PERGUNTAS AULAS RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO

Prévia do material em texto

PERGUNTAS AULAS RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO 
1)O que é recuperar e purificar? R: Recuperar biomoléculas, retirar contaminantes, obter uma 
molécula alvo (composto de interesse). 
2)Por que? R: Aumentar o valor agregado, aumentar o grau de pureza (de acordo com a 
finalidade). Obter bioproduto com requerido grau de pureza a partir do meio que foi 
produzido. 
3)Como fazer? R: Feito a partir de operações unitárias em etapas genéricas que são: -
Separação de células (clarificação; -Rompimento celular; - Concentração e/ou purificação de 
baixa resolução; - Purificação de alta resolução; -Tratamentos finais. 
4) Quando (em que tempo) é realizada a purificação? R: Depende de quando é produzida a 
molécula de interesse, pode ser em qualquer fase de crescimento da fermentação. 
5) Quantas operações unitárias são necessárias? R: Depende do grau de pureza necessário (de 
acordo com a finalidade), é muito importante tentar reduzir o número de etapas, pois estas 
diminuem o rendimento final e encarecem o produto. 
6) Como reduzir o número de etapas do processo de purificação? R: Pode-se reduzir o 
número de etapas do processo combinando finalidades diferentes em uma única etapa, por 
exemplo, clarificando, concentrando e pré-purificando simultaneamente por meio da extração 
em sistemas de duas fases aquosas. A aplicação das etapas cromatográficas em uma ordem 
ótima também contribui para a redução de etapas e perdas no processo. Por fim, deve-se 
mencionar a introdução de modificações genéticas no desenvolvimento do microrganismo 
com o objetivo de aumentar a resolução na purificação, integrando totalmente as etapas de 
desenvolvimento do processo. Uma modificação clássica é aquela em que se introduzem 
sequências adicionais de histidina em uma proteína ou peptídeo, a fim de torná-la susceptível 
à adsorção em zinco ou níquel, previamente ligado a um leito cromatográfico (adsorção 
baseada em afinidade química). 
7) Por que reduzir? R: Pois estas diminuem o rendimento final e encarecem o produto. 
8) Existe um método geral para recuperação e purificação de biomoléculas? R: Existem 
etapas genéricas, que são: - Separação de células (clarificação; -Rompimento celular; - 
Concentração e/ou purificação de baixa resolução; - Purificação de alta resolução; -
Tratamentos finais. 
9) Temos perdas? R: Sim, a cada etapa acrescida no processo ocorre perda do produto de 
interesse. As perdas são diretamente proporcionais ao número de etapas e consequentemente 
cumulativas. 
10) O que precisamos considerar quando vamos iniciar uma rec. E pur.? R: A estrutura 
celular, estrutura química, parede, membrana, dimensões, densidade, sobre tudo se a 
molécula de interesse for intracelular, a finalidade do uso, o custo. 
11) Qual o princípio de cada operação unitária? (Filtração, centrifugação, floculação) R: 
Separar o material em suspensão. 
FILTRAÇÃO= Uma suspensão de células em meio líquido é forçada a atravessar o meio filtrante 
o qual retém as células. A fração volumétrica que atravessa o meio filtrante é denominada 
filtrado ou clarificado. A parte retida denomina-se torta de filtração. O aumento gradativo da 
torta de filtração impõe resistência a filtração. (tamanho da partícula) 
CENTRIFUGAÇÃO= A sedimentação ou decantação é a deposição de partículas sólidas 
suspensas num meio contínuo, líquido ou gasoso, em virtude da diferença de densidade entre 
partícula sólida e o fluido. Na centrifugação promove-se o aumento da velocidade dessa 
sedimentação, acelera-se a decantação da partícula por meio de força gravitacional centrífuga. 
FLOCULAÇÃO=Adiciona-se coagulantes químicos para que partículas pequenas se agreguem 
formando partículas maiores aumentando a velocidade de decantação. 
12) Quais as principais diferenças entre elas? R: Na filtração a força motriz é a diferença de 
pressão, na centrifugação é a força centrífuga através do movimento de rotação (força maior 
do que a gravidade). 
13) Qual escolher? 
14) Qual a diferença entre filtração convencional e tangencial? R: Na filtração tradicional o 
fluido de alimentação é forçada a atravessar a membrana filtrante e pode ser através de 
pressão acima do filtro, ou abaixo (vácuo), de forma perpendicular. Na filtração tangencial o 
fluido escoa tangencialmente sobre a superfície do meio filtrante. 
15) Podem ocorrer problemas de assepsia nas operações de filtração? R: Sim, principalmente 
se o filtro ficar saturado (entupido). É muito difícil manter a assepsia em operações de 
filtração. 
16)Se o meio conter outro material precipitado posso filtrar? R: Posso, mas se eu precisar 
apenas da célula preciso adicionar outra etapa para separar essa célula. 
16) Como determinar S(compressibilidade)? R: Tortas rígidas S=0 (tempo de filtração menor 
em relação a tortas formadas por células microbianas). Tortas formadas por m.o o S pode 
chegar a 0,8. S=0 para tortas incompressíveis. 
17) O que são auxiliares de filtração? R: Auxiliares de filtração reduzem a compressibilidade 
da torta, aumentando a permeabilidade do leito. Evitam penetração da célula ou seus 
fragmentos na membrana, diminuindo a obstrução dos poros. Reduzem o tempo de filtração 
de 5 – 20 x. Ex: terra diatomácea 
18) Você consegue identificar alguma limitação em utilizar um auxiliar de filtração para 
clarificação de meios fermentados? R: O emprego de auxiliares de filtração aumentam o 
custo da operação unitária, diminuição do rendimento da molécula alvo pois há absorção do 
líquido no auxiliar (inviabilizando o uso da célula), aumento da turbidez do clarificado, 
aumento de massa residual, inviabilização do emprego das células residuais para composição 
de ração animal. Precisando separar ele da célula posteriormente. 
19) Por que é importante determinar o coeficiente de retenção de sólidos (R) ? R: Porque ele 
leva em consideração a conc. De sólidos no filtrado e no retido. E isso me dá uma idéia de 
quão eficiente está esse filtro. Eu quero que o sólido seja maior no retido, se ele for mto 
grande no permeado quer dizer que o processo não está sendo eficiente. 
20) Você acha que é possível reverter esses fenômenos que influenciam J e R 
(fouling/entupimento) e polarização? R: Se deixar os poros obstruídos, vai ficar impermeável. 
A obstrução não tem como reverter já a polarização (deposição de cel. Na membrana) pode-se 
reverter com aumento de pressão, ou de velocidade, lavagem, retrolavagem para retirada de 
sujidades. 
21) Você consegue fazer uma relação entre densidade celular, rotação e integridade celular? 
R: Quanto menos densa a célula eu tenho que aumentar a rotação mas pode romper a célula 
(que pode ser indesejado). No caso de ultrafiltração onde tem-se grande elevação de rotação 
pode-se ter aquecimento tbm. 
22) Qual a diferença entre uma centrífuga laboratorial e uma centrífuga preparativa? R: A de 
laboratório eu coloco a suspensao vou fazer a operação e vou ter o precipitado e o 
sobrenadante e na preparativa a separação vai ocorrendo durante o processo, o material 
clarificado vai saindo constantemente. 
23) O que é floculação? R: O floculante é adsorvido na célula e elas se agregam ficando com 
tamanho maior devido as cargas – e + que se atraem. 
24) Por que pode ser um método alternativo a centrifugação e filtração?R: É mto utilizado 
devido ao tamanho dele e não é tão dispendioso quanto filtração e centrifugação. 
25) Você identifica limitações nesta operação? R: Os floculantes utilizados a maioria são 
polímeros derivados do petróleo, exige outro processo para separar. 
26) E sobre sedimentação será viável? R: Sim algumas culturas microbianas sedimentam mas 
não e um processo indicado pq exige mto tempo para a separação. 
ROMPIMENTO CELULAR 
Perguntas que dever ser feitas: *que célula é? Como é composta? Parede frágil ou não? Onde 
está a molécula de interesse? 
Quanto mais informações melhor. 
 
27) A molécula de interesse é termolábil? R: Estabilidade da molécula28) É sensível a tensões de cisalhamento? R: 
 
29) É sujeita a ação de enzimas? R: 
 
30) Como é a parede celular do micro-organismo? R: 
31) Estabilidade mecânica do m.o??? R: É quanto que ele fica resistente ás forças que são 
aplicadas ao m.o. Se ele é mais resistente, mas ela tem rigidez principalmente quando é 
cultivada em meio específico para ela, um meio natural. Quando mudamos o meio de cultivo 
natural para sintético modifica-se mto a estabilidade mecânica do m.o. A estabilidade varia 
com a idade do cultivo, espécie, temperatura, pressão. 
A idade do cultivo= Quando o cultivo está na fase log de crescimento onde há duplicação da 
biomassa, normalmente a parede celular é mais frágil para facilitar a duplicação. Na fase lag 
ele pode ter a parede mais rígida, na fase de quase morte muitas feses já se tem inibição de 
crescimento devido a falta de nutrientes, o que deixa a parede celular mto frágil. 
Os protocolos são seguidos qndo vamos fazer as mesmas coisas, por issso temos que testar e 
ficar preparados para obter resultados diferentes. 
Todas as variáveis q tem no meio influenciam na estabilidade mecanica 
32) Quais as desvantagens da recirculação no homogeneizador de alta pressão? R: Perdas, e 
cada vez mais gera-se fragmentos menores. Suponhamos que estamos separando enzimas a 
minha enzima está ali, mas ao recircular posso gerar mais fragmentos e menores, dificultando 
mais a separação da molécula alvo no final. 
33) Como o desempenho do método de homogeneização de alta pressão pode ser alterado? 
R: Pode ser afetado pela P, pela velocidade, pelo numero de ciclos, pela estabilidade mecânica 
do m.o. 
 
34)Como determinar o tempo de operação em um moinho de bolas? R: Quanto maior o 
tempo no moinho diminui o numero de células intactas. Pode-se ir determinando a atividade 
enzimática (no caso de ser uma enzima). 
O tempo de rompimento total deve-se avaliar a concentração da molécula alvo e o que tem-se 
de fragmento. 
POSSIVEL USAR ULTRASSSOM? Sim, alguns novos artigos trazem saídas para utilização do 
ultrassom a nível laboratorial 
35) Quais as limitações dos métodos mecânicos? R: Forças de cisalhamento provocados pelos 
rompimentos mecânicos podem destruir organelas, desnaturar proteínas, liberar mto mais 
resíduo de material para o meio, elevação da temperatura necessitando de resfriamento. 
 
36) O que é a permeabilidade seletiva? R: Não tem-se rompimento total da célula, a água 
entra e migra da célula carregando os compostos hidrossolúveis. (choque osmótico) 
37) Lembrando da relação congelamento x tamanho dos cristais. Neste caso, o que é mais 
indicado alta ou baixa velocidade de congelamento? R: Só o simples fato de congelar e 
descongelar por causa das formações de cristais há o rompimento celular. A velocidade maior 
de congelamento forma cristais menores, podendo preservar a célula. Isso depende mto do 
tamanho e da fragilidade da célula, se a parede celular estiver bem frágil, torna-se fácil de por 
ex. extrair algum pigmento. 
38) Como definir o método a ser utilizado? R: Tipo celular, morfologia, matriz(célula vegetal 
diferente da célula animal), características da molécula de interesse, o produto de interesse, o 
custo, a viabilidade celular, 
O que? Como? PQ? Sempre pensar 
39) Qual o princípio da técnica de precipitação? R: É uma perturbação química ou física, para 
obter um precipitado de uma molécula. Essa perturbação pode ser um agente precipitante ou 
um processo físico como mudança de temperatura. Tem-se um precipitado e um 
sobrenadante. Pode-se centrifugar, filtrar. A proteína estará no precipitado. 
 
40) Qual a composição do precipitado que será formado? R: A molécula de interesse, 
dependendo do agente precipitante ex: sal estará ligado nas proteínas. 
41) Como recuperar esse precipitado? R: 
42) O que é solubilidade? R: É o resultado das interações atrativas e repulsivas entre 
moléculas de solvente e soluto. 
43) Podemos separar duas proteínas diferentes modificando a temperatura? R: Não é o 
comum utilizar mudança de temperatura para separar proteínas A e B. Pode-se usar para 
separar em geral, pois mudanças drásticas de T causam desnaturação. 
44) E o pH? R: Sim, por causa do ponto isoelétrico de cada proteína. 
45) O que é Ponto isoelétrico? R: É o pH em que a carga global é zero então ocorre a redução 
da repulsão eletroestatica aumentando agregação das moléculas. É onde tem-se a menor 
solubilidade. 
A precipitação por adição de sal e solvente orgânico são as mais utilizados, importante lembrar 
dos conceitos de: 46) Salting-in:/ 47) Salting-out: 
O sal até determinada concentração (baixa) ele promove a solubilidade, na alta ele começa a 
diminuir a solubilidade, pq o sal se liga as moléculas de água que estao na solvatação 
(hidratação) e vai reduzindo a atividade de água na molécula deixando exposto os resíduos 
polares e eles se unem uns aos outros (interação entre cargas superficiais ou zonas hidrófobas) 
ficando resíduos polares ou apolares. Quando elas ficam com essas regiões expostas elas 
precipitam. 
48) Como separar A e B? R: Conhecendo o perfil de solubilidade da proteína é possível 
adicionar determinada concetração de sal e fazer com que ela precipite. 
 
49) O que acontece quadno adiciono solvente? R: Ele reduz a constante dielétrica do meio 
(capacidade do solvente de reduzir o campo elétrico de uma partícula que esteja imersa nele), 
mexendo na camada de solvatação, a água se liga aos grupos hidroxila do solvente, perdendo a 
camada de hidratação. Esse processo desnatura a proteína em temperatura ambiente, então 
realiza-se em baixas T. 
50) Vantagem em adição de solvente? R: Pode-se secar posteriormente, tem propriedade 
bactericida, em baixas concentrações não afetam outros métodos de precipitação. Se quero 
desproteinizar uso um solvente com maior cadeia. 
51) Limitações dessa técnica? R: Pode ser inflamável, gerar calor, desnaturar. 
52) Precipitação por adição de polímero? R: Realizam expulsão da água. 
53) Preciítação por temperatura? R: Pode correr risco de desnaturar se aumentar, então 
trabalha-se com a redução da T.