deficiência hídrica ou altas temperaturas elevadas acumulam N-ureídos na seiva. Por outro lado, quando se trata das bactérias, a alta temperatura danifica a integridade celular e acarreta em perda dos plasmídeos que carregam os genes simbióticos. Sobretudo, os plasmídeos podem sofrer rearranjos genéticos e perder a habilidade de realizar FBN. A causa mais provável dos rearranjos é a atividade de bacteriófagos (vírus que parasitam bactérias) do solo, que redistribuem material genético entre as bactérias. A frequência disso não é conhecida, mas muitos 23 pesquisadores têm hipotetizado que as altas temperaturas aceleram tais rearranjos. Há evidencias de que os rizóbios introduzidos por meio de inoculantes perdem ou recebem material genético nas no campo em condições desfavoráveis de crescimento rizobiano. Também há evidência de que os rizóbios perdem capacidade de FBN sob condições de armazenamento em meio de cultura. Portanto, para a tecnologia de inoculação para FBNseja sempre eficiente, é necessário estabelecer um contínuo programa de seleção de estirpes. Um dos testes realizados para a escolha das estirpes, sem dúvida, é a capacidade de crescimento celular em temperaturas altas. g) Manejo do solo O plantio direto modifica o ambiente de desenvolvimento das raízes e, por isso, favorece a nodulação e a FBN. Isso decorre do fato que a palhada em cobertura contribui para a diminuição das médias e das oscilações de temperatura do solo, diminui as perdas de água por evaporação direta, favorece a biomassa microbiana do solo e permite a sobrevivência de um número maior de rizóbios no solo. A rotação de culturas incluindo leguminosas permite a proliferação de rizóbios no solo após a finalização do ciclo das plantas simbióticas. A rotação também favorece o bom desenvolvimento das culturas, e por sua vez, potencializa a capacidade de FBN das culturas leguminosas individualmente. A necessidade de inoculação com rizóbios Diante da crise do petróleo ao término da Segunda Guerra Mundial, o Brasil tomou a decisão louvável de apostar nos insumos alternativos para fornecimento de N às culturas agrícolas. Inicialmente, fomentado pelo programa Pró-Álcool, uma equipe da Embrapa Agrobiologia isolou estirpes bacterianas que realizam FBN associativa em cana-de-açúcar e propôs que o melhoramento genético da soja e outras leguminosas fosse realizado sem adição de N com a inoculação de rizóbios tidos como eficientes na sua época. Hoje, a inoculação de leguminosas é recomendação generalizada em todos os manuais de adubação e calagem publicados pelos órgãos oficiais competentes em cada Estado da Federação. No caso da soja, há um consenso em todos eles, de que não é necessário aplicar N à cultura. Nas outras leguminosas, há a recomendação oficial da inoculação, mas ainda indicam a possibilidade de doses pequenas de N mineral para arranque da cultura ou para complementação. O atraso na resposta de outras leguminosas à inoculação está provavelmente relacionado aos mesmos fatores 24 que atrasam outros aspectos produtivos nessas culturas. Contudo, poucos estudos foram conclusivos a esse respeito. As seguintes circunstâncias são consideradas situações críticas, sob as quais, a inoculação não pode ser dispensada sob qualquer pretexto: Ausência de cultivo de leguminosa hospedeira ou outra simbioticamente relacionada no passado imediato; Ausência ou limitada nodulação na leguminosa cultivada anteriormente; Baixa contagem do número mais provável de rizóbios no solo; Plantio de leguminosa seguida de uma não-leguminosa em sistema de rotação de culturas; Solos degradados, muito ácidos ou muito alcalinos; Solos sujeitos a estresse ambiental causado por eventos como seca, temperaturas elevadas, inundação prolongada, revolvimento intenso, queimadas ou similares. A inoculação com rizóbios de leguminosas, como amendoim, feijão comum, caupi, ervilha, lentilha e soja, aumenta o rendimento de grãos entre 10 e 60 % em média. A prática de inoculação é benéfica mesmo em áreas com alta densidade populacional de rizóbios. As respostas positivas da inoculação podem ser atribuídas aos seguintes fatos: O N mineral não consegue suprir as demandas de N em tempo real, pois sua aplicação dificilmente poderá ser feita de acordo com as demandas atuais da cultura. Sobretudo, doses elevadas de fertilizantes nitrogenadas estão sujeitas à perdas ambientais por volatilização, lixiviação e erosão superficial; A inoculação coloca rizóbios mais eficientes e mais próximos das raízes, facilitando o contato para a pré-infecção; A inoculação antecipa o início da nodulação nas raízes em relação à nodulação provocada pelos rizóbios nativos do solo; A inoculação é uma tecnologia barata, e, negligenciá-la seria um tremendo equívoco dentro do processo produtivo. Os nódulos formados a partir da inoculação são maiores e mais eficientes, pois crescem próximos à coroa da planta, onde têm acesso imediato aos fotoassimilados, enquanto os nódulos formados espontaneamente a partir de rizóbios nativos do solo são menores, mais tardios e menos eficientes. 25 A eficiência da inoculação pode ser avaliada através da mensuração dos seguintes parâmetros: número de nódulos, massa seca de nódulos, coloração interna e teor de N nas folhas e a produtividade da cultura. 2.4 Produção de inoculantes As estirpes de rizóbios são isoladas a partir de nódulos ou de solos cultivados com as leguminosas alvo. Após sua caracterização morfológica, fisiológica e genética em laboratório, as estirpes são testadas quanto à eficiência de FBN em suas respectivas hospedeiras sob condições adequadas de crescimento. Em seguida, as estirpes promissoras são testadas a campo. Quando os ensaios de campo mostram efeitos positivos significativos na produtividade da leguminosa, os interessados podem proceder ao registro no Ministério da Agricultura ou recomendação para produção e comercialização. Em todas as etapas de seleção de estirpes, os ensaios devem conter os seguintes controles experimentais: Controle 1: com aplicação de N mineral; Controle 2: Sem inoculação e N mineral; Controle 3: com a estirpe eficiente previamente conhecida para a espécie leguminosa. As estirpes de rizóbios a serem selecionadas devem apresentar as seguintes características: Formar nódulos e fixar N na cultura hospedeira; Fixar N em ampla faixa de genótipos da cultura hospedeira; Crescer bem em meio artificial, no veículo do inoculante e no solo; Apresentar estabilidade genética; Apresentar baixa mortalidade na semente; Possuir compatibilidade com agroquímicos, especialmente, defensivos agrícolas recomendados para a cultura hospedeira; Ser mais eficaz na nodulação em relação às bactérias do solo; Colonizar a rizosfera do hospedeiro, mesmo quando não há estímulo para formação de nódulos; Fixar N em ampla faixa de condições ambientais; Persistir no solo para leguminosas que se regeneram anualmente. Além dessas características, alguns pesquisadores estão propondo a seleção de estirpes de rizóbios que, além de nodularem e fixarem N em leguminosas, têm efeito positivo sobre o crescimento de não leguminosas. Dessa maneira, numa perspectiva para o futuro, o mesmo inoculante poderia ser aplicado a todas as culturas 26 no sistema de rotação. Essa proposta, entretanto, ainda não foi consolidada como recomendação por parte dos órgãos oficiais. A legislação brasileira traz bastante detalhamento acerca da produção e comercialização de inoculantes (Instrução Normativa Nº13, de 24 de março de 2011 do MAPA, Secretaria de Defesa Agropecuária). Para obtenção dos registros e comercialização, as firmas de inoculantes precisam apresentar relatório consubstanciado de resultados positivos na produtividade em função da aplicação de seus produtos em ensaios a campo realizados em dois locais com diferentes zonas agroclimáticas e dois anos consecutivos. Os ensaios não podem ser realizados pela própria indústria, mas sim por uma instituição de administração estatal (“órgão público”). O MAPA possui uma lista de estirpes de rizóbios e suas respectivas leguminosas hospedeiras que são autorizadas (podem ser utilizadas) e recomendadas (preferencialmente podem ser utilizadas). Essas estirpes foram selecionadas em programas de seleção de estirpes por diversas instituições brasileiras e tem seus nomes aprovados em assembleia da RELAR (Reunião Latino-Americana de Rizobiologia), regida por regulamento próprio, e que ocorre anualmente em um dos países associados. Atualmente, o mercado agronômico oferece diferentes marcas de inoculantes de rizóbios para leguminosas no Brasil. Os rizóbios são crescidos em tanques de fermentação industrial em condições estéreis e dispersos em veículos inertes também estéreis. Dois tiposde veículos de inoculantes dominam o mercado: o líquido e o turfoso. Embora ambos os veículos permitam eficiente nodulação e resultem em similares índices de produtividade, o inoculante turfoso (produzido a partir de solo turfoso) preserva um maior número de células do que o inoculante líquido. É preciso ter em mente que o uso da turfa como veículo pode ser limitado no futuro. O fato é que a extração de jazidas ocorre em áreas de preservação permanente e protegidas por lei. Como as áreas disponíveis para extração da turfa tendem a diminuir ao longo dos anos, é possível que os trâmites legais para obtenção do licenciamento ambiental se tornem cada vez mais onerosos. Além disso, devido a facilidade de aplicação e o menor desgaste de discos de distribuição das sementes nas plantadoras, os produtores agrícolas têm utilizado os inoculantes líquidos com maior frequência. Um aspecto importante nesse sentido é o fato de que a pesquisa brasileira tem apostado na nanotecnologia para obtenção de veículos de inoculantes cada vez mais eficientes. O veículo tem que ser um material que permita a sobrevivência dos rizóbios em condições de transporte. Existem aditivos que podem ser incorporados aos 27 inoculantes para melhorar a eficiência de nodulação como, por exemplo, as moléculas dos fatores “nod”, citados no início deste capítulo. De acordo com a legislação brasileira, as culturas bacterianas são de domínio público e devem ser fornecidas gratuitamente aos setores interessados na propagação e comercialização de inoculantes, a competitividade dos produtos das diferentes indústrias dependem majoritariamente da qualidade do veículo utilizado no inoculante. Sobre a qualidade dos inoculantes comercializados, a legislação estabelece que: Todos os inoculantes devem apresentar 1×109 células viáveis por grama ou mililitro do produto até a data do vencimento; Devem ser elaborados em suporte estéril e estar livres de micro-organismos não especificados em fator de diluição 1×10-5; O suporte ou veículo deve fornecer todas as condições de sobrevivência ao micro-organismo; O inoculante deve ser elaborado em suporte sólido, fluído ou com outra característica, desde que atendam os requisitos anteriores; O prazo de validade será de 6 meses a partir da data de vencimento. 2.5 Recomendações técnicas para inoculação Inoculação via sementes Cada cultura tem a sua lista de rizóbios autorizados ou recomendados para inoculação (ver Instrução Normativa Nº13, de 24 de março de 2011 do MAPA, Secretaria de Defesa Agropecuária). Portanto, ao comprar a semente, o produtor rural deve também adquirir o inoculante para a respectiva cultura. Ao comprar, ele deve se certificar de que o inoculante está dentro do prazo de validade e que tinha sido estocado em condições com temperaturas inferiores a 30 ºC. A inoculação deve ser feita no momento do plantio de maneira simples ou com peletização. A inoculação simples é utilizada para sementes graúdas como soja, feijão e caupi. Neste tipo de inoculação, faz-se uma pasta do inoculante com o mesmo volume de água ou solução açucarada (açúcar a 10%) e mistura-se as sementes. As sementes devem ser misturadas sob agitação. O procedimento é facilitado se for feito com um tambor tipo betoneira. Após feita a inoculação, o plantio deve ser realizado preferencialmente no mesmo dia ou num prazo de 24 horas. 28 As sementes menores, como as de alfafa, cornichão e trevo vermelho, podem ser inoculadas com peletização. A peletização é obtida pelo revestimento das sementes em procedimento semelhante ao feito com sementes graúdas (inoculante + adesivo), acrescido de uma etapa subsequente, que é o revestimento das sementes inoculadas com calcário e/ou micronutriente ou fosfato de rocha. Após a formação das “pelotas”, a sementes devem ser secas à sombra. A peletização pode ser um procedimento interessante no caso da necessidade de tratamento de sementes com pesticidas e micronutrientes. As sementes inoculadas devem ser armazenadas à sombra até o momento do plantio, uma vez que as bactérias são sensíveis ao calor excessivo e aos raios UV, e, podem perder a viabilidade mais rapidamente se expostas à pressão parcial de oxigênio da atmosfera e não forem expostas ao estímulo da rizosfera. O produtor rural pode optar por adquirir sementes pré-inoculadas no mercado. Entretanto, para assegurar a eficiência da inoculação, o produtor rural deve certificar-se de que cada semente carrega pelo menos 100.000 células viáveis do rizóbio. O ideal é que o número de células viáveis seja determinado em laboratório. Como mencionado anteriormente, os defensivos agrícolas limitam a nodulação e a FBN. Assim, quando houver necessidade de aplicação de defensivos agrícolas como fungicidas, esses devem ser aplicados em fase anterior à inoculação. Para facilitar o manejo durante o plantio, o produtor rural poderá tratar as sementes com os defensivos alguns dias antes e deixar para fazer a inoculação no dia de plantio. Inoculante via sulco A inoculação em sulco tem sido uma ótima alternativa para inoculação em sistema de produção que utilizam mais de um insumo (defensivos agrícolas + micronutrientes) no tratamento de sementes. A viabilização dessa alternativa só se tornou possível com o desenvolvimento de tambores de distribuição de inoculantes acoplados às plantadoras que depositam rizóbios em profundidade, próximo à linha de plantio. Nessa tecnologia, as sementes tratadas com defensivos agrícolas germinam sem ataque de fitopatógenos, e após germinação, as radículas entram em contato com os rizóbios que teriam sido depositadas no sulco. Essa alternativa tem sido amplamente divulgada como solução à incoerência da aplicação de diferentes insumos agrícolas à cultura da soja. Inoculação pós-plantio ou de cobertura 29 A inoculação pós-plantio ou de cobertura pode ser realizada por pulverização diretamente sobre o solo, ou em grande volume de calda para lixiviação do inoculante através do dossel da cultura, entretanto, não substitui a inoculação durante o plantio. Esse tipo de inoculação só deve ser utilizado para evitar a total perda total da lavoura, pois normalmente resulta em produtividades significativamente maiores do que a total ausência de inoculantes, mas menores do que àquela realizada durante o plantio. É importante frisar que independentemente do método de inoculação realizado, a inoculação escolhida deve garantir que, pelo menos, 100.000 células de rizóbio sejam carregados em cada semente. Quantidades menores podem resultar em ineficiente nodulação e maiores que essas podem não ser adequados, pois rizóbios produzem diversos metabólitos que interferem no desenvolvimento das culturas. Para alívio dos usuários menos experientes, os inoculantes comerciais trazem na embalagem as instruções de trabalho para a correta inoculação. Considerações Finais Uma tendência de mercado é a inoculação de consórcio de bactérias ou co- inoculação de duas espécies. Por exemplo, a co-inoculação de Bradyrhizobium japonicum e Azospirillum brasilense em soja, e de Rhizobium tropici e A. brasilense em feijão, tem resultado em melhor nodulação, crescimento vegetal e produtividade de grãos. Na verdade, a aplicação de rizóbios em não leguminosas também resulta em maior produtividade. Por exemplo, há um aumento de produtividade de milho com a co- inoculação Rhizobium tropici e A. brasilense. A descoberta desses efeitos abre oportunidades para desenvolvimento de um pacote tecnológico em que as culturas são produzidas dentro de um planejamento global e não apenas, individualmente. Porém, a utilização de muitas estirpes diferentes pode trazer dificuldades à industria, pois cada espécie tem uma taxa de crescimento diferenciada e dificilmente podem ser crescidas no mesmo sistema de cultivo. Será necessário desenvolversistemas que superem essas dificuldades. Finalmente, uma característica importante das bactérias que realizam FBN é que elas possuem potencial genético para estimular o crescimento das plantas que vai além da FBN por si. Já foi comprovado que as bactérias que realizam FBN podem solubilizar fosfatos e produzir fitohormônios. Essas características estão sendo exploradas pela pesquisa e é possível que novos insumos biotecnológicos baseadas nessas espécies sejam ofertados no futuro. Para complementar seu estudo: 30 1. Procure na internet a Instrução Normativa Instrução Normativa Nº13, de 24 de março de 2011 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, Secretaria de Defesa Agropecuária. Estude os anexos da referida Instrução Normativa, e principalmente os citados abaixo: Anexo I. Normas sobre especificações, garantias, registro, embalagem e rotulagem dos inoculantes destinados à agricultura. Anexo II. Relação dos micro-organismos autorizados para a produção de inoculantes no Brasil. 2. Elabore um roteiro de boas práticas de inoculação de rizóbios em leguminosas, contendo pelo menos 20 recomendações. 3. Escolha 4 leguminosas cultivadas em sua região de atuação. Para cada uma dessas leguminosas, faça o seguinte levantamento: a) Existe recomendação por parte de algum órgão oficial para adubação nitrogenada no cultivo desta leguminosa? Se sim, qual é a dose recomendada? b) Quais são as estirpes recomendadas para produção de inoculantes? Quais são os inoculantes comerciais disponíveis para a leguminosa na sua região? c) Considerando os dados apresentados na tabela 2, qual seria o custo estimado de fertilização nitrogenada, caso a leguminosa dependa apenas de fertilizantes nitrogenados? 4. Elabore uma lista de pelo menos 5 benefícios que o processo de FBN traz ao sistema produtivo de leguminosas. Referências bibliográficas Campo, R.J., Hungria, H. Compatibilidade de uso de inoculante e fungicidas no tratamento de sementes de soja. Circular técnica / Embrapa Soja, n. 26, Londrina. Embrapa Soja. Tecnologias de produção de soja Região Central do Brasil 2014. Sistemas de Produção 16. Londrina: Embrapa Soja, 2013. 265p. Kaschuk, G. Sink stimulation of leaf photosynthesis by the carbon costs of rhizobial and arbuscular mycorrhizal fungal symbioses. Wagenigen: Wageningen University, 2009. 160p. 31 Kaschuk, G.; Hungria, M. Diversity and Importance of Diazotrophic Bacteria to Agricultural Sustainability in the Tropics In: Azevedo, J. L.; Quecine, M. C. (Eds): Diversity and Benefits of Microorganisms from the Tropics, Springer International Publishing, 2017, p.1-43. Kaschuk, G.; Nogueira, M.A.; de Luca, M.J.; Hungria, M. Response of determinate and indeterminate soybean cultivars to basal and topdressing N fertilization compared to sole inoculation with Bradyrhizobium. Field Crops Research, v. 195, p. 21-27, 2016. Marschner, H. Mineral Nutrition of Higher Plants Academic Press, 1995, 889p. Ormeño-Orrillo, E.; Hungria, M.; Martinez-Romero, E. Dinitrogen-Fixing Prokaryotes. In: Rosemberg, E.; de Long, E.F.; Lory, S.; Stackebrandt, E.; Thompson, F. (Org.). The Prokaryotes. 1ed. Berlin Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg, 2013, p. 427- 451. 32 UNIDADE 3. Bactérias promotoras de crescimento vegetal 3.1 Definições A partir dos anos 1960s, fertilizantes, defensivos agrícolas, sementes melhoradas e máquinas agrícolas sofisticadas deram força aos aumentos de produtividade agrícola para níveis jamais experimentadas na história da humanidade. Entretanto, os níveis de produtividade têm sido tão elevados quanto seus custos financeiros, e muitas tecnologias convencionalmente usadas têm se mostrado insustentáveis do ponto de vista ambiental. Em condições atuais, o modelo tecnológico adotado está passando por uma segunda fase de revolução, e novos insumos biotecnológicos estão sobrepondo algumas práticas convencionais. É claro que nem sempre os insumos biotecnológicos substituem os insumos convencionais, mas eles são com certeza aliados para melhorar ainda mais os altos níveis de produtividade e manter a sustentabilidade de produção. Na segunda unidade deste curso, nós aprendemos que os rizóbios podem garantir o suprimento integral de N às leguminosas. Entretanto, os rizóbios não induzem nódulos em plantas que não sejam leguminosas. Neste módulo, nós vamos estudar insumos alternativos para aumentar o crescimento e o rendimento de grãos de leguminosas e não leguminosas a partir da inoculação de bactérias associativas. Uma grande fonte de novos isolados microbianos é a própria rizosfera das plantas. A rizosfera é a zona de contato entre solo e raízes onde ambos são mutuamente influenciados. Na verdade, a rizosfera abriga muito mais micro- organismos do que o solo livre porque é uma zona com muita disponibilidade de compostos orgânicos para crescimento microbiano. As principais fontes orgânicas para organismos heteretróficos (que oxidam matéria orgânica para obtenção de energia e esqueletos de carbono) são células esfoliadas da coifa, raízes em decomposição, exsudatos solúveis, substâncias lisadas e mucilagem proveniente do metabolismo das plantas e dos micro-organismos. O suprimento de compostos pela rizosfera permite o acontecimento de uma infinidade de processos ecológicos entre os micro-organismos e as plantas. As raízes das plantas dão suporte ao crescimento de populações e comunidades microbianas comensalistas (não ajudam nem prejudicam), benéficas ao crescimento vegetal ou até patógenas. As diferentes populações podem interagir entre si e auxiliar nos processos de decomposição da matéria orgânica, predação e controle populacional de organismos prejudiciais ao crescimento vegetal e na disponibilização de nutrientes 33 (solubilização de elementos minerais e fixação biológica de N, entre outros). Um exemplo clássico de interação de populações é a predação de bactérias por protozoários. A rizosfera fomenta a proliferação de bactérias. As bactérias servem de alimento aos protozoários heterotróficos. Como os protozoários não aproveitam tudo que engolfam, a predação de bactérias resulta em mineralização de nitrogênio mineral no solo. Além disso, a rizosfera é local para simbioses e associações benéficas entre plantas e micro-organismos, como são os casos dos rizóbios, dos fungos micorrízicos e a formação de biofilmes formados por bactérias. Contudo, embora a rizosfera abrigue fungos, bactérias, protozoários e fauna de solo em números variados, as bactérias são os micro-organismos que têm despertado mais atenção para a busca de novos insumos biotecnológicos. As bactérias que colonizam a rizosfera de plantas leguminosas e não-leguminosas, principalmente gramíneas, são chamadas de rizobactérias. As rizobactérias ocupam de 7 a 15% da superfície total das raízes e podem conter mais de 30.000 espécies bacterianas, sendo que apenas 8% foram identificadas e muito menos ainda, cultivadas e estudadas. Alguns gêneros comuns na rizosfera de milho são, por exemplo, bactérias Bacillus, Burkholderia, Pantoea, Enterobacter, Pseudomonas, Masillia, Sphigobium, Sphigomonas, Agrobacterium, Rhizobium, Bradyrhizobium, Ochrabactrum e Azospirillum. Algumas dessas bactérias têm potencial de promover o crescimento das plantas e por isso têm sido denominadas Bactérias Promotoras de Crescimento Vegetal (BPCV). As BPCV proliferam na rizosfera nutrindo-se principalmente de exsudatos vegetais ou sobrevivem no solo nutrindo-se da decomposição da matéria orgânica do solo. Em contrapartida pela utilização dos exsudatos da planta, as BPCV coordenam diversos mecanismos (que serão discutidos adiante) que permitem o maior desenvolvimento e crescimento das plantas. Nem todas as espécies que vivem na rizosfera são potencialmente benéficas. Muitas comensalistas vivem na rizosfera, nãobeneficiam, nem prejudicam. Algumas são patogênicas às plantas. Algumas são benéficas às plantas e promovem um extraordinário incremento no crescimento vegetal, mas são potencialmente patogênicas aos humanos, animais domésticos ou poderiam até ser patogênicas aos animais silvestres. Por enquanto, não há protocolo específico para identificar quais bactérias são patogênicas, mas o uso de espécies novas e/ou ainda não listadas como não permitidas deve ser determinado pelo bom senso e aplicar de métodos que provem a biossegurança das bactérias a serem utilizadas como BPCV. O pesquisador ou empresa interessada em produzir o inoculante deve fazer uma pesquisa bibliográfica e se informar sobre aquilo que está pretendendo utilizar como BPCV. Mesmo em culturas 34 agrícolas que não são utilizadas para consumo direto (alimento ou ração) mas sim para obtenção de fibras e bioenergia, o uso de bactérias patogênicas é perigoso, pois as operações de aplicação e manuseio serão feitas por um operador. Além disso, não é porque é biológico que é sempre bom. Não devemos descarregar qualquer coisa no solo. Bactérias potencialmente BPCV também poderiam trazer danos a outras associações entre plantas e micro-organismos devido à interação antagônica entre os inoculantes. Por isso, o lançamento de um inoculante deve ser precedido por muitos experimentos realizados sequenciamente em laboratório, em casa de vegetação e campo. Todo o trabalho é necessário para que o produtor tenha acesso a bons produtos. Assim, apesar de muitas pessoas reclamarem da “burocracia” envolvida, o rigor da regulamentação, fiscalização e punição são necessárias para o bom proveito da tecnologia. Por empenho dos partícipes envolvidos, a legislação brasileira é modelo para muitos países no que concerne a regulamentação da produção e uso de inoculantes. Um dos principais aspectos da legislação é a definição de BPCV. De acordo com a legislação vigente (Instrução Normativa nº 10 de 23 de março de 2011), só poderá ser considerada BPCV aquelas bactérias que atendem pelo menos dois dos seguintes critérios: Apresentam colonização agressiva da rizosfera; Estimulam o crescimento vegetal; São capazes de controlar fitopatógenos. A colonização rizosférica é determinada pela formação de um biofilme sobre a superficie do tecido da planta (no caso, do córtex da raíz). Biofilme é um termo científico da microbiologia para denominar a estruturação de uma população microbiana sobre a superficie. As bactérias proliferam em pilares, deixando espaços livres entre tais pilares, os quais permitem a passagem da água, nutrientes e excedentes e estimulam o crescimento de novas células bacterianas. Biofilme é um termo que os cientistas usam para aquilo que os dentistas chamam de “placa bacteriana”. Assim, as bactérias a serem utilizadas como BPCV devem ser capazes de colonizar a rizosfera e formar um biofilme porque é preciso um número enorme de células para que a planta perceba e se beneficie dos mecanismos de promoção de crescimento das BPCV. O crescimento vegetal é resultado de um conjunto de fatores. O estímulo de crescimento provocado por uma BPCV não é necessariamente resultado de um único mecanismo. Na maioria dos casos, as causas efetivas de crescimento vegetal nem são 35 identificadas. Por exemplo, a maior parte dos estudos tem mostrado que a inoculação com Azospirillum (uma bactéria associativa na maioria das culturas) resulta em alteração na morfologia e maior crescimento do sistema radicular. O maior crescimento radicular, por sua vez, é que permite maior absorção de nutrientes e água, que finalmente, resulta em maior produtividade da cultura. Em outros casos, a inoculação com bactérias capazes de controlar o crescimento de fitopatógenos (nematóides, por exemplo) podem resultar em maior produtividade porque as plantas ficam mais protegidas dos efeitos danosos. Na verdade, a tendência não é substituir insumos tradicionais, mais sim dar suporte e melhorar a eficiência de insumos utilizados convencionalmente. Por exemplo, a inoculação de uma BPCV solubilizadora de fosfato não vai redimir a produção agrícola de repor os nutrientes tirados do solo durante o crescimento vegetal, entretanto, pode aumentar a eficiência dos fertilizantes adicionados. Especificamente, o P é muito importante para a sustentabilidade da produção agrícola no Brasil, pois solos tropicais têm muita força de adsorção de fosfatos e tal força limita a disponibilidade de P para absorção das plantas. Um outro aspecto importante para a indústria de inoculantes, a comercialização e o uso na propriedade agrícola é que a BPCV não pode ser específica para uma cultivar (e até mesmo uma única espécie), mas sim, que tem que ser aplicável à várias cultivares da mesma espécie, ou ainda, à diferentes espécies. Ter uma BPCV com amplo espectro permite que o seu uso seja parte de um manejo integrado da produção agrícola. Por exemplo, pesquisadores estão checando a viabilidade dos inoculantes de rizóbios em culturas não leguminosas (por exemplo, arroz e milho) ou não tradicionais para a estirpe. Mesmo que a BPCV não induza nódulos nas plantas, as plantas poderiam ser beneficiadas pela inoculação de rizóbios, já que muitos rizóbios também se comportam como BPCV. Em tese, os rizóbios podem permanecer por mais tempo e poderiam induzir a formação de nódulos fixadores de N na safra subsequente de uma leguminosa. Num sistema integrado de produção e de rotação de culturas, a introdução antecipada de rizóbio pode elevar o grau de sustentabilidade de produção. Sendo assim, as possíveis alternativas para uso de BPCV são diversas. Esse módulo não deve finalizar o assunto, mas pode ajudar o profissional da área a contribuir para o desenvolvimento de novas tecnologias. Formas de vida das BPCV As BPCV podem formar biofilmes em duas frações da rizosfera: na superfície externa da planta sobre rizoplano; ou na superfície interna da planta, dentro da célula 36 ou no espaço intercelular. As bactérias que formam biofilmes sobre o rizoplano mas não colonizam o interior da célula ou do tecido da planta são chamadas de associativas. As bactérias que vivem dentro do tecido ou da célula da planta são chamadas de endofíticas. Figura 1. Bactérias endofíticas crescem no interior da planta enquanto bactérias associativas formam um biofilme no rizoplano. Fonte da figura: Trends in Microbiology. O termo endofítico foi inicialmente proposto pelo grupo da pesquisadora Johana Döbeirener para definir bactérias que crescem mais abundantemente nos tecidos vegetais do que no solo livre. Mais tarde, outros pesquisadores sugeriram classificar as BPCV em endofíticos obrigatórios e endofíticos facultativos: as BPCV endofíticas obrigatórias são aquelas que precisam estar no tecido (intra- ou intercelularmente) para formarem biofilmes e trazerem efeitos positivos no crescimento das plantas; e, as BPCV endofíticas facultativas são aquelas que não precisam estar no tecido e crescem bem tanto no solo quanto na superfície da planta. Entretanto, as classificações são mais acadêmicas do que práticas porque algumas bactérias podem crescer satisfatoriamente tanto nos tecidos quanto no solo, dependendo individualmente do estímulo de cada planta. Ou seja, uma mesma bactéria pode ser endofítica em uma determinada espécie vegetal mas só crescer associativamente em outra. Por exemplo, a Azospirillum brasilense foi inicialmente isolada de tecidos da cana-de-açúcar, mas cresce associativamente (somente na superfície do rizoplano) na maioria das culturas. 37 Resultados esperados com a inoculação de BPCV Os resultados dependem das condições de cultivo da cultura agrícola, dos fatores limitantes da produção e da espécie/estirpe bacteriana utilizada, bem como, se é inoculada isolamente ou em consórcio. Entretanto,de forma geral, as BPCV afetam efetivamente os seguintes parâmetros: taxas de germinação de sementes; massa de raízes e parte área; número e massa de tubérculos; número de folhas e flores; número e massa de frutos e grãos. 3.2 Mecanismos de ação As BPCV podem afetar o crescimento das plantas pelos seguintes mecanismos: síntese de hormônios vegetais; fixação biológica de N2; solubilização de fosfato insolúvel; aumento da absorção de nutrientes; mitigação a estresses bióticos (pragas e doenças); mitigação a estresses abióticos (água, temperatura, acidez do solo); controle biológico de fitopatógenos; e manutenção da estrutura física do solo. Os principais mecanismos são discutidos a seguir. Produção de fitohormônios As BPCV produzem e induzem a produção de compostos orgânicos que estimulam o crescimento. A produção direta de hormônios pelas BPCV tem o propósito de aumentar o número e a atividade celular vegetal, o que por consequência, aumenta o dreno de fotoassimilados recém produzidos para as células próximas às colônias 38 bacterianas. Ao forçarem a relação dreno, as BPCV estimulam as taxas fotossintéticas das plantas. De fato, as plantas colonizadas por BPCV (por exemplo, Azospirillum e rizóbios) apresentam taxas fotossintéticas mais elevadas do que as plantas não- inoculadas. Além disso, as BPCV podem estimular a produção de hormônios pelas próprias plantas por mecanismos de indução de expressão gênica via alteração bioquímica das células. De um jeito ou de outro, o resultado final é que as BPCV estimulam o crescimento e induzem à alteração da morfologia radicular. Plantas com sistema radicular mais desenvolvido podem absorver mais nutrientes e água e crescer mais rápido. Dentre todos, o hormônio AIA e algumas auxinas similares são os hormônios mais produzidos pelas BPCV. Entretanto, as BPCV também podem produzir etileno. O etileno em elevadas concentrações está associado às condições de estresse para a planta, mas em baixas concentrações estimula o seu crescimento. O etileno em baixas concentrações eleva a taxa de germinação das sementes porque ativa a quebra de dormência. Outros hormônios que também se relaciona com a presença de BPCV são as giberelinas. As giberelinas promovem a elongação e a divisão celular vegetal, e também são importantes na quebra de dormência. Fixação biológica de N2 (FBN) Muitas BPCV possuem o gene da nitrogenase e são capazes de realizar a FBN em associação com as plantas e em solo livre (ver Tabela 1 para exemplos de diazotróficas e suas respectivas plantas hospedeiras). Na rizosfera, as bactérias diazotróficas têm condições mais adequadas para crescimento do que no solo livre, e, por isso podem contribuir com a nutrição das plantas. Ainda assim, mesmo em baixas proporções quando comparado ao sistema rizóbio-leguminosa, a FBN por BPCV contribui para o suprimento de N na rizosfera, onde pode ser metabolizado por outros micro-organismo e absorvido pelas próprias plantas. Tabela 1. Diazotróficas e suas respectivas plantas hospedeiras. Diazotrófica Planta hospedeira Azotobacter paspali Paspalum notatum Azospirillum brasilense / A. lipoferum milho, arroz, sorgo, trigo, cevada Azospirillum amazonense pastagens diversas Beijerinckia spp cana-de-açúcar, braquiária Burkholderia brasiliensis arroz, mandioca, batata-doce e cana-de-açúcar Há relatos de que algumas bactérias associativas e endofíticas podem fixar 39 até 30 kg de N por hectare em plantas de metabolismo C3 e 60 kg em cana-de-açúcar, de metabolismo C4. Mas, de maneira geral, a contribuição das BPCV para plantas cultivadas é pequena, entre 5 e 18% da demanda de N da planta. No caso de bactérias endofíticas, é possível que o N seja depositado na forma de NH4 + no espaço intercelular do córtex, de onde a célula vegetal poderá absorver o nutriente mais rapidamente. No caso de BPCV associativas, a FBN ocorre no rizoplano e no solo livre, onde as BPCV precisam competir por fontes de C com outros micro-organismos do solo, e, por isso, a eficiência para redução de N2 é baixa. Já que muito pouco do N total é derivado da FBN (em comparação com a simbiose rizóbio-leguminosa), é provável que o estímulo do crescimento vegetal seja determinado pela produção de fitohormônios, e, consequente, desenvolvimento radicular do que propriamente da FBN. Solubilização de fosfato Os solos tropicais, ricos em cargas positivas devido à presença predominante de óxidos e hidróxidos de Fe e Al, tem alta capacidade de adsorção de fosfato (íon PO4 -). A reação de adsorção de PO4 - às cargas positivas é rápida, mas a reversibilidade dela é lenta, pois depende da mudança de pH do solo. Assim, mesmo quando adicionado na forma solúvel, o PO4 - da solução que não é absorvido pelos organismos (plantas e micro-organismos) deve ligar-se aos compostos de carga positiva do solo e ficar indisponível para a absorção posterior da planta. Como as BPCV estimulam o desenvolvimento do sistema radicular, as plantas computam um maior acúmulo de nutrientes no tecido. De forma indireta, as BPCV podem estimular a solubilização do PO4 - por alterar as relações de força de dissociação de nutrientes da fase sólida para a solução. Isso é geralmente observado na comparação de plantas que têm taxas de crescimento rápido em relação às plantas de crescimento lento. Quanto mais a planta se desenvolve, mais nutrientes são extraídos do solo. Entretanto, quando falamos em solubilização de PO4 -, estamos falando de mecanismos específicos relacionados à atividade microbiana na rizosfera. Esses mecanismos ainda não foram completamente elucidados, embora existam vários palpites com relação aos genes que atuam no processo e às moléculas orgânicas que provavelmente contribuam para o desfecho do processo como um todo. De forma resumida, a solubilização do PO4- por BPCV está relacionada à produção de ácidos, sideróforos e fosfatases. 40 Os ácidos orgânicos e inorgânicos produzidos durante o crescimento microbiano (principalmente via metabolismo secundário) promovem o abaixamento do pH na rizosfera e causam a dissociação do íon PO4 - da fração inorgânica do P do solo. A respiração celular das bactérias também resulta em liberação de CO2, o qual se dissolve na água do solo e forma ácido carbônico, que também contribui para a dissociação do P ligado às cargas positivas da fração mineral do solo. Algumas reações de solubilização de PO4 -: Um ponto interessante é que o metabolismo secundário também produz moléculas orgânicas comumente denominadas sideróforos, que adsorvem os elementos de carga positiva provenientes da dissociação de minerais (majoritariamente óxidos de Fe), e, impede que o PO4 - seja novamente convertido à fração insolúvel do solo. A produção de sideróforos intracelular nas bactérias retira Fe da solução do solo, e, pode auxiliar no controle de fungos fitopatógenos que dependem de alta disponibilidade de Fe para iniciarem o processo de infecção no tecido da planta. Os micro-organismos do solo são tão limitados quanto as plantas pela disponibilidade pelo PO4 -, por isso, eles têm que usar de estratégias diversas para obterem o que precisam. Os micro-organismos que se associam com as plantas são majoritariamente heterotróficos, mas não ingerem partículas como os animais superiores. Na verdade, eles exsudam enzimas para o ambiente a fim de degradar os compostos mais complexos, e posteriormente, absorvem os íons que resultam dessa degradação. O P orgânico representa 1 a 3% da fração da matéria orgânica do solo, e pode representar de 5 a 90% do P total do solo. Assim, as BPCV heterotróficas que vivem na rizosfera precisam liberar fosfatases (fitases, nucleases, nucletidases, fosfolipases) para crescerem e se multiplicarem. As bactérias exsudam mais
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