Resumos - Metodologias Cito-Histoquimicas

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• Desidratação- consiste na remoção de 
água dos tecidos. Para tal faz-se a 
submersão sucessiva de concentrações 
crescentes de álcool. 
• Diafanização- uso de xilol 
• Impregnação- entrada da parafina no 
tecido 
Metodologias Cito-histoquímicas 
(teoria) 
1. Cito-histoquímica 
- A cito-histoquímica engloba áreas como Histologia, Histopatologia e Histotecnologia. 
 
 
 
 
 
 
 
 
❖ MACROSCOPIA: 
- Abertura 
- Seccionamento 
- Acondicionamento 
- Fixação 
 
❖ FIXAÇÃO: 
- Impede a autólise, isto é, a destruição de parte das estruturas 
celulares por enzimas libertadas pós morte, e preserva a estrutura e 
composição molecular. 
- Na fixação usa-se o Formaldeído a 4% que vai reagir com os 
grupos amina das proteínas e promove a formação de ligações 
cruzadas ente as proteínas. 
❖ PROCESSAMENTO: 
- Preparação das peças para que sejam impregnadas num meio sólido, habitualmente a parafina. 
 
- No processamento, o tecido passa por 3 fases: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
❖ INCLUSÃO: 
- Incluir o tecido num meio sólido e firme para permitir o corte em fatias finas. 
❖ CORTE: 
- Corte em fatias finas, habitualmente entre 3 a 4µm e adesão dos 
cortes a uma lâmina de vidro. 
- O corte é feito num micrótomo ou num criostato. 
❖ COLORAÇÃO: 
- Evidenciar e distinguir diferentes estruturas dos tecidos. 
- Podem ser realizadas colorações de rotina (HE) e colorações especiais. 
- As colorações podem ser feitas de forma manual ou em sistemas automáticos. 
❖ MONTAGEM: 
- Tem por objetivo isolar o tecido do meio exterior de modo a preservar a integridade do mesmo, durante 
longos períodos de tempo. 
❖ OBSERVAÇÃO AO MICROSCÓPIO: 
- É feita durante a coloração 
- Serve de controlo de qualidade e de diagnóstico 
 
2. Teoria da coloração 
Cor- interpretação feita pelo homem da luz emitida/refletida por um objeto por meio de ondas 
eletromagnéticas 
 
A luz visível é a parte do espetro eletromagnético- 𝜆 700nm-380nm 
 
A retina é o 1º lugar a receber a luz e encontra-se na 
parte de trás do olho. 
Os cones e bastonetos transformam a luz num estímulo nervoso. São zonas ricas de neurónios 
fotorecetores. 
 
Vermelho Azul 
 
 
 
 
 
Branco- Reflete toda a luz que recebe; não absorve na região do espetro de luz visível 
Preto- Absorve uma vasta gama de comprimento de onda no espetro visível 
Qualquer cor- A cor que vemos é complementar à cor absorvida 
Algumas moléculas são capazes de absorver um ou mais comprimentos de onda. 
O conjunto de comprimentos de onda absorvidos por uma molécula é o seu espectro de absorção. 
O que não é absorvido, é refletido e é aquilo que se vê. 
 
(por exemplo) A cor verde: 
- absorve no vermelho 
Ou 
- absorve no azul e amarelo 
 
 
 
 
❖ RESSONÂNCIA: 
Ocorre quando um composto pode ser representado por 2 ou mais fórmulas estruturais, apresentando a 
mesma posição para os núcleos dos átomos mas diferindo pela posição dos eletrões que fazem parte da 
ligação. 
A estrutura mais provável é um híbrido resultante da combinação de todos as estruturas. 
A absorção de comprimentos de onda na gama do visível leva à ressonância. 
Modificações na ressonância de uma molécula colorida leva à alteração de cor 
 
 
 
 
❖ BENZENO: 
- É a estrutura básica para a síntese de muitos corantes 
Corante: Composto orgânico 
aromático que contém grupos 
cromóforos e auxócromos. 
A cor é conferida pelos grupos 
cromóforos e a capacidade de ligar 
aos tecidos pelos grupos auxócromos. 
- Quando está isolado +é incolor 
- Absorve comprimentos de onda na região dos 
UV, abaixo dos 400nm 
- A adição de determinados grupos ao benzeno, 
vai desviar o pico de absorção máxima para um 
comprimento de onda maior, o que leva ao 
aparecimento de cor. 
 
 
 
 
 
 
 
 
❖ CROMÓFORO: 
- São os grupos/radicais adicionados que desviam o campo de onda de absorção para maiores comprimentos 
de onda-> Efeito Batocrómico (o benzeno passa de incolor para amarelo) 
- Confere a propriedade de absorver luz na região do visível 
- Quanto maior o número de cromóforos, mais acentuada vai ser a cor do composto 
- Mais utilizados: C=C, C≡C, C=O, C≡N, N=N, NO2 
❖ SUBSTÂNCIAS CROMOGÉNICAS: 
- Apresentam radicais cromóforos e cor 
- Nem todas as substâncias cromogénicas têm capacidades tintoriais, logo têm baixa afinidade para os 
constituintes celulares 
- Mais utilizados: OH, NH2, NHR. NR2, CI e CO2H 
 
❖ AUXÓCROMO: 
- Radical que confere a propriedade do composto se ligar aos tecidos 
- Vão modificar o comprimento máximo de absorção de luz incidente, o que vai modificar a cor conferida 
pelo cromóforo. 
 
 
 
 
Efeito batocrómico: é o desvio 
do pico máximo de absorção 
de luz para um comprimento 
de onda maior. 
Cromóforo: é o grupo químico 
que confere a propriedade de 
absorver luz na região visível 
do espetro eletromagnético. 
Adição de um grupo 
Hidroxilo 
Ioniza o composto 
em solução aquosa 
Estabelecimento de ligações com 
as estruturas catióticas do tecido 
• Animal (carmim) 
• Vegetal (hematoxilina) 
• Mineral 
 
 
 
 
 
 
 
 
❖ FATORES QUE INFLUENCIAM A RESSONÂNCIA: 
- Ph 
- Concentração 
-Comprimento das ligações duplas conjugadas 
- Presença de auxócromos 
- Substituição de átomos de hidrogénio por radicais orgânicos 
 
❖ CLASSIFICAÇÃO DE CORANTES (ORIGEM): 
- Sintéticos 
- Naturais: 
 
 
❖ CLASSIFICAÇÃO DE CORANTES EM ÁCIDOS E BÁSICOS: 
Esta classificação não está relacionada com a concentração de protões na solução corante. 
- Ácidos: Se o anião é colorido, corante aniónico 
Os corantes ácidos encontram-se frequentemente na forma de 
sais de sódio, potássio, cálcio ou amónia. 
- Básico: Se o catião é colorido, corante catiónico 
Os corantes básicos encontram-se frequentemente na forma 
de sais de cloreto, acetato ou sulfato 
❖ TIPO DE LIGAÇÃO DOS CORANTES AOS TECIDOS: 
1. Ligações covalentes: 
- Corante e componentes do tecido estabelecem uma ligação por partilha de um par de eletrões numa orbital 
molecular 
- Processo de coloração permanente 
Auxócromos mais frequente: 
- COOH origina COO- 
- OH origina O- 
- SO3H origina SO3- 
 
Auxócromo mais frequente: 
- NH2 origina NH3+ 
Corantes catiónicos (+): tem carga 
positiva num grupo amino. Ligam-se a 
substancias aniónicas como o DNA e 
RNA. 
Ligações de hidrogénio: átomos de H, 
N, O e F. 
2. Ligações iónicas ou electroestáticas: 
- Envolve forças electroestáticas que atraem iões de cargas opostas 
- Um anião ou um catião associado a um componente do tecido com carga é substituído por um corante 
aniónico ou catiónico 
- A força de integração aumenta com a carga e o tamanho do ião colorido 
 
 
 
 
 
 
3. Forças intermoleculares (Ligações de Van der Waals e ligações de hidrogénio) 
- Atração entre uma espécie rica ou deficiente em eletrões e um componente do tecido deficiente em 
eletrões ou com densidade eletrónica elevada 
- Podem posicionar as moléculas para uma subsequente formação de ligação covalente ou iónica 
 
4.” Ligações” hidrofóbicas: 
- Entre moléculas apolares ou regiões apolares de moléculas 
- As moléculas apolares aglomeram-se entre si na presença de água, porque a água se liga fortemente a si 
mesma 
- A reação tem que ocorrer em meio aquoso e as macromoléculas do tecido e as moléculas do corante têm 
de possuir grupos hidrofóbicos 
❖ CORANTES E SUBSTÂNCIAS ANFOTÉRICAS: 
 Substância que se pode comportar como ácido mas também como base, consoante as outras espécies 
químicas envolvidas na reação. 
Depende do ponto isoelétrico-> o ph do meio em que a partícula tem carga efetiva nula. A partícula 
apresenta um número de cargas positivas igual ao número de cargas negativas. 
- Corante anfotérico: Apresenta um comportamento de um ácido e de uma base e pelo menos um ponto 
isoelétrico. 
PH solução corante < PI: o corante está carregado +; é um corante catiónico ou básico 
PH solução corante = PI:o corante não apresenta uma carga efetiva 
 PH solução corante > PI: o corante está carregado - ; é um corante aniónico ou ácido 
- Componente anfotérico presente no tecido: Apresenta pelo menos um ponto isoelétrico 
PH do meio < PI componente: o componente é catiónico ou básico e tem afinidade para corantes aniónicos; 
componente acidófilo 
Corantes aniónicos (-): contêm grupos 
funcionais de ácidos ionizáveis. Ligam-
se a substâncias catiónicas (+) 
• Molécula que serve de intermediário para unir a molécula de corante com a molécula 
alvo 
• Sal ou hidróxido de um metal 
• O complexo corante-mordente é designado de laca 
• Podem ser utilizados em pré-tratamento/tratamento/após o corante 
• Torna as colorações permanentes 
• As estruturas que são fixadas pela laca depende mais do tipo de mordente do que de 
corante 
• São sempre catiónicas (+) 
• Formam complexos estáveis com as 
estruturas do tecido 
• Agentes oxidantes- ácido crómico, oxálico e 
permanganato de potássio 
• Sais metálicos- alumínio, ferro, tungsténio e 
chumbo 
• Hemateína 
• Carmin vermelho de 
Kernechtrot 
PH do meio = PI componente: o componente não tem caráter básico ou ácido 
PH do meio > PI componente: o componente é aniónico ou ácido e tem afinidade para corantes catiónicos 
(básicos); componente basófilo 
A ph 7 o núcleo tem carater ácido (basófilo) e tem afinidade para corantes básicos; O citoplasma tem carater 
básico (acidófilo) e tem afinidade para corantes ácidos 
❖ CORANTES LEUCO: 
Corantes que podem variar entre a forma incolor ou com cor por reações redox ou temperatura. 
A hematoxilina incolor é reduzida e a hematoxilina colorida é oxidada. 
❖ MECANISMOS DE COLORAÇÃO 
- Coloração direta: afinidade própria dos tecidos para o corante 
- Coloração indireta: o corante liga ao tecido através de um mordente 
- Mordente: 
 
 
 
 
 
 - Lacas: 
 
 
 
- Exemplos de mordentes: 
 
 
 
-Exemplos de corantes que utilizam mordentes: 
 
 
❖ COLORAÇÃO REGRESSIVA: 
- O corante liga-se às estruturas com diferentes afinidades 
- A coloração é feita em excesso e posteriormente é diferenciada, ficando o corante somente nas estruturas 
com maior afinidade 
❖ COLORAÇÃO PROGRESSIVA: 
• Solventes 
• Excesso de mordente- competição pelo local de ligação do mordente ao 
tecido 
• Variação de Ph- altera a carga efetiva de corantes e componentes 
anfotéricos podendo originar a rutura de ligações e pode alterar a 
ligação do corante ao mordente 
• Agentes oxidantes (pouco utilizado)- o corante é oxidado a um 
composto incolor de forma progressiva 
- Ação seletiva do corante para determinadas estruturas 
- Não é realizada diferenciação e por isso tem que existir um controlo no tempo de coloração 
- A coloração é controlada microscopicamente 
- Após a coloração os cortes são lavados para remover o corante que não está ligado ao tecido 
❖ AGENTES DE RETENÇÃO: 
- Retêm o corante já fixado 
-Impedem a descoloração durante a diferenciação 
- Mecanismo de ação diferente dos mordentes 
- Exemplo: iodo na coloração de gram 
❖ DESCOLORAÇÃO: 
- Retira todos os corantes do tecido 
❖ DIFERENCIAÇÃO: 
- Descoloração progressiva 
- Realizada por: 
 
 
 
 
 
3. Hematoxilina-Eosina 
- Técnica de rotina 
- Primeira coloração a ser realizada num fragmento histológico 
- Coloração dos núcleos (hematoxilina) a azul 
- Cora as fibras musculares a rosa intenso/vermelho 
- Cora os eritrócitos de laranja/vermelho 
- Cora a fibrina a rosa a intenso 
- Coloração do citoplasma e matriz celular (eosina) com diferentes tonalidades de rosa 
❖ HEMATOXILINA: 
- Corante de origem natural extraído da espécie Haematoxylum campechianum 
Cortes de 
congelação: 
+ rápidos 
• Delafield 
• Ehrlich 
• Mayer 
• Harris 
• Weigert 
• Weil 
• Verhoeff 
• Heidenhain 
• Mallory 
- Nomes Comuns: Bloodwood, Logwood tree, 
Pau de Campeche 
- É extraída com água quente e ureia 
- Não é um corante 
- A hemateína, produto de oxidação da 
hematoxilina, é o verdadeiro corante 
- O corante deve ser usado com um mordente 
❖ OXIDAÇÃO DA HEMATOXILINA: 
- Oxidação natural: ocorre pela exposição ao ar, luz solar ou UV (3 a 4 meses); tem uma maior estabilidade 
 Exemplos: Erlichs e Delafield 
- Oxidação química: ocorre pela ação de químicos oxidativos; menor duração 
 Exemplos: Iodato de sódio (Mayer) e óxido de mercúrio (Harris) 
❖ HEMATEÍNA: 
- Aniónica 
- Fraca afinidade para os tecidos 
- Inadequada como corante nuclear sem um mordente 
❖ MORDENTE: 
- Catião metálico 
- Confere uma carga positiva ao complexo corante- mordente → permite a ligação com as estruturas 
aniónicas a corar 
- O tipo de mordente determina as estruturas a corar 
❖ CLASSIFICADAS DE ACORDO COM OS MORDENTES: 
Alumínio: Ferro: Tungesténio: 
 
 
❖ HEMATOXILINAS DE ALÚMEN: 
- Grande afinidade nuclear devido à presença do alumínio 
- Mordente: Sulfato de potássio alumínico ou sulfato de amónia alumínico 
- Coram os núcleos de cor avermelhada mas após restauração do grupo cromóforo, em solução ligeiramente 
alcalina ou água, ficam corados de azul/roxo → se os núcleos fossem vermelhos iam ficar muito parecidos 
com o citoplasma (eosina), então passam a azul. 
Podem ser colorações: 
- Regressivas- coram em excesso e necessitam de diferenciação (solução de álcool-ácido). A diferenciação 
quebra a ligação entre: Al3+ e o tecido; Al3+ e a hemateína 
• Tipo de hematoxilina 
• Tipo de tecido 
• Concentração de hemateína 
• Frequência de utilização do corante 
• Coloração progressiva ou regressiva 
• Pré-tratamento do tecido (ex. descalcificação) 
• Preferência do observador 
• Oxidação natural (2 meses) e estável por anos 
• Coloração regressiva 
• Recomendada para mucinas ácidas, osso e cartilagem 
• Utilizada em tecidos que estiveram por muito tempo 
expostos a ácidos, formol ou fixadores ácidos 
• Desadequada para cortes de congelação 
• Oxidação química por iodato de sódio 
• Coloração progressiva, mas também pode ser usada como 
regressivamente 
• Ideal para técnicas de imunohistoquímica ou enzimáticas (baixo grau de 
acidificação) 
• Tempo de coloração 
• Oxidação química por óxido de mercúrio 
• Coloração progressiva, mas pode ser utilizada 
regressivamente 
• Diferenciação meticulosa 
• Tempo de coloração: 5 minutos (regressiva) 
• Oxidação química por iodato de sódio 
• Rotina histológica e citológica 
• Coloração progressiva mas também pode ser usada regressivamente 
• Sensíveis à aplicação de corantes ácidos fortes 
• Qualidade da coloração/corante decrescente com o tempo: filtrar a 
solução → aumentar tempo de coloração → renovar o corante 
- Progressivas- é seletiva e mais lenta; a solução de hemateína contém um excesso de sais de alumínio ou 
ácido → aumenta a seletividade para os núcleos 
Fatores que influenciam o tempo de coloração: 
 
 
 
 
Hematoxilina de Ehrlich: 
 
 
 
Hematoxilina de Mayer: 
 
 
 
 
Hematoxilina de Harris: 
 
 
 
Hematoxilina de Gill: 
 
 
 
 
❖ EOSINA: 
Corante sintético da família dos xantenos, derivado da 
fluoresceína. 
Corante aniónico (ácido)(-) que cora estruturas catiónicas 
existentes no citoplasma e reage com os aminoácidos polares 
com grupos R carregados positivamente como arginina, histidina 
(a ph baixo) e lisina. 
Citoplasmas e componentes da matriz extracelular corados com cores entre rosa e vermelho. 
A eosina Y é + usada e pode ser usada e solução aquosa ou alcoólica, entre 0.5 a 1% 
• Mordente/oxidante→ cloreto de ferro 
• A solução de ferro e a hematoxilina são preparadas separadas e misturadas antes 
de usar 
• Usada em colorações que empregam corantes ácidos 
• Cora os núcleos de negro, portanto não precisa de azular os núcleos 
• Usa o cloreto de ferro + iodo de lugol como mordente 
• Cloreto a 2% → diferenciador 
• Cora de negro as fibras elásticas 
•O sulfato de amónio férrico é usado como mordente/oxidante e diferenciador 
• Coram de negros ou cinza escuro as mitocôndrias, fibras musculares, 
cromatina e mielina 
• A diferenciação prolongada pode remover a coloração de todas estruturas 
• Mordente e hematoxilina usados em simultâneo 
• Demonstra a mielina 
• O formol aumenta a afinidade dos tecidos para corantes básicos; 
• Reage com NH2 que vai reagir com a eosina, assim uma afixação prolongada pode diminuir 
a afinidade para a eosina 
• Tecidos submetidos a fixação com fixadores contendo ácido apresentam menor basofilia 
• Cloreto de mercúrio aumenta a afinidade dos tecidos para corantes ácidos 
Basofilia → 
afinidade 
para corantes 
básicos 
É um corante aniónico e o ph altera a intensidade da coloração (reduz significativamente a ph<5) 
Diferenciação ocorre durante a lavagem em água e ligeiramente durante desidratação. 
 
❖ HEMATOXILINAS FÉRRICAS: 
- Sais de ferro atuam como agentes oxidantes e mordentes (cloreto de ferro e sulfato de amónia férrico) 
- Ligação + forte: evidencia melhor do que hematoxilina de alúmen 
- Pode evidenciar estruturas para além do núcleo, tais como, músculo estriado, mielina, queratina, fibras 
elásticas 
- Excesso de oxidação: preparação do mordente/oxidante e hematoxilina em separado (misturar antes de 
usar ou usá-los sucessivamente no tecido) 
- Colorações num tempo: o corante (hemateína) e o mordente misturam-se, combinam-se entre si e ligam-
se ao tecido 
- Colorações em dois tempos: o corante e o mordente atuam separadamente; 1º põe-se o mordente e em 
2º põe-se a hemateína 
Hematoxilina de Weigert: 
 
 
 
Hematoxilina de Verhöeff: 
 
 
Hematoxilina de Heidenhain: 
 
 
Hematoxilina de Loyez: 
 
❖ FATORES QUE INFLUENCIAM A DISTRIBUIÇÃO DO CORANTE E A COLORAÇÃO DOS TECIDOS: 
pH: a concentração de iões de hidrogénio influencia a ionização dos corantes e dos componentes dos tecidos 
Força iónica das soluções corantes: presença de sais nas soluções corantes pode influenciar as interações 
entre o corante e as estruturas, bem como, a intensidade da cor 
Fixação dos tecidos: os fixadores alteram a estrutura química dos tecidos podendo modificar as suas 
afinidades para o tecido 
 Exemplos: 
 
• Aumenta a taxa de difusão do corante e a velocidade de coloração 
• Aumenta a penetração do corante no tecido 
• Pode levar à dilatação de alguns componentes do tecido 
 Influência o tempo de incubação, a distribuição e a intensidade da cor 
 A presença de impurezas pode influenciar a intensidade ou os padrões da coloração 
Maior 
concentração→ 
mais fácil de corar 
• Rotina: observação da morfologia do tecido; usam-se 2/3 corantes para 
diferenciar o núcleo do citoplasma; diferenciar diferentes tecidos 
• Especial: evidenciar uma estrutura ou substancia endógena de acordo com a 
estrutura química; interligação entre a morfologia e a composição química do 
tecido 
• Impregnação com metais pesados: deposição seletiva de substancias metálicas 
(prata, crómio e ouro) em estruturas celulares, que se tornam insolúveis e visíveis 
após a redução do metal 
Temperatura: 
 
 
Concentração: 
 
Impureza dos reagentes: 
 
Absorção: O corante tem maior afinidade para certos componentes do tecido do que para o solvente, ficando 
retido nessas estruturas. (entra) 
Adsorção: Aderência à superfície do componente celular. (fica à superfície) 
 - depende da carga do corante e da estrutura em que ele precipita; 
 - pode ser alterado pela presença de iões em solução ou pelo pH 
Densidade das estruturas: quanto maior a densidade, maior a intensidade de coloração → maior numero de 
grupos químicos a estabelecer ligação com o corante (cor + intensa) → implica uma diferenciação mais 
cuidada 
Permeabilidade das estruturas: a distribuição do corante vai ser influenciada pela variabilidade de graus de 
permeabilidade das várias estruturas. 
 Varia com: natureza do corante; tamanho da molécula de corante; polimerização do corante 
❖ TIPOS DE COLORAÇÃO UTILIZADAS EM HISTOLOGIA: 
- Coloração vital: utilizada em células e organismos vivos, em que os corantes penetram na célula sem matar. 
Esta pode ser: intravital ou supravital 
Intravital- o corante é injetado no animal vivo. Pode ser captado por células do sistema retículo-endotelial 
ou pode ligar-se especificamente a certas estruturas 
Supravital- procedimento é realizado em células ou tecidos no laboratório 
- Coloração pós-mortem: 
 
 
 
 
 
Impregnação com metais pesados→ não é uma verdadeira coloração: 
 - as estruturas evidenciadas ficam opacas ou negras~ 
 - o “corante” está em forma de partícula 
 - os depósitos não se encontram no elemento a demonstrar (fica perto do elemento) 
• Simples: um único corante com uma ação diferencial nas diferentes 
estruturas do tecido 
• Combinada: utilização de vários corantes com afinidades diferentes para 
as diferentes estruturas celulares 
• Contrastação: utiliza-se para corar um componente celular de forma a 
orientar uma substância na morfologia do tecido 
• 2 aneis 
• Guanina e citosina 
• 3 aneis 
• Uracilo, timina e adenina 
• Reação de Feulgen 
• Verde de metilo/pironina Y 
• Métodos fluorimétricos 
• Hibridação in situ em cortes 
ou esfregaços 
• Extração de ácidos 
nucleicos e análise 
molecular 
 - não existe ligação química entre a substância depositada e a estrutura impregnada 
 - para que a prata se deposite num certo sítio, tem que ser reduzido por algo que está no tecido 
(MECANISMOS DE DEPOSIÇÃO DE PRATA). Para isso usa-se o Argentafim: os catiões são reduzidos por uma 
substância redutora do próprio tecido, sem necessidade de um reagente redutor adicional; já o Argirófilo 
não tem essa capacidade porque: substância com a afinidade para sais de prata que não tem a capacidade 
de reduzir a prata, sendo necessária uma ação de um reagente externo. 
- Tipos de coloração pós-mortem: 
 
 
 
❖ METACROMASIA: * 
- Ortocromasia e Ortocromático: corantes que coram as estruturas com a mesma cor do corante ou com a 
cor esperada. 
- Metacromasia e Metacromático: Alguns corantes coram as moléculas alvo dos tecidos de forma diferente 
da cor do corante utilizado ou do que se espera observar na coloração. 
 Exemplo: Azul de Toluida cora os grânulos de histamina dos mastócitos e cartilagem, em tons de 
vermelho e roxo (metacromasia) e o restante tecido com cor azul (ortocromasia) 
4. Ácidos nucleicos 
Purinas: 
 
Pirimidina: 
 
Na cadeia de dna os nucleótidos estão unidos por ligações covalentes (fosfodiestéricas) entre o grupo fosfato 
de um nucleótido e o grupo OH-3’ do açúcar do nucleótido seguinte. 
❖ MÉTODOS DE DEMONSTRAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS: 
- Histoquímicos (avaliação qualitativa e quantitativa doo DNA ou RNA): 
 
- Moleculares (deteção e visualização de segmentos específicos de DNA ou RNA): 
 
❖ REAÇÃO DE FEULGEN: 
Ocorre em 2 etapas: 
 
 
 
 
- Hidrólise ácida: 
Quanto > o número de grupos aldeídos expostos, > a 
coloração; 
Durante a hidrólise ocorre também a hidrólise das ligações 
éster-fosfato → despolimerização da molécula APA 
(fragmentação), o que poderá originar a remoção de APA do 
tecido → baixa intensidade da coloração. 
Ramo ascendente: aumento da coloração é devido à 
ocorrência da hidrólise das ligações N-glicosídicas entre as purinas e as pentoses; a hidrólise de ligações 
ester-fosfato é mínima 
Plateau: nesta fase a intensidade de coloração é máxima, e não afeta o tempo de hidrólise. Há um 
equilíbrio entre a taxa de formação de grupos aldeídos e a taxa de remoção de aldeídos através da perda de 
fragmentos APA 
Ramo descendente: diminuição da intensidade de coloração com o aumento do tempo de hidrólise. 
Hidrolise das ligações éster-fosfato e remoção do tecido dos fragmentos APA 
- O tempo de cada uma das fases depende: 
 Técnica de hidrólise: temperatura e concentração de HCL 
 Tipo de DNA: a heterocromatina (+condensada)é + resistente à hidrólise que a eucromatina (- 
condensada) 
 Fixação: tipo de fixador 
Exemplos: Helly e Zenker- 5 a 8 min 
EtOH 100% - 5 min 
Bouin não é recomendado 
Formaldeído a 10%- 8 a 12 min→ promove a retração nuclear, a condensação da cromatina e estabelece 
ligações entre o DNA e as proteínas, estabilizando o DNA 
 Meio de impregnação: em parafina leva à retenção o núcleo; com polímeros do tipo metacrilato de 
glicol, estabiliza o DNA e > o tempo ótimo de hidrólise 
- Notas: este método é específico para o Dna nuclear; o Dna mitocondrial não é identificado nesta coloração; 
empora as purinas do RNA sejam removidas por hidrólise, apenas as desoxirriboses atuam como 
“verdadeiros” aldeídos reagindo com o Schiff. 
❖ REAGENTE DE SCHIFF: 
Usado em excesso de ser retirado com a utilização de uma solução de metabissulfito de sódio. 
❖ DEMONSTRAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS POR BASOFILIA: 
- Basofilia: quimicamente refere-se à ligação progressiva e seletiva de corantes catiónicos aos grupos 
aniónicos dos tecidos. Depende do pH, concentração de eletrólitos, tempo, temperatura, concentração e 
tamanho molecular do corante e tratamento do corte 
- Ph: deve permitir que os grupos fosfato do DNA estejam ionizáveis 
 
• PH=4 → grupos sulfato, fosfato e carboxilo 
• PH= 1.5 → grupos sulfato 
• PH= 1.5 a 2 → grupos fosfato 
• PH<3 → resíduos catiónicos (lisina e arginina) estabelecem ligações eletrostáticas fortes com os 
grupos fosfatos ionizáveis → diminuição da coloração 
Observou-se que: 
 
 
 
O valor de pH da solução de corantes catiónicos apresenta habitualmente um pH entre 3 e 4 
- Concentração de eletrólitos: se a solução estiver muito concentrada pode competir pelas estruturas 
aniónicas 
- Tamanho e concentração do corante: o corante poderá não conseguir aceder aos componentes aniónicos 
se estes se encontram em estruturas muito densas 
- Tratamento pós-coloração: a utilização de corantes ácidos ou uma etapa de desidratação muito 
prolongada poderão remover o corante 
 
❖ VERDE DE METILO/PIRONINA Y: 
Método que utiliza 2 corantes catiónicos que permite a diferenciação entre DNA e RNA. 
O verde metil tem afinidade com o DNA e a pironina tem afinidade com o RNA. O dna vai ter cor verde 
e o RNA cor rosa. 
Em conjunto os corantes são mais seletivos. 
A pironina não é especifica para o RNA, e alem de marcar também DNA, marca algumas estruturas como 
cartilagem, queratina, grânulos de eosinófilos e de mastócitos. 
- Tipo de fixador: 
 
 
 
- Métodos fluorescentes: 
 Baseiam-se na emissão de luz visível por determinados elementos químicos (fluorósforos ou 
fluorocromos) quando são incididos por uma radiação intensa. 
 Fluorocromo excitado emite luz num comprimento de onda maior que o absorvido. 
 É um fenómeno de vida curta. 
Hoechst→ ph 7- heterocromatina centromérica; ph 2- nucléolo e citoplasma 
Intercala em regiões ricas em adenina e timina; interações electroestáticas 
Brometo de etídeo→ reage especificamente com o DNA e RNA de cadeia dupla; estabelece ligações com as 
bases (intercala), sem preferência para qualquer tipo de base. 
Iodeto de propídeo→ mecanismo semelhante ao brometo de etídeo 
Quinacrina→ intercalas as bases azotadas, com > intensidades nas regiões ricas em T-A 
• Glicogénio- fígado 
• Proteoglicanos- tecido conjuntivo 
• Mucinas- componente do muco (glândulas) 
Laranja de acridina→ molécula catiónica e o seu posicionamento (entre 2 bases azotadas) permite-lhe 
estabelecer ligações electroestáticas com os grupos fosfato; DNA cadeia dupla quando excitado com luz azul 
fluoresce verde; DNA cadeia simples quando excitado com luz fluoresce vermelho. 
 
5. Hidratos de Carbono 
Fórmula geral Cn(H2O)n (3<n>9) 
Moléculas compostas por H/C/O 
Tem grupos glicosídicos e pontes glicosídicas→ o glicogénio é o único polissacarídeo no Homem; encontra-
se reservado no fígado 
Tem um grupo OH→ confere solubilidade para a água 
❖ CLASSIFICAÇÃO BIOQUÍMICA: 
 
 
 
 
 
 
❖ CLASSIFICAÇÃO HISTQUÍMICA/BANCROFT: 
 
 
 
 
 
❖ FUNÇÕES: 
- Reservas energéticas: glicogénio e glicose 
- Metabolismo celular, adesão, atividade enzimática, regulação da proliferação celular 
- Caracterizar patologias/neoplasias 
+ importante detetar: 
 
 
❖ GLICOGÉNIO: 
- Glucose é a unidade básica 
- Ligam-se através de ligações peptídicas 
PH alto identifica todas 
as mucinas 
PH baixo identifica só 
mucinas ácidas 
fortemente sulfatadas 
- Para identificar o glicogénio faz-se: PAS, Best’s Carmine e Bauer-Feulgen 
❖ PROTEOGLICANOS: 
Os glicosaminoglucanos ligam-se à proteína central. 
Os glicosaminoglucanos são constituídos por várias 
unidades dissacarídicas repetitivas: ácido hexurónico e 
hexosamina. 
A ph baixo reagem com determinados corantes 
catiónicos e são PAS negativos, isto é não são colorados 
por esta técnica. 
- Células produtoras de proteoglicanos: fibroblastos, 
células endoteliais, osteócitos, condrócitos e mastócitos. 
- Função: estabilizam e suportam os elementos fibrosos do tecido conjuntivo 
❖ MUCINAS EPITELIAIS: 
Cadeias polissacáridas ligadas covalentemente a um esqueleto proteico; 
Os glicanos estão unidos por uma ligação do tipo O-glicosídica a uma serina 
ou treonina; 
São classificadas em famílias; 
As ramificações só partem da proteína central 
❖ MUCINAS NEUTRAS: 
Contêm uma grande quantidade de monossacarídeos sem carga como a manose, a galactose e 
galastosamina; 
Não apresentam grupos radicais ácidos reativos 
- Localização: glândulas de Brunner, células epiteliais superficiais da mucosa gástrica, trato respiratório, 
células goblet e glândula prostática 
- Técnicas histoquímicas: identificados por PAS; o corante básico não cora 
❖ MUCINAS ÁCIDAS FORTEMENTE SULFATADAS: 
Reagem a ph baixo (ph=0.5) com corantes catiónicos e são PAS positivas 
❖ MUCINAS ÁCIDAS FRACAMENTE SULFATADAS: 
Diferem das anteriores por reagirem a ph mais alto (ph=1) com corantes catiónicos 
❖ MUCINAS CARBOXILADAS: 
Podem ser: 
- N-acetilsialomucina – lábeis →mucinas de origem epitelial, contêm ácido siálico que reage a ph 2 e acima 
deste valor e reage com corantes catiónicos; são PAS positivo; presentes nas glândulas; sialidase lábil 
- N-acetil-O-acetil sialomucina – resistentes →mucinas de origem epitelial, contêm ácido siálico que reage a 
ph 2 e acima deste valor e reage com corantes catiónicos; são PAS negativo; presentes nas células 
caliciformes da mucosa do cólon; sialidase resistente- não é degradada 
- Ácido hialurónico → PAS negativo; azul de alcião positivo (ph 2.5) 
❖ PAS (PERIODIC ACID-SCHIFF): 
Ácido periódico: forma aldeídos livres dos hidratos de carbono, o que faz com que o glicogénio fique 
marcado. 
Evidencia o glicogénio, as mucinas neutras, sialomucinas N-acetilsialomucias e algumas sulfomucinas 
epiteliais. 
Baseia-se na capacidade do ácido periódico clivar oxidamente os grupos 1,2-glicol, ou os seus derivados 
amino ou alquilamino, a grupos aldeídos livres. 
Estes grupos vão reagir com o reagente de Schiff originando um produto final colorido (magenta) 
O reagente Schiff é uma fucsina básica e incolor 
❖ PAS COM E SEM DIASTASE: 
Permite distinguir o glicogénio dos restantes componentes do tecido que coram com PAS 
É feita uma digestão do glicogénio antes da oxidação com ácido periódico 
Vai-se usar enzimas para ter a certeza que o glicogénio aparece a magenta: 
 -Diastase →extraida do malte que contem as enzimas alfa e beta-amilase 
 -Alfa-amilase →digere as ligações glicosídicas alfa, levando à libertação da maltose 
❖ AZUL DE ALCIEN: 
Flalocianina de cobre básica 
Demonstração de mucosubstancias ácidas, logo é um corante catiónico (+) 
A ligação ao tecido baseia-se em ligações eletroestátias, que permite a ligação do corante aos grupos 
aniónicos, sulfato e carboxilo do tecido 
Não reage com os grupos fosfato dos ácidos nucleicos 
Cora de azul 
O ph influencia a especificidade da ação- os componentes dos tecidos coram + intensamentequando a 
solução corante tem um Ph ao qual os grupos reativos estão totalmente ionizados. 
 
 
 
❖ MUCICARMIN: 
Evidenciam mucinas ácidas epiteliais→ cor de rosa forte a vermelho 
❖ FERRO COLOIDAL (método de Hale): 
Identifica mucosubstancias ácidas 
Baseia-se na afinidade dos catiões de ferro, presentes numa solução coloidal acidificada, pelos grupos 
aniónicos do tecido 
• Suporte para os órgãos e estruturas do corpo 
• Estabelecimento de ligação entre diferentes estruturas do corpo 
• Transporte e defesa (células sanguíneas) 
O catião de ferro fixado no tecido é evidenciado pelo ferrocianeto de potássio→ formação de um 
composto de cor azul 
❖ DIAMINA DE FERRO: 
Evidencia mucinas sulfatadas/sulfomucinas 
Utiliza uma solução corante com Ph baixo e uma alta concentração de ferro 
É realizado em combinação com aminoácidos ph 2.5 
❖ METENAMINA-PRATA: 
Os iões de prata ligam-se aos HC presentes na membrana basal. Esses grupos são transformados em aldeídos 
e estes grupos reduzem a prata formando uma cor negra. 
O cloreto de ouro intensifica a cor formada. 
❖ PAS- FENILDIDRAZINA: 
Os aldeídos das substâncias com carga +/neutra são bloqueados com fenilhidrazina – negativos para a 
reação com Schiff 
Substâncias com carga negativa coram com Schiff pois não são bloqueados 
Mucinas neutras não coram 
Mucinas ácidas coram a magenta 
6. Tecido conjuntivo 
Estabelecimento e manutenção da forma do corpo 
- Funções: 
 
Deriva do folheto mesodérmico embrionário ou mesênquima 
É composto por células rodeadas por uma rede estrutural complexa não celular- matriz extracelular- 
constituída por elementos amorfos e elementos organizados 
 
 
 
 
 
❖ FIBRAS DE COLAGÉNIO: 
São encontradas na matriz extracelular 
Colagénio é sintetizado e secretado por células do tecido conjuntivo (fibroblastos, condrócitos, osteoblastos, 
células epiteliais e musculares). 
Podem ocorrer como fibras individuais, conjuntos de fibras dispostas em onda e feixes de fibras formando 
estruturas com grande tensão. 
Fibras→ bandas onduladas anastomosadas compostas por fibrilas 
Fibrilas→ compostas por microfibrilas 
Microfibrilas→ 20-90nm de diâmetro 
A fresco são brancas 
Com HE são eosinófilas devido ao alto conteúdo proteico→ rosa 
Birrefringência: propriedade optica de um material que possui diferentes índices de refração para diferentes 
direções de propagação da luz 
Birrefrigencia intrínseca (constituição molecular) e de forma (disposição paralela das subunidades) 
Os pontos isoelétricos situam-se entre 8 e 10 e são coradas por corantes ácidos 
❖ TIPOS DE COLAGÉNIO I: 
Mais comum; 
Encontrado no pulmão, ossos, ligamentos, tendões, pele 
Apresentam birrefrigência 
Cora fortemente com os corantentes ácidos→ Van Gieson e Tricómio de Masson 
❖ TIPOS DE COLAGÉNIO II: 
Cartilagem hialina e elatica (produzido por condroblastos ativos) 
São birrefrigentes 
❖ TIPOS DE COLAGÉNIO III: 
Tecidos que contêm outros tipos de colagénio- artérias, rim, fígado, pulmão, baço e musculo liso 
Produzido por fibroblastos e células reticulares 
Principal componente das fibras reticulares 
Constituem fibras argirofilas e pouco birrefrigentes 
❖ TIPOS DE COLAGÉNIO IV: 
Encontrado na membrana basal 
Sintetizado por células epiteliais 
Apresenta uma quantidade significativa de complexos de hidratos de carbono- PAS positivo 
Pouco birrefrigente 
❖ TIPOS DE COLAGÉNIO V: 
Em vasos sanguíneos e membranas fetais 
Sintetizado por células do tecido conjuntivo, epiteliais e endoteliais 
Associado à superfície das células 
 
 
• Baseiam-se na acidofilia e permeabilidade aos corantes; 
• 3 corantes na realização das técnicas podem incluir a coloração de contraste 
nuclear; 
• Demonstram seletivamente fibras musculares e eritrócitos 
❖ COLORAÇÕES PARA FIBRAS DE COLAGÉNIO: 
Não existem colorações especificas- podem ser evidenciadas por métodos imunohistoquímicos 
São + usadas as colorações tricrómicas: 
 
 
❖ VAN GIESON: 
Cora especificamente as fibras de colagénio e não cora as reticulares 
Utiliza uma mistura de corantes fortemente acídicos→ ácido pícrico e fucsina ácida 
Os cortes são tratados com 2 corantes ácidos a ph baixo 
O corante de tamanho molecular + pequeno difunde mais rapidamente (ácido pícrico)→ cora as 
estruturas acidófilas + densas 
O corante de tamanho molecular maior tem menor capacidade de difusão (fucsina ácida)→ cora as 
estruturas acidófilas mais laxas 
Devido ao ph baixo da solução deve ser utilizada uma hematoxilina férrica pois é resistente à 
diferenciação por soluções ácidas 
- Citoplasma, fibras musculares, eritrócitos e fibrina → amarelo 
- Colagénio → rosa 
- Núcleos → preto 
❖ TRICRÓMIO DE MASSON: 
Baseia-se nas diferenças de permeabilidade entre as fibras de colagénio e os elementos acidófilos do 
tecido; e no papel do ácido fosfomolibdico (AFM) ou ácido fosfotungíco (AFT) para a ligação do verde luz/azul 
de anilina às fibras de colagénio 
 
 
 
 
 
- Papel do AFM ou AFT: 
Mordente- apresentam muitos grupos acídicos que provavelmente funcionam como pontes de ligação entre 
o azul de anilina e as fibras de colagénio descoradas; 
“Corante incolor”- competem com a fucsina ácida pelos sítios de ligação catiónicos presentes nas estruturas 
laxas, sendo capaz de deslocar a fucsina (pequeno tamanho nuclear) e de ligar aos sítios catiónicos; 
O azul de anilina/verde luz liga-se aos resíduos básicos das fibras de colagénio que não foram bloqueadas 
pelo AFM ou AFT. 
 
- Citoplasma→ vermelho 
- Fibras musculares, eritrócitos e fibrina→ vermelho 
- Fibras colagénio, reticulina e membranas basais→ verde/azul 
- Núcleos → azul 
- Fatores que afetam a coloração tricrómica: 
Temperatura- alta taxa de difusão dos corantes nos tecidos e a penetração de moléculas de tamanho nuclear 
grande 
pH- as fibras de colagénio coram apenas se o pH da solução for baixo, 1.5 a 3 
Hematoxilina- as hematoxilinas de alumínio podem ser descoradas com as soluções de ph baixo. As 
hematoxilinas férricas são + resistentes 
Fixação (formaldeído)- quanto + tempo de solução menor a qualidade da coloração 
❖ FIBRAS ELÁSTICAS: 
 
 
 
 
 
Fibras elásticas- constituídas pela proteína elastina e pelas microfibrilas, cujo principal componente 
é a glicoproteína fibrilina. 
Microfibrilas- são 1º formadas e a elastina é depositada sobre elas, nas fibras maduras as microfibrilas 
ficam localizadas no interior e na periferia 
Elastina- as moléculas ligam-se covalentemente através da lisil-oxidase; é rica em aa hidrofóbicos, 
apresentando uma conformação enovelada 
Fibrilina- é composta por aminoácidos polares; apresenta ligações dissulfeto resultantes do elevado 
conteúdo de aa cistina 
❖ COLORAÇÕES PARA FIBRAS ELÁSTICAS: 
Coram intensamente: vermelho do congo, HE, PAS, Hematoxilina de Verhoeff, fucsina paraldeídica 
Coram aniónicos: ligações electroestáticas com proteínas (elastina) 
PAS: reação fortemente positiva devido à presença de glicoproteínas e hidratos associados às 
microfibrilas 
Corantes catiónicos: reagem com as ligações dissulfeto dos grupos cistina após oxidação (formação de 
aniónicos) 
Servem para avaliar lesões degenerativas congénitas e adquiridas, doenças pulmonares crónicas em que 
há uma perda progressiva de fibras de elastina e aumento de fibras de colagénio e em patologias com 
excessivas produção de elastina 
 
❖ HEMATOXILINA DE VERHOEFF: 
Fibras elásticas maduras- coram intensamente de negro 
 
 
 
 
 
Fibras elásticas e núcleos→ negro 
Citoplasma→ amarelo 
Fibras musculares e eritrócitos→ amarelo 
Fibras de colagénio→ vermelho 
❖ FIBRAS DE RETICULINA: 
Fornecem uma rede de suporte para os constituintes celulares de vários órgãos e tecidos, estão 
associadas às fibras de colagénio do tipo I e encontradas na membrana basal 
Derivam predominantemente da polimerização do colagénio do tipo III, mas também do colagénio de 
tipo I 
Apresentam uma fração glicosídica significativaestando associadas a proteoglicanos e glicoproteínas 
Avalia a rede tridimensional reticular dos órgãos ricos em fibras reticulares e diagnostica 
diferencialmente alguns tumores malignos 
❖ COLORAÇÕES PARA FIBRAS DE RETICULINA: 
São evidenciadas pelos métodos de coloração para as fibras de colagénio mas não são distinguíveis das 
fibras de colagénio pelos métodos tricrómios 
Os métodos utilizados são baseados nos componentes glícidos da substância interfibrilar 
Métodos baseados na impregnação argêntica 
Fibras de reticula → argirofilas 
Fibras de colagénio → não argirofilas 
❖ IMPREGNAÇÕES ARGÊNTICAS: 
- Oxidação→ leva à formação de grupos aldeídos 
Agentes oxidantes: permanganato de potássio, metabissulfato, ácido fosfomolibdico e ácido periódico. 
- Sensibilização→ pré tratamento para aumentar a seletividade da impregnação/para a prata ou aumentar 
o contraste 
Soluções de sais de metais pesados: alúmen de ferro, nitrato de prata e nitrato de uranilo 
Pares oxidantes/sensibilizadores: permanganato de potássio/alúmen de ferro ou ácido periódico/nitrato 
de prata 
• Epitélio 
• Lâmina basal- pode-se dividir em lâmina densa e lâmina lúcida 
• Lâmina reticular 
- Impregnação→ os grupos aldeídos reduzem os iões de prata diamina, presente na solução de prata 
amoniacal, a prata metálica. A prata metálica deposita-se no local da reação , ligando-se a resíduos de 
açúcar reativos 
- Redução→ é utilizado um agente (formol) para reduzir a prata iónica a prata metálica. Ocorrer uma maior 
deposição de prata nos locais submicroscópios 
- Viragem→ substituição da prata metálica por cloreto de ouro; escurecimento ficando os locais de reação 
com uma cor mais acentuada (de castanho para preto); etapa facultativa 
- Fixação→ o tiossulfato de sódio remove os iões de prata ou ouro, que não foram reduzidos presentes nos 
tecidos 
- Contrastação→ é facultativa; usa-se a solução de Kernechtrot 
Fibras de reticulina→ negro 
Núcleo e restantes→ gradiente rosa a vermelho claro 
❖ MEMBRANA BASAL: 
Matriz que separa o tecido conjuntivo do tecido epitelial, das células endoteliais, musculares, adiposas 
ou nervosas. 
Suporte para as células epiteliais na superfície da mucosa 
Divide-se em 3 zonas: 
 
 
❖ MÉTODOS PARA EVIDENCIAR A MEMBRANA BASAL: 
Contêm um componente glúcido considerável (complexos de carbohidratos, glicoproteínas, 
proteoglicanos)→ PAS e Metanamina Prata 
Serve para avaliação de alguns tipos de tumores, uma vez que a perda da men«mbrana basal contribui 
para a disseminação neoplásica 
Serve também para o estudo da diabetes Mellitus que leva a um espessamento da membrana basal 
dos glomérulos. 
❖ METANAMINA PRATA: 
Agente oxidante- formação de grupos aldeídos→ ácido peródico ou ácido crómico 
Impregnação- solução de metanamina prata alcalina (Ph 8) durante 1h a 56-58ºC→ agente 
alcalinizante é o borax 
 
• Concentração 
• Ph 
• Solventes 
• Temperatura 
• Constituintes do tecido 
❖ CORANTES METACROMÁTICOS: * 
- Tamanho molecular pequeno 
- Estrutura planar 
- Pequena carga nuclear elétrica (unicatiónicos ou unianiónicos) 
❖ METACROMASIA NEGATIVA/BATOCRÓMICA: 
Desvio do pico de absorção do corante para um 𝜆 maior 
❖ METACROMASIA POSITIVA OU HIPSOCRÓMICA: 
Desvio do pico de absorção do corante para um 𝜆 menor 
❖ CROMOTROPOS: 
Substâncias com capacidade de alterar a cor a um corante metacromático; 
Podem estar presentes no tecido ou ser adicionadas à solução corante; 
Grupos aniónicos + eficientes: carboxilo, fosfato diester, sulfato e fosfato monoester; 
A maioria são polianiões de alto peso molecular ou aniões pequenos capazes de se agregarem em grupos 
de alto peso molecular; 
Os sítios de ligação ao corante nas substâncias cromotrópicas devem estar próximos e dispostos de forma 
a favorecer a ligação do corante. 
As interações corante-corante e de corante-cromotropo depende da estrutura e da concentração das 
substâncias cromotrópicas do tecido. 
Efeitos cromotrópicos: 
 
 
 
Com maior concentração de corante, maior será a agregação das moléculas corante→ alteração da 
cor da solução (desvio do comprimento de onda) 
Nota: corantes metacromáticos não seguem a lei de Lambert-Beer 
❖ AGREGAÇÃO DO CORANTE NA METACROMASIA: 
 
 
 
 
 
 
 
 
❖ FATORES QUE INFLUENCIAM A VISUALIZAÇÃO DE CROMOTROPOS: 
- Fixação: 
Melhores resultados em cortes de congelação do que em tecido fixado; 
Depende do tipo de fixador e tipo de cromotropo 
- Descalcificação: 
A utilização de descalcificadores fortes afeta a metacromasia 
É recomendável soluções descalcificadoras de ácidos fracos ou de agentes quelante 
- Inclusão: 
A temperatura da parafina pode influenciar a metacromasia nuclear 
- Concentração do corante e duração a coloração: 
Os componentes do tecido podem apresentar diferentes graus de metacromasia- diluições + diluídas 
ou + concentradas 
- Ph: 
Ph mais baixo favorece a metacromasia 
- Oxidação antes da coloração: 
Em algumas técnicas; 
Os tecidos podem ser tratados para apresentarem sítios de ligação aniónicos cromotrópicos (grupos 
carboxilos/grupos aldeídos) 
- Proteínas: 
Algumas proteínas endógenas podem interferir com a reação metacromática (hidrólise ácida prévia) 
- Eletrólitos: 
Catiões endógenos interfere na metacromasia da matriz óssea calcificada (descalcificação) 
- Desidratação: 
Álcool pode originar a dissociação dos complexos metacromáticos→ desidratar rapidamente os cortes, 
secar ao ar e montar em meio aquoso 
❖ APLICAÇÕES DE METACROMASIA: 
Identificação e caracterização das mucinas ácidas (mucopolissacarídeos) 
Identificação de diferentes tipos celulares da linhagem hematopoiética presentes na medula óssea 
Evidenciação de ácidos nucleicos (acridine orange) 
Evidenciação de amiloide 
❖ SUBSTÂNCIA AMILÓIDE: 
Teste de iodo – identificação de polissacarídeos 
Amilóide- semelhante ao amido 
Ultraestrutura fibrilar proteica, em que as proteínas têm uma conformação em folha β-pregueada (anti-
paralela) 
Material amorfo eosinófilo extracelular 
A configuração β-pregueada produz birrefringência sob luz polarizada após coloração com vermelho do 
congo 
Os depósitos de amilóide contêm cerca de 5% de glicoproteína não fibrilares ⟶ componente P (derivado 
e idêntico à proteína plasmática circulante normal componente amilóide sérico P (SAP) e outras 
glicoproteínas 
❖ AMILOIDOSE: 
Deposição da amiloide nos tecidos ou órgãos na forma de depósitos microscópicos, placas ou massas 
confluentes que substituem o parênquima dos órgãos afetados, levando a uma perda gradual da função dos 
órgãos 
Pode surgir associada a algumas inflamações e infeções crónicas, discrasias imunitárias, desordens 
hereditárias e ao envelhecimento. 
❖ CLASSIFICAÇÃO AMILOIDOSE: 
- Sistémica: afeta vários tecidos e pode surgir associada a algumas inflamações e infeções cronicas, discrasias 
imunocitárias, desordens hereditárias e ao envelhecimento. 
- Localizada: afeta um órgão ou um tecido 
❖ MÉTODOS DE DEMONSTRAÇÃO: 
- Vermelho do congo: 
Corante diazo com estrutura linear e muito hidrofóbico- solvente habitual é uma solução aquosa de 
etanol a 80% 
Amiloide apresenta-se vermelha ao microscópio optico e birrefringente (verde) quando observada 
sob luz polarizada 
Penetra na estrutura fibrilar da amiloide e estabelece ligações de hidrogénio entre 2 cadeias 
polipeptídicas adjacentes em conformação de folha β-pregueada. A ligação do corante ajuda a manter esta 
conformação. 
Pode ser realizado um pré-tratamento com solução alcalina (solução alcalina de cloreto de sódio) - 
as pontes de hidrogénio internas da proteínas ficam disponíveis para reagir com os grupos amina e azo do 
corante. 
Os grupos amino e azo do vermelho do congo estabelecem pontes de Hidrogénio com os grupos 
hidroxil das proteínas da amiloide. 
- Sirius red: 
Semelhante ao vermelho do congo 
Observado com cor verde (birrefringência) 
- Violeta de metilo: 
Pouco utilizado 
Coloração de amiloidemetacromática (vermelho a roxo) 
Baixa sensibilidade e especificidade→ cora outros componentes do tecido 
- Tioflavina T: 
Método muito sensível mas não muito específico 
Deteta depósitos muito pequenos de amiloide 
Deteta outros componentes do tecido como a fibrinóide e queratina 
- Análise imunohistoquímica: 
Caraterização do tipo de amiloide através da utilização de anticorpos direcionados contra proteínas 
amiloides particulares.