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1 [Dica importante: ...Para entender Genética Mendeliana, tenha sempre uma coisa muito importante na cabeça: todo ser vivo (indivíduo) SEMPRE tem um “pai” e uma “mãe”! (é claro que nem todos os seres vivos são assim... Mas para nossos estudos, considere como sim!) LIGAÇÃO GÊNICA (= “linkage”) Para entender BEM o que é isso, e compreender as consequências práticas disso, é necessário lembrar-se da 2ª Lei de Mendel, que diz que “os fatores que definem as características distribuem-se independentemente na formação de gametas”. Por causa dessa 2ª Lei é que sempre tratamos os locos de maneira independenteindependenteindependenteindependente uns dos outros, de modo que sempre multiplicamosmultiplicamosmultiplicamosmultiplicamos as proporções/probabilidades de cada loco nos resultados de cruzamentos – rever os “diagramas de galhos” dos Textos de Apoio da 1ª e 2ª Leis de Mendel!! ☺ Na verdade, devemos recordar que sempre consideramos os locos das características que estávamos estudando como estando todos em cromossomos diferentesdiferentesdiferentesdiferentes; ou seja, 1 loco de uma característica em 1 cromossomo, outro no outro, e assim por diante... Como 1 cromossomo (“1 par de homólogos”) é independenteindependenteindependenteindependente dos demais pares, e os alinhamentos dos homólogos na metáfase I é aleatório, então todas as combinações de alelos é possível nos bilhões de gametas formados no tecido reprodutivo que passa por gametogênese! – lembrar do “jogo dos zíperes” e rever o Texto de Apoio do Ciclo Celular, Mitose e Meiose!! ☺ Para lembrar bem, preste atenção à Figura abaixo que tenta representar “celularmente” (ou seja, pela meiose), como a 2ª Lei de Mendel ocorre (já vimos isso nos Textos de Apoio, vídeo-aulas e jogo dos zíperes – relembre!!). Exemplo: formação de gametas com 2 locos com distribuição independente em 1 célula 2n = 4 (indivíduo duplo-heterozigoto, com genótipo AaBb para estes locos). ... ... alinhamento aleatório dos homólogos (nas milhares de células passando por meiose!) + várias combinações de crossing-over (ñ mostrado!)... A a B b A A a a B b B b A A b b B B a a x milhares células... A A b b B B a a Ciclo celular meiótico ...milhares de Anáfases I UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ –UESC Departamento de Ciências Biológicas – DCB Genética – CIB-066 – Curso de Ciências Biológicas (Bach. & Licenc.) Prof. Leandro Lopes Loguercio 2 Nessas condições, as classes (tipos) de gametas formados com todas as combinações possíveis dos 4 alelos dos 2 locos, nas milhares de células meióticas, são: ... ... AB ab Ab aB Observe que não foram representados os “zilhões” de crossing-overs (permutações ou recombinações) diferentes que ocorreram nas células gametogênicas porque, para esta situação de locos em cromossomos diferentes, isto não faz diferença! Neste caso, então, se este indivíduo AaBb, que formou estes 4 tipos de gametas (n = 2), fizesse parte de um testcross (cruzamento-teste), ou seja, se cruzasse com um testador aabb, a proporção de genótipos/fenótipos, conforme a 2ª Lei de Mendel, seria assim: ¼ 1/4 ¼ 1/4 ¼ 1/4 ¼ 1/4 LeveLeveLeveLeve isisisisttttoooo comcomcomcom vocêvocêvocêvocê atéatéatéaté oooo finalfinalfinalfinal dadadada leituraleituraleituraleitura –––– vocêvocêvocêvocê vaivaivaivai precisar!!precisar!!precisar!!precisar!! ☺ Agora... Pense na seguinte situação: Como se formariam os gametas se estes 2 locos que trabalhamos acima estivessem localizados no mesmo cromossomo ??? Neste caso, porém, para que possa haver “mistura” dos alelos (todas as combinações possíveis!!) desses locos na formação dos gametas (para atender a 2ª Lei de Mendel!), é necessário haver crossing-over na prófase I . Ou seja, se os genes estivessem em cromossomos diferentes (como vimos nas Figuras anteriores!) somente o alinhamento aleatório dos homólogos na metáfase I seria suficiente para “misturar” os alelos de diferentes locos entre os gametas formados, não é mesmo!?! Mas se os genes (locos) estão “ligados” (ou seja, presentes nos mesmos “zíperes”!!), a única maneira de se permitir que todas as combinações possíveis de alelos entre os locos ocorram será se houver crossingcrossingcrossingcrossing----overoveroverover (permutação ou recombinação) entre os locos!!!!! Isto é exatamente a condição de LIGAÇÃO GÊNICA (ou “linkage”!) A B a b A a b B ABABABAB abababab aaaaabbbbb AAAAaBBBBb AbAbAbAb aBaBaBaB ab x aaaaaBBBBb AAAAabbbbb 3 A ligação gênica refere-se à situação em que 2 ou mais locos (genes) fazem parte do mesmo cromossomesmo cromossomesmo cromossomesmo cromossomomomomo; ou seja, refere-se ao caso em que as seqüências de nucleotídeos correspondentes aos genes são localizadas em pontos distantes de uma mesma molécula DNA (que é o cromossomo!). Portanto, diz-se que dois caracteres distintos estarão ‘geneticamente ligados’ se seus genes correspondentes se localizarem no mesmo cromossomo. Para entender melhor, veja a próxima Figura. Nela há um exemplo de formação de gametas com 2 locos ligados entre si num mesmo cromossomo! Consideremos o mesmo caso acima de 1 célula 2n = 4 que sofrerá meiose (indivíduo AaBb). (4 x milhares de células n = 2) ...Ou seja, mesmo quando os mesmo quando os mesmo quando os mesmo quando os genes estão ligadosgenes estão ligadosgenes estão ligadosgenes estão ligados num mesmo num mesmo num mesmo num mesmo cromossomocromossomocromossomocromossomo, é possível obter os mesmos 4 tipos de gametas, por causa do crossing-over: ABABABAB, abababab, AbAbAbAb, aBaBaBaB!! Assim, da mesma forma que no caso anterior, se este indivíduo AaBb que gerou esses gametas participar de um cruzamento-teste (testcross) com um indivíduo testador aabb, os genótipos/fenótipos seriam também AAAAaBBBBb , aaaaabbbbb , AAAAabbbbb , aaaaaBBBBb !!!!! A única diferença importantediferença importantediferença importantediferença importante é que as proporções entre estes genótipos na progênie irão VARIAR, ao contrário do ocorre na 2ª Lei de Mendel, em que seriam sempre 1 :1 :1 :1 (veja acima!). Explicaremos isso a seguir!!... Prófase I A a a A b b B B x milhares células... ... várias combinações de crossingcrossingcrossingcrossing----oversoversoversovers + alinhamento aleatórioalinhamento aleatórioalinhamento aleatórioalinhamento aleatório dos homólogos (nas milhares de células passando por meiose)... B A a B A b b a A a B b a A A a B b B b A A a a B b B b 4 Contudo, é MUITO importante observar um detalhe-chave: � as cromátides do par de homólogos que NÃO NÃO NÃO NÃO sofreram recombinaçãosofreram recombinaçãosofreram recombinaçãosofreram recombinação (aquelas posicionadas na parte “de fora” dos cromossomos duplicados e pareados – ver setas pontilhadas na Figura anterior) segregaram (após a meiose I e II) exatamente da forma como estavam ANTES de ocorrer a recombinação. Ou seja, os gametas que receberam esses “cromossomos-filhos” mantiveram a MESMA configuração de alelos ligados da célula parental (= ANTES da meiose! Ver 1ª célula da Figura), isto é, os gametas ABABABAB e abababab! Por causa deste fato, esses são chamados de gametasgametasgametasgametas parentais, e os genótiposgenótiposgenótiposgenótipos correspondentes, resultantes do testcrosstestcrosstestcrosstestcross, são os genótiposgenótiposgenótiposgenótipos parentais! � Da mesma forma, as outras duas cromátides que recombinaram (que “permutaram” os alelos entre si) acabaram por gerar “cromossomos-filhos” com configuração de alelos ligados DIFERENTE da célula parental (de ANTES da meiose!). Ou seja, geraramos gametas AbAbAbAb e aBaBaBaB que, por causa deste fato, são chamados de gametas recombinantes (aqueles em que os alelos dos 2 locos “quebraram” a ligação entre si, isto é, recombinaram!). Portanto, neste caso, os genótipos correspondentes, resultantes do testcross, são os genótipos recombinantes! Agora pense o seguinte: o que vai ocorrer quando há ligação gênicaligação gênicaligação gênicaligação gênica e a distância física entre os locos for “pequena” o suficiente, de tal modo que diminuem as oportunidades (“chances”) de ocorrer crossing-over entre os locos (genes) ?? � Teremos, neste caso, um aumento na FREQÜÊNCIA dos genótipos parentais e uma diminuição nos recombinantes, pois menos “crossing-overs” ocorrerão na região cromossômica entre os locos (genes) observados!!! Assim, o que vai ocorrer com as proporções proporções proporções proporções geno/geno/geno/geno/fenotípicasfenotípicasfenotípicasfenotípicas na progênieprogênieprogênieprogênie de um cruzamento quando se está estudando genes ligados ?? � Vão desviar do “tradicional” 9:3:3:1 Mendeliano (ou do 1:1:1:1, no caso dos testcrosses). Ou seja, não funcionará mais a 2ª Lei de Mendel , pois a distribuição tenderá a não mais ser independente !!! 5 RESUMINDO: --- prestem atenção!! --- quanto mais próximospróximospróximospróximos estão os genes/locos entre si (= menor a distância entre eles), menosmenosmenosmenos recombinações ocorrem para separá-los, maismaismaismais genótipos do tipo parental ocorrem na progênie, e maiormaiormaiormaior é o desvio em relação às proporções Mendelianasproporções Mendelianasproporções Mendelianasproporções Mendelianas !!! PERGUNTA: sempre que houver ligação gênica haverá desvios na proporção geno/fenotípica da progênie esperada em relação à 2ª Lei ??? NÃO, poispoispoispois dependedependedependedepende dadadada distânciadistânciadistânciadistância !!! � Mesmo ligados, 2 locos podem se comportar como “independentes” se a distância entre eles for tão “grande” que não “prejudique” uma quantidade “normal razoável” de crossing-overs!! Deste modo, a frequência (percentual) de recombinação na progênie de um testcross (AaBb x aabb) será de ~50%; ou seja, a progênie terá ~1/2 de genótipos parentais e ~1/2 de genótipos recombinantes!! Isto quer dizer, em outras palavras, que as proporções geno/fenotípicas ficam iguais àquelas que se encontra na distribuição independente (2ª Lei de Mendel)! Portanto, observe que o máximo de recombinantes possível em uma progênie será sempre aquele definido por Mendel em sua 2ª Lei (isto é ½ ou 50%50%50%50%), mesmo se os genes estiverem ligados em um mesmo cromossomo!! O que vai dizer se haverá ou não desvios em relação às proporções Mendelianas esperadas será a distância física entre os locos!! Funciona assim: [ observem os sinais de ‘>>>>’ (maior) e ‘<<<<’ (menor)!! ] > distância entre locos = > nº cross-overs = nº parentais e recombinantes tende a ser NORMAL � AJUSTE às proporções da 2ª Lei de Mendel – Distribuição Independente (mesmo se estiverem ligados fisicamente num mesmo cromossomo!!) < distância entre locos = < nº cross-overs = < nº recombinantes = > nº parentais = > DESVIOS das proporções geno/fenotípicas da progênie em relação à 2ª Lei de Mendel! Portanto: Quando há distribuição independente ! Quando há ligação gênica próxima! 1/2 (0,5 ou 50% ) 1/4 AaBb 1/4 Aabb 1/4 aaBb 1/4 aabb 1/2 P R AaBb Aabb aaBb aabb P R 6 - Recapitulando: conceitos elementares para entender “LIGAÇÃO GÊNICALIGAÇÃO GÊNICALIGAÇÃO GÊNICALIGAÇÃO GÊNICA”: (i) GENES LIGADOS: genes não-alélicos (locos diferentes) pertencentes ao mesmo cromossomo. Cada cromossomo, com todos os seus genes, forma um ‘grupo de ligação’. (ii) GAMETAS PARENTAIS: gametas constituídos pela mesma configuração de alelos dos locos da célula 2n original, ANTES da meiose (gametogênese). Corresponde às cromátides- irmãs que NÃO sofreram crossing-over (recombinação!). (iii) GAMETAS RECOMBINANTES: gametas que resultaram de crossing-over na prófase I. (iv) MAPA DE LIGAÇÃO: "esquema" do genoma de uma espécie, onde aparece . a posição dos locos (para os genes conhecidos, obviamente) em relação às extremidades do cromossomo . a ordem dos mesmos . e a distância entre eles... (Veremos isso em detalhes adiante...) ... Agora, -- Você já consegue perceber que, para se detectar (ou “suspeitar”) da ocorrência de ligação gênica deve-se utilizar sempre o testcross para essas análises com um indivíduo parental heterozigotoheterozigotoheterozigotoheterozigoto para os 2 locos, pois, no caso de cruzamentos didididi----híbridoshíbridoshíbridoshíbridos, as proporções esperadas para o caso de distribuição independente serão 1/4 : 1/4 : 1/4 : 1/4 e, assim, qualquer DESVIO disso pelos fenótipos parentais (que aumentam) e pelos recombinantes (que diminuem) será indício de ligação gênica. (Volte e relembre o início deste Texto de Apoio!...) Portanto, se houver uma maneira de se detectar “a quantidade de crossing-overs” (� que forma gametas recombinantes!) entre os genes (locos) sob estudo, isto ajudará (i) a saber se os genes estão ligados de maneira próxima, e (ii) a que distância estão um do outro! Uma forma de realizar isso é contar o número de genótipos recombinantes identificados na progênie e relacionar com o TOTAL de indivíduos da progênie; ou seja, verificar simplesmente a frequência (ou percentual) em que os recombinantes ocorrem. -- Então: como se calcula essa FREQÜÊNCIA de RECOMBINAÇÃO?? Obviamente que é necessário planejar e realizar cruzamento(s) de modo a permitir avaliar a(s) progênie(s) para contar os diferentes genótipos (identificados ou reconhecidos pelos respectivos fenótipos). Deve-se utilizar sempre o testcross para essas análises com um parental heterozigoto, pois as proporções serão 1/4 : 1/4 : 1/4 : 1/4. FREQ. RECOMB. = nº observadoobservadoobservadoobservado recombinantes / totaltotaltotaltotal indivíduos da progênie. Como se pode perceber, o valor de frequência de recombinação será sempre menormenormenormenor ou igualigualigualigual a 0,5 porque o nº de recombinantes numa progênie de um testcross dihíbrido com um heterozigoto NUNCA ULTRAPASSARÁ o nº de parentais! (Se quiser, o valor pode ser apresentado na forma de porcentagem (%), multiplicando-se por 100...) 7 Mas ATENÇÃO: NUNCA usar porcentagem diretamente para realizar os cálculos !! Sempre usar decimais ou frações... ☺ E qual é a importância disso afinal ?? ...Esta foi a base para o desenvolvimento dos famosos MAPASMAPASMAPASMAPAS GENÉTICOSGENÉTICOSGENÉTICOSGENÉTICOS !!! Vejamos: Em 1913, ALFRED STURTEVANT propôs uma idéia simples, mas muito eficiente para gerar os primeiros mapas genéticos para as espécies: “usar análise de testcross para quantificar (“medir”) a distância entre genes (locos) !! Desta forma, os mapas genéticos puderam ser construídos porque, com esse método, foi possível ordenar e posicionar os diversos genes nos diversos “grupos de ligação” (cromossomos!). Veja exemplos dos primeiros mapas genéticos feitos no século passado, usando este princípio com caracteres morfológicos e qualitativos (= aqueles em que as proporções mendelianas acontecem, independentemente das variações ambientais! Ou seja, o que vimos até aqui!). Observe que posso representar os cromossomos “em pé” ou “deitados”! ‘Grupos de Ligação’ (= cromossomos!) 8 E, no caso abaixo, o mapa combina marcadores morfológicos com marcadores moleculares: E como se fez para construir esses mapas??? O raciocínio de STURTEVANT foi o seguinte: o indivíduo com genótipo homozigoto recessivo (o TESTADOR) para os 2 genes ligados sob estudo TAMBÉM tem os mesmos “padrões” de nº de recombinações reduzidos pela distância menor entre eles... Só que isso NÃO FAZ NENHUMA DIFERENÇA na progênie, exatamente porque trata-se de homozigotorecessivo, ou seja, não interessa se houve ou não recombinação – os gametas deste homozigoto serão todos iguais e sem contribuição para os fenótipos da progênie !! Assim, como já vimos acima, por meio da relação (divisão) entre (f/g)enótipos recombinantes e o TOTAL de indivíduos na progênie, teremos a FREQÜÊNCIA DE RECOMBINAÇÃO entre os genes e esta seria uma medida ‘genética’, que nos dá uma estimativa da distância física entre os locos! Ora, se formos realizando diversos testcrosses com todos os genes (caracteres) que pudermos definir em uma espécie, estaremos definindo (i) grupos de ligação, (ii) a ordem relativa desses genes entre si, e (iii) a posição específica de um gene em relação aos demais, pois saberemos a distância entre eles dentro de cada grupo de ligação (cromossomo)! Para realizar este “m“m“m“mapeamento genéticoapeamento genéticoapeamento genéticoapeamento genético””””, então, STURTEVANT propôs o seguinte: que cada 1111% recombinação (ou seja, 1111 indivíduo com genótipo recombinante a cada 100 indivíduos da progênie) corresponde a 1111 “unidade de mapa” (ou “map unit” do inglês = m.u.). STURTEVANT era discípulo (“orientado”) do famoso geneticista da época – THOMAS HUNT MORGAN (recebedor do prêmio Nobel pelos seus trabalhos com o organismo que se tornou o maior sistema modelo para estudos em Genética do século XX – a “mosca das frutas”, da espécie Drosophila melanogaster!). Buscando homeageá-lo, STURTEVANT propôs então que esta “unidade de mapa” descrita acima fosse chamada de centiMorgan, abreviada por cM! 9 Assim, observe a Figura abaixo para entender como a distância entre os locos A e B (calculada pelas freqüências de recombinantes que foram encontrados na progenie) permite o estabelecimento de MAPAS GENÉTICOS: |.............12 cM...............| …===== A ================= B ===... � 12% recombinantes � freq. recomb.= 0,12 2 locos ≠ cromossomo! Simples, não?!... ☺ Observe este outro exemplo para os locos ‘s’, ‘t’ e ‘u’. Os resultados de três cruzamentos-testes didididi----híbridoshíbridoshíbridoshíbridos revelaram os seguintes resultados: freq. recomb. � s x u = 0,160,160,160,16 (ou 16%); s x t = 0,350,350,350,35 (ou 35%); t x u = 0,190,190,190,19 (ou 19%) Observe, então, como ficaria o mapeamento desses genes em relação um ao outro, nesta região do cromossomo: ...___s__________u_____________t___... ou ...___t_____________u ________s___... Observe que a posição será sempre relativa entreentreentreentre os genes; a orientação dos mesmos dentro do cromossomo (veja as opções acima na Figura) depende de se poder incluir os centrômeros nessa análise, o que não era possível nos primeiros mapas produzidos no início do século XX... ... Devido à condição de ligação gênica (ou “linkage”), às vezes, você poderá encontrar nos livros-texto os genótipos dos indivíduos representados de uma maneira diferente, buscando caracterizar essa condição de genes ligados! Por exemplo: � ‘AaBb’ seria um heterozigoto em que os locos A e B não estariam ligados; portanto, seria uma condição de distribuição independente tradicional, daquelas com as quais já estamos acostumados... � Por outro lado, a forma ‘AB/ab’ estaria representando um heterozigoto em que os genes A e B estariam ligados (neste caso, ‘A’ ligado com ‘B’ num dos homólogos, e ‘a’ ligado com ‘b’ no outro)!! � Uma outra maneira ainda de se representar essa ligação (como encontrada em vários livros) seria utilizar o símbolo ‘+’ para representar os alelos dominantes! (ex. ++/ab) Isto se deve ao fato de que esses alelos, na maioria dos casos estudados, correspondem aos “alelos selvagens” (wild type) que são ativos (dominantes); nestes casos, os alelos recessivos correspondem a mutações que inativaram a função do respectivo gene (lembrem-se daquelas questões com os genes representando as enzimas de uma rota metabólica qualquer!!! É o mesmo princípio!!) Mas é importante também saber que a representação dessa ligação entre os locos, outras vezes, pode ser simplesmente ignorada, de tal modo que o genótipo seria representado de forma igual ao primeiro que mostrei acima (sem sabermos, portanto, se distribuem- se independentemente ou se estão ligados)! 35 cM 16 cM 16 cM 19 cM 19 cM 10 Agora uma observação IMPORTANTÍSSIMA: Observe atentamente. Há diferença no que você vê nas duas situações de ligação gênica abaixo ?? situação I situação II SIM !! Ao contrário do que vimos até aqui (que foi somente a “situação I” – volte ao início do texto para confirmar!), é possível que o alelo dominantedominantedominantedominante de um dos locos esteja ligadoligadoligadoligado ao alelo recessivorecessivorecessivorecessivo do outro loco, como mostra a “situação II” !!! Só que isso não alteranão alteranão alteranão altera em NADA todostodostodostodos os princípios que discutimos sobre o assunto! Isso apenas leva ao entendimento de que, quando os genes (locos) estão fisicamente ligadosligadosligadosligados num mesmo par de homólogos, a configuraçãoconfiguraçãoconfiguraçãoconfiguração de seus alelos pode ser daquelas duas maneirasduas maneirasduas maneirasduas maneiras mostradas na Figura anterior !! As duas situações de linkage representadas na Figura anterior recebem nomes específicos para diferenciá-las!! Assim, os genes podem estar ligados em ACOPLAMENTO (ou cis), que corresponde à situação I, OU eles podem estar ligados em REPULSÃO (ou trans), que corresponde à situação II. Estas denominações de ‘acoplamento’ e ‘repulsão’ foram baseadas na “idéia” de que os alelos dominantes (ou recessivos) de cada loco, estando fisicamente ligados, levarão os fenótipos dominantes dos 2 caracteres “acoplados” para um mesmo gameta, SE não houver crossing-over para “separá-los” (que foi o que estudamos até aqui! – págs. 4 e 5!). Por outro lado, se o alelo dominante de 1 loco estiver fisicamente ligado ao recessivo do outro loco (e vice-versa), então os fenótipos dominantes estarão sempre “separados” (em“repulsão” um com o outro!) nos gametas, a menos que haja crossing-over para “recombiná-los” e colocá-los juntos num mesmo gameta!! Observe esta figura (neste desenho, os cromossomos estão apenas “deitados” na horizontal! Só isso!): __A_______B__ __A_______b__ __a_______b__ __a_______B__ Representações possíveis para descrever os genótipos: AaBb, ou AB/ab, ou ++/ab AaBb, ou Ab/aB, +b/a+ Agora, a “pergunta que não quer calar”: Se não soubermos NADA antecipadamente sobre a configuração de alelos dos locos acima (ou seja, não podemos usar nenhuma das representação alternativas acima!), como seria possível saber a configuração dos alelos (se em acoplamento ou repulsão) somente pela análise de análise de análise de análise de progênieprogênieprogênieprogênie de um testcross ??? A a B b A a b B 11 SIMPLES!!! ☺ ...Pela observação das classes genotípicas mais numerosas (parentais) em relação às menos numerosas (recombinantes) !! Lembre-se: o máximo de recombinação possível é ½ (50%), portanto, se a proporção da progênie não for 1:1:1:1, então 2222 classes genotípicas (as parentais) serão SEMPRE mais numerosas que as outras duas (as recombinantes) !!!!!!!!!!!!!! Ex: Considere 2 cruzamentos-teste com heterozigoto, em que o total das progênies foram 400 indivíduos em cada uma. Os resultados para cada classe feno/genotípica são estes. Progênie 1 Progênie 2 > 127 AaBb P 79 AaBb R 78 aaBb R acoplamento ! > 131 aaBb P 72 Aabb R > 119 Aabb P repulsão ! > 123 aabb P 71 aabb R (observem os alelos com as letras verdes em cada loco na progênie! Na esquerda, o A está junto com o B, e o a com o b (por isso, “acoplamento” ou “cis”); já na direita, o a está junto com o B, e o A com o b (por isso, “repulsão”ou “trans”). ANÁLISE DE QUIANÁLISE DE QUIANÁLISE DE QUIANÁLISE DE QUI----QUADRADOQUADRADOQUADRADOQUADRADO Neste ponto, devemos refletir: em Genética (bem como em experimentação biológica no geral!), SEMPRE encontraremos variações nos números/proporções/valores “esperados” como resultados de algum teste/observação/experimento – são variações naturais, geradas pelo simples acaso! Por causa dessas variações, o próprio Mendel teve que “arredondar” (aproximar) os valores REAIS obtidos nos famosos cruzamentos que fez, para que fosse possível estabelecer as chamadas “proporções mendelianas” de herança... Portanto, depois de entendida essa questão de locos ligados e de modificação nas freqüências de genótipos recombinantes e parentais na progênie, surge uma pergunta MUITO importante: Como podemos saber se as variações (DESVIOS) que encontramos na progênie de qualquer cruzamento são simplesmente devidas ao ACASO, OU se está, de fato, “acontecendo alguma coisa” que está levando a essas variações ??? 12 Para responder exatamente a esse tipo de pergunta em experimentação é que existem as ANÁLISES ESTATÍSTICAS!!! E, especificamente no nosso caso de linkage, a análise mais utilizada e eficiente é a chamada “ANÁLISE DE QUI-QUADRADO” (o “qui-quadrado” é um parâmetro representado pela letra grega “qui” com expoente ‘2’, ou seja, χχχχ2). Esta é uma análise estatística robusta, não-paramétrica, que possibilita o trabalho de observação com dados de contagem (nº de indivíduos na progênie) e com categorias (classes feno/genotípicas). Mas também serve para ser usada em qualquer outro contexto, além da Genética, em que se quer comparar dados reais obtidos para certas categorias em relação a uma hipótese teórica estabelecida a priori (antes!) dos testes. Permite, portanto, verificar estatisticamente SE qualquer DESVIO de proporções OBTIDAS (observadas) na progênie de um cruzamento, em relação às proporções ESPERADAS (definidas por uma teoria = hipótese inicial ‘Ho’ a ser testada) são devidos ao acaso (variações apenas aleatórias em relação às proporções esperadas pela teoria), OU se são, de fato, devidas a algum MOTIVO REALMOTIVO REALMOTIVO REALMOTIVO REAL, atuando no contexto do experimento ou da observação. Neste nosso caso em Genética, o "motivo real" atuando seria a existência de ligação gênica, que explicaria um desvio não-casual das diversas categorias (classes fenotípicas) da progênie em relação às proporções mendelianas (esperadas pela teoria)!! Repetindo o que foi dito anteriormente, os cruzamentos mais favoráveis para serem utilizados com o intuito de se verificar se 2 caracteres (1 por loco) estão ligados ou não (cruzamentos di-híbrido, portanto) são os testcrosses com um parental heterozigoto! Isto é assim simplesmente por causa da maior facilidade de se testar desvios em relação a uma proporção esperada de 4 classes de fenótipos/genótipos, com mesmas proporções de ¼ para cada um deles na progênie. Ou seja, se numa progênie qualquer de um testcross desse tipo obtivermos um total de 400 indivíduos, esperaremos que as 4 classes feno/genotípicas (isto é, AAAAaBBBBb , aaaaabbbbb , AAAAabbbbb , aaaaaBBBBb – veja pág. 2 acima) tenha 100 indivíduos cada uma! Vamos então entender o .raciocínio fundamental deste teste: Os testes estatísticos, no geral, baseiam-se essencialmente numa análise de probabilidades! Ou seja, deseja-se investigar qual é a probabilidade de que os desvios encontrados (daquilo que se está testando em relação ao que se esperaria por alguma teoria) estejam ocorrendo por simples acaso (aquelas variações naturais de qualquer experimentação que comentamos acima). Estes desvios, são simplesmente a diferença (para mais ou para menos) do valor encontrado (OBSERVADO) em relação ao valor ESPERADO... Portanto, fáceis de expressar matematicamente! ☺ Além disso, a idéia é de que se a probabilidade de acaso for alta, é porque é acaso mesmo!!! Então, no caso do teste de qui-quadrado (χχχχ2), deseja-se saber se é “alta” ou “baixa” a probabilidade (P) de que os desvios (diferença!) dos valores “OBSERVADOS” em relação aos “ESPERADOS” tenham ocorrido por acaso. Se essa probabilidade P for “alta”, significa aceitar que os desvios foram casuais mesmo, não havendo nada de “diferente” no sistema... Agora, se essa P for “baixa” (normalmente é considerada baixa quando for menor do que 5%menor do que 5%menor do que 5%menor do que 5%), isso indica fortemente que “há um motivo realmotivo realmotivo realmotivo real que está causando esse desvio”, porque é “baixa” a probabilidade de ser por acaso!! E o parâmetro estatístico que “mede” esse desvio é exatamente o χχχχ2. 13 Agora, como se “converte” os valores calculados de χχχχ2 em valores de P para saber se esta probabilidade é afinal baixa ou alta ?? Isto é feito analisando-se o que se chama de “Tabela de Distribuição de χχχχ2” (veja ao final). Nesta, os valores de χχχχ2 são todos aqueles números do corpo da Tabela. Os valores de P aparecem na 1ª linha (superior, horizontal) como uma fração de “1”, ou seja, um valor de P de “0,30” na Tabela corresponde a uma probabilidade de 30% de que o desvio encontrado seja casual. Por fim, na 1ª coluna à esquerda (vertical), aparecem os valores de graus de liberdade (GL – pode ser legal rever Estatística para entender isso – a internet está repleta de aulas e explicações sobre isso!..); este valores são necessários para você verificar em qual linha deve procurar seu valor de χχχχ2 para, então, verificar o P correspondente na linha superior (ver a seguir). Vamos ao nosso caso: analisar os resultados de um testcross di-híbrido (2 locos) envolvendo um parental heterozigoto, para verificar como esses locos distribuem-se nos gametas. A hipótese inicial a ser testada (Ho) é de que esteja ocorrendo distribuição independente (2ª Lei de Mendel), com proporção esperada de 1111 : 1111 : 1111 : 1111, e com GL (graus de liberdade) = 3 (porque são 4 classes fenotípicas = 2 parentais e 2 recombinantes, menos 1). Neste contexto: � valores de χχχχ2 baixos (desvios pequenos!) corresponderão a valores de P (na linha superior) mais altos, indicando que Ho pode ser ACEITAACEITAACEITAACEITA, ou seja, está ocorrendo distribuição independente (2ª Lei), sendo que os desvios medidos pelo χχχχ2 ocorreram por acaso; � contrariamente, valores de χχχχ2 altos (desvios grandes!) corresponderão a valores de P mais baixos, indicando que Ho deve ser REJEITADAREJEITADAREJEITADAREJEITADA, ou seja, NÃO está ocorrendo distribuição independente (2ª Lei) e os desvios medidos pelo χχχχ2 NÃO ocorreram por acaso: eles ocorreram por um “motivo real”: os 2 locos devem estar ligados!. Por convenção, definiu-se que somente probabilidades P <<<< 0,05 na Tabela (o que corresponde a valores bastante elevados de χχχχ2) indicariam que os desvios não teriam ocorrido por acaso. Assim sendo, valores de χχχχ2 à esquerda da coluna de P = 0,05 (para o GL correspondente) são considerados baixos para se rejeitar a Ho, enquanto que valores de χχχχ2 à direita da coluna de P = 0,05 são considerados altos e, portanto, rejeita-se Ho. Para exercitar e compreender, vamos então analisar a seguinte situação: Dois caracteres em milho – coloração da semente e posição do embrião – vêm sendo analisados pelos pesquisadores e há uma suspeita de que esteja ocorrendo alguma interferência entre esses locos, porém não se sabe de que natureza seria essa interferência. Foi estabelecida a realização de um cruzamento-teste envolvendo um indivíduo heterozigoto (com semente amarela / embrião central) e o testador (homozigoto recessivo) com semente branca / embrião basal. Os resultados do cruzamento foram 235 sementes amarelas / embrião central; 175 sementes amarelas / embrião basal; 181 sementes brancas / embrião central; 227 sementes brancas / embrião basal. Teste a hipótese de distribuição independente pela análise de qui- quadradoe apresente o resultado completo. 14 Solução: Primeiro, precisamos saber os genótipos de cada fenótipo definidos com base no testador (ver o texto acima); portanto, os alelos para cor da semente são A = amarela e a = branca, e os para posição do embrião são C = central e c = basal. Em seguida, precisamos do total de indivíduos da progênie para estabelecer os valores esperados para cada classe feno/genotípica. Então: 235 (AaCc) + 175 (Aacc) + 181 (aaCc) + 227 (aacc) = 818 no total (em cada genótipo, em cada loco, em negrito aparecem os alelos que vieram dos gametas do parental heterozigoto, enquanto em azul aparecem os alelos vindos do testador). Como a Ho é distribuição independente, e isto é um testcross (proporção esperada 1:1:1:1), então o nº de indivíduos para cada classe fenotípica deve ser o mesmo, isto é, 818 / 4 = 204,5 (para cada classe/fenótipo). Com isso, se pode fazer o cálculo do χχχχ2 . A fórmula geral para o cálculo é a seguinte: χχχχ 2 = Σ (Obt – Esp) 2 / Esp Só que fazer este cálculo fica muito mais fácil na forma de uma “Tabelinha”. Veja como fica: Obt Esp Obt – Esp (O – E)2 (O – E)2/E AaCc 235 204,5 30,5 930,25 4,549 Aacc 175 204,5 -29,5 870,25 4,255 aaCc 181 204,5 -23,5 552,25 2,700 aacc 227 204,5 22,5 506,25 2,475 Σ ==> χχχχ2 = 13,979 Assim, com o resultado do qui-quadrado (χχχχ2) em mãos, e considerando 3 graus de liberdade (4 classes – 1 = 3 = GL), busca-se o valor da probabilidade P para saber se os desvios observados em relação ao esperado pela Ho foram por acaso! Observando na Tabela de Distribuição de χχχχ2 (veja a seguir), vemos que, na linha de GL = 3, o valor 13,979 fica entre os valores 11,35 e 16,27! Portanto, o valor de P fica entre 0,01 e 0,001. Isto quer dizer que a probabilidade dos desvios serem por acaso é MUITO baixa (P << 0,05), portanto, rejeita-se Ho de distribuição independente! Isso quer dizer que deve estar “acontecendo alguma coisa de fato” para os desvios nas proporções da progênie estarem ocorrendo, já que se rejeitou a hipótese de que esses desvios (diferenças) estivessem ocorrendo “por acaso”. Pelos dados, então, sugere-se que está ocorrendo ligação gênica, sendo AaCc (235) e aacc (227) as classes fe/genotípicas parentais (mais numerosas!), indicando, portanto, que os genes estão ligados em acoplamento!! * * * * * 15 Tabela para teste de qui-quadrado - χ 2 GL Probabilidades 0,95 0,90 0,70 0,50 0,30 0,20 0,10 0,05 0,01 0,001 1 0,004 0,016 0,15 0,46 1,07 1,64 2,71 3,84 6,64 10,83 2 0,10 0,21 0,71 1,39 2,41 3,22 4,61 5,99 9,21 13,82 3 0,35 0,58 1,42 2,37 3,67 4,64 6,25 7,82 11,35 16,27 Aceita Rejeita 16 LIGAÇÃO GÊNICA – vídeo-aulas Dorival aulas I, II, III https://www.youtube.com/watch?v=0DzBq2T2mC0 7:48 min https://www.youtube.com/watch?v=0fY5qAFMcsc 9:05 min https://www.youtube.com/watch?v=1P4cGRV5Z0Y 4:59 min (muito didático!) Kinapse https://www.youtube.com/watch?v=rCTwdWVkojI 10:15 min (uma outra forma de didática que pode server a quem não tenha gostado dos vídeos acima. Em ambos os casos, trata-se dos conceitos mais elementares, sem aprofundar em mapeamento e o processamento em si das frequências de recombinação...) Loucos por saber https://www.youtube.com/watch?v=CJ2ivFQfkhs 9:35 min (Apresenta teoria de MAPEAMENTO até 4:42 min, e exercício depois, com explicação, trabalhando um mapeamento simples.) Hélio Apóstolo https://www.youtube.com/watch?v=Bv_WfNRPFGw 31:19 min (Longa, mas interessante! Questões históricas e aplicadas à realidade são apresentadas... Ótima explicação a partir de 12:36 min até 27:11 min – recomendo ver ESTA PARTE, pois explica como ligação se desvia do esperado, e sobre configuração “cis” e “trans”!) Fábio Reccanello https://www.youtube.com/watch?v=c0JJPIjnh8o 43:29 min (Aula completa de ligação gênica – é uma opção ver só esta!! Inclusive, começa revendo as “2 leis da genética” (Mendel) e introduz uma “terceira lei”, relacionada à ligação gênica e ao Morgan! Eu diria que abrange quase tudo que as demais acima abordam, com exercícios/perguntas discutidas ao longo... É bastante didático também!)
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