BIOQUIMICA CLINICA A2

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BIOQUIMICA CLINICA
Técnicas Ópticas
Fotometria
Medida da intensidade luminosa ou a quantidade de luminosidade incidente em uma
superfície, independente do comprimento de onda.
Espectrofotometria
Trata da medida da intensidade da luz EM COMPRIMENTOS DE ONDAS SELECIONADOS
Lei de Beer
• A proporcionalidade direta entre a absorbância e a
concentração deve ser estabelecida experimentalmente
para um determinado instrumento sob condições
especificadas.
• Freqüentemente existe uma relação linear até certa
concentração ou absorbância, até onde a solução
respeita a Lei de Beer.
• Na prática, quando a solução alcança concentração tal
que a relação linear com a absorbância é perdida,
procede-se a diluição da amostra, multiplicando o valor
experimental obtido pelo número de diluições realizadas.
Assim, a Lei de Beer só é seguida se:
1. A radiação incidente sobre a substância de interesse é 
monocromática
2. A absorção pelo solvente é insignificante, quando comparada 
com a absorbância do soluto
3. A concentração do soluto está dentro dos limites
4. Não há interferência óptica
5. Não ocorre reação química entre a molécula de interesse e 
outra molécula do soluto ou solvente
Espectrofotometria
Espectrofotometria de UV – quando a fonte luminosa emite radiação na faixa ULTRAVIOLETA 
(entre 180 e 390 nm).
Espectrofotometria de IV – quando a fonte luminosa emite radiação na faixa do 
INFRAVERMELHO (770 e 12.000 nm)
Nefelometria e Turbidimetria
A dispersão da luz é um fenômeno físico resultante da interação da luz com partículas em
solução. A nefelometria e a turbidimetria são técnicas analíticas utilizadas para medir a luz
dispersa.
Turbidimetria:
A turbidez diminui a intensidade do feixe de luz incidente enquanto este passa por uma
solução contendo partículas. A turbidimetriamede a diminuição desta intensidade
Nefelometria
A nefelometria é definida como a detecção de energia da luz dispersa ou refletida em
direção a um detector que não se encontra na trajetória direta da luztransmitida.
ELETROFORESE
Refere-se à migração de partículas ou solutos carregados em um meio líquido sob a
influência de um campo elétrico.
ELETROFORESE ZONAL
As zonas de proteína são visualizadas quando o meio de suporte é corado com um corante específico para proteína.
TEORIA DA ELETROFORESE
- Espécies químicas carregadas eletricamente (por ionização) movem-se em direção ao catodo
(eletrodo negativo) ou ao anodo (eletrodo positivo), dependendo da carga que possuem.
- Os íons positivos (cátions) migram em direção ao catodo, e osions negativos(ânions) migram
em direção ao anodo.
- Moléculas ANFÓLITAS, que são carregadas tanto positiva quanto negativamente, adquirem
uma carga positiva em uma solução mais ácida do que seu ponto isoelétrico, e migram em
direção ao catodo.
Ponto Isoelétrico
É O VALOR DO pH ONDE UMA MOLÉCULA, POR EXEMPLO UMA PROTEÍNA OU AMINOÁCIDO,
APRESENTA CARGA ELÉTRICA LÍQUIDA IGUAL A ZERO = HÁ EQUILÍBRIO ENTRE AS CARGAS
NEGATIVAS E POSITIVAS DOS GRUPOS IÔNICOS DE UM AA OU PROTEÍNA
TEORIA DA ELETROFORESE
A velocidade de migração é dependente de fatores tais como:
1. Carga elétrica líquida da molécula
2. Tamanho e forma da molécula
3. Força do Campo Elétrico
4. Propriedades do meio de suporte
5. Temperatura de operação
A mobilidade eletroforética (μ) é definida como a velocidade de migração (cm/s) por unidade
de força de campo (volts/cm):
Meios de suporte
1. Gel de amido e acetato de celulose
2. Agarose
3. Poliacrilamida
Quantificação das proteínas
Cromatografia
 Técnica de separação (física/química) na qual os componentes a serem separados são distribuídos entre 2 fases: sendo uma fixa e de grande área superficial, denominada “fase estacionária”, e outra, denominada fase móvel, um fluido que percola através da fase estacionária
Fase estacionária (FE) 
– fase retida em uma coluna ou superfície plana
Fase móvel (FM) 
– fase que se movimento através da FE transportando o soluto.
– gás, líquido, etc
CONCEITOS
ADSORÇÃO
Os compostos são retidos na fase estacionária (polaridade) por um período de tempo (tempo de retenção – TR) até que a passagem constante da fase móvel seja capaz de retirar gradativamente, 
cada um desses compostos.
PARTIÇÃO
Os compostos passam por uma distribuição (solubilidade) entre a fase móvel e a estacionária, que é colocada na coluna na forma de um filme em um suporte sólido hidrofílico.
FATOR DE RETENÇÃO 
(k): 
razão entre a massa do soluto presente na FM e na FE. 
•Quanto maior o k , maior o tempo de retenção na coluna.
• Juntamente com o fluxo, determina o TR do pico.
SELETIVIDADE (α): 
• relação entre o tempo que 2 solutos passam na fase líquida.
•Mede a capacidade de separação entre 2 picos e é alterada com a troca do solvente da FM, pH, 
FE e temperatura
Cromatografia a gás
› É uma das técnicas de análise de maior uso;
› É utilizada para a separação e quantificação de diversos produtos;
› Podendo também ser usada como técnica de identificação, em casos especiais, principalmente 
quando acoplada a um EM(MS) ou outro detector qualitativo
TECNICA
1. corrente de gás passa pela coluna
2. amostra vaporizada é introduzida no gás
3. arraste da amostra através da coluna
4. substâncias são separadas
5. detector 
6. é gerado um sinal 
7. registrado
Cromatografia de alta eficiência (CLAE)
› Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é o tipo mais versátil e mais amplamente empregado de cromatografia por eluição.
› Na cromatografia líquida, a fase móvel é um solvente líquido, o qual contém a amostra na forma de 
uma mistura de solutos.
› A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) tornou-se uma ferramenta analítica indispensável