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Lívia Mara Vitorino da Silva 
 
 
 
 
Caracterização Epidemiológica e Molecular de Staphylococcus Coagulase Negativa 
Resistentes aos Beta-Lactâmicos Isolados de Leite de Vacas com Mastite Subclínica 
 
 
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-
Graduação em Produção Animal do Instituto de 
Ciências Agrárias da Universidade Federal de Minas 
Gerais, como requisito parcial para a obtenção do 
grau de Mestre em Produção Animal. 
 
Área de Concentração: Produção animal. 
 
Orientador: Prof (a) Anna Christina de Almeida 
Co-orientador (es): Prof (a) Alessandra Rejane 
Ericsson de Oliveira Xavier 
Prof. Mauro Aparecido de Sousa Xavier 
 
 
 
 
 
 
MONTES CLAROS 
2018 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ELABORADA PELA BIBLIOTECA UNIVERSITÁRIA DO ICA/UFMG 
Josiel Machado Santos / CRB-6/2577
 
 
 
 
 
 
 
 
 
S586c 
2018 
 
Da Silva, Lívia Mara Vitorino. 
 
 Caracterização Epidemiológica e Molecular de Staphylococcus 
Coagulase Negativa Resistentes aos Beta-Lactâmicos Isolados de Leite de 
Vacas com Mastite Subclínica / Lívia Mara Vitorino da Silva. Montes 
Claros, 2018. 
 48 f.: il. 
 
 Dissertação (Mestrado) - Área de concentração em Produção Animal, 
Universidade Federal de Minas Gerais / Instituto de Ciências Agrárias. 
 
 Orientador(a): Profa Anna Christina de Almeida 
 Banca examinadora: Profa Alessandra Rejane Ericsson de Oliveira 
Xavier, Dra Carolina Magalhães Caires Carvalho, Prof Mauro Aparecido de 
Sousa Xavier, Prof Otaviano Souza Pires Neto 
 
 Inclui referências: f. 24-28, 50-54. 
 
 1. Laticínios -- microbiologia. 2. Epidemiologia veterinária. 3. Mastite. 
4. Antibióticos beta lactâmicos. 5. Infecções estafilococicas. I. Almeida, 
Anna Christina (Orientador). II. Universidade Federal de Minas Gerais. 
Instituto de Ciências Agrárias. III. Titulo. 
CDU: 579 
 
 
 
Lívia Mara Vitorino da Silva 
 
Caracterização Epidemiológica e Molecular de Cepas de Staphylococcus Coagulase Negativa 
Resistentes aos Beta-Lactâmicos Isolados em Leite Bovino do Norte de Minas Gerais 
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-
Graduação em Produção Animal do Instituto de 
Ciências Agrárias da Universidade Federal de Minas 
Gerais, como requisito parcial para a obtenção do 
grau de Mestre em Produção Animal. 
Área de Concentração: Produção animal. 
Linha de Pesquisa: Manejo sanitário da produção 
animal sustentável 
Orientador: Prof (a) Anna Christina de Almeida 
Instituto de Ciências Agrárias da UFMG 
 
 
Aprovado pela banca examinadora constituída pelos professores: 
 
Dra. Carolina Magalhães Caires Carvalho (UFMG) 
Prof. Otaviano Souza Pires Neto (FUNORTE) 
Profa. Alessandra Rejane Ericsson de Oliveira Xavier (Unimontes) - Coorientador 
Prof. Mauro Aparecido de Sousa Xavier (Unimontes) 
Coorientador 
 
________________________________________________________ 
Orientadora Prof (a) Anna Christina de Almeida (UFMG) 
 
 
Montes Claros, 26 de outubro de 2018 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dedico este trabalho a minha mãe Zenilda, meus irmãos 
e aos meus sobrinhos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Agradecimento 
 
 Agradeço primeiramente à Deus, por sempre está presente na minha essência, 
principalmente nos momentos de fraqueza e por ter me guiado por estes anos, comprovando 
que o conhecimento é a melhor arma para combater uma mente que por muitas vezes foi 
desviada pelo comodismo. 
 A minha amada mãe Zenilda, por sempre me apoiar e mesmo nas cobranças, nunca 
deixou de acreditar no meu potencial e sempre me demonstrando firmeza para concluir os meus 
objetivos, deixando que as influências negativas mesmo que aparentemente agradáveis não 
exercesse o papel mais primordial na minha vida. 
 Aos meus irmãos, Leandro e Lyza por sempre me incentivarem, pelos melhores 
conselhos e pelo carinho que só os irmãos sabem transmitir, os meus sobrinhos Thales e Lara, 
pelas brincadeiras, risadas e doçura. 
 Os meus amigos de Belo Horizonte, Julien, Mariana, Gina que estão comigo a muitos 
anos e nunca deixou a amizade cair no ostracismo, tornando minhas vindas a BH neste período 
de estudos em encontros maravilhosos e inesquecíveis. 
 Aos amigos que conquistei em Montes Claros, como o Rody, que desde a minha 
chegada a cidade firmamos uma amizade. Foi através do seu projeto que cresci como 
profissional e nas nossas conversas, a todo momento disse que seria capaz, devo essa conquista 
a você. 
 O Idael, que desde o primeiro dia de aula foi meu amigo e desde então me ajudou em 
todos os sentidos e que mesmo distante, nossa amizade permanece forte. Obrigada por tudo e 
sempre poderá contar comigo onde quer que estejamos. Torço muito pelo seu sucesso e sei que 
ele virá, pois, é merecedor. 
 A minha Professora e orientadora Anna Christina, que desde 2014 me orientou com 
dedicação exclusiva, estimulando em todos os momentos, desde o resumo simples até o 
mestrado. Obrigada pelos conselhos, pelo companheirismo, profissionalismo e pela seriedade. 
 Aos meus co-orientadores e Professores Alessandra e Mauro, que sempre se 
disponibilizaram para que este trabalho se realizasse. Obrigada pelas aulas de Biologia 
Molecular que é o ponto mais importante para o compreendimento desta pesquisa, pela 
disponibilidade de trabalharmos no Laboratório de Microbiologia da Unimontes e pelo 
encorajamento. 
A equipe do Laboratório de Sanidade Animal do Centro de Pesquisas Agrárias, que me 
ajudaram desde de 2016 pela concretização da minha formação. 
Aos colegas do grupo SANILEITE, pelas viagens, parceria e profissionalismo dos 
meninos da extensão, Paulo Henrique, Lucas e Flávio, obrigada pela dedicação em levar os 
trabalhos para vários locais de Minas Gerais e demais estados. 
Os meus colegas de sala em especial Stephanie, Gabriel e Luís, pela companhia, 
conversas engraçadas e pela amizade. 
A CAPES pelo apoio através da bolsa, que proporcionou minha estádia em Montes 
Claros e auxílio no experimento. 
E por fim, a UFMG campus Montes Claros por ter me acolhido e principalmente a todos 
os Professores que lecionaram me tornando uma profissional em Zootecnia. 
 
Muito obrigada a todos! 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 ‘’Amor de mãe é a mais elevada forma de altruísmo’’. 
Machado de Assis 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESUMO 
 
O grupo de Staphylococcus coagulase negativo tornou-se um dos principais agentes patogênicos 
causadores de mastite subclínica em bovinos leiteiros. Objetivou-se identificar espécies de 
Staphylococcus coagulase negativo isolados de leite contaminado por mastite subclínica pela 
técnica MALDI-TOF MS, avaliar a resistência a antimicrobianos beta lactâmicos e rastrear a 
presença dos genes blaOXA-23 e blaKPC pela reação de polimerase em cadeia (PCR). Cento e onze 
isolados identificados como cocos Gram positivos provenientes da bacterioteca da UFMG foram 
analisadas neste estudo. Os isolados foram submetidos a análise para identificação através 
MALDI-TOF MS. As cepas identificadas foram avaliadas quanto a suscepitibilidade aos 
antibióticos cefoxitina (30µg), oxacilina (1µg), vancomicina (30µg), meropenem (10µg), 
imepenem (10µg) e subactam-ampicilina (10µg) pela técnica de difusão de disco e calculou-se o 
índice de multirresistência das espécies. Cepas resistentes fenotipicamente ao antimicrobiano 
meropenem, foram analisados genotipicamente quanto a presença dos genes de resistência 
blaOXA-23 e blaKPC. Através de teste Qui quadrado avaliou- se a frequência de espécies do grupo 
Staphylococcus coagulase negativo, de resistência aos beta-lactâmicos, bem como o índice de 
multirresistência. Através da técnica MALDI-TOF MS o gênero mais encontrado com 56,8% e o 
grupo Staphylococcus coagulase negativo apresentou frequência de 27%. As espéciesStaphylococcus epidermidis e Staphylococcus chromogenes obtiveram maior prevalência nos 
rebanhos com 35,8% respectivamente. Em Janaúba a propriedade Nova Prima, o valor médio 
do índice de multirresistência encontrado foi de 0,6, as demais propriedades e munícipios foram 
de 0,5. Nos rebanhos de bovinos leiteiros a resistência antimicrobiana foi para as bases cefoxitina 
(100%), oxacilina (100%), meropenem (100%) e vancominicina (100%). Os genes de resistência 
blaOXA-23 e blaKPC não foram rastreados nas espécies Staphylococcus epidermidis, 
Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus auriculares e Staphylococcus haemolyticus. 
Outros mecanismos de resistência estão presentes nas cepas causando ineficiência no 
tratamento antimicrobiano nos rebanhos, comprometendo o bem-estar dos animais e saúde 
pública. 
 
Palavras-chaves: genes de resistência. multirresistência antimicrobiana. produtos de origem 
animal. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ABSTRACT 
The coagulase-negative Staphylococcus group has become one of the main pathogens causing 
subclinical mastitis in dairy cattle. The objective of this study was to identify species of coagulase 
negative Staphylococcus isolated from milk contaminated by subclinical mastitis using the 
MALDI-TOF MS technique, to evaluate the resistance to beta lactam antimicrobials and to trace 
the presence of blaOXA-23 and blaKPC genes by polymerase chain reaction (PCR). One hundred 
and eleven isolates identified as Gram-positive cocci from the UFMG library were analyzed in this 
study. The isolates were submitted to analysis for identification through MALDI-TOF MS. The 
strains identified were evaluated for susceptibility to antibiotics cefoxitin (30 μg), oxacillin (1 μg), 
vancomycin (30 μg), meropenem (10 μg), imepenem (10 μg) and subactam-ampicillin (10 μg) the 
species multiresistance index was used. Strains phenotypically resistant to the antimicrobial 
meropenem were analyzed genotypically for the presence of the resistance genes blaOXA-23 and 
blaKPC. The frequency of species of the coagulase-negative Staphylococcus coagulase group, 
resistance to beta-lactams, as well as the multidrug resistance index were evaluated by Chi-
square test. Using the MALDI-TOF MS technique, the most common genotype was 56.8% and 
the coagulase-negative Staphylococcus group had a frequency of 27%. The species 
Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus chromogenes had a higher prevalence in the 
herds with 35.8%, respectively. In Janaúba Nova Prima property, the mean value of the 
multiresistance index found was 0.6, the other properties and municipalities were 0.5. Cefoxitin 
(100%), oxacillin (100%), meropenem (100%) and vancomycin (100%) were the antimicrobial 
resistance in the herds of dairy cattle. The blaOXA-23 and blaKPC resistance genes were not 
screened in the species Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus chromogenes, 
Staphylococcus auriculares and Staphylococcus haemolyticus. Other mechanisms of resistance 
are present in the strains causing inefficiency in the antimicrobial treatment in the herds, 
compromising the well-being of the animals and public health. 
 
Keywords: resistance genes. antimicrobial multiresistance. products of animal origin. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE ILUSTRAÇÕES- ARTIGO 
 
Quadro 1- Sequência dos oligonucleotídeos, genes alvo, tamanhos dos fragmentos amplificados 
(amplicons em pares de bases- pb) e referências que foram utilizados nas análises moleculares 
.................................................................................................................................................... 36 
 
Quadro 2- Caracterização fenotípica de resistência a antibióticos, bioquímica,coloração de Gram, 
análise de perfil proteômico e genômico de dezessete cepas Staphylococcus cogulase negativa 
isolados de leite de vacas com mastite subclínica em rebanhos do Norte de Minas 
Gerais........................................................................................................................................ 38 
 
Gráfico 1- Frequência de espécies de Staphylococcus spp multirresistentes identificados pelo 
MALDI- TOF MS em vacas com mastite subclínica ................................................................. 39 
 
Gráfico 2- Frequência de espécies de SCN em cada propriedade do Norte de Minas 
Gerais....................................................................................................................................... 41 
 
Gráfico 3- Frequência de SCN em cada município do Norte de Minas Gerais......................... 41 
 
Figura 1- Resultado da Extração do DNA em cepas de 
SCN............................................................................................................................................ 47 
 
Figura 2- Análise de PCR com os iniciadores do gene 16S rDNA bacteriano 
universal..................................................................................................................................... 47 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE ILUSTRAÇÕES- REVISÃO 
 
Figura 1- Staphylococcus spp pela coloração de Gram visualizado em microscopia 
óptica.......................................................................................................................................... 17 
 
Figura 2- Princípios da tecnologia de espectrometria de massas por ionização/dessorção de 
matriz assistida por laser por tempo de voo (MALDI-TOF 
MS)..............................................................................................................................................23 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE TABELAS- ARTIGO 
 
Tabela 1- Perfil de resistência e multirresistência das espécies do grupo de Staphylococcus 
coagulase negativo frente ao beta lactâmicos isolados de leite bovino nos municípios de 
propriedades do Norte de Minas Gerais.......................................................................................43 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE TABELAS- REVISÃO 
 
Tabela 1- Espécies de SCN isolados de bovinos leiteiros com mastite clínica e 
subclínica.................................................................................................................................... 18 
 
Tabela 2- Multirresistência de espécies de Staphylococcus coagulase negativo ao beta 
lactâmicos em rebanhos de bovinos leiteiros e ambiente de produção 
animal......................................................................................................................................... 20 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
1 INTRODUÇÃO....................................................................................................................... 14 
 
2 OBJETIVOS........................................................................................................................... 15 
2.1 Objetivo Geral...................................................................................................................... 15 
2.2 Objetivos Especifícos........................................................................................................... 15 
 
3 REVISÃO DE LITERATURA................................................................................................... 16 
3.1 Mastite subclínica.................................................................................................................. 16 
3.1.2 Staphylococcus coagulase negativo.................................................................................. 17 
3.1.3 Resistência aos antimicrobianos beta lactâmicos no grupo de Staphylococcus coagulase 
negativo em animais de produção e humanos...........................................................................19 
3.1.4 Staphylococcus coagulase negativo resistentes aos carbapenêmicos.............................. 21 
3.1.5 MALDI-TOF MS................................................................................................................. 22 
3.4 REFERÊNCIAS.................................................................................................................... 24 
 
4 ARTIGO................................................................................................................................... 29 
4.1 Artigo1- Caracterização genotípica de espécies de Staphylococcus coagulase negativos 
provenientes de leite bovino encontrados em propriedades e municípios do Norte de Minas 
Gerais......................................................................................................................................... 29 
 
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS.................................................................................................... 54 
14 
 
 
 
1 INTRODUÇÃO 
 Staphylococcus é um grupo heterogêneo composto por 52 espécies e 28 subespécies 
descritas (http://www.bacterio.net/staphylococcus.html). A heterogeneidade evidente no gênero 
Staphylococcus levou a uma classificação baseada em procedimentos de diagnóstico com a 
caracteristica de produção de coagulase, facilitando a abordagem clínica ao diferenciar entre 
espécies patogênicas S. aureus e um grupo denominado Staphylococcus coagulase negativa 
(SCN) (BECKER, et al. 2014). 
 O grupo SCN, até o final da década de 80 era considerado um agente oportunista, de 
menor impacto. BECKER, et al. (2014) e VANDERHAEGHEN et al., (2015) apresentam um 
compilado de dados publicados com abordagem de aspectos epidemiológicos e taxonômicos 
evidenciando a importância do grupo como patógeno para saúde humana e animal. 
 A variedade de espécies desse grupo dificulta a identificação por técnicas 
microbiológicas convencionais, que envolvem etapas onerosas e tempo considerado longo para 
a confirmação dos resultados. A técnica MALDI -TOF MS, desenvolvida no final dos anos oitenta, 
tem sido empregado por obter níveis elevados de confiabilidade e agilidade na identificação de 
microrganismos, (BIER et al., 2017 e CROXATTO; PROD’HOM; GREUB, 2012), incluindo a 
identificação de SCN em leite mastítico (HUBER et al., 2011; TOMAZI et al., 2014; NYMAN et 
al., 2017). 
 Outro agravante observado nas infecçãoes por SCN é a multirresistência aos 
antimicrobianos, em especial ao grupo do beta lactâmicos, largamente utilizados no tratamento 
de infecções da glândula mamária em animais de produção (IBRAHIM et al., 2015) e como 
patógeno nosocomial, restringindo a cura de patologias no âmbito hospitalar (HASHMI et al., 
2016; e WOERTHER et al., 2018). 
 Métodos terapêuticos, realizados com antibioticoterapia, colaboraram com redução de 
doenças na área da veterinária e humana, no entanto, a multirresistência das bactérias levaram 
a proposição de novas moléculas como os carbapenêmicos que já estão apresentando 
multirresistência e comprometendo o tratamento das infecções (PAPHITOU, 2013 e 
WOERTHER et al., 2018). 
 Mediante a presença de Staphylococcus coagulase negativo em leite de vacas com 
mastite subclínica, objetivou se identificar as espécies prevalentes utilizando a técnica MALDI-
TOF MS, avaliar a resistência fenotípica aos beta-lactâmicos e averiguar a presença os genes 
blaOXA-23 e blaKPC, que codificam resistência aos carbapenêmicos em leite de vacas com mastite 
subclínica. 
 
http://www.bacterio.net/staphylococcus.html).
15 
 
 
2 OBJETIVOS 
2.1 Objetivo Geral 
 Caracterizar a participação de Staphylococcus coagulase negativo na etiologia da 
mastite bovina subclínica, a resistência fenotípica aos antimicrobianos beta-lactâmicos e verificar 
a presença de genes relacionados com a resistência aos carbapenêmicos. 
 
2.2 Objetivos Específicos 
- Identificar espécies Staphlylococcus coagulase negativo presentes em rebanhos com mastite 
subclinica pela técnica de MALDI-TOF MS. 
 
- Caracterizar fenotipicamente a resistência dos isolados a antimicrobianos do grupo beta- 
lactâmico. 
 
- Rastrear a presença dos genes blaOXA-23 e blaKPC em isolados resistentes aos carbapenêmicos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
16 
 
 
3 REVISÃO DE LITERATURA 
3.1 Mastite subclínica 
 A mastite é uma doença que acomete os animais leiteiros, principalmente os bovinos e 
economicamente causa muitos prejuízos aos produtores de leite. A inflamação da glândula 
mamária resulta em redução da produção de leite, perdas na quantidade e qualidade do leite, 
abate prematuro, custos no tratamento e na mão de obra (KRISHNAMOORTHY et al., 2017; 
HOGEVEN et al., 2011). 
 Estes danos dependem da gravidade da inflamação e ela pode ser classificada em forma 
subclínica, clínica e crônica, e o seu grau é dependente da natureza do patógeno causador, da 
idade, raça, saúde imunológica e o estado de lactação do animal. Dentre estas citadas, a mastite 
subclínica é a mais difícil e acometidas nos rebanhos leiteiros, pois é devido à ausência de 
qualquer indício visível, no momento da ordenha, como grumos no leite causando altos custos 
no tratamento (BANSAL e GUPTA, 2009). 
 Com isso, a mastite subclínica é 15 a 40 vezes mais prevalente que a mastite clínica. É 
importante enfatizar que os efeitos que os animais afetados por este tipo de inflamação, 
continuam sendo uma fonte contínua de infecção para as vacas sadias no momento da ordenha 
(FAO, 2014). 
 O processo de infecção da glândula mamária é iniciado quando microrganismos 
patogênicos invadem o esfíncter do teto e multiplicam-se no interior dos tecidos mamários. Após 
a invasão ocorre uma intensa migração de leucócitos do sangue para o leite, com o objetivo de 
eliminar o agente infeccioso e alterações da permeabilidade vascular e outros sinais da 
inflamação (SANTOS; FONSECA, 2007). 
 Desse modo, a maior parte dos casos de mastite subclínica em bovinos é de etiologia 
bacteriana e são causadas por cinco bactérias em sua maioria, cujo as espécies mais isoladas 
são a Escherichia coli, Streptococcus uberis, Staphylococcus aureus, Streptococcus dysgolatiae 
e Streptococcus agalacitae. (BRADLEY, 2002; VERMA et al., 2018). 
 Além destas bactérias, outros agentes infecciosos como Staphylococcus coagulase 
negativo estão comumente isolados em amostras de leite bovino (IBRAHIM et al., 2015; 
MAHATO et al., 2017). 
 Em várias pesquisas realizadas em diversos países, inclusive o Brasil, a mastite 
subclínica é a mais prevalente em rebanhos leiteiros. Em estudo realizado por Dieser et al., 
(2014) 2296 vacas leiteiras em 51 rebanhos, 54% dos animais foram diagnosticados com mastite 
subclínica. 
 
17 
 
 
Do mesmo modo, 387 vacas leiteiras no Noroeste da Polônia, foram diagnosticadas com mastite 
subclínica, totalizando 36,7% do rebanho avaliado (SZATACHARÍSKA et al., 2016). 
 E no Brasil, a prevalência de mastite subclínica foram avaliadas em diferentes regiões, 
no Sudeste a inflamação da glândula mamária na forma subclínica variou de 10 a 48,64% e no 
Nordeste de 14,49% a 30,7% (COSTA et al., 2012; RIBEIRO et al., 2009; NEVES et al., 2010; 
BIANCHINI et al., 2010). 
 
3.1.2 Staphylococcus coagulase negativo 
Os estafilococos são bactérias Gram positivas, esféricas, que formam agrupamentos 
irregulares como cachos de uva (Figura 1) no qual, o gênero Staphylococcus spp tem alta 
prevalência em casos de mastite clínica e subclínica em bovinos, sendo o grupo de 
Staphylococcus coagulase negativo (SCN) microrganismos comensais (TORTORA; FUNKE; 
CASE, 2012; ISAAC et al., 2017). 
 
Figura 1- Staphylococcus spp pela coloração de Gram visualizado em microscopia óptica 
 
Fonte: autora (2018) 
 
100µm 
18 
 
 
O gênero Staphylococcus spp consiste em 52 espécies, destes, 38 foram classificados 
como coagulase negativo, responsáveis por diversas infecções e intoxicações emseres 
humanos e animais (BECKER; HEILMANN; PETERS, 2014; DIEDRICH et al., 2013). 
Nos rebanhos bovinos leiteiros de vários países, incluindo o Brasil, foram isoladas várias 
espécies do grupo de Staphylococcus coagulase negativo (Tabela 1). 
 
Tabela 1- Espécies de SCN isolados de leite de vacas com mastite clínica e subclínica 
Espécies de SCN Referências 
Staphylococcus xylosus Harrison et al., 2013 e Mello et al., 2017 
Staphylococcus saprophyticus Mello et al., 2017 e Srednik et al., 2017 
Staphylococcus epidermidis Sampimon et al., 2011 e Mello et al., 2017 
Staphylococcus chromogenes 
Staphylococcus haemolyticus Mello et al., 2017 
Staphylococcus simulans 
Staphylococcus warneri 
Fonte adaptada pela autora (2018) 
 
Além da ocorrência em bovinos, estudos relatam a contaminação por SCN em derivados 
lácteos e produtos cárneos, além de infecções intramamárias em rebanhos caprinos e ovinos 
(BECKER; HEILMANN; PETERS, 2014; CHAJE-CKAWIERZCHOWSKA, 2015; FIJALKOWKI; 
PLEITER; KARAKULSKA, 2016; IBRAHIM et al., 2015), além dos já citados em bovinos. 
Em seres humanos, SCN são encontrados na microbiota normal da pele, entretanto, 
esse grupo está cada vez mais relacionado com infecções graves como bacteremia, endocardite, 
implantações de próteses e cateteres intravasculares (TUFARIELLO e LOWY, 2017; ZHU et al., 
2012). 
 Isso significa que, a maioria dos casos de infecções hospitalares e os encontrados em 
isolados de pacientes com diversas doenças infecciosas são: Staphylococcus haemolyticus, 
Staphylococcus hominis, Staphylococcus capitis, Staphylococcus lugdumensis, Staphylococcus 
epidermidis e Staphylococcus sciuri (HASHMI et al., 2016; HITZENBCHER et al., 2016; MARÍN 
et al., 2017). 
 
19 
 
 
Além destas citadas, outras espécies de Staphylococcus coagulase negativo foram 
isolados de amostras clínicas humanas como, Staphylococcus jettensis, Saphylococcus 
massilensis, Staphylococcus petrasii e Staphylococcus pettenkoferi (DE BEL et al., 2013; AL 
MASSALMA; RAOULT; ROUX, 2010; PANTŮČEK et al., 2013; TRÜLZSCH et al., 2007). 
 
3.1.3 Resistência aos antimicrobianos beta lactâmicos no grupo de Staphylococcus coagulase 
negativo em animais de produção e humanos 
Antimicrobianos são largamente utilizados como promotores de crescimento e no 
combate a infecções intramamárias, causadas por microrganismos patogênicos, principalmente 
por Staphylococcus spp, que possuí versatilidade no desenvolvimento de resistência aos 
antimicrobianos (KESERU et al., 2013; LANDERS et al., 2013). 
Métodos terapêuticos, realizados com uso dos antibióticos, colaborou para a 
transformação da prática médica e veterinária de um diagnóstico e resolução eficaz na cura de 
diversas enfermidades. Porém, poucos anos após o advento dos antimicrobianos, a resistência 
reduziu drasticamente a eficiência desta abordagem de terapia (PAPHITOU, 2013). 
Diante deste problema, os beta lactâmicos se tornaram de certa maneira ineficazes no 
tratamento de infecções da glândula mamária ocasionadas por bactérias estafilocócicas em 
bovinos leiteiros, devido ao uso imprudente desta classe de antibióticos, colocando o Brasil como 
um dos três países com maior utilização de antimicrobianos na produção animal (PRIBUL et al., 
2011; VAN BOECKEL et al., 2015). 
Com isso, estudos foram realizados com espécies do grupo de Staphyococcus 
coagulase negativo para ratificar a multirresistência em rebanhos leiteiros e propriedades rurais 
em diversos países (Tabela 2) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
20 
 
Tabela 2- Multiresistência de espécies de Staphylococcus coagulase negativo ao beta lactâmicos 
em rebanhos leiteiros e ambiente de produção animal. 
*Frequencia de resistência apresentada na sequência citada para as bases utilizadas. 
**Antibióticos: PEN (penicilina); TET (tetraciclina); OXA (oxacilina); TMP-SMX (trimethoprim-
sulfamethoxalaze); GENT (gentamicina); FUS (ácido - fúsidico); CLI (clindamicina); ERI 
(eritromicina). Sequen 
Fonte adaptada pela autora (2018) 
 
Staphylococcus coagulase negativos, são considerados patógenos emergentes e 
oportunistas, sendo os derivados lácteos os principais alvos de contaminação e intoxicações 
alimentares causando riscos aos consumidores, devido à alta prevalência no leite bovino 
(IBRAHIM et al., 2015; TREMBLAY et al., 2013; CHAJE CKAWIERZCHOWSKA, 2015). 
Na área da saúde humana espécies de Staphylococcus coagulase negativo, possuí 
potencial de proliferar em biomateriais e o uso contínuo de antibióticos em centros cirúrgicos e 
pós-operatórios, tornou esses microrganismos multirresistentes. A vancomicina por exemplo, é 
um antimicrobiano beta lactâmico, que após trinta anos foram isolados os primeiros casos 
clínicos com suscetibilidade reduzida, como foi descrito em cepas de Staphylococcus epidermidis 
(CANDIDO; BERNARDI, 2016; HASHMI et al., 2016; PIETTE, 2009; SUJATHA; PRAHARAJ, 
2012). 
 
Espécies 
de SCN 
Frequência de 
resistência (%) 
Bases antimicrobianas Referências País 
 
S.lugdumensis 
S.hominis 
S.epidermidis 
S.xylosus 
S.intermedius 
 
100 
100 
66,6 
42,8 
27,2 
 
 
 
TET 
 
 
 
El-Razik et al., 2017 
 
 
 
Egito 
 
S.epidermiis 
S. 
chromogenes 
S. 
haemolyticus 
S. simulans 
 
74,1; 27; 17; 11; 36 
14; 19; 5 
24; 10 
15; 2; 6 
 
PEN; OXA; ERI; TMP-
SMX; TET 
PEN; OXA; TMP-SMX 
PEN; OXA 
OXA; GENT; TMP-SMX 
 
 
Taponen et al., 2016 
 
 
 
Finlândia 
 
S. sciuri 
 
98; 85; 50; 75; 99; 
76 
 
FUS; TET; ERI; CLI; OXA; 
PEN 
 
Schoenfelder et al., 
2017 
 
 
Alemanha 
21 
 
Além dos centros cirúrgicos e pós-operatórios, a multirresistência antimicrobiana das 
espécies de SCN estão presentes nas infecções perioprotéticas, que são complicações raras em 
cirurgia de prótese e as espécies, cujo apresentaram maior de resistência aos antibióticos beta 
lactâmicos avaliados em 19-40% das infecções foram a penicilina, eritromicina, gentamicina e 
ofloxacina (LOURTET-HASCOËT et al., 2018). 
 
3.1.4 Staphylococcus coagulase negativo resistentes aos carbapenêmicos 
Outra categoria de antibióticos classificados como beta lactâmicos, são os 
carbapenêmicos, agentes terapêuticos para infecções graves. Porém, a incidência de 
multirresistência dos microrganismos patogênicos a esses antimicrobianos está em ascensão 
devido aos mecanismos que as bactérias desenvolveram e disseminam em ambientes 
hospitalares, restringindo o tratamento eficiente ocasionando pandemias no mundo inteiro 
(VERWASET, 2000 e WOERTHER et al., 2018). A utilização dos carbapenêmicos e a 
consequente seleção de bactérias produtoras de carbapenemases, limita a ação terapêutica 
disponível para o tratamento de infecções. 
Três grandes grupos de carbapenemases são conhecidos por inativar o grupo dos 
carbapenêmicos, sendo o grupo classe A (tipos; IIM; SME-; GES- e KPC), classe B ou metallo- 
β- lactamase (tipos; IMP; VIM; SPM e NDM) e classe D oxacilinases (tipo OXA-, principalmente 
a OXA-48 e OXA-23) (AVLAMI et al., 2010 e PEIRANO et al., 2009). 
Esta resistência aos carbapenêmicos, envolve múltiplos mecanismos, incluindo 
alterações na permeabilidade da membrana externa mediada pela perda de porinas, aumento 
da regulação dos sistemas de fluxo juntamente com hiperprodução de β-lactamases AmpC ou 
β-lactamasede espectro estendido. As β-lactamases de KPC, são capazes de hidrolisar além 
dos carbapenêmicos, as cefalosporinas, cefamicinas, monobactâmicos e ácido clavulânico 
(CHEN et al., 2014). 
Outras enzimas são referidas como OXA’s (oxacilinases) devido à sua capacidade de 
hidrolisar a isoxazolilpenicilina- oxacilina mais rapidamente que a benzilpenicilina. Com isso, seis 
grupos de carbapenemases OXA foram representadas por: OXA-51; OXA-23, OXA-40/124; 
OXA-58; OXA-143 e OXA-48 (NOWAK e PALUCHOWSKA, 2016). 
Diante da resistência aos carbapenêmicos, é necessário atentar-se ao uso contínuo 
desta classe de antimicrobianos, pois, pesquisas relatam a presença destes genes de tolerância 
aos carbapenêmicos em produtos de origem animal. Ainda que não existam legislações que 
estabeleçam estudos ou limite de resíduos destes antibióticos em alimentos (MICHAEL et al., 
2015 e MORISSON; RUBIN, 2015), e também foram isolados de diferentes tecidos de cães e 
gatos portadores de conjuntivite, resistência ao carbapnêmico meropenem na espécie de 
Staphylococcus intermedius (FERREIRA et al., 1999). 
 
22 
 
Embora as carbapenemases são considerados predominantes em ambientes 
nosocomiais e comunitários a presença do gene OXA-48 em animais produtores de alimentos, 
sugere que estes possam disseminar em reservatórios de leite cru e possibilitar a transmissão 
da resistência aos seres humanos via alimentação ou mesmo durante o manejo (CECCARELLI 
et al., 2017; KHALIFA et al., 2017; LÜBBERT et al., 2017; MAIRI et al., 2017). 
 
3.1.5 MALDI-TOF MS 
A espectrometria de massa é uma técnica analítica, no qual compostos são ionizados 
em moléculas carregadas. Embora a espectrometria de massa (MS) tenha sido descoberta nos 
primeiros anos do século XX, seu escopo estava limitado às ciências químicas (SINGHAL et al., 
2015). 
 A utilização da MS iniciou se nos anos 70 para identificação de microrganismos, mas o 
grande impulso para a evolução da tecnológica foi dado por Tanaka e seus colaboradores no 
final da década de oitenta. Estes pesquisadores conseguiram ionizar grandes moléculas por 
laser, utilizando uma matriz composta por partículas de cobalto e glicerol. No entanto, a princípio 
não foi possível ionizar moléculas não voláteis ou de grande peso molecular (ANHALT; 
FENSELAU, 1975 e TANAKA et al., 1988). 
O princípio geral do MALDI TOF é simples, os íons de diferentes massas e cargas 
sujeitos a um movimento de campo elétrico e a distância percorrida em um determinado tempo 
é uma função da relação massa-carga (m/z). O termo MALDI deriva se da língua inglesa: Mass 
Assited Laser Desorption/Ionization, ou seja, dessorção/ionização por laser assistido por matriz. 
Os equipamentos de MS apresentaram variados analisadores que separam os íons de diferentes 
pesos/massas. Entre analisadores/separadores de íons, há aqueles que diferenciam 
pesos/massas pelo tempo de voo destas moléculas em tubo de vácuo (TOF: time of ligth) 
(CARBONNELLE; NASSIF, 2011). 
Os íons assim formados, geralmente de carga 1+, no caso de MALDI, será acionado sob 
ação de um campo elétrico e o analisador irá separá-los de acordo com a relação m/z. Eles então 
passam por um número de grades de extração antes de chegar ao “tubo de voo” no final do qual 
é detector. Com isso, para alcançar o detector é calculado a massa de cada partícula e a soma 
dos íons analisados formarão um espectro característico da amostra (CARBONNELLE; NASSIF, 
2011). 
 
 
 
 
23 
 
Figura 2- Princípios da tecnologia de espectrometria de massas por ionização/dessorção de 
matriz assistida por laser por tempo de voo (MALDI-TOF MS) 
 
 
 Fonte: Croxatto, Prod’Hom e Greub (2012). 
 
A tecnologia MALDI-TOF MS, quando comparado a outras técnicas laboratoriais para 
identificação de microrganismos, a principal vantagem desta técnica proteômica é a agilidade 
para obtenção dos resultados. Entre o preparo do depósito e a leitura final, um resultado isolado 
pode ser obtido em menos de trinta minutos (CROXATTO; PROD’HOM; GREUB, 2012). 
 
 
 
 
 
 
 
 
24 
 
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29 
 
 
4 ARTIGO 
4.1. Caracterização epidemiológica e genotípica de espécies de Staphylococcus coagulase 
negativos isolados de leite bovino resistentes a beta lactâmicos 
 
Este artigo foi elaborado conforme as normas da Revista Arquivo Brasileiro de Medicina 
Veterinária e Zootecnia 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
30 
 
 
Caracterização epidemiológica e genotípica de espécies de Staphylococcus coagulase 
negativos isolados de leite bovino resistentes a beta lactâmicos 
Epidemiological and genotypic characterization of beta lactam-resistant isolates of 
Staphylococcus coagulase negative isolates of bovine milk 
L.M.V, Silva1*, A.C, Almeida1, A.R.E.O, Xavier2, S.F, Gonçalves1, G.A.A.D, Souza1, D.A, 
Sanglard1, L, Cardoso2, M.A.S, Xavier2 
1Universidade Federal de Minas Gerais, Montes Claros, MG, Brasil 
2Universidade Estadual de Montes Claros, Montes Claros, MG, Brasil 
*Autor para correspondência- lviavitorino@yahoo.com.br 
 
RESUMO 
Cento e onze isolados cocos Gram positivos, de seis propriedades leiteiras do Norte de Minas 
Gerais, foram identificados pela técnica proteômica. As espécies de Staphylococcus coagulase 
negativo foram submetidas ao teste de difusão de disco com antibióticos convencionais beta-
lactâmicos. Cepas resistentes ao meropenem foram rastreados os genes blaOXA-23 e blaKPC por 
meio da PCR. Através de teste Qui quadrado avaliou- se as espécies de Staphylococcus 
coagulase negativo, quanto a resistência e o índice de multirresistência. Pelo MALDI-TOF MS o 
gênero mais encontrado com 56,8% foi o Staphylococcus spp, o grupo SCN apresentou 
frequência de 27%. As espécies Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus chromogenes 
obtiveram maior prevalência nos rebanhos com 35,8% respectivamente. Em Janaúba a 
propriedade Nova Prima, o valor médio do índice de multirresistência encontrado foi de 0,6, as 
demais propriedades e munícipios foram de 0,5. Nos rebanhos de bovinos leiteiros a resistência 
antimicrobiana foi para as bases cefoxitina (100%), oxacilina (100%), meropenem (100%) e 
vancominicina (100%). Os genes de resistência blaOXA-23 e blaKPC não foram rastreados nas 
espécies Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus 
auriculares e Staphylococcus haemolyticus. Outros mecanismos de resistência estão presentes 
nas cepas causando ineficiência no tratamento antimicrobiano nos rebanhos, comprometendo o 
bem-estar dos animais e saúde pública. 
Palavras chave: genes de resistência; multirresistência antimicrobiana; produtos de origem 
animal 
31 
 
 
 
ABSTRACT 
 
 One hundred eleven Gram positive cocci from six dairy farms in the north of Minas Gerais were 
identified by the proteomic technique. Staphylococcus coagulase negative species were 
submitted to the disc diffusion test with conventional beta-lactam antibiotics. Strains resistant to 
meropenem were screened for the blaOXA-23 and blaKPC genes by PCR. Staphylococcus 
coagulase-negative species were evaluated by Chi-square test for resistance and multidrug 
resistance index. For MALDI-TOF MS the most common genus with 56.8% was Staphylococcus 
spp, the SCN group had a frequency of 27%. The species Staphylococcus epidermidis and 
Staphylococcus chromogenes had a higher prevalence in the herds with 35.8%, respectively. In 
Janaúba Nova Prima property, the mean value of the multiresistance index found was 0.6, the 
other properties and municipalities were 0.5. Cefoxitin (100%), oxacillin (100%), meropenem 
(100%) and vancomycin (100%) were the antimicrobial resistance in the herds of dairy cattle. The 
blaOXA-23 and blaKPC resistance genes were not screened in the species Staphylococcus 
epidermidis, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus auriculares and Staphylococcus 
haemolyticus. Other mechanisms of resistance are present in the strains causing inefficiency in 
the antimicrobial treatment in the herds, compromising the well-being of the animals and public 
health. 
 
Keywords: resistance genes; antimicrobial multiresistance; products of animal origin 
 
 
 
 
 
 
 
 
32 
 
 
INTRODUÇÃO 
A frequência de isolamento do grupo de Staphylococcus coagulase negativo (SCN) no 
final da década de 80 era considerado um agente oportunista de menor impacto, porém tem se 
tornado comum em vários países como causadores de mastite em bovinos leiteiros, 
principalmente em vacas jovens (Becker et al., 2014 Pyörälä e Taponem, 2009; Vanderhaeghen 
et al., 2015). 
Neste grupo estão incluídos uma variedade de espécies, o que dificulta a identificação 
por métodos microbiológicos convencionais (Bier et al., 2017), que interfere nos estudos 
epidemiológicos e patogênicos de mastite causadas por Staphylococcus coagulase negativo. 
Associado à participação de SCN na patogenia das mastites, com alta prevalência a 
identificação de cepas multirresistentes capazes de veicular genes a outras bactérias, incluindo 
S. aureus, desperta para a necessidade de maior conhecimento sobre a real participação deste 
grupo em saúde humana e animal (Isaac et al., 2017). 
Com isso, novos genes são descritos como codificadores de resistência a outros grupos 
de beta lactâmicos como carbapenêmicos como os genes blaOXA-23. Microrganismos contendo o 
gene bla KPC possuí frequentemente vários genes que codificam resistência a outros agentes 
antimicrobianos, como aminoglicosídeos, quinolonas, triemetropim, sulfonamidas e tetraciclinas 
(Chen et al., 2014; Nowak e Paluchowska, 2016). 
 Objetivou-se identificar as espécies prevalentes de SCN em leite de vacas com mastite 
subclínica; averiguar a resistência aos betas lactâmicos e a presença de genes blaOXA-23 e blaKPC, 
relacionados com a resistência aos carbapenêmicos. 
 
 
 
 
 
 
 
33 
 
 
MATERIAL E MÉTODOS 
Este trabalho foi conduzido segundo critérios aprovados pela Câmara de Ética e Experimentação 
Animal (CEUA) com o protocolo n⸰ 145/2013 da Universidade Federal de Minas Gerais. 
 
 Isolados bacterianos 
Cento e onze cepas identificadas como cocos Gram positivos provenientes da 
bacterioteca do Laboratório de Sanidade Animal- CPCA- UFMG foram utilizadas para estapesquisa. Estes foram provenientes de leite de vacas com mastite subclínica em seis 
propriedades do Norte de Minas Gerais conforme descrito em estudos relatados por Xavier et al. 
(2017). 
As cepas estavam armazenadas sobre congelamento em meio BHI contendo 20% de 
glicerol e armazenados em alíquotas em freezer à - 20ºC (Teixeira et al., 2014) e foram ativadas 
em caldo BHI e incubadas por 24h a 37ºC por três vezes consecutivos. 
Para confirmação da pureza das culturas, as colônias foram analisadas 
microbiologicamente quanto à morfologia de colônias ao Agar sangue (Oxoid) suplementado com 
5% de sangue de ovino desfibrinado e coloração de Gram de acordo com Quinn et al., (2005) e 
Koneman; Allen; Janda, (2001). Aquelas colônias que apresentarem morfologia microscópica de 
cocos Gram-positivos, em culturas puras, foram selecionados, repicadas em ágar TSA (Oxoid) e 
enviadas para a análise MALDI-TOF MS. 
 
Análise proteômica através da técnica MALDI TOF MS 
Cento e onze cepas identificadas presuntivamente como cocos Gram positivos, 
conservadas em refrigeração foram ativadas em cultivo em BHI e repicadas em placas contendo 
ágar TSA (Oxoid) e colônias frescas, puras e isoladas foram encaminhados para a realização 
das análises proteômicas ao laboratório AQUACEN/RENAQUA da Escola de Veterinária da 
Universidade Federal de Minas Gerais. 
A análise por MALDI TOF MS foi realizada em conformidade com Assis et al., (2017) 
utilizando o aparelho Microflex TM MALDI TOF MS da Bruker Daltonics. Uma única colônia fresca 
foi colocada usando um palito de madeira estéril e colocada em uma placa de aço de 96 poços. 
34 
 
Para cada estirpe, 1µL de ácido fórmico (70%) e 1µL de matriz MALDI TOF MS, 
constituída por uma solução saturada de α- aciano- 4- hidroxicinâmico (HCCA) Bruker Daltonics, 
Bremen, Alemanha, foram aplicados no local e deixados a temperatura ambiente. Antes das 
medições, a calibração foi procedida por um padrão de teste bacteriano (E. colli DH5 alpha; 
Bruker Daltonics). 
Os critérios de escore de identificação em tempo real foram aqueles recomendados pelo 
fabricante: escore ≥ 2,000 indica identificação a nível de espécie, escore ≥ 1,700 e ≤ 2000 indica 
identificação a nível de gênero e ≤ 1700 indica identificação não confiável. 
 
Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos 
As cepas identificadas como Staphylococcus coagulase negativo pelo MALDI-TOF MS 
foram analisados quanto a resistência a beta lactâmicos, pela técnica de difusão em discos 
conforme Wayne (2016), utilizando os seguintes antibióticos: cefoxitina (30µg) (Laborclin), 
oxacilina (1µg) (Cecon), vancomicina (30µg) (Laborclin),, meropenem (10µg) (Cecon), imepenem 
(10µg) (Cecon) e sulbactam ampicilina (10µg) (Laborclin),. 
O índice de múltipla resistência antimicrobiana (MAR) dos microrganismos foi 
determinado pela relação entre o número de antimicrobianos que a amostra é resistente e o 
número total de antimicrobianos testados. Índice MAR acima de 0,2 foi caracterizado como 
multirresistência (Krumperman, 1983). 
 
Extração de DNA 
Isolados que apresentaram resistência aos carbapenêmico meropenem no teste de 
sensibilidade em disco foram criopreservados e posteriormente reativados pela semeadura em 
meio BHI (Prodimol Biotecnologia) e incubadas a 37ºC durante 24 horas, em três cultivos 
sucessivos. As culturas bacterianas foram enviadas ao laboratório de Biotecnologia da 
Universidade Federal de Minas Gerais, onde foram submetidas a extração de DNA pelo método 
digestão por proteinase K, seguida por fenol-clorofórmio (Barea et al., 2004) com modificações. 
Um volume de 1,5mL de cada cultura de Staphylococcus coagulase negativo foi 
centrifugado a 5000 rpm durante 15 minutos. O sobrenadante foi descartado e o sedimento de 
células bacterianas ressuspendido em 40µL de tampão de lise (NaCl 0,9%, EDTA 0,2M e 
35 
 
 
proteinase K 20mg/mL). Foi adicionado 40µL de SDS a 20% e as amostras incubadas em banho 
maria a 60ºC durante 10 minutos e em seguida resfriados a temperatura ambiente. A integridade 
e quantificação dos DNA’s extraídos foram verificados por eletroforese em gel de agarose a 1%. 
Este material foi utilizado nas reações de PCR. 
 
 Detecção de gene universal para bactérias-16S rDNA 
Para assegurar que o DNA extraído referia-se a bactérias, realizou PCR utilizando os 
primers DG74 (5'-AGGAGGTGATCCAACCGCA-3') e RW01 (5'-
AACTGGAGGAAGGTGGGGAT-3') gerando um amplicon de 370 bp, nas condições descritas 
por Xavier et al., (2017). As reações foram conduzidas utilizando-se um mmix contendo 
2XGoTaq® Green Master Mix (Promega Corporation, USA), MgCl2 (2.5 mm), 10 µM de cada 
primer, e 50 ng de DNA bacteriano bacterial DNA, in a final total volume de reação de 50 μL. As 
condições foram as seguintes: um ciclo inicial de desnaturação em 94 ° C por 5 min seguido por 
35 ciclos de desnaturação a 95 ° C por 30 s, anelamento a 57 ° C por 30s, extensão a 72 ° C por 
45 s e extensão final de 10 min. Os amplicons foram visualizados em gel de agarose a 1,5% 
corado com brometo de etídio e fotografado e documentado. Como controle positivo da PCR, 
uma estirpe nosocomial de Klebsiella pneumoniae identificado pela codificação do gene 16S 
rDNA bacteriano universal foi usado. 
 
 Análise de PCR para detecção dos genes de resistência blaOXA23 e blaKPC 
Todos os primers utilizados neste trabalho foram sintetizados pela Integrad DNA 
Technology USA e estão apresentados no quadro a seguir: 
Quadro 1 Sequência dos oligonucleotídeos, genes alvo, tamanhos dos fragmentos amplificados 
(amplicons em pares de bases- pb) e referências que foram utilizados nas análises moleculares. 
 
 
 
 
 
36 
 
 
Oligonucleotídeo Sequência Gene 
Alvo 
Amplicon 
 
Referência 
OXA23F 
OXA 23R 
 ATGTGTCATAGTATTCGTCG 
TCACAACAACTAAAAGCACTG-
3 
 blaOXA-23 1057 pb Fonseca et al., 
(2013) 
Bla KPC F 
Bla KPC R 
 
TGT CAC TGT ATC GCC GTC 
CTC AGT GCT CTA CAG AAA 
ACC 
 bla KPC 876 pb Yigit et al., (2001); 
 
 
As reações para pesquisa presença do gene blaOXA-23 ocorreram em uma mistura 
contendo 1X Taq buffer do kit Kappa PCR, 2,5 mM MgCl2, 1 µM desoxinucleotídeos, 0,5 U Taq 
Polimerase Taq, 1,25 µM de cada primer, e 1 µL (50 ng / µL) de DNA bacteriano, para um volume 
final da reação de 25µL. 
As condições de amplificação foram as seguintes: um ciclo de desnaturação inicial a 95 
° C por 3 min, seguido por 35 ciclos de desnaturação a 95 ° C por 30 s, anelamento a 55 ° C por 
30 s, extensão a 72 ° C por 30 s, e um final extensão de 5min Carvalho et al., (2016). Como 
controle positivo para a PCR, foi utilizada uma cepa de Acinetobacter baumannii isolada em 
pesquisas anteriores e geneticamente identificados por um laboratório brasileiro de referência 
(Fundação Ezequiel Dias) como A. baumannii codificando o gene blaOXA-23. Como controle 
negativo, utilizou-se uma cepa de Escherichia coli, ATCC 25922. 
Para rastrear o gene blaKPC, as amplificações foram realizadas em uma PCR contendo 
2x Go Taq Green Master Mix® (Promega, EUA), 2,5mM MgCl2, 10µM cada iniciador e 50ng de 
DNA bacteriano em um volume final de 50µL. As condições de amplificação foram de 5 minutos 
a 95ºC, seguido de 35 ciclos de desnaturação a 95ºC por 1 minuto, anelamento a 58ºC por 30 
segundos e extensão a 72ºC por 1 minuto e meio. A amplificação obteve uma extensão final a 
72ºC por 10 minutos. Como controle positivo para PCR, utilizou se a cepa K. pneumoniae e água 
como controle negativo. Yigit et al., (2001); 
Todos amplicons dos genes descritos foram visualizados em gel de agarose a 1,5% 
corados com brometo de etídeo e fotodocumentados. 
 
 
37 
 
 
 
 Análise estatística 
Os resultados foram submetidos à estatística descritiva por meio da distribuição das 
frequências relativa para os achados microbiológicos. Foi utilizado o teste qui-quadrado em nível 
de significância de 5% para avaliar a diferenças entre a frequência de Staphylococcuscoagulase 
negativo (SCN) nas propriedades e nos municípios. Para verificar se houve associação entre 
resistência dos antimicrobianos nas propriedades e nos municípios foi realizado o mesmo teste 
estatístico descrito acima. As análises foram realizadas através do programa R versão 3.5.0. 
 
RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 
 Espécies de Staphylococcus spp identificados pelo MALDI-TOF MS 
Através da técnica MALDI - TOF MS o gênero mais encontrado com 56,8% (n= 63/111) 
foi o Staphylococcus spp. Entre estes, Staphylococcus aureus correspondeu a 70,0% (n= 44/63) 
e o grupo Staphylococcus coagulase negativo apresentou frequência de 27,0% (n= 17/63). 
No quadro 2 estão apresentados os resultados de localização das cepas identificadas 
como SCN, bem como, os resultados na coloração pelo método de Gram, teste de coagulase e 
análise proteômica. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
38 
 
Quadro 2- Caracterização fenotipica de resistência a antibióticos, bioquímica, coloração pelo Gram, análise de perfil proteômico e genômico de dezessete cepas 
de Staphylococcus coagulase negativo isolados de vacas com mastite subclínica em rebanhos do Norte de Minas Gerais. 
 
 
Fazenda* Data de 
Isolamento 
Município Perfil de resistência 
a antimicrobianosa 
Analise 
microbiologia-
coloração pelo Gram 
Teste 
bioquímico- 
coagulase 
Análise proteômica 
MALDI-TOF 
Gene 16S 
rDNA 
universal de 
bactéria 
Perfil Genômico 
Gene 
blaKpc 
Gene 
blaOXA23 
MUG 1 16/02/2018 Porteirinha CFO, OXA, VAN Staphylococcus spp - Staphylococcus epidermidis + NT NT 
MUG 2 16/02/2018 Porteirinha Sensível Staphylococcus spp - Staphylococcus epidermidis + NT NT 
NP 1 16/02/2018 Janaúba CFO, OXA, MER Staphylococcus spp - Staphylococcus epidermidis + - - 
NP 2 16/02/2018 Janaúba CFO, OXA Staphylococcus spp - Staphylococcus epidermidis + NT NT 
NP 3 16/02/2018 Janaúba CFO, OXA, VAN Staphylococcus spp - Staphylococcus epidermidis + NT NT 
NP 4 16/02/2018 Janaúba CFO, OXA Staphylococcus spp - Staphylococcus haemolyticus + NT NT 
VA 1 16/02/2018 Janaúba CFO, OXA Staphylococcus spp - Staphylococcus warneri + NT NT 
VA 2 16/02/2018 Janaúba Sensível Staphylococcus spp - Staphylococcus chromogenes + NT NT 
TR 1 16/02/2018 Bocaiuva CFO, OXA, MER Staphylococcus spp - Staphylococcus crhomogenes + - - 
TR 2 16/02/2018 Bocaiuva CFO, OXA, MER Staphylococcus spp - Staphylococcus chromogenes + - - 
GU 1 16/02/2018 Icaraí de Minas CFO. OXA Staphylococcus spp - Staphylococcus epidermidis + NT NT 
GU 2 16/02/2018 Icaraí de Minas CFO, OXA, VAN Staphylococcus spp - Staphylococcus chromogenes + NT NT 
FEHAN 1 16/02/2018 Montes Claros CFO, OXA, MER Staphylococcus spp - Staphylococcus crhomogenes + - - 
FEHAN 2 16/02/2018 Montes Claros CFO, OXA, MER Staphylococcus spp - Staphylococcus auriculares + - - 
FEHAN 3 16/02/2018 Montes Claros Sensível Staphylococcus spp - Staphylococcus chromogenes + NT NT 
FEHAN 4 16/02/2018 Montes Claros CFO, OXA, MER Staphylococcus spp - Staphylococcus haemolyticus + - - 
FEHAN 5 16/02/2018 Montes Claros Sensível Staphylococcus spp - Staphylococcus auriculares + NT NT 
 
 CFO= Cefoxitina; OXA= Oxacilina; MER= Meropenem; VAN= Vancomicina; NT= Não testado- maiores detalhes em material e métodos; 
 (-) Resultado negativo; (+) Resultado positivo 
 
 *MUG= Muganga; NP= Nova Prima; VA= Vista Alegre; TR= Triunfo; FEHAN= Fazenda Experimental Professor Hamilton de Abreu Navarro 
 
 
 
39 
 
S. epidermidis e S. chromogenes foram identificados na mesma frequência, 
correspondendo a 35,3% dos isolados, seguidos de S. auriculares, S. haemolyticus e S.warneri 
(Graf.1). Estudos relatam a presença das mesmas espécies de SCN aqui identificadas, ainda 
que utilizando metodologias diferentes para identificação. 
 
 
Gráfico 1- Frequência de espécies de Staphylococcus spp multirresistentes identificados pelo 
MALDI- TOF MS em vacas com mastite subclínica 
 
Mello et al., (2017), Silva et al., (2014) também observaram frequência semelhante de 
Staphylococcus chromogenes e Staphylococcus epidermidis em leite de tetos com mastite 
subclínica. Já Lange et al., (2015) observaram Staphylococcus chromogenes (38.5%) em 
frequência superior a S. epidermidis (13.1%). Os autores supracitados também observaram em 
menor frequência S. haemolyticus, Staphylococcus auricularis S. warneri além de outros SCN. 
Em outros países, a frequência de espécies de SCN é variável, conforme descrito por Pyörälä e 
Taponen (2009); Piessens et al., (2011); Piessens et al., (2012); De Vliegher et al., (2012) e 
Thorberg et al., (2009) também observaram maior frequência de Staphylococcus chromogenes 
e Staphylococcus epidermidis em leite de tetos com mastite subclínica e Taponen et al., (2016) 
0.00%
10.00%
20.00%
30.00%
40.00%
50.00%
60.00%
70.00%
80.00%
F
re
q
u
ê
n
c
ia
 (
%
)
Espécies identificadas
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus chromogenes
Staphylococcus auricularis
Staphylococcus haemolyticus
Staphylococcus warneri
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=De%20Vliegher%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22365187
40 
 
que identificaram Staphylococcus epidermidis (30,7%) como o segundo agente em maior 
frequência em mastite subclínica. 
Essas pesquisas utilizaram identificação genética de SCN. Já Tomazi et al. (2014) 
utilizaram MALDI-TOF e Frey et al. (2013) também encontraram uma diversidade de espécies 
em leite de tetos com mastite subclinica, corroborando em parte com o estudo, pois, S. 
chromogenes (74,07%) com maior prevalência seguido de S. haemolyticus e S. epidermidis entre 
outros SCN. 
A eficiência do MALDI- TOF MS utilizado nos isolados de leite bovino contaminados por 
mastite subclínica foi de 92% (n=102/111) corroborando com o trabalho de Schaubauer et al., 
(2014) que, ao empregar a mesma técnica, obteve 90,5% de acerto em vinte e uma amostras de 
isolados de leite em vacas com mastite subclínica. 
A metodologia MALDI- TOF MS, comparado com outras técnicas laboratoriais para a 
identificação de microrganismos, possuí a vantagem de agilidade e exatidão nos resultados. 
Entre o preparo do depósito até a leitura final, um resultado isolado pode ser obtido em menos 
de trinta minutos (Croxatto; Prod’Hom e Greub, 2012). 
Ao avaliar epidemiologicamente a participação de SCN entre os rebanhos estudados, a 
frequência de espécies de Staphylococcus coagulase negativo identificados foi semelhante entre 
as fazendas (Graf. 2) (p= 0,1546) e municípios (Graf. 3) (p= 0,3917). A prevalência de espécies 
SCN na etiologia de mastite bovina é variável com as regiões de estudo (ISAAC et al., 2017; 
NYMAN et al., 2017; VANDERHAEGHEN et al., 2015,) e com uma diversidade epidemiológica 
entre rebanhos e entre as espécies (PIESSEN et al., 2012), conforme observado neste trabalho. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
41 
 
 
Gráfico 2- Frequência de espécies de SCN em cada propriedade do Norte de Minas Gerais (p= 
0,1546) 
 
 
Gráfico 3: Frequência de SCN em cada município do Norte de Minas Gerais (p= 0,3917). 
 
A avaliação da clonalidade entre estes isolados poderá indicar mais claramente a 
veiculação entre e intra rebanhos, conforme observado por Piessens et al., (2012) ao detectarem 
genótipos semelhantes de SCN em leite contaminado por mastite, de diferentes rebanhos, assim 
como no ambiente. 
 
 
 
0%
2%
4%
6%
8%
10%
12%
14%
16%
18%
20%
F
re
q
u
ê
n
c
ia
 S
C
N
Propriedades de bovinos leiteiros do Norte de Minas Gerais
S.chromogenes
S. epidermidis
S.hamolyticus
S.auricularis
S.warneri
0%
2%
4%
6%
8%
10%
12%
14%
16%
18%
20%
F
re
q
u
ê
n
c
ia
 d
e
 S
C
N
Municipios do Norte de Minas Gerais
S.chromogenes
S.epidermidis
S.haemolyticus
S.auricularis
S.warneri
42 
 
 
Multiresistência dos Staphylococcus coagulase negativo frente aos antibióticos 
convencionais avaliados nas propriedades e municípios do Norte de Minas Gerais 
A resistência das espéciesdo grupo de Staphylococcus coagulase negativo foi 
observada em treze cepas das dezessete identificadas. As espécies Staphylococcus 
epidermidis, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus 
auricularis e Staphylococcus warneri, obtiveram resistência elevada as bases cefoxitina (100%), 
oxacilina (100%), meropenem (100%) e vancomicina (100%), exceto para os antimicrobianos 
subactam-ampicilina e imepenem, conforme a Tab. 1. 
Todos os munícipios e propriedades avaliados, apresentaram multirresistência ao beta 
lactâmicos testados. O município de Janaúba apresentou o índice de multirresistência (MAR) 
mais elevado com valor médio de 0,6 (n= 4/6) os demais municípios Bocaiúva, Porteirinha, Icaraí 
de Minas e Montes Claros, foram observados que o MAR obtiveram valores médios de 0,5 (n= 
3/6) estes resultados mostraram que todos os municípios foram multirresistentes devido à 
resistência a mais de dois antibióticos utilizados. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
43 
 
Tabela 1- Perfil de resistência e multirresistência das espécies do grupo de Staphylococcus coagulase negativo frente ao beta lactâmicos isolados de 
leite bovino nos municípios de propriedades do Norte de Minas Gerais 
 
Espécies de 
SCN 
Municípios Resistência antimicrobiana entre os municípios (%) MAR entre 
municípios 
Fazendas Resistência antimicrobiana entre as fazendas (%) MAR 
entre as 
fazendas CFO OXA VAN MER SBA IMP CFO OXA VAN MER SBA IMP 
 
 
S. epidermidis 
 
Janaúba 
 
100 
 
 
100 
 
33,3 
 
33,3 
 
0 
 
0 
 
0,6 
 
Nova Prima 
 
 
 
100 
 
100 
 
33,3 
 
33,3 
 
0 
 
0 
 
0,6 
Porteirinha 
 
50 50 50 0 0 0 0,5 Muganga 50 50 50 0 0 0 0,5 
 
Icaraí de 
Minas 
 
100 
 
100 
 
0 
 
0 
 
0 
 
0 
 
0,3 
 
GU 
 
100 
 
100 
 
0 
 
0 
 
0 
 
0 
 
0,3 
 
S.chromogenes 
 
Bocaíuva 
 
100 
 
100 
 
0 
 
100 
 
0 
 
0 
 
0,5 
 
Triunfo 
 
100 
 
100 
 
0 
 
100 
 
0 
 
0 
 
0,5 
 
Icaraí de 
Minas 
 
100 
 
100 
 
100 
 
0 
 
0 
 
0 
 
0,5 
 
GU 
 
100 
 
100 
 
100 
 
0 
 
0 
 
0 
 
0,5 
 
S.haemolyticus 
 
Janaúba 
 
100 
 
100 
 
0 
 
0 
 
0 
 
0 
 
0,3 
 
Nova Prima 
 
100 
 
100 
 
0 
 
0 
 
0 
 
0 
 
0,3 
 
Montes 
Claros 
 
100 
 
100 
 
0 
 
100 
 
0 
 
0 
 
0,5 
 
FEHAN 
 
100 
 
100 
 
0 
 
100 
 
0 
 
0 
 
0,5 
 
S. auricularis 
 
Montes 
Claros 
 
50 
 
50 
 
0 
 
50 
 
0 
 
0 
 
0,5 
 
FEHAN 
 
50 
 
50 
 
0 
 
50 
 
0 
 
0 
 
0,5 
 
S. warneri 
 
 
Janaúba 
 
100 
 
100 
 
0 
 
0 
 
0 
 
0 
 
0,3 
 
Vista 
Alegre 
 
100 
 
100 
 
0 
 
0 
 
0 
 
0 
 
0,3 
 
Valor de P 
 
 
0,3917 
 
 
0,5712 
 
 
0,5712 
 
 
0,3564 
 
 
0,0881 
 
 
N.V 
 
 
N.V 
 
 
0,5712 
 
 
0,1546 
 
 
0,4442 
 
 
0,4442 
 
 
0,1326 
 
 
0,421 
 
 
N.V 
 
 
N.V 
 
 
0,4442 
Nota: CFO= cefoxitina; SBA= subactam- ampicilina, OXA= oxacilina; VAN= vancomicina; IPM= imepenem; MER= meropenem; MAR= índice de 
multiresistência antimicrobiana. 
Valores de P através do teste Qui quadrado (p< 0,05); NV= Não houve variação significativa 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
44 
 
 
Assim como nas propriedades, no qual a fazenda Nova Prima obteve o MAR mais 
elevado, com valor médio de 0,6 (n=4/6) as demais propriedades avaliadas Muganga, Triunfo, 
Gu e FEHAN, foram observados valores de MAR em 0,5 (n=3/6). 
Os resultados encontrados entre os municípios e propriedades em relação ao MAR e a 
resistência corroborou com o trabalho de Xavier et al., (2017) que observaram resistência 
antimicrobiana em cepas de Staphylococcus aureus, encontrados em rebanhos leiteiros com 
mastite subclínica, nos municípios de Janaúba, Bocaiuva e Icaraí de Minas. 
Assim como foram semelhantes ao de Mahato et al., (2017) Taponen et al., 2016 que 
observaram maiores índices de resistência as bases cefoxitina e oxacilina, respectivamente, por 
SCN isolados de tetos de vacas com mastite subclínica. 
A participação de SCN multiresistentes a antimicrobianos é descrita em pesquisas em 
vários países, incluindo o Brasil (Bansal et al., 2015; Mahato et al., 2017; Tapponen, et al., 2016). 
Em relação à multirresistência aos betas lactâmicos, resultados semelhantes foram 
observados Bansal et al., (2015) ao avaliarem SCN isolados de tetos com mastite subclínica, no 
entanto, quando se avalia as bases antimicrobianas, maiores índices de resistência à penicilina, 
ampicilina e amoxilina. os autores observaram 50,9% de resistência a amoxilica + sulbactam, 
diferente dos resultados obtidos neste trabalho que foi de 100% de cepas sensíveis. Deve-se 
considerar que os autores realizaram um estudo mais amplo com número maior de isolados SCN 
e as espécies em estudo não foram citadas no trabalho. 
Da mesma maneira, Soares et al. (2012) observaram maiores índices de SCN 
multirresistentes aos betas –lactâmicos ampicilina (79%) e penicilina (79%), mas também 
observaram 40% de resistência a oxacilia e cefalotina, semelhante aos resultados aqui obtidos, 
ainda que as espécies SCN não sejam as mesmas observadas neste estudo. Frey et al., (2013) 
observaram 43,9% de SCN resistente a oxacilina em mastite subclínica. 
Em relação às espécies de SCN resistentes aos beta lactâmicos, os estudos de Sawant 
et al., 2009 e Waller et al., (2011) observaram altas frequências S. epidermidis, S. chromogenes 
e S. haemolyticus multirresistentes a beta lactâmicos, mas em nenhum destes trabalhos 
observou-se resitência a oxacilina e cefoxtina, o que caracteriza a resistência a meticilina. 
 
 
 
 
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bansal%20BK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27047108
45 
 
 
Poucos estudos descrevem as espécies de SCN observadas neste estudo quanto à 
meticilina indicada pela resistência a oxacilina e cefoxitina. No Brasil, Santos et al. (2016) 
observaram S. epidermidis Meticilina resistente em leite de tetos com mastite subclínica, sendo 
confirmado fenotipicamente pela resistência a oxacilina e cefoxitina, bem como geneticamente. 
Kibli et al., (2018), Bandyopadhyay et al., (2015); Frey et al., (2013) também descrevem 
diagnostico de S. epidermidis Meticilina resistente em outros países, corroborando com os 
resultados aqui obtidos. 
Quanto a S. chromogenes meticilina resistente, os resultados aqui alcançados são 
corroborados por Xu et al., (2015) relatam 75 % de cepas S. chromogenes meticilina resistentes 
em leite de tetos com mastite subclinica na China e Taponem et al., (2015), no entanto, já 
observam isolados S. epidermidis, S. chromogenes e S. haemolyticus resistentes a oxacilina 
em leite de tetos com mastite subclínica. 
Todos estes autores destacam a importância de SCN metilicina resistentes importância 
tanto na saúde humana quanto animal, mediante a possibilidade de transferência de genes de 
resistência, sendo este grupo um importante reservatório de elementos genéticos móveis que 
podem participar não só da resistência a beta-lactâmicos como a outras classes de 
antimicrobianos (Vanderhaeghen et al., 2015), além da possibilidade de veiculação de cepas 
entre animais e humanos (Beyene, et al., 2017). Santos et al., (2016), em estudos com S. 
epidermidis meticilina resistente isolados de rebanhos brasileiros evidenciaram que este 
patógeno pode ser reservatório de genes de resistência a beta lactâmicos para outras espécies 
de estafilococos. 
Os autores destacam a importância de conhecimento sobre a resistência fenotípica de 
Staphylococcus só em uma dada região para que procedimentos preventivos e terapêuticos 
sejam adotados, objetivando a redução da disseminação de genes de resistência nos rebanhos 
e entre animais e humanos. 
A resistência ao carbapenêmico meropenem observada nos isolados S. epidermidis,