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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS 
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS 
 
 
 
 
Celso Martins Queiroz Junior 
 
 
 
 
 
CARACTERIZAÇÃO DA DOENÇA 
PERIODONTAL ASSOCIADA À ARTRITE 
EXPERIMENTAL EM CAMUNDONGOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Belo Horizonte 
2011 
 
Celso Martins Queiroz Junior 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CARACTERIZAÇÃO DA DOENÇA 
PERIODONTAL ASSOCIADA À ARTRITE 
EXPERIMENTAL EM CAMUNDONGOS 
 
 
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em 
Biologia Celular do Instituto de Ciências Biológicas 
da Universidade Federal de Minas Gerais, como 
requisito parcial para a obtenção do título de doutor 
em Biologia Celular. 
 
Orientadora: Profa. Tarcília Aparecida da Silva 
 Departamento de Clínica, Patologia 
e Cirurgia Odontológica – Faculdade 
Odontologia/UFMG 
 
Co-orientadora: Profa. Danielle da Glória de Souza 
 Departamento de Microbiologia – 
ICB/UFMG 
 
 
 
 
 
 
 
 
Belo Horizonte 
2011 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Trabalho realizado no Laboratório de Interação Microrganismo-Hospedeiro 
(Departamento de Microbiologia – ICB/UFMG), Laboratório de Imunofarmacologia 
(Departamento de Bioquímica e Imunologia – ICB/UFMG), Laboratório de Patologia 
(Departamento de Clínica, Patologia e Cirurgia Odontológica – Faculdade de 
Odontologia/UFMG) e Laboratório de Histologia (Departamento de Ciências Biológicas 
– Faculdade de Odontologia/USP), com o auxílio financeiro do Conselho Nacional de 
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e da Fundação de Amparo à Pesquisa 
do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG). 
 
AGRADECIMENTOS 
 
 
“POR TUDO O QUE TENS FEITO, 
POR TUDO O QUE VAIS FAZER, 
POR TUAS PROMESSAS E TUDO O QUE ÉS, 
EU QUERO TE AGRADECER, 
COM TODO O MEU SER! 
TE AGRADEÇO, MEU SENHOR!” 
(Dennis Jerningan. Versão: Ana Bessa) 
 
 
Todos os outros, de alguma forma, presentes em minha história, sintam-se 
abraçados. 
Família, orientadoras, chefe, professores, funcionários, meu povo dos 
laboratórios, do grupo de pesquisa, das classes, da vida: muito obrigado! 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
É NA MUDANÇA QUE ENCONTRAMOS UM OBJETIVO. 
HERÁCLITO DE ÉFESO 
 
O MUNDO DETESTA MUDANÇAS E, NO ENTANTO, É A ÚNICA COISA QUE TRAZ 
PROGRESSO. 
CHARLES FRANKLIN KETTERING 
 
RESUMO 
 
 
A doença periodontal (DP) é uma condição inflamatória crônica, de origem infecciosa, 
associada à perda dos tecidos de suporte dos dentes. Sua patogênese pode estar 
associada a doenças sistêmicas, como a artrite reumatóide (AR). A AR é uma doença 
inflamatória crônica, progressiva, de caráter autoimune, que resulta na destruição 
articular. DP e AR compartilham inúmeras características e mecanismos patogênicos e, 
de fato, estudos clínicos indicam que pacientes com AR são acometidos por DP com 
mais frequência e maior gravidade. Porém esta associação ainda não está bem 
estabelecida. Sendo assim, os objetivos deste trabalho consistiram em caracterizar a DP 
induzida ou exacerbada pela AR utilizando modelos experimentais em camundongos. 
Inicialmente, estabeleceu-se um modelo de artrite crônica induzida por antígeno 
(albumina de soro bovino metilada) (AIA) e foram avaliados parâmetros articulares, 
periodontais e sistêmicos. Concomitantemente à lesão articular, observou-se perda óssea 
alveolar dependente da microbiota oral, associada ao aumento da expressão de TNF-α, 
IL-1β, IFN-γ, IL-6 na maxila, do fator de transcrição RORγ no linfonodo cervical, de 
anticorpos séricos anti-colágeno tipo I, além de maior reatividade celular ao colágeno 
tipo I. Também houve melhora dos parâmetros articulares, orais e séricos avaliados na 
AIA após tratamento com uma terapia anti-TNF-α. Posteriormente, associou-se o 
modelo experimental de AIA a um modelo de DP induzida por Aggregatibacter 
actinomycetemcomitans, para investigar a influência da AIA sobre a DP já estabelecida. 
A AIA exacerbou a perda óssea alveolar induzida por A. actinomycetemcomitans, ao 
passo que a infecção oral não alterou a lesão articular. Esse processo foi associado ao 
aumento da expressão do fator de transcrição tBET nos linfonodos cervicais, da citocina 
IFN-γ na maxila, bem como de níveis significativos de IL-6 no soro. Esta condição 
também foi melhorada após terapia anti-TNF-α. Desta forma, conclui-se que a AIA 
experimental induz sinais de DP e exacerba a perda óssea alveolar desencadeada por A. 
actinomycetemcomitans. Essas alterações periodontais são dependentes da microbiota 
oral e são atenuadas por uma terapia anti-TNF-α. 
 
Palavras-chave: Artrite, Doença Periodontal, TNF-α, Microbiota Oral. 
 
 
 
ABSTRACT 
 
 
Periodontal disease (PD) is a chronic infectious and inflammatory condition of the tooth 
supporting tissues, whose pathogenesis may be associated to systemic conditions, such 
as rheumatoid arthritis (RA). RA is a chronic systemic auto-immune inflammatory 
disorder, which triggers joint lesions. PD and RA share several pathogenic features and, 
indeed, clinical studies have suggested that RA patients are more likely to experience 
PD more frequently and intensively. Nevertheless, this association is not well 
understood. Therefore, the aim of the current study was to characterize the PD induced 
or exacerbated by RA, using experimental models in mice. Initially, a mouse model of 
chronic antigen-induced arthritis (AIA) was established and joint, periodontal and 
systemic parameters were evaluated. Concomitantly to joint lesion, there was significant 
alveolar bone loss, which was dependent on oral microbiota and was associated to 
enhanced expression of TNF-α, IL-1β, IFN-γ, IL-6 in maxillae, the transcription factor 
RORγ in submandibular lymph node, serum anti-collagen I IgG, besides increased cell 
reactivity to this protein. Joint, oral and serum conditions triggered by AIA were 
ameliorated by treatment with an anti-TNF-α therapy. Subsequently, the experimental 
AIA model was associated to a model of Aggregatibacter actinomycetemcomitans-
induced PD, in order to investigate the influence of AIA on established PD. AIA 
exacerbated the alveolar bone loss triggered by A. actinomycetemcomitans, although the 
oral infection did not influence joint lesion. This process was associated to enhanced 
expression of the transcription factor tBET in submandibular lymph nodes, higher 
release of IFN-γ in maxillae, as well as the production of significant serum levels of IL-
6. This condition was also ameliorated by an anti-TNF-α therapy. In conclusion, 
experimental AIA induces signs of PD and exacerbates A. actinomycetemcomitans-
induced alveolar bone loss. These periodontal imbalances are dependent on oral 
microbiota and are attenuated by an anti-TNF-α therapy. 
 
Keywords: Arthritis, Periodontal Disease, TNF-α, Oral Microbiota. 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS .................................................................................... 9 
1 REFERENCIAL TEÓRICO ................................................................................. 10 
1.1 A doença periodontal .......................................................................................... 10 
1.1.1 Patogênese da DP .............................................................................................. 11 
1.1.2 Modelos experimentais de DP ............................................................................ 12 
1.2 A artrite reumatóide ........................................................................................... 13 
1.2.1 Patogênese da AR .............................................................................................. 13 
1.2.2 Modelos experimentais de AR ............................................................................. 15 
1.3 Artrite reumatóide x doença periodontal ...........................................................15 
1.3.1 Correlação entre AR e DP .................................................................................. 18 
2 ARTIGO CIENTÍFICO 1 ...................................................................................... 22 
3 ARTIGO CIENTÍFICO 2 ...................................................................................... 38 
4 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 68 
5 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 76 
6 PERSPECTIVAS ................................................................................................... 77 
REFERÊNCIAS ........................................................................................................ 78 
ANEXO: Protocolo de aprovação CETEA/UFMG ................................................. 87 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS 
 
 
AIA Artrite induzida por antígeno 
AR Artrite reumatóide 
DP Doença periodontal 
FoxP3 Forkhead box P3 
FR Fator reumatóide 
GATA Guanine-Adenine-Thymine-Adenine - Fator de transcrição com 
capacidade se ligar à sequência de DNA GATA 
HLA Human leukocyte antigen 
IFN-γ Interferon-γ 
IL- Interleucina- 
LN Linfonodo 
mBSA Albumina de soro bovino metilada 
MPO Mieloperoxidase 
NAG N-acetilglicosaminidase 
RANKL Ligante do Receptor Ativador do Fator Nuclear (NF)-κB 
RORγ Retinoic acid-related orphan receptor gamma 
tBET T-box expressed in T cells 
TNF-α Fator de necrose tumoral-α 
 
 
1 REFERENCIAL TEÓRICO 
 
 
1.1 A doença periodontal 
 
A doença periodontal (DP) é uma condição inflamatória crônica e destrutiva das 
estruturas de sustentação dos dentes – osso alveolar, ligamento periodontal, cemento e 
gengiva. A DP é uma das causas mais significativas de perda dental em adultos, além de 
ser considerada uma das formas mais prevalentes de doença que afeta estruturas ósseas 
em humanos (BAKER, 2000). Essencialmente, a DP é uma doença de origem 
infecciosa, desencadeada pelo acúmulo de bactérias predominantemente anaeróbias 
Gram-negativo na região subgengival, o que induz uma cascata inflamatória e estimula 
a destruição tecidual mediada pelo próprio hospedeiro. Na ausência de tratamento, essa 
destruição progressiva do ligamento periodontal e osso alveolar pode levar à formação 
de bolsas periodontais e retração gengival, podendo evoluir até a perda dos dentes 
(PAGE et al., 1997; SANZ; WINKELHOFF, 2011). 
Estudos epidemiológicos indicam que uma grande porcentagem da população 
mundial adulta é afetada significativamente por algum tipo de DP, sendo a periodontite 
crônica uma doença prevalente na população idosa. Apesar disso, é comum encontrar 
DP crônica entre indivíduos de diferentes faixas etárias (ALBANDAR, 2005). 
Estimativas indicam que aproximadamente 25-48% dos norte-americanos e mais de 
30% dos indivíduos adultos do Reino Unido têm periodontite crônica, e valores 
similares ou maiores que esses já foram relatados em outras populações. No Brasil, uma 
recente avaliação epidemiológica, realizada em 2010, indicou que cerca de metade da 
população adulta do país apresenta sangramento gengival e cálculo dentário e que 
aproximadamente 30% dela possui bolsas periodontais em uma ou mais regiões da boca 
(BRASIL, 2011). Sendo assim, as DPs representam importantes questões 
socioeconômicas e de saúde pública em âmbito mundial (ALBANDAR, 2005; 
BRASIL, 2011; MORRIS et al., 2001; WILLIAMS, 1990). 
O impacto da DP nas populações se deve não apenas à perda dos dentes. Estudos 
sugerem que pessoas com DP avançada podem ser até duas vezes mais susceptíveis a 
doenças cardiovasculares do que pessoas sem DP (ALMAN et al., 2011; PAQUETTE, 
2004). Infecções orais maternas também podem constituir fatores de risco para 
complicações na gravidez, tais como o nascimento de bebês prematuros (MADIANOS; 
 Referencial Teórico 
 
 11
 
BOBETSIS; KINANE, 2002). A relação entre a DP e outras condições inflamatórias, 
como a artrite reumatóide, também parece ser significativa, sendo que indivíduos com 
artrite tendem a apresentar lesão periodontal mais frequentemente e com maior 
gravidade que indivíduos sem artrite. Entretanto, os mecanismos dessa relação ainda 
não são bem compreendidos (DE PABLO et al., 2009; MERCADO et al., 2001). 
 
1.1.1 Patogênese da DP 
 
A DP crônica apresenta etiologia bacteriana com padrão complexo, existindo uma 
variedade de microrganismos responsáveis por seu desencadeamento e outros por sua 
progressão. Embora a DP tenha agentes etiológicos já identificados, como 
Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythensis e Aggregatibacter 
actinomycetemcomitans, a resposta do hospedeiro a esses microrganismos 
periodontopatogênicos desempenha papel importante no desenvolvimento da doença 
(PAQUETTE; WILLIAMS, 2000; SANZ; WINKELHOFF, 2011). 
As bactérias presentes nos tecidos subgengivais desencadeiam uma resposta 
inflamatória associada à destruição tecidual. A interação entre o crescente número de 
microrganismos e de seus fatores de virulência com o epitélio gengival induz a 
expressão de moléculas de adesão celular e a liberação de mediadores inflamatórios. Em 
conseqüência disso, células como leucócitos polimorfonucleares, linfócitos, macrófagos 
e mastócitos migram para o periodonto para interagir com os agentes patogênicos. De 
fato, tanto as células recrutadas quanto as células residentes liberam mediadores que, se 
não conseguirem impedir a progressão do processo infeccioso, perpetuarão a condição 
inflamatória local e contribuirão para a destruição dos tecidos periodontais (CHAPPLE, 
1997; LEE et al., 1995; KINANE; PRESHAW; LOOS, 2011; LOHINAI et al., 1998). 
Dentre os inúmeros mediadores inflamatórios envolvidos nessa resposta 
periodontal, as citocinas estão entre os mais relevantes. Algumas citocinas, como IL 
(interleucina)-1β, IL-6, IL-8, IFN (interferon)-γ e TNF (fator de necrose tumoral)-α são 
caracterizadas por sua atividade pró-inflamatória (FENG; WEINBERG, 2006), ao passo 
que outras, como IL-4 e IL-10, regulam negativamente tal resposta (MENG et al., 
2007). Em doenças inflamatórias como a DP, o que ocorre é um desequilíbrio entre os 
mediadores pró e anti-inflamatórios em favor da inflamação, havendo posteriormente 
uma tendência de aumento dos mediadores anti-inflamatórios quando o processo se 
torna crônico (GARLET et al., 2006a; KINANE; PRESHAW; LOOS, 2011). 
 Referencial Teórico 
 
 12
 
Elevados níveis de TNF-α já foram encontrados no fluido crevicular de pacientes 
com DP, em relação a indivíduos saudáveis, e são indicativos do papel dessa citocina na 
destruição periodontal (ROSSOMANDO; KENNEDY; HADJIMICHAEL, 1990). 
Apesar de o TNF-α ser um importante mediador no controle da infecção periodontal, ele 
também atua sobremaneira na destruição dos tecidos de sustentação dos dentes 
(GARLET et al., 2006b; GRAVES et al., 2001). De fato, alguns autores já propuseram 
terapias anti-TNF-α como adjuvantes ao tratamento periodontal convencional para 
impedir a progressão da DP (ASSUMA et al., 1998; GRAVES et al., 1998; PERS et al., 
2008). 
 
1.1.2 Modelos experimentais de DP 
 
O estudo da doença periodontal humana apresenta um alto grau de complexidade, 
o qual é decorrente do grande número de variáveis existentes, como por exemplo 
hábitos dos pacientes (fumo, consumo de álcool), uso de medicamentos, fatores 
genéticos, microbiota, entre outros. Por isso, a utilização de modelos experimentais, 
capazes de reproduzir aspectos bem definidos da doença, é útil para desvendar 
mecanismos e propor novas estratégias terapêuticas para a DP (GENCO; VAN DYKE; 
AMAR, 1998). 
Frequentemente,os roedores são os animais de escolha para os estudos de DP 
experimental, pois eles são fáceis de manusear, têm características genéticas 
determinadas, apresentam sistema imune bem estudado e são susceptíveis à indução da 
dos sinais da doença. Nesses animais, a indução dos sinais de DP pode ser realizada, por 
exemplo, pela introdução experimental de periodontopatógenos na cavidade bucal. Este 
modelo experimental de DP por inoculação oral de microrganismos é simples de ser 
reproduzido, é bem estabelecido na literatura e apresenta vantagens: a DP é induzida por 
um periodontopatógeno conhecido, o tempo de infecção é preciso e não há necessidade 
do uso de ligaduras, o que permite o estudo dos efeitos induzidos pelos microrganismos 
sem a interferência de um elemento estranho aos tecidos. Além disso, esse modelo 
possibilita que importantes parâmetros da DP, tais como cinética de perda óssea, 
caracterização dos tipos celulares e mecanismos inflamatórios envolvidos, possam ser 
avaliados (GARLET et al., 2006a, b; MADEIRA, 2008). 
 
 
 Referencial Teórico 
 
 13
 
1.2 A artrite reumatóide 
 
Uma condição de grande relevância na clínica médica é a artrite reumatóide (AR), 
uma doença destrutiva das articulações cujos relatos de existência acompanham a 
história da humanidade. Os conceitos atuais descrevem a AR como uma doença 
inflamatória crônica, sistêmica e progressiva, de caráter autoimune, que acomete 
articulações diartrodiais simetricamente ao induzir proliferação da membrana sinovial, 
erosão da cartilagem articular, infiltrado de células inflamatórias nos espaços 
periarticulares e destruição óssea (CULSHAW; MCINNES; LIEW, 2011; FIRESTEIN, 
2003; SCOTT; WOLFE; HUIZINGA, 2010). 
Estimativas epidemiológicas indicam que a AR afeta cerca de 0,5-1% de toda 
população do mundo industrializado e leva comumente a índices significativos de 
incapacidade funcional e, consequentemente, a uma pior qualidade de vida. A AR é 
duas a três vezes mais frequente em mulheres e pode se iniciar em qualquer idade, 
apesar de que o pico de incidência ocorre entre a quarta e sexta décadas de vida 
(GABRIEL, 2001; NEOVIUS et al., 2011). A AR é uma condição potencialmente 
incapacitante e, só nos Estados Unidos, estima-se que o custo com despesas médicas e 
com queda de produtividade no trabalho relacionados à AR tenha ultrapassado os 65 
bilhões de dólares nos últimos anos. E, com o aumento significativo da expectativa de 
vida em todo o planeta, existe uma tendência de avanço nesses gastos (ELDERS, 2000; 
NEOVIUS et al., 2011; PUGNER et al., 2000). 
 
1.2.1 Patogênese da AR 
 
A AR é uma doença em que um “gatilho imunológico” desencadeia um processo 
inflamatório e leva a sinais e sintomas clínicos como edema, dor articular, destruição da 
cartilagem e osso. Apesar dos inúmeros estudos sobre AR ao longo da história da 
ciência, esse fator de desencadeamento da doença ainda parece ser uma incógnita. 
Existem evidências de que agentes infecciosos, predisposição genética ou outras 
condições induzam uma resposta inflamatória com formação de autoanticorpos que 
caracterizam a AR (CULSHAW; MCINNES; LIEW, 2011; SCOTT; WOLFE; 
HUIZINGA, 2010; SMOLEN; STEINER, 2003). 
A inflamação articular tem início na membrana sinovial, presente na camada 
interna da cápsula articular e formada por sinoviócitos que secretam o líquido sinovial. 
 Referencial Teórico 
 
 14
 
Na sinóvia reumatóide, ocorre uma hiperplasia dessa camada de células, paralelamente 
a uma migração de linfócitos T e mastócitos na camada sub-sinovial, além de um rico 
infiltrado neutrofílico, predominantemente, no líquido sinovial. Esse quadro, por sua 
vez, provoca um aumento na produção de mediadores pró-inflamatórios, em detrimento 
dos anti-inflamatórios, que culmina na erosão da cartilagem e osso e perpetuação da AR 
(BINGHAM, 2002; FIRESTEIN, 2005; SCOTT; WOLFE; HUIZINGA, 2010; 
SMOLEN; STEINER, 2003). 
Dentre os mediadores inflamatórios, assim como na DP, as citocinas exercem 
papéis fundamentais na patogênese da AR. Em condições fisiológicas, a atuação das 
proteínas pró-inflamatórias é contrabalanceada por mediadores com atividade anti-
inflamatória, como IL-4, IL-10 e antagonista do receptor de IL-1 (IL-1ra). Nas 
articulações artríticas, entretanto, o balanço favorece as citocinas pró-inflamatórias, 
como IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8 e IFN-γ (CULSHAW; MCINNES; LIEW, 2011; 
FIRESTEIN, 2005; SCOTT; WOLFE; HUIZINGA, 2010). 
De grande relevância parece ser o fator de necrose tumoral-α (TNF-α) (CANETTI 
et al., 2001; FIRESTEIN; ALVARO-GARCIA; MAKI, 1990; SZEKANECZ et al., 
2000). Amplamente identificado nos tecidos sinoviais de pacientes com AR, o TNF-α 
induz alterações que se correlacionam diretamente com a progressão da doença (CHU et 
al., 1991). Essa citocina participa ativamente da migração e ativação celular nessa 
condição inflamatória, o que resulta na liberação de enzimas proteolíticas e outras 
citocinas, i.e. IL-1β, IL-6, IL-8, além de estimular a proliferação dos sinoviócitos e 
induzir a formação de pannus (BRENNAN et al., 1989; GRIMBACHER et al., 1998). 
Em modelos experimentais, o TNF-α induz sinais de artrite quando é injetado na 
articulação de animais de experimentação (SAEZ-LLORENS et al., 1991) e 
camundongos que superexpressam essa citocina apresentam sinais de AR 
espontaneamente (KEFFER et al., 1991). Frente a evidências como essas, a estratégia 
de neutralização de citocinas como forma de tratamento de pacientes com AR passou 
com sucesso da ciência básica para a clínica médica, o que representou um grande 
avanço nos últimos dez anos. O infliximab – o primeiro bloqueador de TNF-α a ser 
utilizado clinicamente – e o adalimumab são anticorpos anti-TNF-α que bloqueiam a 
interação dessa citocina com seu receptor. Outro bloqueador dessa citocina de uso 
clínico aprovado é o etanercept, uma proteína de fusão que atua como receptor solúvel 
de TNF-α (LIPSKY et al., 2000; WEINBLATT et al., 1999, 2003). 
 Referencial Teórico 
 
 15
 
Apesar dos bons resultados clínicos, as terapias anti-TNF-α são completamente 
eficazes apenas em cerca de 40% dos pacientes – provavelmente devido ao 
envolvimento de outros mecanismos. Assim, a recomendação atual é que essas terapias 
sejam utilizadas, primordialmente, em pacientes que não respondam bem às terapias 
convencionais (antiinflamatórios não esteroidais, esteroidais e fármacos antirreumáticos 
modificadores da doença, como o metotrexato) (FIRESTEIN, 2003; SCOTT; WOLFE; 
HUIZINGA, 2010; SMOLEN; STEINER, 2003). 
 
1.2.2 Modelos experimentais de AR 
 
Grande parte dos avanços observados nos estudos sobre fármacos com potencial 
terapêutico para AR decorreram do uso de modelos experimentais, pois estes permitem 
entender com detalhes os mecanismos, tipos celulares e mediadores relacionados ao 
desenvolvimento da doença (KEFFER et al., 1991; PEARSON; WOOD, 1963; 
WENGNER et al., 2007). 
Entre os modelos experimentais de AR mais utilizados na literatura está o de 
artrite induzida por antígeno-adjuvante. Neste modelo, a albumina de soro bovino 
metilada (mBSA) é utilizada como antígeno protéico associada a adjuvante completo de 
Freund, o que induz uma resposta imune mediada por células T na presença desse 
antígeno e desencadeia um quadro histopatológico caracterizado por intenso infiltrado 
inflamatório, exsudato articular, formação de pannus na articulação desafiada e 
presença de nódulos linfóides no processo crônico da doença. Ou seja, há uma 
similaridade das manifestações clínicas, da natureza imunológica da patogênese da 
doença e da eficácia dos agentes terapêuticosentre o modelo experimental e a condição 
humana, o que fornece uma alternativa valiosa para o estudo dos mecanismos da AR 
(HEGEN et al., 2008; PEARSON; WOOD, 1963; SANTOS et al., 2001; THORBECKE 
et al., 1992; WENGNER et al., 2007). 
 
1.3 Artrite reumatóide x doença periodontal 
 
A similaridade entre os mecanismos patogênicos de DP e AR há muito desperta o 
interesse na pesquisa sobre a associação entre essas condições. Alguns autores chegam, 
inclusive, a colocar a hipótese de que elas seriam manifestações distintas de uma única 
doença: “de fato, a periodontite crônica e a artrite reumatóide têm muita coisa em 
 Referencial Teórico 
 
 16
 
comum, tanta coisa que eu me questiono se, na realidade, elas não seriam uma mesma 
doença” (GREENWALD; KIRKWOOD, 19991, citado por BARTOLD; MARSHALL; 
HAYNES, 2005). Desde os anos 60, há estudos que indicam que pacientes com AR 
apresentam maiores índices de perda óssea alveolar e edentulismo quando comparados a 
indivíduos saudáveis (LIUBOMOROVA, 1964; MALMSTROM; CALONIUS, 19752, 
citado por MERCADO et al., 2001). No entanto, paralelamente, outros autores 
apresentavam dados opostos, em que a DP não parecia ser uma característica 
proeminente em pessoas com AR (HELMINEN-PAKKALA, 19713, citado por 
BARTOLD; MARSHALL; HAYNES, 2005). 
A literatura científica era, até então, controversa no tocante à relação DP e AR. As 
hipóteses colocadas para explicar a relação entre as duas doenças apontavam mais para 
a potencial deficiência motora, o componente emocional e a conseqüente higienização 
oral insatisfatória dos pacientes artríticos, do que para uma convergência de 
mecanismos patogênicos (ARNEBERG et al., 1991; PERSSON; BERGLUND; 
SAHLBERG, 1999). Entretanto, um estudo que avaliou especificamente a higiene oral 
de indivíduos artríticos não indicou diferenças significativas no controle de placa 
bacteriana desses pacientes após o uso de diferentes métodos de escovação dental 
(RISHEIM; KJAERHEIM; ARNEBERG, 1992). Mais recentemente, os trabalhos 
científicos praticamente não apontam a possível deficiência de higiene oral como o fator 
de associação entre AR e DP. Diversos estudos populacionais mostram que não existem 
diferenças significativas entre os índices de placa de pacientes com e sem AR 
(HAVEMOSE-POULSEN et al., 2006; KÄBER et al., 1997; MERCADO et al., 2001; 
MIRANDA et al., 2003). 
Em um estudo recente, Pischon et al. (2008) avaliaram a prevalência de DP em 
indivíduos com AR e detectaram que o risco de pacientes artríticos apresentarem DP era 
quase 6 vezes maior que o de pacientes sem AR, e que a deficiência de higienização 
oral apresenta pouca influência nessa correlação. Além disso, os autores mostraram que 
a associação entre AR e DP era maior que as interações já bem estabelecidas entre 
fumo, consumo de álcool e obesidade versus DP. Observou-se ainda que a AR se 
 
1 GREENWALD, R. A.; KIRKWOOD, K. Adult periodontitis as a model for rheumatoid arthritis with 
emphasis on treatment strategies. J. Rheumatol., v. 26, p. 1650-1653, 1999. 
2 MALSTROM, M.; CALONIUS, P. E. B. Teeth loss and inflammation of teeth supporting tissues in 
rheumatoid disease. Scand. J. Rheumatol., v. 4, p. 49-55, 1975. 
3 HELMINEN-PAKKALA, E. Periodontal conditions in rheumatoid arthritis. A clinical and reontological 
investigation. Part two. The study in rheumatoids. Proc. Finnish Dental Soc., Sup. IV, p. 1-108, 1971. 
 
 Referencial Teórico 
 
 17
 
relacionava à periodontite independentemente de características demográficas e de 
estilo de vida (idade, sexo, grau de escolaridade, fumo, consumo de álcool). 
Em um estudo experimental em ratos, Ramamurthy et al. (2005) demonstraram 
que a indução de artrite por adjuvante nesses roedores é capaz de desencadear uma 
significativa perda óssea alveolar, mobilidade dentária, bem como aumento dos níveis 
gengivais de IL-1β e de TNF-α. De modo similar, também já foi mostrado que ratos 
transgênicos, superexpressando alelos associados à AR, HLA-B27, apresentam, além da 
artrite, uma perda óssea periodontal significativa (TATAKIS; GUGLIELMONI, 2000). 
Mais recentemente, outros dois estudos apoiaram a hipótese de que a relação entre AR e 
DP decorre dos mecanismos imunopatogênicos semelhantes das duas doenças. 
Trombone et al. (2010) mostraram, em linhagens de camundongos selecionados 
geneticamente, que um genótipo hiper-inflamatório é essencial para que a AR agrave os 
sinais de DP induzida por bactéria. Park et al. (2011) demonstraram, por meio de 
ensaios in vitro, que células obtidas de osso alveolar de camundongos com AR induzida 
por colágeno apresentavam maior atividade osteoclástica e menor atividade de formação 
óssea, e esses achados foram associados à maior perda óssea alveolar nesses 
camundongos. Sendo assim, as evidências atuais apontam que a interação entre AR e 
DP deve ocorrer, predominantemente, pela convergência e semelhança dos mecanismos 
patogênicos das duas doenças em indivíduos susceptíveis. No entanto, essas interações 
ainda não estão bem definidas. 
De modo interessante, a relação inversa, isto é, DP induzindo AR, apesar de 
menos freqüente, também tem sido relatada (AL-KATMA et al., 2007; DE PABLO et 
al., 2009). Essa relação parece estar intimamente associada a um periodontopatógeno 
em particular, Porphyromonas gingivalis, pois essa bactéria expressa a enzima peptidil 
arginina deaminase, que é responsável pela citrulinação pós-traducional de antígenos 
peptídicos em resíduos de arginina. Teoricamente, em pacientes com DP, esse processo 
pode gerar fatores imunogênicos sistêmicos, potencialmente capazes de desencadear 
uma perda de auto-tolerância e, consequentemente, AR (CANTLEY et al., 2011; DE 
PABLO et al., 2009). Um recente estudo experimental realizado por Cantley et al. 
(2011) indicou que, na presença de uma grande carga bacteriana de P. gingivalis, os 
sinais de artrite em camundongos podem ser agravados. Em contrapartida, estudos 
envolvendo outros microrganismos, como o A. actinomycetemcomitans, não detectaram 
a capacidade de a DP influenciar do desenvolvimento da AR (TROMBONE et al., 
2010). Também já foi mostrado que o controle da infecção periodontal pode reduzir a 
 Referencial Teórico 
 
 18
 
avaliação subjetiva de pacientes quanto à intensidade dos sinais de AR, apesar de a 
microbiota não ter sido caracterizada (AL-KATMA et al., 2007). Deste modo, este é um 
aspecto que também precisa ser estudado. 
 
1.3.1 Correlação entre AR e DP 
 
Embora a DP seja considerada uma doença primariamente infecciosa e a AR uma 
doença autoimune, a patogênese dessas condições apresenta diversos mecanismos 
comuns que poderiam caracterizar a AR como moduladora da resposta 
imune/inflamatória no periodonto do hospedeiro, capaz de aumentar a susceptibilidade à 
DP destrutiva em adultos e vice-versa (BARTOLD; MARSHALL; HAYNES, 2005; 
CULSHAW; MCINNES; LIEW, 2011). 
De acordo com De Pablo et al. (2009), o modelo conceitual de interação entre as 
doenças poderia ser caracterizado amplamente por vias causais, em que a AR seria um 
fator causal de DP, induzindo uma maior incidência e progressão da periodontite em 
indivíduos artríticos, e vice-versa, e por vias não-causais, em que fatores ambientais e 
do hospedeiro aumentariam a susceptibilidade a ambas doenças. Em consonância com a 
via causal, Golub et al. (2006) propuseram um modelo hipotético denominado two-hit 
model. Neste modelo, os autores sugerem que, em um ambiente “favorável” como a 
boca com seus produtos microbianos gerados pelo biofilme subgentival (primeiro hit), 
doençassistêmicas envolvendo destruição óssea, como a AR, podem se “comunicar” 
com o tecido periodontal (segundo hit), para co-induzir, não apenas exacerbar, a DP, 
mesmo na ausência de periodontopatógenos clássicos. Apesar da falta de evidências, 
essas são as hipóteses mais aceitas atualmente para explicar a relação entre DP e AR. 
Estudos de comparação entre os perfis de expressão gênica de citocinas de 
pacientes com AR e/ou com DP indicam que o componente genético pode ter um 
importante papel na interação entre essas doenças (HAVEMOSE-POULSEN et al., 
2005; SORENSEN et al., 2008; TROMBONE et al., 2010). Relata-se, por exemplo, que 
mais de 50% das variações nas diversas características da periodontite crônica podem 
ser explicadas por fatores genéticos, tais como o polimorfismo do grupo de genes da 
interleucina-1β (HAVEMOSE-POULSEN et al., 2007). As fortes associações dos genes 
HLA (human leukocyte antigen) com a AR – genes que constituem fatores de risco de 
cerca de 30% para a doença – também parecem ter alguma influência sobre o 
 Referencial Teórico 
 
 19
 
desencadeamento e progressão da DP, conforme mostrado em um estudo experimental 
em ratos transgênicos (TATAKIS; GUGLIELMONI, 2000). 
Além dos componentes genéticos, existe uma grande similaridade entre os 
mediadores que induzem a destruição periodontal e articular (CULSHAW; MCINNES; 
LIEW, 2011). A produção excessiva de espécies reativas de oxigênio (CHAPPLE, 
1997), de mediadores inflamatórios lipídicos derivados do ácido araquidônico (OHM et 
al., 1984), os elevados níveis de enzimas derivadas de neutrófilos (LEE et al., 1995), de 
citocinas pró-inflamatórias como o TNF-α (NISSON; KOPP, 2008), de 
metaloproteinases de matriz e de fatores de ativação de osteoclastos, além dos baixos 
níveis de citocinas anti-inflamatórias, como IL-4 e IL-10, e de inibidores teciduais de 
metaloproteinases, que são encontrados nos tecidos periodontais doentes (GARLET et 
al., 2006a), caracterizam também os tecidos articulares inflamados (FIRESTEIN, 2005; 
SMOLEN; STEINER, 2003). 
Sendo assim, o perfil da resposta imunológica observada na AR, capaz de gerar 
alterações locais e sistêmicas, teria potencial para fazer com que pacientes artríticos, na 
presença de patógenos periodontais, apresentassem uma maior susceptibilidade à DP 
(DE PABLO et al., 2009; MERCADO et al., 2001). 
Outras evidências corroboram ainda mais essas hipóteses. Por diversas razões, 
incluindo o processo inflamatório em si, a AR induz, frequentemente, uma perda óssea 
sistêmica generalizada (WOOLF, 1991). Isso decorre de um aumento na 
osteoclastogênese (WALSH et al., 2005), bem como de uma diminuição das atividades 
físicas do paciente e do uso de fármacos com potencial para causar osteoporose, como 
os anti-inflamatórios esteroidais (WALSH et al., 2005). Essas condições, por sua vez, 
podem ter um impacto sobre a saúde periodontal. 
A relação entre o chamado fator reumatóide (FR) e a DP também parece contribuir 
para a explicação da interação AR e DP. O FR, autoanticorpos contra determinantes 
antigênicos no fragmento Fc de IgG, é encontrado no soro, fluido sinovial e membrana 
sinovial de pacientes com AR e é um dos marcadores que caracterizam a doença 
(FIRESTEIN, 2005). Entretanto, apesar de estar caracteristicamente relacionado à AR, o 
FR já foi detectado na gengiva, saliva e soro de pacientes com DP, com e sem AR 
(THÉ; EBERSOLE, 1991). 
Apesar da existência de inúmeros achados que confrontam as semelhanças e 
diferenças entre os mediadores relacionados à AR ou à DP, ainda se conhece muito 
pouco sobre as influências de uma doença sobre a outra, ou sobre as conseqüências do 
 Referencial Teórico 
 
 20
 
processo autoimune sobre a condição inflamatória de natureza infecciosa. A grande 
maioria dos estudos que avaliam DP e AR concomitantemente são estudos 
populacionais, muitas vezes retrospectivos, transversais, baseados apenas em 
observações clínicas, radiográficas, história pregressa e relatos de pacientes (KÄBER et 
al., 1997; MERCADO et al., 2001; MIRANDA et al., 2003; PISCHON et al., 2008). 
Apesar da relevância, muitas vezes os achados obtidos nesses trabalhos são 
limitados, pois a avaliação da cinética de progressão das doenças, a caracterização 
histológica e citológica, a determinação dos tipos de mediadores e mecanismos 
associados ao desenvolvimento da AR e da DP simultaneamente, e a determinação da 
influência sistêmica de uma condição sobre a outra se tornam difíceis em humanos. 
Além disso, as grandes chances de viés decorrentes da origem dos indivíduos que 
participam de estudos como esses, i.e. indivíduos controles recrutados em hospitais, 
podem resultar na super ou subestimação da associação entre AR e DP (DE PABLO et 
al., 2009). Outro fator que dificulta a interpretação dos resultados de pesquisas em 
humanos é o uso das terapias antiartrite pelos pacientes. Como os tratamentos não 
podem ser interrompidos e como os fármacos utilizados geralmente têm atividade anti-
inflamatória, as relações entre as doenças e os mecanismos envolvidos muitas vezes são 
mascarados (ISHI et al., 2008). 
Em virtude disso, justifica-se o uso de modelos experimentais de AR e DP, já bem 
estabelecidos na literatura, a fim de se conhecer mais sobre a cinética das interações 
entre essas doenças, bem como sobre os efeitos de estratégias terapêuticas anti-artrite na 
DP associada. Os modelos experimentais possibilitam reproduzir as principais 
características das doenças, intervir sobre elas e analisá-las em diferentes estágios de 
suas progressões (GARLET et al., 2006a; WENGER et al., 2007). 
Deste modo, sabendo-se que: 
(1) AR e DP estão entre as formas mais prevalentes de doenças inflamatórias 
crônicas indutoras de perda óssea em humanos (BAKER, 2000; CULSHAW; 
MCINNES; LIEW, 2011; GABRIEL, 2001; WILLIAMS, 1990); 
(2) Diversos estudos sugerem que indivíduos que apresentam AR são mais 
susceptíveis a desenvolverem DP, tanto em maior frequência quanto com maior 
gravidade (BARTOLD; MARSHALL; HAYNES, 2005; CULSHAW; MCINNES; 
LIEW, 2011; DE PABLO et al., 2009; MERCADO et al., 2001); 
(3) Existem poucas evidências experimentais que caracterizam a interação entre 
DP e AR; 
 Referencial Teórico 
 
 21
 
(4) E que entender essa interação tem uma grande relevância clínica, o presente 
estudo objetiva caracterizar a DP induzida ou exacerbada pela artrite, utilizando 
modelos experimentais bem estabelecidos na literatura. 
Em um primeiro momento, estabeleceu-se um modelo de artrite crônica induzida 
por antígeno (albumina de soro bovino metilada) (AIA) em camundongos e avaliaram-
se parâmetros articulares, periodontais e sistêmicos. Posteriormente, associou-se o 
modelo experimental de AIA a um modelo de DP induzida por Aggregatibacter 
actinomycetemcomitans, para investigar a influência da AIA sobre a DP já estabelecida. 
 
 
2 ARTIGO CIENTÍFICO 1 
 
 
Experimental arthritis triggers periodontal disease in mice: involvement of TNF-α 
and the oral microbiota 
 
Celso M. Queiroz-Junior*†‡, Mila F. M. Madeira†‡, Fernanda M. Coelho‡, Vivian V. 
Costa†, Rafaela L. C. Bessoni*‡, Larissa F. C. Sousa‡, Gustavo P. Garlet§, Daniele G. 
Souza†, Mauro M. Teixeira‡, Tarcília A. Silva*‡ 
 
*Department of Oral Surgery and Pathology, Faculdade de Odontologia, Universidade 
Federal de Minas Gerais, Minas Gerais, Brazil; 
†Department of Microbiology, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de 
Minas Gerais, Minas Gerais, Brazil; 
‡Department of Biochemistry and Immunology, Instituto de Ciências Biológicas, 
Universidade Federal de Minas Gerais,Minas Gerais, Brazil; 
§Department of Biological Sciences, School of Dentistry of Bauru, Universidade de São 
Paulo, São Paulo, Brazil. 
 
Artigo científico publicado na edição 187, páginas 3821-3830, do periódico The Journal 
of Immunology. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Este trabalho foi classificado no tópico In This Issue da revista The Journal of 
Immunology, que destaca os 10% melhores trabalhos publicados no periódico, conforme 
descrito abaixo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Este trabalho também foi alvo de comentários e recomendações, sendo, por isso, 
classificado como Top 2% do arquivo de publicações em biologia e medicina do 
Faculty of 1000, como mostrado abaixo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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3 ARTIGO CIENTÍFICO 2 
 
 
Experimental arthritis exacerbates Aggregatibacter actinomycetemcomitans-
induced periodontitis in mice 
 
Celso Martins Queiroz-Junior*†‡, Mila Fernandes Moreira Madeira†‡, Fernanda Matos 
Coelho‡, Camila Ribeiro de Oliveira*‡, Luíza Castro Menezes Cândido ‡, Gustavo 
Pompermaier Garlet§, Mauro Martins Teixeira‡, Daniele da Glória de Souza†, Tarcília 
Aparecida da Silva*‡ 
 
*Department of Oral Surgery and Pathology, Faculdade de Odontologia, Universidade 
Federal de Minas Gerais, Minas Gerais, Brazil; 
†Department of Microbiology, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de 
Minas Gerais, Minas Gerais, Brazil; 
‡Department of Biochemistry and Immunology, Instituto de Ciências Biológicas, 
Universidade Federal de Minas Gerais, Minas Gerais, Brazil; 
§Department of Biological Sciences, School of Dentistry of Bauru, Universidade de São 
Paulo, São Paulo, Brazil. 
 
Artigo científico submetido ao periódico Journal of Clinical Periodontology e avaliado 
pelos editores e revisores da revista. O trabalho está em revisão para responder as 
questões apontadas pelos revisores. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Artigo Científico 2 
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Experimental arthritis exacerbates Aggregatibacter actinomycetemcomitans-
induced periodontitis in mice 
 
Celso Martins Queiroz-Junior*†‡, Mila Fernandes Moreira Madeira†‡, Fernanda Matos 
Coelho‡, Camila Ribeiro de Oliveira*‡, Luíza Castro Menezes Cândido ‡, Gustavo 
Pompermaier Garlet§, Mauro Martins Teixeira‡, Daniele da Glória de Souza†, Tarcília 
Aparecida da Silva*‡1 
 
*Department of Oral Surgery and Pathology, Faculdade de Odontologia, Universidade 
Federal de Minas Gerais, Minas Gerais, Brazil; 
†Department of Microbiology, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de 
Minas Gerais, Minas Gerais, Brazil; 
‡Department of Biochemistry and Immunology, Instituto de Ciências Biológicas, 
Universidade Federal de Minas Gerais, Minas Gerais, Brazil; 
§Department of Biological Sciences, School of Dentistry of Bauru, Universidade de São 
Paulo, São Paulo, Brazil. 
 
Running title: Arthritis aggravates periodontitis 
 
Keywords: Arthritis, Periodontal Disease, TNF-α, Bone Loss, Experimental Model 
 
Conflict of interest and source of funding statement: The authors declare that they 
have no conflict of interests. This work was supported by Conselho Nacional de 
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brazil) and Fundação do Amparo a 
Pesquisas do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG, Brazil). 
 
 
 
 
 
 
 
1 Corresponding author: Tarcília Aparecida da Silva. Mailing address: Departamento de Clínica, 
Patologia e Cirurgia Odontológicas, Faculdade de Odontologia, Universidade Federal de Minas Gerais, 
Av. Presidente Antônio Carlos 6627, CEP 31.270-901, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil. Phone: 55 
31 3409-2478 (voice); 55 31 3409-2430 (Fax). E-mail: tarcilia@ufmg.br. 
 Artigo Científico 2 
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Abstract 
Aim: This study aimed to investigate the influence of chronic antigen-induced arthritis 
(AIA) on infection-induced periodontitis (PD) in mice. The contribution of TNF-α was 
also evaluated. 
Materials and methods: PD was induced in C57BL/6 mice by oral infection with 
Aggregatibacter actinomycetemcomitans. AIA was induced 30 d after infection. Anti-
TNF-α and chlorhexidine treatments were used to investigate the role of TNF-α and oral 
infection on PD and AIA interaction. Maxillae, knee joints, lymph nodes and serum 
samples were used for histomorphometric,immunoenzimatic and/or real time-PCR 
analyses. 
Results: AIA exacerbated alveolar bone loss triggered by PD infection. In contrast, PD 
did not influence AIA in the evaluated time point. PD exacerbation was associated with 
enhanced production of IFN-γ in maxillae and expression of Th1 transcription factor in 
submandibular lymph nodes. Increased serum levels of IL-6 and C-reactive protein were 
also detected. Anti-TNF-α and antiseptic therapies prevented the development and 
exacerbation of infectious-PD by reducing the expression of IFN-γ, TNF-α and IL-17 in 
maxillae. 
Conclusions: Altogether, the current results indicate that exacerbation of PD by AIA is 
prevented by anti-TNF-α therapy and is associated with an alteration of the Th 
polarization pattern and increased systemic reactivity. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Artigo Científico 2 
 41
 
Clinical Relevance 
Scientific rationale for the study: Clinical evidence suggests that PD is more severe in 
patients with RA. The current study investigated the interaction between PD and RA by 
assessing immune imbalances triggered by antigen-induced arthritis (AIA) in mice with 
PD. 
Principal findings: AIA aggravated alveolar bone loss and inflammation in the maxillae 
of mice with PD. This exacerbation was associated with functional immune 
interferences, systemic reactivity to auto-antigens and amelioration by anti-TNF-α 
therapy. 
Practical implications: Understanding the interaction between periodontitis and arthritis 
in a mouse model provides insights for therapeutic strategies to improve the course of 
periodontal breakdown in RA patients. 
 Artigo Científico 2 
 42
 
Introduction 
 
Periodontal disease (PD) and rheumatoid arthritis (RA) are some of the most prevalent 
chronic inflammatory diseases that affect soft and bone structures in humans (Albandar, 
2005, Firestein, 2005). Although PD is primarily triggered by infection and RA is an 
auto-immune disorder, the examination of both conditions indicates a remarkable 
similarity of their pathogenic features, such as bone resorption, cell infiltration and 
release of inflammatory mediators, e.g. tumor necrosis factor (TNF)-α, in affected sites 
(Pablo et al. 2009). These similarities have been suggested to account for the 
development and exacerbation of RA signs by PD (Ribeiro et al. 2005, Bartold et al. 
2010, Cantley et al. 2011) and vice versa, increased PD in patients with RA (Tolo & 
Jorkjend, 1990, Mercado et al. 2000, Mercado et al. 2001, Pablo et al. 2009). 
Recently, experimental studies from Bartold et al. (2010) and Cantley et al. (2011) 
showed that Porphyromonas gingivalis-induced inflammation can promote systemic 
alterations, which lead to the development and enhancement of arthritis signs in rodents. 
Inversely, our group (Queiroz-Junior et al. 2011) and others (Tatakis & Guglielmoni 
2000, Ramamurthy et al. 2005, Trombone et al. 2010, Park et al. 2011) indicated that 
arthritis can induce alveolar bone loss in the presence of a non-manipulated oral 
microbiota. In a model of antigen-induced arthritis (AIA) in mice, we showed that AIA 
spontaneously triggered signs of PD through induction of T-helper (Th) 17 polarization 
and systemic hyper-reactivity to auto-antigens, in a TNF-α-dependent manner (Queiroz-
Junior et al. 2011). Moreover, collagen-induced arthritis in mice triggered PD by 
increasing osteoclastic activity (Park et al. 2011). Altogether, these results support a 
causal hypothesis – RA triggering PD, and vice versa, through systemic immune 
activation (Pablo et al. 2009) – but the influence of RA on the severity of pre-existent 
PD has not been addressed yet. Besides an increase in prevalence, several clinical 
studies suggest greater severity of PD among individuals with RA (Tolo & Jorkjend, 
1990, Mercado et al. 2000, Mercado et al. 2001, Havemose-Poulsen et al. 2006, Pischon 
et al. 2008). Accordingly, in a model of experimental arthritis induced by systemic 
challenge, it was observed exacerbation of infection-induced PD in mice with maximum 
acute inflammatory reactivity (Trombone et al. 2010). Nevertheless, the mechanisms by 
which RA exacerbates PD are not well understood. 
In the current study, we investigated the influence of chronic antigen-induced arthritis 
(AIA) on Aggregatibacter actinomycetemcomitans-induced PD in mice. We also 
 Artigo Científico 2 
 43
 
evaluated the contribution of anti-TNF-α therapy, oral microbiota and systemic 
imbalances triggered by AIA on this condition. 
 Artigo Científico 2 
 44
 
Material and Methods 
 
Mice 
Experimental groups consisted of 6-week-old male C57BL/6 mice housed under 
standard conditions in the animal facilities of the Department of Microbiology, Instituto 
de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Brazil. Mice had free 
access to chow and water. All experiments were performed according to a protocol 
approved by the local Institutional Committee for Animal Care and Use (protocol 
number: 165/2009). 
 
Experimental periodontitis 
Infectious periodontal disease (PD) was induced in two groups of mice – with or 
without experimental arthritis – as described previously (Garlet et al. 2006). Periodontal 
infection was achieved by oral delivery of 1 x 109 CFU of the periodontopathogen 
Aggregatibacter actinomycetemcomitans strain FDC Y4 (from the collection of 
Laboratório de Microbiologia Oral e Anaeróbios [Department of Microbiology, 
UFMG]) in 100 µL phosphate buffered saline (PBS) with 1.5% carboxymethylcellulose 
(CMC), on day 0, for 3 alternated days. Oral infection was induced 30 days before 
arthritis re-challenge. Mice were euthanized 45 days post-infection and maxillae, knee 
joints, spleen, serum, inguinal and submandibular lymph nodes were collected for 
analysis. Negative controls included naïve and sham-infected mice. 
 
Chronic antigen-induced arthritis 
Chronic antigen-induced arthritis (AIA) was performed as described earlier (Wengner et 
al. 2007, Queiroz-Junior et al. 2011). Mice were immunized with subcutaneous 100 µg 
mBSA (Methylated Bovine Serum Albumin, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) 
emulsified in Freund’s complete adjuvant (CFA; Sigma-Aldrich) and further reinforced 
with mBSA in Freund’s incomplete adjuvant (IFA; Sigma-Aldrich). In parallel, 200 ng 
of Bordetella pertussis toxin (Calbiochem, La Jolla, CA, USA) was injected (i.p.). 
These immunizations do not induce any signs of arthritis in mice (Wengner et al. 2007, 
Queiroz-Junior et al. 2011). Fourteen days after immunization, mice were orally 
inoculated for PD (day 0), as described above, and first joint-challenged. Subsequently, 
30 d later, mice were re-challenged by intra-articular joint injection with mBSA to 
induce chronic AIA and were euthanized 15 days later (corresponding to 45 days of oral 
 Artigo Científico 2 
 45
 
infection). In the group PD, without AIA, mice were immunized but joint challenge 
with the antigen mBSA was replaced by vehicle. Non-immunized mice, inoculated for 
PD, were also evaluated but presented no difference from immunized animals. 
 
Anti-TNF-α therapy 
To evaluate the role of TNF-α on PD and AIA interaction, mice were treated with 
infliximab (Remicade®, Shering-Plough, Kenilwoth, NJ, USA, 10 mg/kg, i.p.), a 
chimeric monoclonal anti-TNF-α antibody, each 2 days, until the 45th day post-infection(Sachs et al. 2011). 
 
Oral anti-microbial therapy 
To investigate the effects of oral infection on PD and AIA association, two additional 
groups – PD+CLX and PD+AIA+CLX – were created by topical delivery of 50 µL 
chlorhexidine (1-chlorhexidine gluconate 0.12%) plus 2% CMC, each 2 days, until the 
45th day post-infection (Trombone et al. 2010). Control group received 50 µL aqueous 
2% CMC. 
 
Morphometric evaluation of maxillae 
At 45 days of A. actinomycetemcomitans infection, maxillae of 5 mice/group were 
collected and analyzed as described previously (Garlet et al. 2006, Queiroz-Junior et al. 
2011). The palatal faces of maxillae samples were photographed using a 
stereomicroscope and a digital camera (Kodak EasyShare C743, Kodak, Manaus, 
Brazil). Quantitative analyzes comprised the measurement of the area between the 
cemento-enamel junction (CEJ) and the alveolar bone crest (ABC) in the 1st molar using 
Image J software (NIH, National Institute of Health, Bethesda, MD, USA). 
In further experiments, the left hemi-maxillae were collected for immunoenzimatic or 
Real-Time PCR assays. The right hemi-maxillae were histologically processed and 
three distinct sections of each sample were stained for tartarate resistant acid 
phosphatase (TRAP, Sigma-Aldrich) for blinded osteoclast counting in the distal 
alveolar bone adjacent to the 1st molar in 5 consecutive microscopic fields (400x) per 
section. 
 
Knee joint evaluation 
 Artigo Científico 2 
 46
 
Knee joints of mice euthanized for maxillae evaluation were also analyzed. Knee cavity 
was washed with PBS (2 x 5 µL) and total number of leukocytes was counted in a 
Neubauer chamber. Periarticular tissues were collected for immunoenzimatic assays. 
Knee joints were also collected for histological evaluation. Samples were processed and 
stained for H&E or toluidine blue (TB). Two sections per knee joint were scored in a 
blinded manner for different parameters (severity of synovial hyperplasia, intensity of 
inflammatory infiltrate and bone erosion) to obtain an arthritis index (range: 0-8) 
(Williams et al. 2007). TB stained slides were used to estimate joint proteoglycan 
content as described previously (Urech et al. 2010). 
 
Quantification of neutrophil and macrophage enzymes 
Quantification of the neutrophil enzyme marker myeloperoxidase (MPO) and the 
macrophage enzyme marker N-acetylglucosaminidase (NAG) was performed as 
described earlier (Barcelos et al. 2005). MPO and NAG activities in maxillary and knee 
joint tissues were evaluated by enzymatic reaction, at the absorbance of 450 nm and 405 
nm, respectively. 
 
Real-time PCR 
The extraction of total RNA from maxillae, inguinal and submandibular lymph nodes 
was performed with Trizol reagent (Invitrogen, Rockville, MD, USA) and the cDNA 
synthesis was accomplished as described earlier (Garlet et al. 2006). Extraction of A. 
actinomycetemcomitans DNA was performed from maxillary tissues with DNA 
Purification System (Promega Biosciences Inc., San Luis Obispo, CA, USA). Real-time 
PCR quantitative mRNA or DNA analyzes were performed in a MiniOpticon system 
(Bio-Rad, Hercules, CA, USA), using Sybr Green PCR Master Mix (Invitrogen), 100 
nM specific primers and 2.5 ng cDNA or 5 ng DNA in each reaction. Primer sequences 
and reaction properties are depicted in Table 1. For mRNA analysis, the relative level of 
gene expression was calculated with reference to β-actin using the cycle threshold (Ct) 
method. DNA levels of A. actinomycetemcomitans were determined using the Ct 
method and normalized by the tissue weight. 
 
Detection of serum anti-collagen I antibodies 
Estimation of anti-collagen I IgG in serum of mice was determined as described earlier 
(Van de Velde et al. 2010, Queiroz-Junior et al. 2011). Ninety-six-well microplates 
 Artigo Científico 2 
 47
 
were incubated with 20 µg/mL solution of murine collagen I (kind gift of Dr. G. T. 
Kitten, UFMG). Serum samples (1:2-1:100) were incubated, followed by addition of 
biotinylated goat anti-mouse IgG (Southern Biotechnology, Birmingham, AL, USA) 
and streptavidin-peroxidase. OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride; Sigma-
Aldrich) was the substrate buffer and 1 M H2SO4 the stop buffer. Results are expressed 
as optical density (O.D.) at the absorbance of 492 nm. 
 
Spleen cell cultures 
The protocol for stimulation of cell cultures with collagen was adapted from Berg et al. 
(2000). Whole spleen cells from individual mice were harvested 45 days after PD 
induction and cultured in triplicate in 96-well microplates at 106 cells/mL in the 
presence of collagen I 15 µg/well, concavalin (Con A) 2 µg/well or culture medium 
(RPMI, Flow Laboratories, Irvine, Scotland). Culture supernatants were collected 48 h 
later and TNF-α levels determined by ELISA. 
 
ELISA 
The concentration of interleukin (IL)-1β, IL-6, IL-17, IL-10, interferon (IFN)-γ and 
tumor necrosis factor (TNF)-α was measured in maxillae, serum and/or splenocytes 
culture supernatants, using commercially available kits, according to manufacturer 
instructions (R&D Systems, Minneapolis, MN). The results were expressed as 
picograms of cytokines (± S.E.M.) normalized for 100 mg tissue or 1 mL of sample. 
 
C-Reactive Protein 
Quantification of C reactive protein (CRP) levels was determined in serum samples of 
mice using a commercially available agglutination kit according to manufacturer 
instructions (Labtest Diagnóstica, São Paulo, Brazil). 
 
Statistical analysis 
Data are presented as mean ± SEM and the statistical significance among control, PD, 
PD+AIA and treated groups was detected by analyses of variance (ANOVA), followed 
by Newman-Keuls post hoc analysis. Tests were performed with GraphPad Prism 4.0 
software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Results with P<0.05 were 
considered statistically significant. 
 Artigo Científico 2 
 48
 
Results 
 
Influence of chronic experimental arthritis on A. actinomycemcomitans-induced 
periodontal disease 
Infection with Aggregatibacter actinomycetemcomitans, referred to here as PD, induced 
alveolar bone loss (Fig. 1a and 1c), increased number of osteoclasts (Fig. 1b and 1d) 
and enhanced levels of MPO (Fig. 1e) in maxillae 45 days post-infection. AIA alone 
also triggered significant signs of PD, i.e. alveolar bone loss (0.78 ± 0.02 mm2; p<0.05), 
increased number of osteoclasts (1.25 ± 0.09 cells/field; p<0.05) and MPO levels (0.33 
± 0.07 relative units; p<0.05), which were similar to the induced by infection. 
Concomitant induction of PD+AIA significantly exacerbated alveolar bone loss and 
increased number of osteoclasts when compared with the PD group (Fig. 1a-d), 
although maxillary levels of MPO were not influenced (Fig. 1e). 
Infectious PD also triggered the expression of cytokines in maxillae, including TNF-α, 
IFN-γ, IL-17 and IL-10 (Fig. 2a-d). This was similarly observed in mice with AIA 
alone, except for IL-10 whose expression was decreased (data not shown). Concomitant 
induction of AIA in mice with PD enhanced levels of IFN-γ (Fig. 2b) in comparison 
with mice subjected to PD only but expression of TNF-α, IL-17 and IL-10 (Fig. 2a-d) 
was not affected. 
As TNF-α is a key mediator in RA and PD, the role of TNF-α in mediating exacerbated 
bone loss in animals subjected to PD and AIA was evaluated by using infliximab, a 
clinically prescribed anti-TNF antibody. Infliximab induced major effects in alveolar 
bone loss, number of osteoclasts and MPO levels in maxillae (Fig. 1c-e). Moreover, it 
reduced expression of TNF-α, IFN-γ and IL-17in maxillae in PD and PD+AIA groups 
(Fig. 2a-c). 
 
Aggregatibacter actinomycetemcomitans-induced PD does not interfere with AIA 
In order to evaluate the influence of PD infection on AIA signs, animals infected or not 
with A. actinomycetemcomitans were subjected to AIA and indices of joint 
inflammation were assessed. AIA triggered synovial hyperplasia and infiltration of 
mononuclear cells in the synovium, as scored in the arthritis index (Fig. 3a), 
proteoglycan loss in joint cartilage (Fig. 3b), increased leukocyte number in synovial 
fluid (Fig. 3c) and NAG levels in periarticular tissues (Fig. 3d). These signs were 
similarly increased when comparing groups without and with PD (AIA and PD+AIA, 
 Artigo Científico 2 
 49
 
respectively). A. actinomycemcomitans infection did not induce signs of joint lesion by 
itself (Fig. 3). Also, no signs of inflammation were observed in the contra-lateral 
unchallenged joint of mice subjected to AIA or PD+AIA. 
In addition, the anti-TNF-α therapy decreased joint inflammation triggered by AIA (i.e., 
it reduced the arthritis index, proteoglycan loss and cell infiltrate) (Fig. 3). 
 
Dependence of PD and AIA interaction on oral infection 
Despite the greater alveolar bone loss (Fig. 1c) and expression of IFN-γ (Fig. 2b) in the 
group PD+AIA than in the group PD, A. actinomycetemcomitans load in maxillae was 
similarly increased in both groups (Table 2). Also, A. actinomycetemcomitans load was 
not affected by the anti-TNF-α therapy (Table 2). Although bacterial load was not 
influenced by AIA, it was necessary for PD development. Topical oral application of 
chlorhexidine (CLX) abrogated alveolar bone loss in the groups PD and PD+AIA (PD: 
0.84 ± 0.02 mm2 versus PD+CLX: 0.63 ± 0.03 mm2, P<0.05; PD+AIA: 1.01 ± 0.08 
mm2 versus PD+AIA+CLX: 0.54 ± 0.04 mm2, P<0.05; mean ± SEM), although it did 
not influence AIA parameters (data not shown). 
 
T-helper transcription factors in submandibular lymph nodes 
In view of the results indicating that AIA exacerbates PD, but not the opposite, a 
scenario ameliorated by anti-TNF-α therapy, we next investigated the expression of Th 
transcription factors in PD and AIA interaction. In submandibular lymph nodes, an 
increased expression of tBET, GATA3, RORγ and Foxp3 mRNA was associated with PD 
(Fig. 4). Nevertheless, in the group PD+AIA, the expression of tBET was exacerbated, 
while GATA3 and Foxp3 mRNA levels were reduced in relation to group PD (Fig. 4a-
d). Infliximab decreased the expression of tBET (Fig. 4a) in PD+AIA mice, but it did 
not affect the other transcription factors (Fig. 4b-d). Regarding inguinal lymph nodes, 
which drain joint region, PD did not affect the expression of any of the evaluated 
transcription factors, while in the groups AIA and PD+AIA tBET, GATA3, RORγ and 
Foxp3 mRNA levels were indistinctly increased. Infliximab therapy reversed this 
polarization pattern of Th transcription factors, triggered by AIA in inguinal lymph 
nodes (data not shown). 
 
Serum anti-collagen I antibodies 
 Artigo Científico 2 
 50
 
We further investigated whether any soluble factor in the serum could account for the 
exacerbation of PD by AIA. No significant changes in levels of cytokines, including 
TNF-α, IL-1β, IL-17 and IL-10, were observed in serum of mice with or without AIA, 
45 days post-PD-infection (data not shown). Nevertheless, serum levels of IL-6 were 
markedly increased in the group PD+AIA and this expression was ablated by infliximab 
(Fig. 5a). Increased serum C-reactive protein levels were detected in PD group (C: 3.14 
± 0.37 versus PD: 6.82 ± 0.13 mg/l; mean ± SEM, P < 0.05), while in the group 
PD+AIA these levels were even higher (PD+AIA: 11.61 ± 1.31 mg/l, P<0.05). In 
addition, AIA induced production of anti-collagen I IgG detected in serum and partially 
reduced by anti-TNF-α treatment (Fig. 5b). Stimulation of whole spleen cell cultures 
with collagen I enhanced the expression of TNF-α by cells from group PD+AIA, but not 
by cells from groups C and PD (Fig. 5c). Without stimulus or with ConA, cell cultures 
responded similarly (data not shown). 
 Artigo Científico 2 
 51
 
Discussion 
 
Periodontal disease (PD) and rheumatoid arthritis (RA) have remarkably similar 
pathogenesis and, despite some controversies, emerging evidence suggests that RA 
might have a direct role in sustaining and aggravating the immune-mediated 
inflammatory response in established PD and vice versa (Golub et al. 2006, Pablo et al. 
2009). Previously, we demonstrated that AIA induces signs of PD through increased 
systemic reactivity to auto-antigens (Queiroz-Junior et al. 2011). In the current study, 
we showed that chronic joint AIA exacerbated infection-induced PD in mice, a scenario 
that was ameliorated by anti-TNF-α therapy, although PD did not influence AIA. This 
interaction was associated with an altered polarization pattern of Th transcription factors 
and increased systemic reactivity. 
The use of microorganisms to study PD in mice is useful and well established in the 
literature (Garlet et al. 2006, Garlet et al. 2010, Trombone et al. 2010, Cantley et al 
2011). Indeed, in the present study, A. actinomycetemcomitans infection triggered signs 
of PD, including alveolar bone loss, neutrophil infiltration (as indicated by MPO levels) 
and release of inflammatory cytokines in maxillae. In view of these results, we 
investigated whether AIA, which was already shown to spontaneously induce signs of 
PD (Queiroz-Junior et al., 2011), would alter the progression of A. 
actinomycetemcomitans-induced PD and found that mice challenged for AIA had these 
signs of PD markedly exacerbated. These findings highlight the evidence that RA 
aggravates PD not through functional limb disabilities of the patients, but through active 
immunological imbalances (Mercado et al. 2001, Havemose-Poulsen et al. 2006, 
Pischon et al. 2008). 
Arthritis triggers systemic functional immune interferences that may alter host response 
to periodontopathogens (Pablo et al. 2009, Golub et al. 2006, Trombone et al. 2010). 
Investigating the mechanisms underlying the influence of AIA on PD severity, we 
showed that the inflammatory response in maxillae was locally amplified and skewed 
toward a Th1 response in mice with AIA – increased IFN-γ levels in maxillae and 
enhanced expression of the Th1 transcription factor tBET in submandibular lymph 
nodes. The expression of RORγ, related to the Th17 response, although enhanced by 
infection, was not influenced by AIA. Indeed, Th1 immune response has been 
associated with the influx of inflammatory cells, production of bone resorptive 
cytokines and worse RA (Firestein 2005) and PD (Garlet et al. 2006, 2010) prognosis. 
 Artigo Científico 2 
 52
 
Along with this pattern, the expression of Foxp3 and GATA-3, transcription factors 
associated to T regulatory cells and the Th2 response respectively, which are involved 
in the control of periodontal destruction after infection (Garlet et al. 2010), was reduced 
in mice with PD+AIA. 
Besides the interference in the Th polarization pattern, AIA also triggered systemic 
reactivity in mice with PD. Circulating serum levels of C-reactive protein and the bone 
resorptive IL-6 were significantly higher after AIA induction in mice with PD, but this 
increase was not observed in mice with PD or AIA alone (Queiroz-Junior et al. 2011). 
IL-6 can induce osteoclastogenesis (Liu et al. 2005) and it was alreadysuggested to 
interfere with periodontal parameters of patients with RA (Bozkurt et al. 2006). These 
serum mediators may also prime circulating leukocytes, favoring their responsiveness to 
bacterial stimulus (Golub et al. 2006). Another relevant finding was the production of 
anti-collagen antibodies triggered by AIA. Auto-antibodies can lead to the formation of 
immune complexes which may induce the release of tissue degrading enzymes and 
cytokines (Adkisson et al. 2002, Mullazehi et al. 2006). Indeed, in vitro stimulation of 
whole spleen cell cultures of PD+AIA mice with collagen I, an important component of 
periodontium (Havemose-Poulsen et al. 1997), induced the production of TNF-α, not 
observed in cell cultures of Control and PD groups. These results suggest that the 
systemic reactivity triggered by AIA can be directed against particular auto-antigens 
and this may favor periodontal destruction. In contrast, A. actinomycetemcomitans 
infection induced narrow systemic effects by itself, insufficient to interfere with AIA. 
These findings differ from some evidences showing that the inflammation triggered by 
the periodontopathogen P. gingivalis may alter the course of arthritis (Bartold et al. 
2010, Cantley et al. 2011). In fact P. gingivalis is supposed to influence PD and RA 
interaction through active citrullination of host peptides, generating systemic 
autoantigens that could be involved in the loss of self-tolerance and RA development in 
the context of untreated PD (Liao et al. 2009). This ability is due to the expression of 
the enzyme peptidyl arginine deiminase by P. gingivalis, which is not harbored by A. 
actinomycetemcomitans. Moreover, it is known that, in some conditions, periodontal 
bacteria can induce transient bacteremia and reach other organs, as it has already been 
described in arthritic joints, being a potential trigger point of RA (Martinez-Martinez et 
al. 2009). Nevertheless, as previously characterized, bacterial dissemination to other 
organs, such as spleen, liver, joints, is not detected in the experimental model of A. 
actinomycetemcomitans-induced PD in mice (Garlet et al. 2008, Trombone et al. 2010), 
 Artigo Científico 2 
 53
 
despite the periodontal colonization, which is in line with our results indicating no signs 
of inflammation in joints of infected mice without AIA. Therefore, these conditions 
may have been responsible for the narrow systemic effects triggered by A. 
actinomycetemcomitans-infection and, consequentely, the discrepancies among the 
studies. 
Finally, the prevention of PD and AIA development and exacerbation by the anti-TNF-α 
therapy, shown in this study, has relevant clinical importance. Anti-TNF-α therapies 
represented a major breakthrough in the treatment of chronic inflammatory conditions, 
such as RA (McInnes & Schett, 2007), and they have already been shown to be 
effective in experimental PD (Assuma et al. 1998, Graves et al. 2001). Here, anti-TNF-α 
therapy prevented the development and exacerbation of PD by AIA and it was 
associated with reduction in the expression of bone resorptive cytokines in maxillae and 
tBET in submandibular lymph nodes. Although infliximab prevented PD exacerbation, 
the documented side effects of ablating TNF-α activity include increased risk of 
infections (Smolen et al. 2007), as shown in experimental PD (Garlet et al. 2006). 
Nevertheless, here infliximab did not influence A. actinomycetemcomitans load in 
maxillae of PD and PD+AIA groups. Therefore the efficacious use of this therapy 
seems to be safe to treat RA and avoid the exacerbation of other inflammatory co-
morbidities, such as PD. However, in the clinics it is known that more than half of 
patients do not respond to treatment with complete remission of RA (Firestein 2005). 
Thus, it is possible that clinical response in the oral cavity may not be complete in 
patients whose arthritis do not respond to anti-TNF. In these cases, treating oral 
infection, such as exemplified here with the use of chlorhexidine, may avoid AIA-
induced exacerbation of infectious PD. 
Altogether, the present results indicate that exacerbation of PD by AIA is ameliorated 
by an anti-TNF-α therapy and is associated with an alteration in the Th polarization 
pattern, production of anti-collagen antibodies and increased systemic reactivity. 
Strategies that efficiently treat AIA may restrain the aggravation of PD. Therefore, 
studies aiming at developing therapeutic strategies directed to specific targets to control 
host response seem to be the best approach to reduce co-morbidities such as the one 
involving PD and RA. 
 
 
 
 Artigo Científico 2 
 54
 
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