Imunoensaios

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Imunoensaios
Baseados nos princípios de que antígenos específicos irão estimular reações imunológicas muito específicas e de que proteínas produzidas pela reação imunológica, chamadas anticorpos, podem ser usadas para sinalizar a presença de um composto alvo em uma amostra.
Resposta humoral
Testes de ligação primária
1. Imunofluorescência
É uma técnica que permite a detecção ou localização de antígenos em tecidos ou células a partir de uma marcação com anticorpos conjugados a uma molécula fluorescente, os fluorocromos.
Os fluorocromos são moléculas que possuem a capacidade de absorver a energia proveniente de uma luz ultravioleta e emitir parte dessa energia em forma de luz em um comprimento de onda visível aos olhos. Chamamos esse fenômeno de fluorescência. A visualização é feita em microscópio de fluorescência.
Existem dois tipos
Imunofluorescencia direta: é colocado apenas um anticorpo e esse é conjugado ao fluorocromo, ou seja, o antígeno é detectado diretamente pelo anticorpo primário.
Imunofluorescencia indireta: Além do anticorpo primário como na anterior, é colocado um secundário e esse estará conjugado a um fluorocromo, ou seja, o antígeno é detectado indiretamente.
1. ELISA
	Ensaio de imunoabsorção enzimática é um teste imunoenzimático que permite a detecção de anticorpos específicos. Nesse método, uma enzima, que reage com um substrato incolor para produzir um produto colorido, é covalentemente ligada a um anticorpo específico que reconhece um antígeno alvo. Se o antígeno estiver presente, o complexo anticorpo-enzima irá ligar-se a ele e a enzima catalisará a reação. Então, a presença de produto colorido indica a presença de antígeno.
Teste Indireto – mais comum
Placas com micropoços de poliestireno são preenchidas com uma solução de antígeno. As proteínas se ligam fortemente na superfície do poliestireno e, em seguida, o antígeno não ligado é removido com lavagens vigorosas. O soro a ser testado é adicionado aos poços. Os anticorpos presentes no soro se ligarão ao antígeno que reveste o poço. 
Após incubar e lavar a placa para a remoção dos anticorpos não ligados, a presença de qualquer anticorpo que tenha se ligado ao antígeno pode ser detectada adicionando uma solução contendo antiglobulina quimicamente conjugada a uma enzima. Esta antiglobulina marcada liga-se ao anticorpo e, após incubação e lavagem, pode ser detectada. 
Elisa Sanduiche: mensura antígeno especifica
Os poços nas placas de poliestireno são revestidos com anticorpos específicos (anticorpos de captura) antes de realizar o teste. solução de antígeno a ser analisada é adicionada a cada poço. 
Antígenos presentes na amostra irão se ligar aos anticorpos de captura presentes nos poços. após lavagem, da adição de anticorpos específicos, que também se ligam ao antígeno (chamado de anticorpos de detecção).Após lavagem para remoção dos anticorpos não ligados, são adicionados antiglobulina marcada e o substrato.
Elisa: antígeno marcado
O soro a ser testado é adicionado aos poços e, após a lavagem da placa, é adicionado um antígeno marcado. Os antígenos marcados irão se ligar aos anticorpos ligados aos antígenos aderidos nos poços e a reação poderá ser mensurada.
Elisa: competição
Nesta técnica, o micropoço é revestido por um anticorpo específico antes do teste. Em uma única reação, a amostra a ser analisada e o antígeno marcado com uma enzima são colocados simultaneamente no poço, onde os antígenos da amostra irão competir com aqueles marcados pelos sítios de ligação dos anticorpos. A quantidade de antígenos marcados ligada aos anticorpos presentes nos micropoços será inversamente proporcional à concentração de antígeno na amostra analisada.
Testes de Ligação Secundária
Ocorre quando os anticorpos se conjugam com antígenos suspensos em uma solução, os complexos resultantes podem precipitar. Anticorpos que reconhecem antígenos particulados podem causar agregação ou aglutinação destes. 
1. Precipitação		
Se uma suspensão de antígeno solúvel for misturada a um antissoro concentrado, a mistura torna-se turva em poucos minutos e, posteriormente, apresenta floculações. Finalmente, um precipitado deposita-se no fundo do tubo. Este precipitado é formado por complexos antígeno-anticorpo. Os anticorpos se ligam em pontos diferentes do agente deixando-a pesada e precipitando.
Ex: IDGH
Consiste em uma técnica de diagnóstico que consiste numa simples reação de precipitação de antígenos por anticorpos. Em um placa contendo àgar solidificado são feitos sete poços (1 central e 6 circulando-a) 
Na cavidade central é colocado o antígeno, enquanto nas demais alterna-se entre controle positivo e soro teste. Após incubação de 48 horas, é durante este momento que ocorre a difusão do antígeno na cavidade central e anticorpos se presentes, das cavidades externas.
Se no soro teste existir anticorpos contra o antígeno, forma-se uma linha de precipitação no encontro desses anticorpos. A presença dessa linha determina se a amostra é positiva ou negativa.
Se as soluções utilizadas contiverem vários anticorpos e antígenos diferentes, os componentes provavelmente não atingirão proporções ótimas na mesma posição. Consequentemente, uma linha separada de precipitado é produzida em cada grupo de interações de antígeno e anticorpo. Se estas linhas se unirem, provavelmente os dois antígenos são idênticos. Se as linhas se cruzarem, os dois antígenos são completamente diferentes. Se as linhas se unirem havendo a formação de um esporão, existe uma identidade parcial, indicando que um antígeno possui epitopos que não estão presentes no outro.
2. Aglutinação
Como os anticorpos são bivalentes, eles podem se ligar de forma cruzada com antígenos particulados como bactérias ou eritrócitos estranhos, resultando em coagulação ou em aglutinação.
Direta
Se for necessário testar para a presença de anticorpos não aglutinantes na superfície de partículas como bactérias ou eritrócitos, utiliza-se, possivelmente, um teste de antiglobulina direto. As partículas lavadas podem ser misturadas com uma antiglobulina e, se os anticorpos estiverem presentes na sua superfície, irá ocorrer a aglutinação
Indireto
O teste de aglutinação indireta ou passiva emprega a adsorção de anticorpos ou antígenos solúveis proteicos ou polissacarídeos na superfície de micropartículas inertes (suportes) que não interferem na interação antígeno-anticorpo, como plásticos, gelatina, carvão e hemácias formolizadas de aves e carneiros.
3. Fixação de completo
A ativação da via clássica do complemento por anticorpos ligados a antígenos resulta na geração de complexos terminais do complemento que podem romper as membranas celulares. teste de fixação do complemento é realizado em duas etapas. Primeiramente, os antígenos e anticorpos são misturados e incubados na presença de soro de cobaia normal como fonte de complemento. Após a mistura antígeno-anticorpocomplemento reagir, a quantidade de complemento livre que permanece na mistura é mensurada adicionando um sistema indicador que consiste em eritrócitos de ovelha recobertos por anticorpos. A lise destas células é um resultado negativo indicando que o complemento não foi ativado e que o anticorpo estava ausente do soro analisado . A ausência de lise (observada como uma suspensão turva de células vermelhas) indica que o complemento foi consumido (ou fixado) e é um resultado positivo. Normalmente quando ocorre uma reação antígeno anticorpo o sistema complemento se liga e causa lise na célula.
Testes de ligação Terciária
1. Testes de soroneutralização
Consiste numa amostra de soro do animal suspeito de estar infectado onde vai ser colocado o antígeno. Se o animal estiver infectado não vai ocorrer destruição celular porque os anticorpos vão estar ligados ao a gente. Se ocorre dano, então o animal não estava infectado.
2. Testes de Proteção
Faz a inoculação de um soro de animal suspeito de estar infectado, no rato. Depois inocula o agente no camundongo. Se for positivo não acontecenada, se ele morrer é porque era negativo.
Resposta Celular
Testes Cutâneos
 
1. Teste de tuberculinização 
O hapteno do antígeno é inoculado no animal, e se esse animal teve uma exposição previa, vai formar uma reação rápida e aguda. Depois e feita a medição para comprovar se o animal já foi ou não exposto. Depois faz um teste comparativo.
2. Teste de maleina 
Segue a mesma linha do da tuberculinização, porém é feito em equinos.
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