Relatório de aula prática imunofluorescência indireta

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Universidade Federal do Pará 
Instituto de Ciências Biológicas 
Faculdade de Biomedicina 
 
 
 
 
 
 
 
INGRID RAQUEL SILVA SANTOS 
 
 
 
 
RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA: IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Belém-Pa 
2023 
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1. INTRODUÇÃO 
 
Na área da imunologia, a imunofluorescência indireta caracteriza-se como a técnica laboratorial 
que utiliza da fluorescência para detectar antígenos celulares. Estes podem estar presentes na 
superfície ou no interior celular. Desse modo, eles são usados como marcadores na identificação 
dos diferentes tipos celulares em suspensões ou tecidos (ABBAS et al, 2008). A técnica de 
imunofluorescência indireta utiliza anticorpos ligados a moléculas denominadas fluorocromos, 
as quais são capazes de absorver radiação, excitar-se e emitir luz visível. Tal associação entre 
fluorocromo e anticorpo deve ser simples e capaz de produzir um conjugado fluorescente que 
proporcione a detecção dos autoanticorpos ligados aos antígenos celulares, o que torna possível 
a identificação de imunocomplexos que se dirigem contra diferentes componentes celulares e 
formam distintos padrões de fluorescência associados a doenças (AOKI et al, 2010). A 
metodologia para a detecção de autoanticorpos é realizada em placas com antígenos fixados aos 
poços, os quais se ligam aos anticorpos autorreativos presentes nas amostras dos pacientes, essa 
ligação serve como ponte para a união do antígeno associado ao fluorocromo - sendo um dos 
mais utilizados o isotiocianato de fluoresceína (FITC), de cor verde. Ao microscópio, é possível 
notar luz visível que proporciona um resultado qualitativo referente a presença ou ausência de 
anticorpos na amostra do paciente. Nesse contexto, por ser um teste presente em muitas rotinas 
laboratoriais que possibilitam o diagnóstico de diversas doenças autoimunes, as atividades 
práticas referentes a técnica de imunofluorescência indireta utilizaram-se de amostras suspeitas 
de infecção por HIV para a detecção de autoanticorpos nucleares. Portanto, objetivou-se a 
realização prática de tal teste, com o intuito de demostrar seus possíveis resultados em relação 
as amostras advindas de pacientes possivelmente HIV soro positivo. 
 
2. MATERIAIS E MÉTODOS 
 
Para a realização da técnica de imunofluorescência indireta utilizou o kit antinuclear 
antibody / HEP-2 IFA da Virgo, então, com a solução tampão PBS diluiu-se as oito amostras 
de soro humano em uma proporção 1:4. Essa etapa foi realizada em tubos, cada um recebeu 
780 µl de tampão PBS e 40 µl de amostra de soro. Na lâmina com poços do próprio kit, 
depositou-se uma gota (aproximadamente 10 µl) de amostra controle negativo no primeiro poço 
e no terceiro poço uma gota de controle positivo. Os demais poços receberam 10 µl das amostras 
diluídas na etapa anterior (foto 1). Em seguida, a lâmina foi colocada dentro de uma câmara 
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úmida - uma placa de petri forrada com papel absorvente molhado - para que incubasse durante 
30 minutos a 23 ºC (foto 2). 
 
Foto 1- Materiais utilizados na primeira etapa do teste: PBS (no Erlenmeyer), tubos com as 
diluições, amostras (no rack preto) e controles. 
 
Fonte: arquivo pessoal. 
 
Foto 2 – Câmara úmida. 
 
Fonte: arquivo pessoal. 
 
Após o período de incubação, com o auxílio de uma pipeta pasteur, enxaguou-se a lâmina com 
um leve jato de tampão PBS. Em seguida, a lâmina foi colocada em uma cubeta contendo 
tampão PBS e mantida por 7 minutos, em gentil agitação. Ao final desse passo, retirou-se a 
lâmina do recipiente e descartou-se a solução de PBS utilizada, trocando-a por uma nova. Logo 
depois, realizou-se a segunda lavagem, em que se seguiu os mesmos passos da primeira 
lavagem, mas por um período de 8 minutos. Após a segunda lavagem, com um papel 
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absorvente, secou-se a lâmina cuidadosamente evitando o contato do papel com os poços. 
Seguidamente, depositou-se uma gota do conjugado FITC nos poços contendo as amostras e 
novamente levou-se a lâmina para a câmara úmida para incubar por 30 minutos a 23 ºC. Por se 
tratar de uma substância fotossensível, a etapa de deposição das gotas do conjugado foi 
realizada com as luzes apagadas. Além disso, transferiu-se a câmara úmida para um recipiente 
metálico protegido da luminosidade. Posteriormente aos 30 minutos de incubação, retirou-se a 
lâmina da câmara e com a pipeta pasteur enxaguou-a com um leve jato de tampão PBS, 
novamente realizou-se as duas etapas de lavagem de 7 e 8 minutos. Ao final das lavagens secou-
se a lâmina cuidadosamente com um papel absorvente, evitando o contato com os poços. Em 
seguida, adicionou-se uma gota de glicerol em todos os poços da placa e cobriu-a com uma 
lamínula. Logo depois, a lâmina foi levada ao microscópio para ser visualizada (foto 3). 
 
Foto 3 – visualização da lâmina ao microscópio: a) controle positivo; b) controle negativo. 
a) b) 
Fonte: arquivo pessoal. 
 
 
3. CONCLUSÃO 
 
Durante as atividades de aula prática os discentes tiveram a oportunidade de aprender 
sobre a técnica de imunofluorescência indireta, a qual foi exemplificada de forma prática. Os 
alunos puderam observar o teste e avaliar os diferentes resultados obtidos a partir de cada 
amostra avaliada. Para as amostras controles positivo e negativo notou-se resultados esperados, 
a presença e ausência de fluorescência, respectivamente. Nas amostras dos pacientes avaliados 
foi possível observar diferentes padrões de fluorescência, os quais foram enviados ao 
especialista para confirmação do resultado como sendo negativo ou positivo. Desse modo, 
esclareceu-se a técnica, proporcionando fixação das etapas metodológicas da sua realização 
laboratorial. 
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REFERÊNCIAS 
ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; PILLAI, S. Imunologia celular e molecular: 9. ed. Rio 
de janeiro: Elsevier, 2008. 
 
Aoki, V., Sousa Jr, J. X., Fukumori, L. M., Périgo, A. M., Freitas, E. L., & Oliveira, Z. 
N.Imunofluorescência direta e indireta. Anais Brasileiros de Dermatologia, v. 85, p. 490-500, 
2010.