Rompimento Celular - Bioengenharia

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ROMPIMENTO CELULAR 
A maior parcela dos produtos biotecnológicos de interesse comercial corresponde 
a metabólitos extracelulares de células microbianas como bactérias e leveduras. 
Entretanto, uma parcela importante dos bioprodutos corresponde a moléculas acumuladas 
intracelularmente, como proteínas, enzimas e anticorpos. O aumento da demanda por 
bioprodutos intracelulares para aplicações nas indústrias alimentícias e farmacêuticas 
evidencia a importância das operações de rompimento celular. Soma-se a isso o fato de 
que os avanços nas técnicas de recombinação de DNA apontam na direção de estudos 
relacionados à síntese de diversas novas moléculas intracelulares, em procariotos e 
eucariotos, o que leva à necessidade adicional de avanços nas técnicas de rompimento 
celular. 
Quando a molécula de interesse está no meio intracelular, a primeira operação 
necessária é o rompimento da parede celular ou membrana celular. O mecanismo adotado 
para romper células depende do tipo de microrganismo empregado e ocorre após a etapa 
de separação e lavagem das células obtidas ao final do cultivo (PESSOA & KILIKIAN, 
2005). Os métodos de rompimento celular podem ser assim subdivididos: 
 1) mecânicos; 
 2) não mecânicos ou físicos; 
 3) químicos; 
 4) enzimáticos. 
Segundo MONKS (2015), esses métodos podem ser mecânicos (homogeneizador 
de alta pressão, moinho de bolas, prensa francesa e ultra- som), não mecanismos (choque 
osmótico, congelamento e descongelamento, aquecimento, secagem), químicos (álcalis, 
solventes, detergentes, ácidos) e enzimáticos (lise enzimática, inibição da síntese da 
parede celular). 
No entanto, os métodos mais abordados em escala laboratorial e industrial são os 
mecânicos e os métodos de rompimento químico, pois o enzimático é de difícil ampliação 
de escala, devido à dificuldade de monitoramento dos parâmetros adotados. (NEVES, 
2003). 
O meio líquido resultante da operação de rompimento das células é denominado 
homogeneizado ou lisado, e é constituído pela molécula-alvo, moléculas contaminantes 
e fragmentos de membranas celulares, o que resulta em uma composição complexa. Os 
compostos indesejáveis presentes nesse lisado devem ser removidos por meio de 
operações unitárias adequadas, que compreendem o processo de purificação de 
biomoléculas. 
A etapa de rompimento celular acaba promovendo o aumento do número e da 
diversidade de moléculas contaminantes no meio que contém a biomolécula a ser 
purificada, além do aumento da viscosidade causada pela liberação de componentes do 
citoplasma das células, como os ácidos nucleicos. Além disso, é necessário acrescentar 
mais uma operação de clarificação, para separação dos fragmentos da parede celular. 
Como resultado, tem-se um processo com maior número de operações unitárias, e 
consequentemente, maior custo do produto final, quando comparado com o custo de 
produtos extracelulares, além de menores rendimentos, pois a cada etapa de purificação 
agregada ao processo uma fração da molécula-alvo é perdida. 
 Nesse sentido, a biologia molecular pode contribuir para a redução dos custos dos 
processos de purificação de produtos biotecnológicos, uma vez que pode ser aplicada para 
a modificação genética da célula de tal forma que ela passe a produzir a biomolécula-alvo 
extracelularmente. 
Fatores que afetam o rompimento celular 
Como citado anteriormente, para escolher o método de rompimento celular mais 
adequado, é necessário ter conhecimento da morfologia e tamanho da célula, ou seja, ter 
conhecimento sobre sua estrutura (CARNEIRO,1996). A Saccharomyces cerevisiae, por 
exemplo, é um fungo unicelular que apresenta parede celular rígida e altamente complexa, 
por possuir polissacarídeos, o que geralmente está relacionado às condições de cultivo 
em que foi submetida (RIO, 2002). Os Beta-glucanos e a quitina são os maiores 
responsáveis pela rigidez da parede celular e definem sua forma. (GOMES, 2009). 
Assim, conhecendo tais características, torna-se possível definir o método para 
rompimento da célula. A parede celular pode ser completamente rompida ou o suficiente 
para liberar a molécula alvo. Após o rompimento os compostos indesejados 
(biomoléculas e fragmentos celulares) devem ser removidos por processos de filtração, 
centrifugação, precipitação ou extração liquido- liquido. 
Considerando que o rompimento celular agrega etapas e custos adicionais ao 
processo de purificação e reduz o rendimento final da molécula-alvo, especial atenção 
deve-se dar à seleção do método que será empregado. Assim, alguns fatores, listados 
abaixo, devem ser considerados na seleção da operação de rompimento celular a ser 
utilizada. 
• Fatores dependentes dos organismos: Tipo de célula, estado fisiológico, 
velocidade de crescimento, tamanho e forma da célula e meio de cultivo utilizado. 
• Fatores dependentes do produto final: Sensibilidade ao calor, tempo de 
rompimento, sensibilidade a tensões de cisalhamento, custo do processo e 
localização na célula. 
Com os avanços das técnicas de recombinação de DNA, várias moléculas intracelulares 
tem sido sintetizada a partir de procariotos e eucariotos. Levando em consideração: 
tamanho da célula, tolerância a tensões de cisalhamento, necessidade de controle de 
temperatura, custo e rendimento do processo. Células envolvidas só por membranas 
celulares, como células de animais, são frágeis e rompidas facilmente sob baixas tensões. 
Além de poderem ser rompidas por variação da pressão osmótica do meio, adição de 
detergentes ou aplicação de ultra som. Por outro lado, há células com parede celular 
robusta, caso das microbianas e o rompimento é mais difícil. As bactérias gram-positivas 
possuem parede mais rígida que as gram-negativas. AS leveduras possuem paredes 
celulares ainda mais rígidas. 
Métodos de rompimento celular 
1. Mecânicos 
Embora existam muitos exemplos específicos de ruptura celular por processos 
químicos e enzimáticos, são os métodos mecânicos que têm sido mais utilizados 
industrialmente. O tamanho e a forma das células, assim como a estrutura da parede 
celular, são fatores determinantes para a definição do tipo de processo a ser utilizado para 
a ruptura celular através de processos mecânicos. 
1.1 Homogeneização a alta pressão 
Constituído por pistões projetados para a aplicação de altas pressões, forçando a 
passagem da suspensão celular por um orifício estreito seguida de colisão contra uma 
superfície em uma câmara de baixa pressão. A redução instantânea da pressão associada 
ao impacto provoca rompimento celular sem danificar as biomoléculas. A quantidade de 
células rompidas é proporcional à pressão empregada. Este tipo de rompimento provoca 
aumento da temperatura do meio, por isso necessita de sistema de refrigeração. O 
desempenho pode ser afetado por: Pressão de operação, velocidade de alimentação, 
temperatura, estado fisiológico do microrganismo, condições de cultivo, tipo de célula e 
sua concentração. 
A homogeneização sob alta pressão consiste em fazer passar suspensões de 
células, a alta pressão, através de um pequeno orifício que liga uma câmara com a pressão 
atmosférica. Pela súbita descompressão, as células se rompem. Esta mudança brusca de 
pressão gera grande quantidade de calor, por isso é necessário um sistema de refrigeração 
eficaz (TREVAN et al., 1990). 
 
Figura 1. Esquema de Homogeneizador a alta pressão 
 
 
Figura 2. Homogeneizador a alta pressão para aplicação industrial 
 
O grau de ruptura verificada nesse tipo de equipamento depende da fase de 
crescimento do micro-organismo, sendo que as células da fase estacionária são mais 
resistentes que as da fase exponencial (TREVAN et al., 1990). A ruptura em 
homogeneizador sob alta pressão gera um rompimento não específico, pois ocorre em 
apenas uma parte da parede celular. O homogeneizador é um equipamento vital nas 
indústrias de laticínios para ruptura dos glóbulosde gordura do leite e controle de 
tamanho destes (GECIOVA, BURY; JELEN, 2002). 
Esses equipamentos são indicados para romper bactérias e leveduras, e não para 
fungos filamentosos (bloqueiam a válvula de descarga). Porém esse tipo de rompimento 
causa o aumento da temperatura do meio e por isso, o equipamento deve ter um sistema 
de refrigeração, principalmente quando a molécula é termo sensível. A quantidade de 
células rompidas é proporcional a pressão de alimentação (5000 a 20000 psi). Para 
aumentar a eficiência pode- se recircular o material (aumenta o custo, gera fragmentos 
bem menores, pode-se degradar a molécula). 
As condições de crescimento influenciam a eficiência. Células E. Coli cultivadas 
em meio sintético são rompidas em condições mais brandas do que as cultivadas em meio 
complexo (pode oferecer nutrientes essenciais para a síntese da parede celular). 
Crescimento rápido gera células com paredes celulares menos robustas. 
1.2 Agitação em moinho de bolas 
O método de rompimento mecânico de moinho de bolas consiste na utilização de 
esferas de vidro em um recipiente cilíndrico contendo a suspensão celular 
(GARCIA,2006). O choque das esferas com a biomassa promove transferência de energia 
e consequentemente o rompimento celular. Alguns fatores como tamanho das esferas, 
velocidade de agitação do moinho e a concentração de células interferem neste processo 
(LUCI et. al., 2015). 
Consiste na passagem da suspensão celular por uma câmara de trituração (vertical 
ou horizontal) promovida de um eixo com discos de agitação e preenchida com esferas 
de vidro. O rompimento ocorre devido à força de cisalhamento aplicada pelas esferas de 
vidro contra a parede celular das células. 
O moinho de bolas, originalmente utilizado nas indústrias de tintas, foi adaptado 
com sucesso para o rompimento celular, tanto em laboratório quanto industrialmente. É 
um método simples e efetivo para o rompimento da parede celular de diferentes tipos de 
micro-organismos. O esquema básico desses equipamentos consiste em uma câmera de 
moagem encamisada com uma haste longitudinal rotatória no centro. Na haste estão 
presos agitadores de diferentes formatos que são responsáveis por transmitir energia 
cinética a pequenas esferas (geralmente de diâmetro inferior a 1,5 16 mm) contidas na 
câmera, forçando-as a colidirem umas com as outras (MIDDELBERG, 1995). 
A seleção do diâmetro das esferas e da carga de partículas é de grande importância 
para uma maior eficiência no processo de ruptura celular, dependendo da localização do 
bioproduto na célula. Uma carga geralmente de 80-90% do volume livre do 
compartimento de abrasão é considerada ótima (MIDDELBERG, 1995). 
É constituído por uma câmera cilíndrica fechada, horizontal ou vertical, um 
sistema de refrigeração e um eixo que gira em alta rotação. Nessa câmera são adicionadas 
esferas de vidro e células em suspensão. Ocorre atrito entre esferas e as células o que 
causa o rompimento celular. As condições de rompimento são facilmente controláveis e 
a eficiência depende: 
1) da geometria da câmera: câmeras horizontais proporcionam maior eficiência; 
2) da velocidade: quanto maior a velocidade mais rápido é o rompimento; 
3) do tipo de agitador: o que transfere mais energia é o mais eficiente; 
4) do tamanho das esferas: bactérias requerem 0,1mm e leveduras 0,5mm. Quanto 
menor o diâmetro melhor a eficiência; 
5) da carga das esferas: as esferas devem ocupar de 80 a 85% do volume da câmera 
horizontal e 50 a 60% do volume da câmera vertical. Carga muito pequena não 
proporciona colisão e carga muito grande faz que esferas colidam com esferas; 
6) da concentração celular: 30 a 50% do volume da câmera; 
7) da velocidade de alimentação: a fração de células rompidas diminui com o fluxo 
de alimentação, pois diminui o tempo de residência no rompedor; 
8) da temperatura: recomenda- se o rompimento entre 5 e 15 graus, para os 
moinhos de bolas devem possuir mantas de resfriamento. 
1.3 Ultrassom 
O rompimento por ultrassom ocorre quando ondas sonoras de altíssima frequência 
são convertidas em vibrações em um meio liquido gerando bolhas pequenas, as quais 
entram em colapso com o passar do tempo, gerando impacto e uma onda de choque que 
circundam pelo meio líquido, produzindo uma tensão de cisalhamento e o rompimento 
celular. Método muito utilizado em escala de laboratório e inviável em grande escala. A 
energia ultrassônica é gerada por um aparelho chamado sonicador e transmitida por uma 
sonda. 
Grande parte da energia ultrassônica absorvida pela suspensão celular se 
transforma em calor, por isto um controle de temperatura é necessário (MIDDELBERG, 
1995). 
O mecanismo de ruptura celular por ondas ultrassônicas está associado com o 
fenômeno de cavitação. Este fenômeno resulta na liberação de ondas de choque altamente 
energéticas, que causam a aparição de tensões mecânicas, provocando danos na superfície 
atingida. As forças cisalhantes produzidas pelo turbilhonamento gerado durante a 
cavitação geram pequenas bolhas de ar, e quando estas bolhas são maiores que as células, 
elas fazem com que estas células se movimentem de forma violenta até que ocorra o 
rompimento das mesmas. Por outro lado, quando as bolhas são menores que as células, 
elas são capazes de gerar stress cisalhante disruptivo sem a necessidade de movimentação 
das células. Dessa forma, células maiores sentem mais o turbilhão do que células menores 
(GECIOVA, BURY; JELEN, 2002). 
Desvantagens do rompimento mecânico 
As elevadas forças de cisalhamento provocadas pelos rompimentos mecânicos 
podem destruir organelas celulares e desnaturar enzimas; com o rompimento integral das 
células todo o conteúdo intracelular, incluindo ácidos nucléicos, organelas e fragmentos 
celulares é liberado junto com a molécula-alvo, sendo que o homogeneizado celular pode 
conter grande quantidade de contaminantes e elevada viscosidade. 
2. Não Mecânicos 
2.1 Choque osmótico 
Para o rompimento celular em meio com alta pressão osmótica, as células devem 
ser mantidas por 30 min em meio cuja concentração de sacarose seja de 20%, separadas 
por centrifugação e suspendidas em água destilada a 4ºC. O choque não rompe a célula 
integralmente, mas propicia uma permeabilidade seletiva, onde algumas proteínas podem 
ser liberadas para fora da célula. Essa técnica reduz a quantidade de contaminantes para 
ser retirado em técnicas posteriores. Muito indicado para gram-negativas (parede celular 
mais sensível). 
2.2 Congelamento/descongelamento 
Consiste em ciclos de congelamento e descongelamento, em velocidade e 
temperaturas adequadas. A ruptura total ou parcial da parede celular se dá pela ação dos 
cristais de água formados (cristas de gelo que perfuram a célula ou a lesionam) e liberal 
a molécula-alvo. Os fatores de importância a se considerar são: tipo de célula, sua idade, 
temperatura final de congelamento e as velocidades de congelamento e aquecimento. 
É indicado para rompimento de patógenos, porém possui algumas desvantagens 
por ser um método demorado e de difícil implantação em grande escala, além disso, 
enzimas sensíveis ao congelamento podem acabar sendo inativadas. Logo, não é indicado 
para a obtenção de biomoléculas sensíveis. 
 
2.3 Aquecimento/ Termólise 
Consiste no aquecimento da suspensão celular em banho termostatizado, com 
injeção direta de vapor, tambor rotativo ou em spray-drier. São os mais utilizados para 
rompimento em larga escala devido à sua simplicidade; principalmente utilizados para 
algas, fungos filamentosos, leveduras e bactérias destinadas à produção de proteína 
microbiana; apresenta a vantagem de gerar fragmentos celulares com maiores dimensões 
e, portanto, de mais fácil remoção por filtração ou centrifugação. 
Exemplos: Rompimento total de células de uma suspensão de E. coli (bactéria 
Gram-negativa), ocorre com aquecimento a 90 ºC por 15 minutos com liberaçãode 
enzimas intracelulares. Uma suspensão de Bacilus megaterium nas mesmas condições 
proporciona o rompimento de menos da metade das células (bactéria Gram-positiva - 
camada mais espessa de peptideoglicano). 
 
3. Químicos 
3.1 Álcalis 
Os compostos álcalis mais utilizados para o rompimento celular são o hidróxido 
de sódio e a amônia, em razão da inativação de patógenos ou microrganismos 
geneticamente modificados. 
Essa técnica é adequada para ser utilizada quando a biomolécula se encontra 
estável em um pH acima de 11,0. Ademais, é um método simples e com baixo custo de 
investimento, podendo facilmente ser ampliado em larga escala. Sua principal 
desvantagem é a geração de poluentes produzida durante o uso. 
 
3.2 Detergente 
Os detergentes têm como função desestruturar as moléculas de lipídio das 
membranas biológicas, gerando a ruptura e todo seu conteúdo celular passa a ficar 
disperso na solução. 
Nesse caso, a célula apresenta a possibilidade de ser totalmente rompida, devido 
à propriedade que os detergentes possuem de dissociar proteínas e lipoproteínas de suas 
paredes celulares. Isso ocasiona a formação de poros que irão liberar a molécula alvo em 
questão. 
A eficiência dessa ruptura irá depender do pH e da temperatura, podendo ser 
aumentado por meio de um pré-tratamento à base de solventes orgânicos que estimulam 
a autólise. 
 
4. Enzimáticos 
4.1 Lise enzimática 
Esse processo utiliza enzimas que possuem a capacidade hidrolisar as paredes 
celulares de células microbianas. O mecanismo consiste no rompimento da membrana 
citoplasmática através de pressão osmótica interna. Após a parede celular, ou parte dela, 
ser removida pelas enzimas, o conteúdo intracelular é liberado para o meio externo. 
A lise enzimática é um método de rompimento celular atraente em termos da sua 
especificidade, condições suaves de operação, baixo investimento de capital, além de ser 
adequado para a recuperação de biomoléculas sensíveis à tensão de cisalhamento 
(Harrison, 1991). 
É vantajoso devido à facilidade no controle de temperatura e do pH, alta 
especificidade para degradação da parede celular e é possível associar o uso com outros 
métodos, mecânicos ou não. Já como desvantagens, tem-se o alto custo das enzimas e a 
variação da eficiência em função do estado fisiológico do microrganismo, visto que a 
eficácia dessas enzimas pode variar de acordo com o estágio de crescimento celular, 
gênero e espécie. 
O sistema enzimático deve ser adequado para cada tipo de organismo, pois 
possuem composições distintas na parede celular. As bactérias gram-negativas, diferentes 
das gram-positivas, são compostos por uma parede com duas camadas: a interna, de 
peptidoglicano e a externa, de lipoproteínas, proteínas, fosfolipídios e lipossacarídeos. 
 
 
 
 
 
Figura X – Diferentes estruturas de paredes celulares de microrganismos 
 
 
REFERÊNCIAS 
HARRISON, S. T. L. Bacterial cell disruption : a key unit operation in the recovery of 
intracellular products. Biotechnology Advances, v.9, n.2, 1991. 
 
 
 
 
LEITÃO, Ana Laura Oliveira de Sá. Avaliação de métodos de rompimento celular e 
de diferentes metais imobilizados em resina Streamline Chelating para purificação 
do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi. 2017. Dissertação de Mestrado. Brasil. 
 
 
NEVES, L. C. M. Obtenção da enzima glicose 6-fosfato desidrogenase utilizando 
‘Sacchamomyces cerevisiae’ W303-181. Dissertação (Mestrado em Tecnologia de 
Fermentações) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas, USP, 2003. 
 
 
PESSOA JR, A.; KILIKIAN, B. V. Purificação de produtos biotecnológicos. Barueri, 
SP: Manole, 2005.