RADIOBIOLOGIA E FOTOBIOLOGIA CAP VII - 2012 - Alvaro Leit_o

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CAPÍTULO VII 
 
MECANISMOS CELULARES DE REPARAÇÃO 
 
A PRESERVAÇÃO DA INFORMAÇÃO GENÉTICA 
 
 O papel biológico desempenhado pelas moléculas de DNA exige que elas possuam duas propriedades 
fundamentais: autorreplicação e preservação da informação genética. 
 Para que o conteúdo informacional do DNA seja preservado e corretamente transmitido, de geração em 
geração, é indispensável que haja fidelidade na replicação semiconservativa e que existam mecanismos capazes 
de reparar modificações estruturais produzidas no material genético por agentes físicos ou químicos do meio 
ambiente. 
 Erros na replicação semiconservativa podem ocorrer espontaneamente, mas, ao final da replicação, são 
bastante raros (1 em 109-1011 bases incorporadas) dada a existência de mecanismos capazes de impedí-los ou 
corrigí-los. Durante a formação das novas cadeias polinucleotídicas, além das diferenças de afinidade das bases 
nitrogenadas [formação preferencial de pares entre adenina e timina (A:T) ou entre citosina e guanina (C:G)] 
(Figura VII-1), a atuação seletiva da DNA polimerase e sua capacidade exonucleolítica (“editorial”) que, 
agindo no sentido 3’→5’, elimina nucleotídeos incorretamente inseridos, evita grande parte dos erros de 
emparelhamento. Em E. coli, a DNA polimerase III (Pol III), responsável pela replicação semiconservativa é 
uma enzima constituída de 10 proteínas (subunidades) diferentes e cada célula contém de 10 a 20 moléculas, 
que polimerizam de 500 a 1.000 nucleotídeos por segundo. Esta polimerase erra 1 em 104-105 bases 
incorporadas. A atividade de “revisão editorial” (exonuclease 3'→5') encontra-se na subunidade epsilon (ε), 
codificada pelo gene dnaQ (mutD) (Figura VII-2) e após sua ação (Figura VII-3) o número de bases erradas 
passa para cerca de 1 em 107 bases incorporadas. 
 
 
 
 
 
(a) Emparelhamento correto
(b) Emparelhamento incorreto
1 em 104 bases
Figura VII-1 – Emparelhamento correto e incorreto das bases nitrogenadas do DNA
 
VII-2
 
Figura VII-2 - Estruturas da DNA polimerase durante a polimerização e da editoração
P = Polimerização; E = Editoração (exonucleolítica)
E = subunidade εεεε = Exo 3’ → 5’ ( mutD = dnaQ)
POLIMERIZAÇÃO EDITORAÇÃO
Adaptado de:
Fita molde
DNA neossintetizado
 
 
 
Figura VII-3 - Correção de erros de emparelhamento pela subunidade ε da DNA polimerase
Incorporação de
G no lugar de A
A subunidade ε excisa G
através da atividade 
3’→ 5’ exonuclease
A síntese prossegue
com a incorporação 
correta de A
 
Em células humanas a polimerização é mais lenta (em torno de 50 nucleotídeos por segundo) e o 
complexo de replicação é composto pelas DNA polimerases alfa (Polαααα), delta (Polδδδδ) e épsilon (Polεεεε), 
sendo que a atividade de “revisão editorial” encontra-se nas duas últimas. Os erros das DNA polimerases 
humanas são semelhantes aos de E. coli e, considerando o tamanho do genoma humano (cerca de 3x109 
pares de nucleotídeos), um erro em 107 pode gerar milhares de erros de emparelhamento durante a 
duplicação do DNA. 
 
 Além dos erros normais das polimerases outros ocorrem por incorporação de nucleotídeos lesados [8-
oxo-GTP (GO) pode parear com adenina] ou por nucleotídeos normais em oposição a bases lesadas [timina 
pode parear com O6-metilguanina (O6MeG)]. Em sequências repetitivas ocorre deslizamento das polimerases e 
aparecimento de deleções e inserções. 
 Finalmente as células bacterianas assim como as eucarióticas possuem polimerases especializadas nas 
quais a fidelidade de replicação é baixa e, portanto, cometem muitos erros. As representantes destas 
polimerases em E. coli são as DNA polimerases II, IV e V e em eucariotos estão incluídas as polimerases da 
VII-3
família X [polimerases beta (β) e lambda (λ)] e as da família Y [polimerases eta (η), iota (ι) e kappa (κ)]. Estas 
polimerases não têm a “função editorial” e erram muito (1 em 104 para as da família X e 1 em 10 para as da Y). 
 
Correção de erros de emparelhamento em longos fragmentos (Mismatch Repair – MMR) 
 
 Após a replicação, os erros que escaparam da “edição” das DNA polimerases necessitan ser corrigidos 
por meio de enzimas capazes de remover bases nitrogenadas incorretamente incorporadas à cadeia ou de 
degradar segmentos nos quais tenham ocorrido erros, ou ainda, eliminar bases alteradas ou lesadas; para tal, é 
indispensável a distinção entre as hélices neossintetizadas e as preexistentes, o que depende dos diferentes 
graus de metilação existentes entre elas. 
 Em E. coli, na hélice neossintetizada a adenina das milhares de sequências 5’GATC3’ não está 
metilada. Na hélice parental a adenina está metilada na posição N6 (N6MeA) pela DNA-adenina metilase (32 
kDa), produto do gene dam. Quando persistem erros de emparelhamento, após a replicação, algumas enzimas 
entram em ação; as proteínas MutS e MutL reconhecem os erros de emparelhamento e a proteína MutH corta o 
DNA no sitio 5’ de G de uma das sequências 5’GATC3’ não metiladas adjacentes. Posteriormente a DNA 
helicase II, produto do gene uvrD (mutU, recL, uvrE), em conjunto com proteínas que se ligam à hélice simples 
(SSB) abrem o fragmento e as exonucleases digerem o DNA. A PolIII sintetiza de novo, conforme mostrado na 
Figura VII-4. 
 
Figura VII-4 – Correção de erros de emparelhamento em grandes fragmentos (MMR)
E. coli
 
Embora a eficiência do reparo de alguns erros dependa da sequência, em E. coli o único erro para o 
qual a correção é muito difícil é o par C:C, e o par mais facilmente corrigido é o G:T. Além dos erros de 
emparelhamento o sistema também repara deleções ou inserções de até quatro nucleotídeos, originadas pelo 
deslizamento da DNA polimerase, normalmente em sequências repetitivas. 
 A reparação é iniciada pela ligação do homodímero de MutS (95 kDa) ao erro, seguida da ligação de 
MutL (68 kDa), também na forma de homodímero, dependente da hidrólise de ATP. A ligação deste complexo, 
principalmente MutL, leva à ativação de uma endonuclease GATC latente, associada à proteína MutH (25 
kDa), a qual incisa a ligação 5’ da guanina na sequência GATC não metilada. 
 O sítio GATC pode dirigir a correção de um erro distante de até 1 kb, mas o sinal é muito reduzido 
quando a distância ultrapassa 2 kb. 
 A combinação MutSLH parece “sentir” a presença do erro e da não-metilação, acreditando-se que para 
isto se forme uma estrutura alfa (α), que talvez seja a ativadora de MutH. 
 A reação é estritamente exonucleolítica, iniciando-se no corte em GATC e prosseguindo através do erro 
até cerca de 100 bases após. A função exonucleolítica é bidirecional; no sentido 5’→3’ é feita pela 
exonuclease RecJ ou pela exonuclease VII (produto do gene xseA) e no sentido 3’→5’ é feita pela exonuclease 
I (produto do gene sbcB), pela exonuclease VII ou pela exonuclease X. 
 Como essas exonucleases só agem em hélice simples é necessário que a helicase II (produto do gene 
uvrD), seja utilizada para desenrolar o DNA e permitir a entrada das exonucleases. 
VII-4
 A última etapa é o preenchimento da lacuna, especificamente pela PolIII, uma vez que outras 
polimerases não são capazes de substituí-la, sugerindo uma ligação entre o sistema de reparação e o de 
replicação do DNA. A DNA ligase termina o reparo, unindo o DNA neossintetizado ao preexistente. 
 Cepas bacterianas contendo mutações no gene dam que produzam a enzima em quantidades maiores 
que o normal ou não a produzam são hipermutáveis, uma vez que, neste caso, a diferenciação entre as hélices 
pela proteína MutH é dificultada. 
 A correção depende da modificação da adenina na sequência GATC. O DNA sem modificação é 
reparado, mas não especifica a hélice o que pode acarretar mutagênese ou quebras duplas pela ação de MutH. O 
DNA modificado nas duas hélices não é reparado pelo MMR. 
 A incisão por MutH ocorre a 3’ ou 5’ do erro e a quebra simples serve de sinal para dirigir a excisão 
posterior. Assim, uma quebra previamente existente, não necessariamente no GATC, pode contribuir para o 
processo, independente de MutH e GATC,já que o complexo MutSL é suficiente para ativar a excisão. 
 MutSL ativam a ação da DNA helicase II na quebra e há preferência da excisão na direção do erro, 
coordenada também por MutSL. A porção da hélice incisada é destacada pela helicase e hidrolisada pelas 
exonucleases. 
 O complexo γ da DNA polimerase III, que funciona como um carreador coloca o “β-clamp” na hélice. 
O β-clamp funciona como um fator de processividade da DNA polimerase III, mas também interage fisicamente 
com MutS. O mesmo ocorre com o homólogo eucariotico do β-clamp, o PCNA (Proliferating Cell Nuclear 
Antigen) e o fator de replicação C (RFC- homólogo do comprexo γ), que têm importantes papéis na regulação 
da excisão no MMR humano. 
 A inativação do MMR eleva a mutagênese espontânea entre 50 e 1000 vezes além de permitir a 
recombinação ilegitima entre sequências quase homólogas. 
 Os mutantes deficientes em Dam também são hipersensíveis à morte pelo agente alquilante N-metil-N’-
nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG). Entretanto, os mutantes duplos dam mutL e dam mutS não são mais 
sensíveis que a cepa selvagem, o que implica MutS e MutL no aumento de morte associada à deficiência de 
metilação. Por outro lado, a mutagênese é semelhante nas cepas selvagens e nos mutantes dam e dam mutL, 
mostrando a separação entre efeitos letais e mutagênicos. Estas observações conduziram à sugestão de que as 
lesões O6MeG produzidas por MNNG podem provocar a resposta do reparo por erros de emparelhamento, 
devido à formação dos pares O6MeG:T e O6MeG:C. 
 Como o sistema só repara erros na hélice filha, ele não repara a base metilada na hélice mãe (lesão), já 
que, neste caso, seria um reparo abortivo que poderia resultar em letalidade, devido à síntese inútil do DNA. 
 
Em células humanas, diversos genes codificam para proteínas semelhantes à MutS e MutL e a 
sua não funcionalidade está relacionada ao aparecimento de alguns cânceres esporádicos e a 
praticamente 100% dos cânceres de cólon hereditários HNPCC (Hereditary Non Polyposis Colorectal 
Cancer) (Figuras VII-5 e VII-6). 
 
Câncer de Cólon
DEFICIÊNCIA EM MMR
HNPCC – SINDROME DE LYNCH
Figura VII-5 - Exemplo da câncer de cólon
 
VII-5
 
HNPCC
Figura VII-6 – Exemplos de câncer de cólon
 
Aparentemente, em células humanas a correção de erros de emparelhamento funciona de 
maneira semelhante ao descrito para E. coli. Em extratos de células humanas já foi verificado que a 
correção é realizada de maneira similar e, aparentemente, também ocorre a excisão bidirecional. 
 Os principais alvos do MMR humano são erros de emparelhamento, tais como: G:T, G:G, A:C e 
C:C, entretanto, as proteínas do MMR também se ligam a lesões, tais como: O6MeG, ligada a C ou T, 
ligações cruzadas GpG de cisplatina, fotoprodutos da radiação UVC, etc. 
Em células humanas foram identificados genes que participam na correção dos erros de 
emparelhamento: MSH2 (MSH = MutS Homolog), MSH3 e MSH6 que codificam proteínas homólogas à 
MutS bacteriana e MLH1(MLH = MutL Homolog), MLH3, e PMS2 (PMS=Post-Meiotic Segregation), que 
especificam diferentes homólogos da MutL bacteriana. 
 As proteínas MSH2 e MSH6 [GTBP (G:T Binding Protein) ou p160] formam um heterodímero 
que é ativo na correção de erros de emparelhamento e foi designado MutSαααα. MSH2 também forma 
complexo com MSH3 gerando MutSββββ. Dependendo do par, os heterodímeros reconhecem diferentes 
substratos. MutSαααα reconhece erros de emparelhamento de bases e pequenas deleções/inserções enquanto 
MutSββββ somente reconhece deleções/inserções preferencialmente grandes e, para uma ligação eficiente de 
MutSαααα ao erro há necessidade de fosforilação. 
A proteína MLH1 também forma heterodímeros com PMS2, PMS1 e MLH3 para formar 
MutLαααα, MutLββββ e MutLγ. Enquanto MutLαααα contribui com MutSαααα/ββββ para o MMR, MutLγ parece 
participar no reparo de inserções/deleções e processos associados com a recombinação meiótica. A 
função de MutLββββ ainda não está esclarecida (Figura VII-7). 
 Em células humanas o reconhecimento dos erros depende de MutSαααα e MutLαααα e a especificidade 
da correção é similar à de bactérias. Aparentemente PCNA, conduzido por RFC, liga-se a MutSαααα e 
MutSββββ e conduz o complexo para o erro. Quando o erro é encontrado PCNA libera-se do complexo. 
Algumas evidências indicam que MutSαααα é direcionada à forquilha de replicação para se ligar a PCNA 
localizada no DNA replicado e então transferida de PCNA para o DNA após encontrar o erro. O sistema 
corrige tanto troca de bases como pequenas deleções e inserções de até quatro nucleotídeos. A reação é 
dependente de ATP e é acompanhada por síntese de reparo partindo da incisão e atravessando o erro 
(Figura VII-8). 
 Uma simples incisão em até 1 kb de distância do erro pode dirigir o reparo, entretanto, a 
eficiência vai diminuindo com a distância entre 100 e 1000 bases e independe do corte em 3’ou em 5’. 
 Assim como em E. coli, a excisão parece ser bidirecional e as lacunas geradas começam na incisão 
e vão até 90 a 170 nucleotídeos após o erro. Como a excisão é igual para erros de emparelhamento ou 
inserção de 2 nucleotídeos acredita-se que o mecanismo seja o mesmo. 
 A sinalização para distinguir a hélice filha não está clara em mamíferos. Verificou-se que não é 
metilação em sequências específicas como em E. coli. O sinal parece ser a permanência de proteínas 
associadas à hélice mãe durante a replicação ou a presença de quebras simples na hélice filha que 
VII-6
ocorrem durante a replicação ou ainda o PCNA que ao parar na forquilha funcionaria como um sinal de 
hélice. 
 
Figura VII-7 – MMR em humanos
 
 
ERRO
hMUTSα ENCONTRA O ERRO
ENCONTRA A POLIMERASE
E PÁRA A SÍNTESE
EXO I DEGRADA O DNA
POLIMERIZAÇÃO
Figura VII-8 – Esquema da correção de erros de emparelhamento (MMR) em humanos
 
 A exonuclease I humana é, possivelmente, a responsável pela digestão (5’→→→→ 3’) da fita contendo o 
erro. Não se conhece a exonuclease responsável pela digestão da fita na direção 3’→→→→ 5’, embora haja 
sugestões de que as funções editoriais das Polδδδδ e Polεεεε seriam as responsáveis por esta digestão. Além 
disto, nenhuma helicase foi ainda detectada para este sistema em células humanas. Aparentemente a 
EXO1 é a única diretamente implicada no MMR, sendo também a única que interage com MutSα e 
MutLα de eucariotos. 
 A quantidade de DNA degradado pelo complexo MutSα-EXO1 é controlada pela proteína de 
replicação A (RPA), que se liga e protege o DNA em hélica simples que é gerado pela exonuclease. Isto 
acarreta a hidrólise de aproximadamente 250 nucleotídeos por vez, o que resulta em muitos ciclos de 
degradação até que não haja mais erros presentes. 
 Recentemente foi detectado que MutLα possui uma atividade exonuclease latente localizada na 
subunidade PMS2 e que é ativada por MutSα, PCNA e RFC dependendo de ATP. Esta atividade 
introduz quebras simples na hélice descontínua, independente de onde se encontre a descontinuidade. 
VII-7
Portanto, MutLα consegue gerar pontos para a hidrólise 5’→→→→ 3’, mesmo que a descontinuidade esteja a 
3’ do erro. 
Após a excisão nucleolítica do erro a síntese de reparação é feita pela DNA polimerase δδδδ junto 
com PCNA. A etapa final é a ligação pela DNA ligase I. 
O tratamento de células com agentes alquilantes tais como MNNG conduz à translocação de 
MSH2 e MSH6 para o núcleo, conduzindo ao aumento da atividade de ligação de MutSαααα aos erros de 
emparelhamento, entretanto, ainda não se mostrou inequivocamente a indução do MMR, tanto em 
bactérias como em eucariotos. 
A primeira evidência da existência deste mecanismo em células humanas veio de estudos com 
uma cultura celular hipermutável, que era deficiente na correção dos erros. Esta cultura foi isolada in 
vitro pela sua capacidade de sobreviver em presença de lesões no DNA, pela exposição a agentes 
alquilantes, que normalmente matariam as células. A partir destes experimentos a seleção, in vitro, para 
resistência a MNNG ou metil nitroso uréia (MNU) conduziuà identificação de diversas linhagens 
celulares de mamíferos tolerantes a metilação. 
 Tanto em bactérias como em células humanas a resistência adquirida contra o efeito letal de 
agentes metilantes, a qual não pode ser atribuída ao aumento do reparo das lesões, é definida como 
tolerância a metilação. 
 A linhagem melhor caracterizada é a MT1 (MT = Methylation Tolerance), derivada de células 
humanas linfoblastóides TK6, após uma única etapa de seleção para resistência a MNNG. Esta 
linhagem, embora seja centenas de vezes mais resistente a MNNG que a parental, em alguns casos é mais 
sensível à mutagênese do MNNG. Portanto MT1 tolera adutos citotóxicos. 
Células MT1 também exibem um defeito de pontos de checagem (PC) do ciclo celular após 
tratamento com MNNG e são hipermutáveis em ausência de MNNG. A mutagênese espontânea é 
elevada 60 vezes nas células MT1, sendo em sua maior parte do tipo transversões, transições A→G e 
inserções ou deleções de um nucleotídeo. 
Baseado nos fenótipos de MT1 e de bactérias deficientes no reparo de erros de emparelhamento 
foi sugerido que os defeitos de reparo podem conferir tolerância a agentes alquilantes em células de 
mamíferos, assim como ocorre em bactérias. 
Células MT1 são deficientes em atividade MutSαααα e têm mutações em ambos os alelos do gene que 
codifica a subunidade MSH6. MT1 exibe um defeito de checagem no estágio G2 do ciclo celular. 
Observações similares foram feitas em células de camundongos com o gene MSH2 nocauteado. 
 
Correção de erros de emparelhamento em pequenos fragmentos (VSP = Very Short Patch) 
 
 Outras sequências metiladas existem no DNA, tais como a (CC(A/T)GG), metilada pela DNA-citosina 
metilase (Dcm), na segunda citosina, na posição C5. Esta metilação em E. coli protege o DNA contra enzimas 
de restrição enquanto em células de mamíferos ela suprime a transcrição, acarretando o bloqueio de alguns 
genes. Em condições de baixa de 5-metil citosina (C5MeC) há um aumento da formação de tumores, sugerindo 
a localização destas sequências possivelmente em promotores de oncogenes. 
 A desaminação da C5MeC acarreta a formação do par T:G. O sistema VSP corrige eficientemente T nos 
erros T:G que ocorrem naquelas sequências. Os sítios de reconhecimento de Dcm são pontos hipermutáveis 
devido à desaminação espontânea da C5MeC do par G: C5MeC, um evento que conduz ao par T:G. 
 O sistema VSP utiliza dois genes de reparação de erros de emparelhamento, mutS e mutL mas não os 
genes mutH e uvrD. Adicionalmente, são necessários os produtos dos genes vsr e polA. O gene vsr está 
localizado antes do dcm e fazendo parte da mesma unidade transcricional. 
 Em heteroduplexes nas quais as sequências GATC estão metiladas, representando DNA replicado, o 
sistema VSP entra em ação (Figura VII-9). quando o DNA está em replicação e a hélice filha não está 
metilada, age o sistema MutSLH. 
 O produto do gene vsr é uma proteína de 18 kDa constituindo uma endonuclease de correção de erros 
hélice-específica. Ela reconhece o par T:G no contexto CT(A/T)GG e NT(A/T)GG e faz incisões do lado 5’da 
timina produzindo terminais 5’PO4 e 3’OH. Aparentemente a PolI (que é requerida para o VSP) remove a 
timina com sua atividade exonucleolítica 5’→3’ e faz a síntese de reparo de pequenos fragmentos (entre 10 e 
20 nucleotídeos) como é sua característica. 
 MutS e MutL provavelmente agem estimulando ou regulando a endonuclease Vsr, já que em células 
contendo plasmídeos multicópia com o gene vsr, MutS e MutL são dispensáveis no reparo VSP. Além disto, a 
proteína MutL interage fisica e funcionalmente in vitro com a Vsr, assim como com MutS. 
 
VII-8
 
ATP
DNA pol I (5’→→→→ 3’ EXONUCLEASE)
5-METIL CITOSINADESAMINAÇÃO DA
DNA CITOSINA METILASE
CTAGG
GGTCC
CH3
GATC
CTAG
CH3
CH3
5’
5’
3’
3’
GATC
CTAG
CH3
CH3
5’
5’
3’
3’
GATC
CTAG
CH3
CH3
T
G
GATC
CTAG
CH3
CH3
MutS
MutS
MutL
MutL
Vsr
GATC
GGTCC CTAG
CH3
CH3 CH3
5’
3’
5’
3’
GATC
CTAG
CH3
CH3
GATC
CTAG
CH3
CCAGG
GGTCC
CH3
CH3 CH3
5’
3’
5’
3’
GATC
CTAG
CH3
CH3
GATC
CTAG
CH3
CCAGG
GGTCC
CH3
CH3 CH3
5’
5’3’
3’GATC
CTAG
CH3
CH3
Figura VII-9 – Esquema do mecanismo de correção de erros de emparelhamento
em pequenos fragmentos (Very Short Patch Repair) em E. coli
 
Uma vez terminado o reparo, a proteína Dcm metila novamente a citosina. Neste caso, o reparo pode 
ser considerado como uma reparação por excisão de nucleotídeos dirigida por MutS e MutL. 
 
Em células humanas, a reparação de G:T para G:C foi demonstrada em extratos nucleares de 
células HeLa (HeLa – Henrietta Lacks – Câncer cervical que a matou em 1951). A análise dos 
intermediários da reação indica que o reparo envolve a troca de um simples nucleotídeo e, a DNA Polββββ, é 
a responsável pelo fechamento da lacuna. 
Atividades enzimáticas capazes de incisar as ligações fosfodiéster imediatamente a 5’e 3’da 
timina errada foram identificadas em extratos de células humanas. 
 Uma vez que a timina é liberada como uma base livre, foi sugerido que uma Timina-DNA 
Glicosilase (TDG) gere um sítio intermediário abásico, que serve de substrato para as incisões. A enzima 
(55 kDa) foi isolada de células HeLa e é uma timina-DNA glicosilase específica para erros, que é capaz de 
remover T do par G:T, sem atividade AP liase ou AP endonuclease associada. Em verdade a enzima 
reconhece o T pareado com G e não com A, uma verdadeira interação com a base oposta ao erro. O par 
G:T é originado da desaminação de C5MeC nas sequências CpG. Esta enzima também pode remover U 
dos pares G:U que podem surgir de desaminações de citosina em regiões ricas em G:C. Neste caso este 
erro poderia ser corrigido pelo sistema de reparação de bases, o que também ocorre quando o uracil 
entra erradamente na molécula de DNA. Após a retirada da timina a TDG permanece no local 
impedindo a ação da AP endonuclease APE1. TDG então é sumolada, o complexo se desfaz e assim o sitio 
AP serve de substrato para a AP-Endonuclease I (APE1). Após a ação de APE1 o processo ocorre como 
um reparo por excisão de bases (ver adiante). No par G:T, também pode atuar a proteína MBD4 (Methyl 
Binding Domain), que compete com a TDG. TDG é degradada por sumo, mas MBD4 permanece, porém 
inativa (Figura VII-10). 
 
Correção de erros por MutY (metil independente) 
 
 O erro G:A ocorre muito frequentemente durante a polimerização, entretanto, na ausência de MutSLH 
o número de mutantes com este erro não é muito elevado, devido à existência de outros sistemas; assim, a 
proteína MutY retira A do par G:A e também participa da reparação da lesão oxidativa 8-oxoguanina (8-oxoG 
= GO), em conjunto com as proteínas MutT e MutM como será visto adiante. 
 Este sistema libera pequenos fragmentos e é independente de MutSLH, hidrólise de ATP ou metilação. 
Os erros G:A são corrigidos para G:C. O reparo requer a função do gene mutY (micA) e da PolI, a qual libera e, 
em seguida, incorpora entre 10 e 20 nucleotídeos. 
 A proteína MutY funciona como uma DNA glicosilase com uma atividade 3’AP liase associada, 
removendo especificamente A dos pares errados G:A e C:A com uma eficiência 20 vezes maior para o par G:A. 
 
VII-9
 
MMR EM
PEQUENOS
FRAGMENTOS
(HUMANOS)
Figura VII-10 – Mecanismo de correção de erros de emparelhamento em pequenos fragmentos
 
Em células humanas, recentemente foi purificada uma enzima, que cliva especificamente erros 
A:G e A:C. A MYH interage com PCNA e é dirigida à forquilha com o erro na hélice neossintetizada, 
evitando que o G ou C seja retirado e cause a mutagênese. Ela faz simultaneamente incisões na primeira 
ligação fosfodiéster 3’ e 5’ do erro no lado com A e não no lado com G, uma ação muito similar à da 
proteína MutY de E. coli. 
 
Erros de emparelhamento e recombinação genética 
 
 Normalmente, a frequência de recombinação genética entre E. coli vs S. typhimurium (recombinação 
homeóloga) é da ordem de 10-6 para um dado caráter (ex., xyl ou met), comparada com a recombinação entre E. 
coli vs E.coli (recombinação homóloga), que é de 10-1. 
 Em mutantes mutSLH a frequência aumenta cerca de 1.000 vezes quando a divergência de nucleotídeos 
é de cerca de 20% (E. coli vs S. typhimurium), sendo os mutantes mutS e mutL os mais eficazes em deixar a 
recombinação ocorrer. 
 A indução do sistema SOS estimula a recombinação homeóloga através da superprodução da proteína 
RecA. Já que a proteína RecA é capaz de deixar mais de 30% de erros de emparelhamento na recombinação, o 
efeito cumulativo de deficiência de correção de erros de emparelhamento e indução do sistema SOS leva a taxa 
de recombinação homeóloga a aproximar-se da homóloga. 
 Trocas entre sequências divergentes em somente 3% são dramaticamente inibidas por MutS, um efeito 
que pode ser significativamente aumentado por MutL. Como estas proteínas não interferem na recombinação 
homóloga o maior efeito é bloquear a migração dos cruzamentos das hélices de DNA durante as trocas 
homeólogas, não deixando a recombinação ocorrer, formando uma verdadeira barreira entre as espécies. 
 
Barreiras genéticas entre bactérias 
 
 Embora a transferência de material durante a conjugação seja altamente eficiente, a frequência de 
recombinação entre E. coli vs S. typhimurium é muito baixa, aproximadamente 105 vezes menor que entre as 
mesmas espécies. 
 Durante a conjugação Hfr x F- (Figura VII-11) o DNA entra na célula receptora como uma hélice 
simples com a fita líder 5’. Na célula F- a fita complementar é sintetizada, gerando a dupla hélice. 
 As pontas da dupla hélice são substrato para a enzima RecBCD, que com sua ação helicase e 
exonuclease digere a dupla hélice até encontrar uma sequência chi (χ) (5’GCTGGTGG3’). A sequência χ 
altera a enzima baixando a afinidade de RecD com o heterodímero RecBC. 
 Com a perda de RecD o complexo RecBC fica deficiente em exonuclease, mas proficiente em helicase, 
produzindo hélices simples de DNA. A proteína RecA forma um polímero na hélice simples e catalisa a 
VII-10
procura por sequências idênticas no DNA em hélice dupla. A troca de hélices mediada por RecA requer um 
mínimo de identidade para processamento. 
 
Ponte de
protoplasma
Figura VII-11 – Conjugação bacteriana
 
 Durante a conjugação interespécies o número de segmentos com o mínimo de identidade é limitado 
pelo grau de divergência entre os DNAs dos conjugantes, diminuindo a velocidade da recombinação mediada 
por RecA. Consequentemente, o complexo entre RecA e DNA em hélice simples permanece mais tempo no 
cruzamento interespécies que no cruzamento intraespécies, resultando na ativação da função coproteásica de 
RecA e desrepressão do regulon SOS. Como resultado aumenta a quantidade das proteínas RecA e RuvAB o 
que estimula a recombinação entre as espécies. Assim, o SOS age como um regulador positivo indutível da 
recombinação interespécies. 
 Entretanto, a indução do sistema SOS não afeta a atividade de correção de erros de emparelhamento em 
grandes fragmentos (MMR), que é um poderoso inibidor da recombinação entre sequências divergentes e, a 
ligação das proteínas MutS e MutL bloqueia a troca de hélices promovida por RecA, reduzindo a frequência de 
recombinação interespécies (Figura VII-12). 
 
 
DNA doador
DNA idêntico
10-1 recombinantes
DNA divergente
Indução do SOS
10-6 recombinantes 10-3 recombinantes
Alta expressão de recA e ruvAB
MutSL+ MutSL
—
χχχχ = (5’GCTGGTGG3’)
RuvABC
Figura VII-12 – Esquema do modelo proposto para a manutenção da barreira genética entre
bactérias (papel das proteínas MutS e MutL)
 
 
VII-11
Reparação de deleções e inserções 
 
As repetições de dinucleotídeos e trinucleotídeos que ocorrem frequentemente no DNA de eucariotos e 
mais raramente em procariotos, representam um problema potencial durante a replicação, provocando 
deslizamento entre as hélices e conduzindo a deleções e inserções. A frequência de deleções e inserções num 
fragmento de dinucleotídeos repetitivos (AC)20 é aumentada cerca de 10 vezes em cepas de E. coli mutL e mutS, 
o que não ocorre em mutantes recA. Este fato correlaciona-se com a detecção de instabilidade em repetições de 
dinucleotídeos em células humanas deficientes no reparo de erros de emparelhamento. 
 Por outro lado, repetições de trinucleotídeos (CTG)180 são mais estáveis nos mutantes mutH, mutL ou 
mutS, sugerindo a participação do sistema MMR na promoção das deleções e inserções. Entretanto, a 
estabilidade das repetições de trinucleotideos (CGG)80 não é afetada pela reparação de erros de 
emparelhamento em E. coli. Em células humanas ainda não foi reportada instabilidade de repetições de 
trinucleotídeos em células mutantes, deficientes na reparação de erros de emparelhamento. 
 A instabilidade de micro-satélites é um biomarcador para a perda de MMR em células tumorais já que 
o MMR é o maior guardião contra a instabilidade de micro-satélites. Estes micro-satélites são replicados 
inacuradamente, levando a frequentes deslizamentos da DNA polimerase e ineficienmte correção. 
 A perda do MMR diminui apoptose, aumenta a sobrevivência celular e resulta em resistência a 
quimioterapia, portanto, a falha de MMR contribui para o crescimento seletivo destas células durante a 
carcinogênese, explicando parcialmente o aumento da suscetibilidade a cânceres tecido específicos associados a 
defeitos em genes MMR. 
A atuação conjugada dos processos acima descritos faz com que a probabilidade de ocorrência e (ou) 
persistência de um erro de emparelhamento seja bastante reduzida, da ordem de grandeza de l0-10, ou seja, de 
um nucleotídeo indevidamente inserido para cada 1010 nucleotídeos. Na polimerização normal os erros são da 
ordem de 10-4; após a “revisão editorial” passam para 10-7 e após a ação das proteínas Mut são da ordem de 10-
10
. Uma base nitrogenada incorporada erroneamente acarreta alteração do conteúdo informacional, 
transmissível às gerações subsequentes, constituindo a mutagênese direta. 
 
 
REPARAÇÃO DE LESÕES (ASPECTOS GERAIS) 
 
 Agentes químicos também podem provocar erros de emparelhamento, causando modificações 
estruturais nas bases nitrogenadas e alterando sua capacidade de formação correta de pares. Isto ocorre, por 
exemplo, após tratamento com certos agentes alquilantes, como MNNG, capaz de inserir, por exemplo, 
grupamentos metil no O6 da guanina, de forma que esta passa a se emparelhar com a timina, e não mais com a 
citosina. 
 Diversos agentes físicos ou químicos do meio ambiente promovem modificações estruturais na 
molécula de DNA, englobadas sob a designação genérica de lesões, cuja persistência representa um obstáculo à 
manutenção dos processos bioquímicos intracelulares. Assim, é fácil entender a importância dos mecanismos 
enzimáticos que atuam restaurando a integridade do genoma ou criando vias que permitam à célula “tolerar” as 
lesões, isto é, manter suas funções mesmo sem a eliminação dos danos provocados no DNA. 
 A não funcionalidade dos mecanismos de reparação conduz à inativação celular após o tratamento com 
o agente físico ou químico ou, eventualmente, à modificação do patrimônio genético, isto é, ao surgimento de 
mutações. Mas nem sempre os mecanismos de reparação atuam corretamente, em alguns casos eles podem 
promover o desaparecimento da lesão, com alteração do conteúdo informacional, o que caracteriza a 
mutagênese indireta. Estas diferentes possibilidades encontram-se esquematicamente representadas na Figura 
VII-13. 
 Os mecanismos de reparação do DNA são, em geral, dependentes dos produtos de diversos genes e se 
caracterizam por possuírem várias etapas, possibilitando vias alternativas, muitas vezes coexistentes e 
competitivas. 
 
REVERSÃO DIRETA DAS LESÕES 
 
 Alguns tipos de lesões podem ser revertidos diretamente, mediante a ação de uma única enzima, que 
desfaz a lesão produzida, restaurando a integridade da molécula de DNA. Como exemplos de mecanismos 
deste tipo de reparação podem ser citados: a ligação direta de quebras simples, a fotorreativação enzimática e a 
remoção de grupamentosalquil. Outro mecanismo enzimático é a remoção de dois fosfatos da lesão 8-oxo –
dGTP, formando 8-oxo-dGMP, que não é incorporada ao DNA (ver adiante). 
VII-12
 
DNA
Tratamentos com agentes físicos ou químicos
DNA LESADO
Reparação CORRETA Reparação AUSENTE ou MAL-SUCEDIDA Reparação INCORRETA
DNA RESTAURADO
(Preservação da informação 
biológica)
PERDA DE ATIVIDADE 
BIOLÓGICA
DNA MUTADO (Evolução)
Figura VII-13 - Atuação dos mecanismos de reparação na eliminação das lesões,
na preservação do conteúdo informacional e na mutagênese
 
Além destes mecanismos enzimáticos, algumas lesões, como os dímeros de pirimidinas podem ser 
revertidos diretamente pela radiação ultravioleta, como é o caso da fotorreversão. 
 
Reparo de quebras simples pela ligação direta 
 
 Na maior parte das vezes a reparação das quebras produzidas no DNA pelas radiações X, γ e outros 
agentes requer o sistema recombinacional. Além disto, os grupamentos deixados normalmente requerem 
processamento para limpeza das pontas antes da polimerização. Em E. coli, e possivelmente em outros 
organismos, algumas das quebras simples produzidas podem ser reparadas diretamente pela ação da DNA 
ligase. A enzima de E. coli requer NAD e Mg2+ como cofatores e, como todas as DNA ligases, requer pontas 
livres no sítio da quebra e a presença de 3’OH e 5’PO4. Assim, uma quebra simples com estas características, 
produzida por agentes lesivos, está sujeita ao reparo pela ligação direta (Figura VII-14). 
 
 
 
P
O
O —O—
O
OH
5’
3’ 5’
3’
+ DNA ligase
+ NAD (E. coli) ou
+ ATP (T4)
P
O
O—
OO5’
3’ 5’
3’
+ AMP + NMN ou PPi
Figura VII-14 - Esquema do modelo proposto para ligação direta de
quebras simples no DNA de E. coli
 
 
VII-13
Fotorreativação 
 
 Entre os fotoprodutos formados pelas radiações UV germicidas (UV-C), os dímeros de pirimidinas 
(CPD = Ciclobutane Pyrimidine Dimer) são os mais frequentes, sendo os maiores responsáveis pela inativação 
celular. 
 A fotorreativação consiste na eliminação de CPDs formados no DNA pelo UV-C, mediante exposição 
das células às radiações UV de comprimentos de onda superiores a 300 nm ou à luz visível. O processo, 
esquematicamente representado na Figura VII-15, é mediado pela enzima de fotorreativação ou fotoliase, que 
tem a propriedade de combinar-se, mesmo em ausência de luz, com DNA contendo dímeros de pirimidinas. 
Quando o complexo enzima-substrato é iluminado, ele se dissocia, sendo liberados o DNA reparado e a enzima, 
esta podendo atuar em outros sítios nos quais ainda existam dímeros. Existem entre 10 e 20 moléculas por 
célula bacteriana e a fotoliase (49 kDa) age rompendo a ligação ciclobutano entre a duas pirimidinas, numa 
velocidade de 5 dímeros /molécula/min e, em E. coli é codificada pelo gene phr. Para estas células os 
comprimentos de onda mais eficientes para promover a fotorreativação situam-se entre 340 e 390 nm. 
 
FiguraVII-15 - Esquema representativo da fotorreativação enzimática
DNA
nativo
DNA
com
dímero
Fotoliase
liga-se ao
dímero
Absorção
de luz
(> 300 nm)
Reparação
e liberação
da enzima
 
 Recentemente foi detectado que a fotoliase de plantas também é capaz de desfazer a ligação do 
fotoproduto 6-4 (6-4PP = 6-4 Pirimidina Pirimidona). 
A fotoliase contém dois cromóforos FADH2 ou FADH- (1,5-dihidroflavina adenina dinucleotídeo) e 
folato MTHF [5,10-metenoetiltetrahidrofolil (poliglutamato)] ou deazaflavina (8-HDH). O folato absorve a 
maioria dos fótons e é chamado de “antena” da fotoliase. O folato, ao receber um fóton, passa ao estado 
tripleto e desativa-se transferindo a energia para o FADH-. O FADH- excitado (singleto) transfere um elétron 
para o dímero. Através de um rearranjo eletrônico há quebra do anel ciclobutano, gerando pirimidina e 
pirimidina ânion o qual transfere o elétron para o FADHo, regenerando o FADH2 (Figura VII-16A). 
A fotorreativação permite não somente o aumento da viabilidade celular após exposição ao UV-C, 
germicida, mas também a redução da mutagênese fotoinduzida. 
 O processo, em E. coli parece ser altamente específico para dímeros de pirimidinas, mas, a fotoliase 
talvez desempenhe outros papéis na célula, entre os quais o favorecimento de outros mecanismos de reparação. 
A ligação da fotoliase aos dímeros torna estas lesões mais acessíveis ao complexo UvrABC, aumentando a 
eficiência da reparação por excisão de nucleotídeos (ver adiante). 
 Foi mostrado que a FADH2 purificada da fotoliase de E. coli catalisa a monomerização de dímeros de 
uracil em poli-U in vitro, mas com uma eficiência 1.000 vezes menor que a de dímeros de uracil do DNA. 
A fotorreativação já foi descrita em diversos sistemas biológicos: micoplasmas, bactérias, leveduras, 
moscas, sapos, diversas plantas e mamíferos não placentários, mas não em mamíferos superiores. 
Em S. cerevisiae o gene PHR1 localiza-se no cromossomo 15 e codifica uma proteína de 66,2 kDa. Este 
gene complementa mutantes phr de E. coli deficientes em fotorreativação e vice versa. Diferentemente de E. 
coli, em células da levedura existem muitas moléculas de fotoliase (entre 250 a 300 em condições 
constitutivas). 
VII-14
Curiosamente o gene PHR1 tem a sua transcrição aumentada quando as células são submetidas à 
radiação UV-C ou a diversos agentes químicos que interagem com o DNA embora a fotoliase não esteja 
envolvida na reparação de lesões químicas. 
A fotorreativação é muito importante em plantas, que estão constantemente expostas ao sol. Em estudos 
com A. thaliana foi verificado que a fotorreativação é altamente eficiente para reparar dímeros e lesões 6-4PP e 
que mutantes uvr2-1 necrosam quando expostos a baixas doses de UV-C. O mesmo fenômeno de sensibilidade 
foi verificado no arroz Norin I (economicamente o mais importante no Japão) cujas sementes são deficientes 
em fotorreativação de dímeros. 
A fotoliase que repara lesões 6-4PP foi inicialmente detectada em D. melanogaster. Posteriormente foi 
também detectada em plantas (A. thaliana) e alguns vertebrados (X. laevis e D. rerio). O mecanismo proposto 
para a ação destas fotoliases é o mesmo utilizado pelas que reparam os dímeros e, além disto, ambas utilizam 
FAD para a transferência dos elétrons para a lesão. A ligação do 6-4PP à fotoliase induz o rearranjo e um anel 
oxetano é formado com o auxilio de dois resíduos His na fotoliase. Uma vez sendo formado o radical na lesão a 
ligação entre as pirimidinas é quebrada e um elétron é transferido de volta para o cofator catalítico (Figura 
VII-16B). 
 
Figura VII-16 – Fotorreativação do dímero (A) e do fotoproduto 6-4 (B)
dímero TT
fotoproduto 6-4 TT intermediário oxetane
 
Alguns estudos sugeriram a existência de proteínas filogeneticamente correlacionadas à fotoliase 
em células de mamíferos e outros mostraram perda de dímeros, dependentemente de luz, em células em 
cultura e em pele humana intacta, entretanto, estes estudos não foram confirmados. 
Muitos estudos falharam na tentativa de mostrar fotorreativação em organismos mais avançados 
que os não-placentários (marsupiais); portanto, acredita-se que ela não exista em seres humanos. 
 Em células humanas foram detectadas proteínas similares às fotoliases, os “criptocromos”, 
porém não relacionadas ao reparo de lesões, mas sim à regulação do ritmo circadiano. Estas proteínas 
pertencem à família dos receptores de luz azul que em plantas seriam responsáveis pela floração em 
resposta à luz (CRY2). 
 Já foram clonados os genes hCRY1 e hCRY2 em humanos e mCRY1 e mCRY2 em camundongos. 
CRY1 e CRY2 são expressos em diversos tecidos tais como: fígado, testículos, cérebro (nunca expostos à 
luz) e retina. O gene mCRY2 é altamente expresso na retina e mCRY1 no núcleo supraquiasmático, que 
agem como fotorreceptores do ritmo circadiano em mamíferos. 
 Aparentemente os genes CRY1 e CRY2 têm papéis antagônicos, uma vez que o período circadiano 
é diminuído em camundongos cry1-/- e aumentado em camundongos cry2-/-. Estes genes revelam uma 
modificação evolucionária muito interessante,uma vez que uma enzima de reparação de DNA parece ter 
se transformado em uma proteína com funções completamente diferentes. 
 Quando uma dose de radiação UV-C suficiente para causar eritema é aplicada em seres humanos 
a aplicação tópica de fotoliase de A. nidulans incorporada a lipossomas acarreta significativa redução do 
número de dímeros de pirimidinas nas células da pele e também evita a imunossupressão induzida por 
UV-B. Foi também demonstrado que a expressão do gene da fotoliase de marsupiais em camundongos 
VII-15
repara eficientemente os dímeros e reduz os efeitos da irradiação na pele (eritema, hiperplasia, 
apoptose). A expressão de fotoliases de dímeros em células XP-A humanas reduz substancialmente a 
mutagênese e aumenta a sobrevivência ao UV-C. 
 Os dímeros são os maiores alvos para eventos mutagênicos e formação de mutações nas vias do 
gene p53 na formação de células epidémicas pré-neoplásicas. Portanto, a eliminação preferencial de 
dímeros dos keratinócitos basais reduz drasticamente a indução de câncer de pele pelo UV. 
 
Fotorreversão 
 
 A reversão de dímeros de pirimidinas pode também ser obtida por outros processos, independentes da 
fotoliase. Ela ocorre, por exemplo, mediante exposição das células, previamente irradiadas com UV germicida, 
a comprimentos de onda situados entre 200 e 300 nm (235nm favorece a fotomonomerização e 280 nm favorece 
a dimerização), uma vez que a união de duas pirimidinas é uma reação reversível e que cada comprimento de 
onda, ainda que com diferentes eficiências, pode promover tanto a dimerização como a monomerização; a 
desdimerização devida unicamente à exposição ao UV-C constitui a fotorreversão direta. 
 Proteínas ricas em triptofano, como a codificada pelo gene 32 do fago T4, e mesmo oligopeptídeos 
ricos neste aminoácido, podem, quando expostos a comprimentos de onda de 334 nm, adquirir a capacidade de 
promover a monomerização de timinas dimerizadas, o que parece ser consequência da transferência de elétrons 
do anel do triptofano para os dímeros; este fenômeno constitui a fotorreversão sensibilizada. 
 
Reversão direta de alquilações 
 
Transferência de grupamentos alquil 
 
 Quando células são tratadas com agentes alquilantes tais como MNU ou MNNG, seu DNA é alquilado 
nas mais diversas posições. Em alguns casos, estas lesões podem ser reparadas diretamente, pela remoção dos 
grupamentos alquil. 
 As metilações que ocorrem no oxigênio exocíclico das bases são diretamente removidas, sendo O6MeG 
a mais abundante (6 a 8% das metilações totais) e O4MeT a de menor importância (< 0,4%). A metilação da 
ligação fosfotriéster é da ordem de 17%. (Na Figura VII-17 estão representados os diferentes sítios de 
metilação com as respectivas ocorrências). 
 
Pareamento C:G no DNA Pareamento T:A no DNA
Fosfato na cadeia fosfodiester
Figura VII-17 - Principais sítios de alquilação no DNA
 
 Em E. coli existem duas enzimas que reparam o DNA por transferência direta do grupamento alquil; as 
proteínas Ada e Ogt (O6-Metilguanina - DNA Metiltransferases) codificadas pelos genes ada e ogt 
respectivamente. 
 A proteína Ada (39 kDa) remove grupamentos metil das posições O6 da guanina, O4 da timina e da 
ligação fosfotriéster enquanto a Ogt só consegue removê-los das posições O6 da guanina e O4 da timina. A 
VII-16
remoção dos grupamentos alquil das bases acarreta a inativação das proteínas (enzima “suicida”), entretanto, no 
caso da remoção do metil da ligação fosfotriéster, a proteína Ada sofre uma mudança conformacional, 
tornando-se um ativador de seu próprio gene, conduzindo à síntese de milhares de moléculas de Ada. 
 A proteína Ogt (19 kDa) é constitutiva, não tendo sido detectada nenhuma ativação por qualquer 
tratamento. 
 Foi mostrado que os mutantes ada e ogt são propensos a acumular mutações espontaneamente, 
mostrando a existência de alquilações espontâneas provenientes provavelmente do cloreto de metila, que é 
abundante na atmosfera, com uma estimativa anual de emissão de 5 x106 toneladas, a maior parte de fontes 
naturais e de fontes endógenas como a S-adenosil metionina e outros doadores intracelulares. 
 Apesar da semelhança quanto à sua atuação, recentemente foi verificado que aparentemente Ada 
prefere O6MeG e Ogt prefere O4MeT. 
Uma vez que as enzimas são capazes de remover diversos grupamentos alquil, há proposta de 
denominá-las O6-alquilguanina-DNA alquiltransferases I e II (O6-AgtI e O6AgtII). 
 A proteína Ada, produto do gene ada remove grupamentos alquil inseridos nas posições O6 da guanina, 
O4 da timina com sua parte C terminal de 19 kDa (C-Ada19) e da ligação fosfotriéster, com sua parte N 
germinal de 20 kDa (N-Ada20) transferindo-os para uma cisteína constituinte da proteína, o que justifica a sua 
inativação durante o processo (Figura VII-18). Uma vez que a metilação da guanina na posição O6 conduz, 
durante a replicação semiconservativa do DNA, a erros de emparelhamento, torna-se fácil entender os efeitos 
mutagênicos deste tipo de lesão e a importância da reparação adaptativa na redução da mutagênese. Em células 
de E. coli não adaptadas existem entre 20 e 60 moléculas desta enzima, cuja concentração pode ser multiplicada 
por 100 ou 200 em consequência do tratamento indutor. 
 
Figura VII-18 – Mecanismo de ação da proteína Ada
metil fosfotriéster
O6 metilguanina
 
 Quando a transferência é feita da O6-metil guanina ou da O4-metil timina o metil é capturado pela 
cisteína 321 do sítio ativo C terminal (Pro-Cys-His-Arg-Val/Ile) e a enzima é inativada, entretanto quando o 
metil é retirado do fosfotriéster ele é capturado pela cisteína 38 (do N terminal) a enzima transforma-se em um 
ativador do seu próprio gene, conduzindo à síntese de milhares de moléculas da proteína Ada. 
 Quando da metilação de cys 38, que é irreversível, Ada transforma-se na ativadora da transcrição dos 
genes da resposta adaptativa, ada-alkB, alkA e aidB (Figura VII-19), uma vez que, neste caso, a mudança 
conformacional de Ada aumenta a capacidade de ligação aos promotores destes genes, facilitando a ligação da 
RNA polimerase. 
 A transformação da proteína Ada conduz à desrepressão de outro gene, o alkA, que codifica a síntese da 
3-metil adenina DNA glicosilase II (AlkA) que remove bases metiladas em diferentes posições (N3 e N7 da 
guanina, O2 da citosina, N3 e N7 da adenina e O2 da timina, entre outras). 
 Na Figura VII-20 está representado esquematicamente o processo da resposta adaptativa para agentes 
alquilantes. 
 
 
VII-17
 
Metilfosfotriester Fosfato
Ativação da 
transcrição
GuaninaO6-metilguanina
Figura VII-19 - Inativação e ativação da proteína Ada em bactérias
 
 
Figura VII-20 – Mecanismo da resposta adaptativa para agentes alquilantes
Não induzido
Baixo nível de reparo
Sinal indutor
Ativação da
transcrição
Indução
Aumento da
reparação
 
Em células não adaptadas a proteína AlkA atua juntamente com a Tag, mas a quantidade desta não se 
altera durante a adaptação; em células adaptadas, a quantidade de AlkA é multiplicada por 20, e esta enzima 
passa a ter um papel importante na eliminação de bases alteradas. 
 A proteína Ada também regula outros genes tais como o alkB e o aidB. 
 O papel da proteína AlkB é o reparo de N1MeA e N3MeC em DNA em hélice simples. Por outro lado, o 
papel da proteína AidB ainda não está bem estabelecido. Aparentemente ela inativa agentes alquilantes antes 
que eles causem as lesões, não participando do reparo das lesões. 
 Após a metilação do N-terminal Ada reconhece as regiões promotoras do regulon ada e recruta a RNA 
polimerase para iniciar a ativação dos genes de resistência a metilação. Assim, Ada é um quimiosensor de 
metilação em E. coli. 
 A atividade O6-AGT em leveduras é expressa em um nível de 150 moléculas por célula na fase 
exponencial de crescimento e indetectável na fase estacionária. Em S. cerevisiae o gene clonado MGT1 é capaz 
de complementar o duplo mutante ada ogt de E. coli. Mutantes deletados em MGT1 são sensíveis à mortee 
mutagênese por tratamento com agentes alquilantes. Adicionalmente mutantes mgt1 têm a mutagênese 
espontânea aumentada, sugerindo a existência de alquilação endógena em S. cerevisiae. O gene MGT1 mapeia 
VII-18
no cromossoma IV e os transcritos não são aumentados por tratamento com agentes alquilantes. Tanto em 
leveduras como em mamíferos a sequência (Pro-Cys-His-Arg-Val/Ile) que contém a Cys 321 é conservada.
 
 
Em células humanas, a O6-Metilguanina-DNA Metiltransferase (O6-MGMT), ainda conhecida 
como Atase, AGT e AGAT, também é uma enzima suicida que repara o DNA transferindo o grupamento 
metil da O6MeG no DNA para um resíduo cisteína (145) da enzima em uma reação irreversível (Figura 
VII-21). 
 
(MGMT)
(145)
Figura VII-21 – Remoção de grupamentos alquil em humanos
ativa
inativa
metiltransferase
O6 metilguanina guanina
 
A transferência do grupamento alquil, inativa e transforma a enzima em alvo para ubiquitinação 
e degradação por proteases. 
Ela repara também O6 etilguanina e O6 butilguanina assim como O4 metiltimina com uma 
eficiência mais baixa. Estas lesões são produzidas por agentes alquilantes (MNNG, MNU, etc., contidos 
em alimentos, cigarros, etc.). Em condições fisiológicas o DNA é metilado por metilantes naturais como a 
S-adenosilmetionina. 
A O6MGMT foi detectada em todas as espécies. A enzima humana é uma proteína monomérica 
de 24 kDa. Ela é semelhante à Ogt bacteriana e também só tem função de metil transferase para O6MeG 
e O4MeT, com uma preferência 10.000 vezes maior para O6MeG. Ela não tem a função de retirar grupos 
alquil das ligações fosfotriéster e também não tem a função regulatória parecida com a proteína Ada de 
bactérias, embora seja induzida por estresse genotóxico. 
 O gene da O6-MGMT humana está localizado no cromossomo 10 e tem 6 exons e mais de 170 kb e 
a proteína tem regiões de extensa homologia com as bacterianas, entretanto, não há muita homologia de 
sequência e o cDNA humano não hibridiza com o DNA genômico de E. coli. 
A proteína humana é uma enzima simples, sem cofator, com uma cisteína ativa na sequência 
contexto PCHRV/I (Pro-Cys-His-Arg-Val/Ile), que é conservada em todas as O6MGMTs. O sítio ativo é 
escondido (latente = críptico) só se tornando acessível após modificação conformacional induzida pelo 
contato com o DNA. 
 Os efeitos citotóxicos, mutagênicos e tumorigênicos da O6MeG são diminuídos pela ação da 
enzima O6-MGMT. Não são conhecidos mutantes humanos para o gene da O6-MGMT, entretanto cerca 
de 20% dos tumores humanos são sensíveis a MNNG e não possuem atividade O6-MGMT detectável 
sendo denominados fenotipicamente Mer- (Methylation repair minus). Similarmente, a transformação de 
células humanas com vírus tumorais causa um fenótipo deficiente em O6-MGMT, denominado Mex- 
(Methylation excision minus). Embora não sejam mutadas no gene O6-MGMT, a introdução do gene 
bacteriano ou humano em células Mer- ou Mex- restaura a resistência a MNNG, o que indica uma 
relação de causa e efeito entre a falta de atividade de O6MTMG e a sensibilidade a agentes alquilantes. 
VII-19
 Após exposição a agentes alquilantes as células humanas podem adquirir resistência à morte e 
lesões cromossômicas, mas não à mutagênese. Este fenótipo é denominado tolerância à metilação e 
envolve uma deficiência no reparo de erros de emparelhamento. 
 Durante a replicação do DNA contendo O6-MeG há alta probabilidade da incorporação de timina 
na frente da base alquilada. Tanto C como T em frente a O6-MeG são reconhecidas como bases erradas e 
serão excisadas pelo sistema MMR, que só age na hélice filha. Portanto, o reparo de O6-MeG é fútil e 
perigoso, pois se o MMR continua a excisão as bases colocadas em frente à base alquilada podem gerar 
quebras no DNA, aumentando a morte celular. 
 A O6-MGMT, logicamente, tem um papel importante na prevenção do câncer. Em um grande 
número de cânceres, a mutação oncogênica resultou de uma transição G:C para A:T, a qual pode ter 
resultado de uma alquilação de G. Em verdade, a superexpressão de O6-MGMT protege camundongos 
transgênicos de cânceres induzidos por agentes alquilantes. Em um caso, a expressão de O6-MGMT 
humana em camundongos transgênicos protegeu-os contra o linfoma de timo, induzido por MNU. Em 
outro caso, a expressão do gene ada de E. coli em camundongos transgênicos protegeu os animais contra 
câncer de fígado induzido por dimetil ou dietilnitrosamina. 
 A ocorrência de tumores cerebrais em ratos jovens tratados com etil nitrosuréia é correlacionada 
com a persistência da O6 alquil guanina no cérebro. Similarmente, o tratamento crônico com MNU 
especificamente resulta em tumores neurais em animais experimentais e é acompanhado por progressiva 
acumulação de O6MeG no cérebro sem a concomitante acumulação em outros tecidos. 
 Os efeitos citotóxicos das lesões alquilantes podem ser usados no tratamento de câncer. 
Clinicamente são usadas nitrosouréias e agentes cloroetilantes tais como carmustina (BCNU), entretanto 
o aumento da produção de O6-MGMT é uma das causas da resistência a estas terapias. Portanto, a 
inibição de O6-MGMT pode aumentar a eficiência dos tratamentos. 
 O meio mais simples para inibir a enzima é alquilar a sua cisteína ativa. Por algum tempo a 
O6MeG como base livre foi o único substrato usado, entretanto, a O6BuG se mostrou mais efetiva que a 
forma metilada. A pré-incubação de linhagens celulares de câncer com esta pequena molécula aumenta a 
sensibilidade ao tratamento com agentes tipo CNU. Ensaios clínicos de fase I de O6BuG e BCNU 
estabeleceram a dose máxima tolerável. O estudo também mostrou que O6BuG é rapidamente convertida 
a 8-oxo-O6BuG, que também é um bom inativador de O6-MGMT in vivo. 
 Estudo de fase II com doses de 120 mg/m2 de O6BuG não produziram regressão de tumor em 
pacientes com glioma maligno resistente a nitrosouréia, embora alguns pacientes exibissem estabilidade 
da doença por 18 semanas com o tratamento. Portanto, mais estudos são necessários. 
Ainda não foi detectada doença humana associada com a mutação no gene O6-MGMT. O fenótipo 
Mer- parece ser o efeito e não a causa da transformação maligna. 
Em células humanas o gene da O6MGMT foi o primeiro que mostrou ser indutível por estresses 
genotóxicos e por glicocorticóides, conduzindo à resposta adaptativa das células aos efeitos citotóxicos e 
mutagênicos de agentes alquilantes simples. 
 A expressão de O6MGMT é regulada pela metilação do gene e do promotor. A metilação do 
promotor provoca a inibição e a metilação do gene resulta no aumento da expressão da proteína. A 
metilação também está envolvida na resistência adquirida por células de melanoma contra drogas 
anticâncer contendo cloroetila. 
 Em células eucarióticas ainda não se detectou a reparação das metilações nas ligações 
fosfotriéster. 
 
 
Transferência de grupamentos alquil por AlkB 
 
 As metilações podem ocorrer em 14 sítios diferentes no DNA (ver Figura VII-17), 12 dos quais são 
reparados por Ada, AlkA e AlkB. As metilações mais abundantes são N7MeG (70%) e N3MeA (10%). 
 Alguns agentes alquilantes, tais como: CH3Cl, CH3I e CH3Br, geram metilações em RNA e DNA em 
hélice simples (N1MeA e N3MeC), uma vez que estes sítios estão protegidos na dupla hélice. 
 AlkB é uma dioxigenase α-cetoglutarato-Fe(II) dependente, que utiliza um intermediário ferro-oxo para 
hidroxilar N1MeA e N3MeC no DNA. Estes intermediários hidroxilados são instáveis e se decompõem, 
gerando formaldeído e regenerando a base íntegra. No caso de N1etilAdenina é liberado acetaldeído, numa 
verdadeira demetilação oxidativa (Figura VII-22). 
 In vitro, AlkB repara DNA em hélice simples assim como DNA em hélice dupla (preparado por 
anelamento após a metilação). 
VII-20
 Além disto, AlkB também é capaz de retirar o N1metil de dATP, impedindo a incorporação do 
precursor metilado durante a síntese de DNA. 
 
Figura VII-22 – Mecanismo de ação da proteína AlkB
 
 
O primeiro gene humano descrito como homólogo ao alkB de E. colifoi o ABH1. Entretanto, os 
resultados obtidos não foram confirmados, embora este gene possua 18,5% de identidade com alkB e 
possivelmente tenha uma função relacionada. 
 Posteriormente ABH2 e ABH3 (também conhecido como DEPC-1), foram descritos e mostraram 
complementar a mutação alkB de E. coli. 
 ABH2 está localizado no cromossomo 12 e é composto de 4 exons e AHB3 está no cromossomo 11, 
sendo composto de 10 exons. 
 As proteínas AHB2 e AHB3 são do grupo da superfamília das dioxigenases cetoglutarato Fe(II)-
dependentes, contendo a sequência contexto de ligação do Fe(II). 
 As duas proteínas retiram metil de N1MeA e N2MeC e ABH2 é mais ativa em N1MeA e ABH3 em 
N3MeC no DNA. 
 Em contraste com AlkB as proteínas humanas têm muito pouca afinidade por N1-etilA. 
 As proteínas AlkB e ABH3 preferem DNA em hélice simples e RNA, enquanto ABH2 prefere 
DNA em hélice simples e dupla, por isto AlkB e ABH3 reparam eficientemente RNA, entretanto, a 
preferência das duas proteínas humanas por DNA é o dobro daquela observada para RNA. 
 Como as metilações N1MeA e N3MeA são geradas em DNA em hélice simples, foi sugerido que 
AlkB e os homólogos devam funcionar nas forquilhas de replicação e nos sítios de transcrição. Em 
verdade, os mutantes alkB de E. coli são muito mais sensíveis a agentes alquilantes em fase exponencial 
do que na estacionária de crescimento e ABH2, mas não ABH3, colocaliza com PCNA nos “foci” de 
replicação. Além disto, alkB também está associado com a replicação em organismos como C. crescentus, 
aumentado sua expressão durante a fase S, junto com outros genes requeridos para a síntese de DNA. 
 Ainda não se demonstrou a indução dos genes humanos pelos tratamentos com agentes metilantes 
de hélices simples DNA. 
 
 
 
REPARAÇÃO POR EXCISÃO 
 
Aspectos gerais 
 
 O isolamento de mutantes de E. coli B denominados Bs-1 e Bs-2, bastante sensíveis às radiações UV-C, 
levou, há mais de quatro décadas, à proposição da existência de um mecanismo de reparação independente da 
iluminação e que, nestes mutantes, seria deficiente. Por esta razão, este mecanismo foi inicialmente 
VII-21
denominado de reparação no escuro (“dark repair”), sendo hoje conhecido como reparação por excisão ou 
reparação por excisão-ressíntese. 
 Este tipo de reparação, provavelmente o mais importante mecanismo de eliminação de lesões foto, 
radio ou quimioinduzidas, admite várias vias alternativas, que podem ser agrupados em: 
 a) remoção da base nitrogenada lesada, seguida da inserção de uma base idêntica, não lesada por uma 
“insertase”. Em células humanas foi detectada atividade insertase, mas, o gene não foi detectado e o mecanismo 
é obscuro; 
 b) remoção da base nitrogenada lesada, gerando um sítio apurínico ou apirimidínico, capaz de ser 
reconhecido por uma endonuclease, que produz uma quebra na cadeia polinucleotídica, seguindo-se a 
eliminação do fragmento, ressíntese e ligação; 
 c) excisão de um fragmento relativamente curto da cadeia contendo a lesão, seguida de ressíntese e 
ligação; 
 d) excisão de um longo fragmento de cadeia, formado por mais de 1.500 nucleotídeos, seguida de 
ressíntese e ligação. 
 
REPARAÇÃO POR EXCISÃO DE BASES (BER) 
 
 O material genético é constantemente exposto a agentes físicos e químicos que induzem grande 
variedade de modificações no DNA. Para evitar que esses agentes causem mutações ou morte celular os 
organismos desenvolveram diversos mecanismos para prevenir e reparar as lesões. 
 Uma grande variedade de lesões é reparada por um sistema em múltiplas etapas, denominado reparação 
por excisão de bases, composto das seguintes etapas: 
a) liberação da base lesada ou mal emparelhada por uma DNA glicosilase específica; 
b) incisão da cadeia açúcar fosfato no sitio abásico resultante, por uma liase ou por uma endonuclease; 
c) remoção do terminal criado; 
d) síntese de reparo e 
e) ligação do DNA neossintetizado ao preexistente. 
O sistema de excisão de bases é o principal sistema para a reparação de bases modificadas, sítios com 
perda de bases, quebras simples e pequenas lacunas no DNA. 
 
DNA glicosilases 
 
 Bases nitrogenadas lesadas pelo tratamento com agentes físicos ou químicos podem ser removidas pela 
atuação de N-glicosilases, capazes de romper a ligação entre a base e a desoxirribose. 
 Muitas DNA glicosilases reconhecem somente uma forma particular da lesão da base e a maioria das 
DNA glicosilases é altamente específica para bases com uma lesão específica. 
 Elas são proteínas pequenas, com menos de 30 kDa e o aparecimento de bases livres após tratamento 
do DNA com agentes genotóxicos é a maior demonstração da atividade das DNA glicosilases. Isto 
normalmente é feito por análise cromatográfica seja da mistura inteira da incubação do DNA marcado 
radioativamente seja da fração contendo oligo ou mononucleotídeos solúveis em ácido ou álcool. 
 As DNA glicosilases podem ser monofuncionais, removendo a base e deixando um sítio AP ou 
bifuncionais devido a terem associada uma atividade liase que cliva o DNA no lado 3’ do sitio abásico. 
 
Uracil-DNA glicosilases (UDGs) 
 
Família 1 - Uracil-DNA glicosilase (Ung) 
 
É uma enzima codificada em E. coli pelo gene ung, constituindo-se de um polipetídeo de 26 kDa que 
remove moléculas de uracil incorporadas ao DNA pela DNA polimerase, que incorpora erradamente uma 
molécula de uracil para cada 1.000 a 10.000 timinas. 
 O uracil também pode ser formado no DNA em consequência da desaminação da citosina, fenômeno 
este que ocorre com elevada frequência pela ação de agentes físicos ou químicos. Portanto, Ung tem um papel 
relevante em evitar a mutagênese espontânea C:G → T:A. 
 Algumas formas de vida usam o uracil no DNA (bacteriófagos PBS1 e PBS2 de Bacillus subtilis). 
Estas cepas, entretanto, possuem Ung e, em verdade, logo após a infecção o gene ugi do fago (inibidor da Ung) 
é expresso, permitindo a replicação do vírus. 
VII-22
 A Ung utiliza DNA em hélice dupla ou simples contendo deoxiuridina. A enzima retira o uracil e 
“engloba-o” no seu sítio ativo, o que limita as lesões reparáveis. Entretanto, além do uracil, foi mostrado que 
ela também é capaz de reconhecer 5-fluoruracil e 5-hidroxiuracil. A enzima é capaz de remover 800 resíduos de 
uracil por minuto e cada célula tem cerca de 300 moléculas (Figura VII-23). 
 
Figura VII-23 – Mecanismo de ação da Uracil-DNA glicosilase (Ung)
 
 Em células de mamíferos existem duas formas do mesmo gene, designadas UNG2 no núcleo e 
UNG1 na mitocôndria. A proteína UNG nuclear co-localiza com fatores de replicação: proteína de 
replicação A (RPA) e antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) nos sítios da replicação. A 
principal função de UNG em células de mamíferos é remover U quando ele é incorporado em frente a A 
durante a replicação, tendo também um pequeno papel na remoção de U em frente a G por desaminação 
da citosina fora da replicação. Estas proteínas existem em bactérias, leveduras, mamíferos, plantas e em 
alguns virus, mas não em insetos. 
Interessantemente, alguns vírus, incluindo HSV1, HSV2 e varicela zoster, codificam sua própria 
uracil-DNA glicosilase, indicando a importância desta enzima para sua manutenção. Não existe doença 
humana conhecida associada com defeito em UNG. 
 
Família 2 – UDGs (Timina-DNA glicosilases - TDG) 
 
As TDG de eucariotos foram inicialmente descritas pela capacidade de retirar timina dos pares G:T. 
Elas também são capazes de retirar uracil mas somente dos pares G:U. As bactérias possuem homólogos 
estruturais designados Mug (mismatch-specific uracil-DNA glycosylase). As TDG e Mug existem em 
mamíferos, insetos e outros eucariotos (S. pombe). 
Estas glicosilases possuem um mecanismo de reconhecimento das lesões diferente da família 1, o que 
permite a elas excisar uracil e timina em frente à guanina. Além disto, elas também podem remover a base 
alquilada 3,N4-etenocitosina oposta a G e 1,N2-etenoguanina oposta a C, sendo talvez a reparação de adutos de 
eteno o papel mais importante paraestas enzimas. 
 
 
Família 3 – 5-Hidroximetiluracil-DNA glicosilase (somente em eucariotos) 
 
 O 5-hidroximetiluracil é formado pela oxidação do grupamento metil da timina ou pela 
desaminação da 5-hidroximetilcitosina. Ele é detectado em urina de ratos e de humanos e é usado como 
medida da formação de lesões oxidativas no DNA nestes organismos. Esta lesão é removida por uma 
glicosilase específica presente em todos os vertebrados, mas não em procariotos, provavelmente porque 
os procariotos não têm muitos resíduos 5-metilcitosina. A enzima age igualmente em DNA em hélice 
simples como em dupla, em contraste com a uracil-DNA glicosilase, que prefere DNA em hélice simples e 
outras glicosilases que preferem DNA em hélice dupla. A enzima purificada foi designa SMUG (single-
VII-23
stranded specific monofunctional uracil-DNA glycosylase). Posteriormente foi verificado que ela prefere 
DNA dupla hélice (700 vezes mais que hélice simples). 
 Alem do 5-hidroximetiluracil SMUG pode remover 5-formiluracil e 5-hidroxiuracil do DNA. 
 
Família 4 – UDGs de Archaea e algumas bactérias 
 
 Bactérias termofilicas vivem em altas temperaturas, uma condição na qual as desaminações são muito 
frequentes, gerando pares G:U e G:T, pela desaminação de citosina e 5-metilcitosina respectivamente. Estes 
organismos possuem uma família de DNA glicosilases denominada TmUDG. Estas enzimas detectadas em 
diversos membros de Archaea hipertermofilicos, possuem centros ferro-enxofre estruturais e parecem agir de 
maneira homóloga à proteína UNG de mamíferos na forquilha de replicação. 
 
Proteínas MBD4 de mamíferos 
 
 Estas proteínas contêm um domínio (MDB = methyl-binding domain) que se liga a DNA rico em 
sequências 5-Me-CpG. A proteína MDB4 tem uma atividade que remove T e U mal emparelhados com G 
com alta especificidade para as sequências CpG metiladas. Além da ação glicosilase MDB4 também tem 
ação liase. Ela compete com a TDG na remoção de timinas do par G:T. 
 Além de sua atuação nas ilhas CpG a proteína também remove timina de erros com O6-
metilguanina. 
 
 
Deficiência em DNA glicosilases 
 
 A deficiência de ung aumenta os níveis de mutagênese, principalmente GC → AT em E. coli. Em 
leveduras a deficiência de UNG não aumenta muito a mutagênese e em mamíferos a deficiência em UNG causa 
pré-disposição para malignidade nas células β e alterações do sistema imune. 
 Camundongos Ung-/- são férteis e não mostram defeitos no desenvolvimento. Entretanto as células são 
parcialmente deficientes na remoção de U incorporado erroneamente. No primeiro ano de vida os camundongos 
são normais, mas, após 18 meses, eles morrem mais que o controle e começam a aparecer muitos linfomas de 
células β. Isto representa o primeiro exemplo de aumento de malignidade espontânea em camundongos como 
resultado da deficiência de uma DNA glicosilase. 
 Camundongos nocaute para MBD4 apresentam três vezes mais mutações C→ G nos sítios CpG. 
Quando cruzados com camundongos com um dos alelos mutados em Apc (adenomatoous polyposis coli) o 
resultante manifesta formação acelerada de tumores no trato gastrointestinal e mutações CpG → TpG no gene 
Apc. Embora a inativação de MBD4 por si não aumente a susceptibilidade para câncer em camundongos há 
alteração do espectro de mutações em genes supressores, modulando, portanto, a pré-disposição para 
cancerização. 
 
3 metil adenina DNA glicosilases (bactérias) / N-metilpurina-DNA glicosilase (humanos) 
 
 Quando do tratamento das células com agentes alquilantes, diversas posições nas bases são alquiladas e 
não são reconhecidas pelas proteínas Ada e Ogt. Entre as bases alquiladas, a 3-metil-adenina é a lesão mais 
crítica uma vez que interfere com a replicação, conduzindo à letalidade. 
 Em E. coli, duas proteínas são responsáveis pela eliminação destas bases, as enzimas TagA e AlkA (3-
metil-adenina DNA glicosilase I e II), codificadas pelos genes tagA e alkA, respectivamente. A proteína TagA 
(21 kDa) é capaz de reparar diversas bases além da 3-meA. Ela também catalisa a excisão de 3-metilguanina e 
3-etiladenina. 
 A proteína AlkA (31 kDa), além de remover 3-meA é capaz de catalisar a eliminação de pelo menos 
mais 20 produtos de metilação, tais como: 3-metilguanina, 7-metilpurinas, 7 e 3-etilpurinas, O2-
metilpirimidinas, 5-hidroximetiluracil, N1-carboxietiladenina, N7-carboxietilguanina, etc. 
 Em células de E. coli não adaptadas AlkA é responsável pela retirada de 5 a 10% da 3-meA, entretanto 
em células adaptadas ela é responsável por 50 a 70% da atividade total. 
 Em S. cerevisiae o gene MAG1 codifica a metil adenina DNA glicosilase Mag1 que à semelhança de 
AlkA remove 3-metilpurinas, 7-metilpurinas, etenoadenina e O2-metilpirimidinas. 
 
VII-24
 Em células humanas só foi detectada uma N-metil purina-DNA glicosilase (MPG), que é uma 
proteína de 33 kDa. A enzima de mamíferos é funcionalmente homóloga à AlkA de E. coli com relação à 
especificidade de substrato, entretanto ela não tem homologia de sequência com Tag nem com AlkA, 
portanto, o nome N-metil purina-DNA glicosilase é preferido para a enzima humana. Entretanto, o 
nome não define completamente o espectro de substratos. A enzima remove também a lesão 8-oxoG 
(GO), hipoxantina e 1,N6-eteno adenina da mesma maneira que 3-MeA. Os mutantes de E. coli são 
extremamente sensíveis aos efeitos mutagênicos e letais dos agentes alquilantes, entretanto, em 
mamíferos não foi detectada nenhuma doença associada com a deficiência de MPG. 
 
DNA glicosilases com atividade AP liase associada 
 
 Em reações in vitro foi detectada uma associação de eliminação das bases com concomitante quebra 
das ligações fosfodiéster. Foi mostrado que as incisões ocorrem por β-eliminação no lado 3’ do sítio AP e foi 
mostrado também que esta β-eliminação em sítios AP pode ser facilitada por algumas proteínas básicas, não se 
sabendo, entretanto, se elas são verdadeiras enzimas, uma vez que, a quebra por endonucleases envolve uma 
molécula de água, ou seja, são endonucleases hidrolíticas. 
 Isto gerou controvérsias acerca das “verdadeiras” AP endonucleases e sua distinção entre proteínas que 
provocam quebras espúrias no DNA. 
 
Química e estrutura dos sítios AP 
 
 Os sítios AP existem no DNA como uma mistura de equilíbrio contendo cadeia aberta α, β-aldeído 
insaturado, α e β-hemiacetal e cadeia aberta α, β-hidrato insaturado. Os aldeídos abertos constituem somente 
1% dos sítios AP, mas são os mais reativos. Os sítios AP podem reagir quimicamente levando à quebra da 
cadeia na ausência de proteínas. 
 
 ββββ-eliminação – Ocorre de duas maneiras: um próton é transferido do grupo CH2 da desoxirribose α 
para o grupo carbonil do carbono 1 ou uma base de Schiff é formada entre uma amina e o grupo C1 carbonil da 
cadeia aberta do aldeído. Ambas as reações são seguidas de β-eliminação que deixa 3’ α,β-aldeído insaturado, 
4-hidroxi-2-pentenal e 5’PO4, sendo este o mais relevante mecanismo de clivagem nos sítios AP. 
 
 δδδδ-eliminação – Em certas condições o aldeído insaturado 3’ pode sofrer uma reação adicional de delta 
eliminação, resultado da liberação de 4-hidroxi-pent-2,4-dienal deixando uma lacuna de um nucleotídeo e 
terminais 3’PO4 e 5’PO4. 
 
 Rearranjo – Em condições alcalinas o aldeído 3’α, β insaturado pode rearranjar-se formando um 3’–2-
oxociclopent-1-enil terminal. 
 
 Todas as DNA glicosilases que podem hidrolisar as ligações fosfodiéster no sítio da perda da base o 
fazem por β-eliminação. Portanto, foi sugerido que estas e outras proteínas que facilitam a β-eliminação nos 
sítios AP devem ser designadas como AP liases e não AP endonucleases. 
 Na Figura VII-24 estão representadas as reações descritas acima. 
 
MutY-DNA-glicosilase (no contexto da lesão GO) – Sistema GO 
 
 A MutY-DNA glicosilase é uma glicosilase de 36 kDa que catalisa a remoção de adenina, 
independentemente do estado de metilação do DNA. É codificada pelo gene mutY. Células deficientes em 
MutY são hipermutáveis, gerando transversõesG:C → T:A. 
 O gene foi clonado e gera um polipeptídeo de 39,1 kDa cuja sequência apresenta homologia com a 
endonuclease III, produto do gene nth de E. coli. 
 A proteína MutY purificada é capaz de remover adenina do DNA contendo A:G ou A:C e tem 
associada uma atividade 3’AP liase. 
 A proteína evita a mutagênese potencial das lesões GO (G:C→ T:A) que escapam do reparo da 
Fpg/MutM, já que esta não reconhece eficientemente GO em frente a A. 
 Deve ser notado, entretanto, que os mutantes mutY somente conduzem ao aumento de mutações 
espontâneas G:C → T:A presumivelmente porque as MutSLH eliminam C:A e possivelmente G:A, tornando o 
VII-25
papel de MutY redundante. A MutY é a única glicosilase que funciona na correção de erros de emparelhamento 
de bases normais. 
 
OH
O
3’
5’
\
OH
OOH
O
3’
5’
\
\
5’
\
3’
~OH
3’
\
5’
\
\
3’
\
5’
OH
O
OH
~OH
5’
\
/
3’
\
3’
\
5’
3’
\
5’
\
DNA glicosilase ou Perda 
espôntanea de base
ββββ,δδδδ Eliminação*ββββ Eliminação*
Hidrólise 
AP-endonuclease (classe II)
Figura VII-24 - Mecanismos de incisão de sítios AP no DNA
 
 
Sistema GO 
 
 A lesão GO pode parear tanto com C como com A, de modo que o sistema GO está envolvido com a 
atenuação dos efeitos mutagênicos desses erros de emparelhamento. 
 A observação de que tanto mutantes fpg/mutM como mutY têm aumento da frequência de transversões 
G:C → T:A levou à conclusão que eles devem participar de um reparo comum. Em verdade, havia sido 
mostrado que a proteína MutY é capaz de catalisar a remoção de A do par A:GO, um substrato que pode 
aparecer na replicação se existirem lesões GO no DNA. Além disto, a proteína MutY permanece ligada ao 
DNA após a retirada da A do par A:GO, possivelmente protegendo o sítio GO contra o ataque da Fpg, evitando 
quebras duplas. 
 A superexpressão do gene fpg/mutM corrige completamente o fenótipo mutante mutY. E o duplo 
mutante mutY mutM tem uma taxa de mutagênese espontânea que é 20 vezes maior que a soma das taxas dos 
dois mutantes isoladamente. Coletivamente estas observações levaram ao modelo de reparação das lesões GO 
(Figura VII-25). 
VII-26
 
Replicação
Replicação
Dano oxidativo
Replicação
Reparo
Reparo
e
Figura VII-25 - Esquema do modelo proposto para eliminação de 8-oxoG do DNA de E.
coli: A) 8-oxoG; B) atividade das enzimas MutY e MutM (Fpg) C) atividade fosfatase de
MutT
 
 
Se as lesões GO forem removidas pela MutM antes da replicação, o reparo é efetuado pelo sistema de 
excisão de bases normal. Se a lesão GO não é eliminada antes da replicação e a replicação for acurada, entrará 
citosina e a Fpg terá outra oportunidade de eliminar a lesão. Entretanto a replicação pode levar à formação do 
par A:GO. A excisão de A pela MutY pode iniciar o processo de excisão da hélice não lesada, o que pode 
conduzir à formação do par C:GO, que é, outra vez, sujeito à ação da MutM. 
 Após a remoção da A pela MutY, o ataque a GO pela Fpg é bloqueado pela ligação de MutY ao DNA. 
Resta saber como o sistema de excisão de bases consegue contornar este obstáculo e colocar a base certa. 
 Um terceiro elemento no sistema GO é o gene mutT, cujo produto não é uma DNA glicosilase. 
 A inativação de mutT causa um aumento de até 10.000 vezes na mutagênese espontânea gerando 
transversões A:T → C:G. A proteína codificada por mutT é pequena (15 kDa), tem uma fraca atividade GTPase 
trifosfatase, mas é cerca de 1.000 vezes mais ativa sobre a 8-oxo-dGTP (8-oxo-7,8-dihidro-2’-dGTP), originada 
da oxidação de dGTP. Sua ação gera 8-oxo-GMP que não é incorporada ao DNA. 
 A inativação de mutT leva à formação de A:GO durante a replicação e, neste caso, a proteína MutY 
conduz à mutagênese A:T → G:C. Em verdade foi verificado que o duplo mutante mutT mutY é menos mutável 
espontaneamente que o simples mutante mutT. 
 Evidentemente a deficiência em proteínas MutY, MutT e MutM acarreta alta taxa de mutagênese 
espontânea, devida simplesmente à respiração celular. 
 O genoma de D. radiodurans codifica múltiplos homólogos de MutT, entretanto o eucarioto S. 
cerevisiae, não codifica nem MutT nem MutY. 
 Em seres humanos genes semelhantes a mutY, mutT e fpg/mutM já foram detectados e a não 
funcionalidade do gene fpg/mutM humano é detectada na maioria dos cânceres de pulmão. 
 
Em células humanas o sistema GO atua de maneira semelhante ao descrito para E. coli, evitando 
que GO (que pareia igualmente com A e C) conduza às transversões mutagênicas GC→→→→TA e AT→→→→CG. 
Além disto, o sistema GO em humanos envolve outros sistemas de reparação tais como BER, MMR e 
NER, como pode ser visto na Figura VII-26. 
A proteína MTH1 (MTH = MutT Homolog) é capaz de degradar 8-oxo-dGTP assim como 8-oxo-
dATP e 2 hidroxi-dATP, gerando monofosfatos, que não são incorporados ao DNA. A localização de 
MTH1 é ubíqua, sendo encontrada no núcleo, citosol e mitocôndrias, existindo 3 ou 4 variantes (MTHa-
d) nas células. 
Em camundongos Mth-/-, aumenta muito a quantidade de tumores espontâneos, embora as 
transversões AT→CG não sejam observadas nesses camundongos. Entretanto as transversões GC→TA 
aparecem em maior número, assim como inserções/deleções de 1 base em microssatélites de 
mononucleotídeos. 
 
VII-27
 
Replicação
MMR
8-Oxoguanina
A C T T G G 
T G A A C G
DNA pol
8-oxo-dGMP
MTH1
A C T Go G C 
T G A A C G
A C T AP G G 
T G A A C G
OGG2
GO
BER
DNA reparado
MMR
A C T Go G G 
T G A A C G
A C T Go G G 
T G A AP C G
A C T T G G 
T G A A C G
BER A
MUTAÇÃO
A C T Go G C 
T G A C C G
A C T G G C 
T G A C C G
Lesão 
oxidativa
A C T AP G C 
T G A C C G
A C T G G C 
T G A C C G
NEIL1
OGG1
GO
OU
BER
DNA reparado
TCR
GGR
RAR
Figura VII.12 - Reparo de lesões GO em mamíferos
Replicação
MMR
8-Oxoguanina
A C T T G G 
T G A A C G
DNA pol
8-oxo-dGMP
MTH1
A C T Go G C 
T G A A C G
A C T AP G G 
T G A A C G
OGG2
GO
BER
DNA reparado
MMR
A C T Go G G 
T G A A C G
A C T Go G G 
T G A AP C G
A C T T G G 
T G A A C G
BER A
MUTAÇÃO
A C T Go G C 
T G A C C G
A C T G G C 
T G A C C G
Lesão 
oxidativa
A C T AP G C 
T G A C C G
A C T G G C 
T G A C C G
NEIL1
OGG1
GO
OU
BER
DNA reparado
TCR
GGR
RAR
Replicação
MMR
8-Oxoguanina
A C T T G G 
T G A A C G
DNA pol
8-oxo-dGMP
MTH1
A C T Go G C 
T G A A C G
A C T AP G G 
T G A A C G
OGG2
GO
BER
DNA reparado
MMR
A C T Go G G 
T G A A C G
A C T Go G G 
T G A AP C G
A C T T G G 
T G A A C G
BER A
MUTAÇÃO
A C T Go G C 
T G A C C G
A C T G G C 
T G A C C G
Lesão 
oxidativa
A C T AP G C 
T G A C C G
A C T G G C 
T G A C C G
NEIL1
OGG1
GO
OU
BER
DNA reparado
TCR
GGR
RAR
Replicação
MMR
8-Oxoguanina
A C T T G G 
T G A A C G
DNA pol
8-oxo-dGMP
MTH1
A C T Go G C 
T G A A C G
A C T AP G G 
T G A A C G
OGG2
GO
BER
DNA reparado
MMR
8-Oxoguanina8-Oxoguanina
A C T T G G 
T G A A C G
A C T T G G 
T G A A C GT G A A C G
DNA polDNA pol
8-oxo-dGMP
MTH1MTH1
A C T Go G C 
T G A A C G
A C T Go G C A C