UNIVERSIDADE PAULISTA UNIP RELATÓRIO DE IMUNOLOGIA CLINICA

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UNIVERSIDADE PAULISTA – UNIP 
RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS 
CURSO: BIOMEDICINA 
DISCIPLINA: IMUNOLOGIA CLÍNICA 
NOME DO ALUNO: THAMIRYS MONTEIRO PINTO 
RA: 2137079
POLO DE MATRÍCULA: ITES – TAUBATE 
POLO DE PRÁTICA: ITES – TAUABTE 
 DATA DAS AULAS PRÁTICAS (Relacione todas as datas em que compareceu): 
19/08/2023 
26/08/2023 
ATIVIDADES OBRIGATORIAS 
VISUALIZAÇÃO DE CÉLULAS SANGUÍNEAS 
Qualquer definição de células sanguíneas envolve uma variedade de tipos de células, cada um com funções específicas. Os componentes primários do sangue são plasma, leucócitos, eritrócitos e plaquetas; os três últimos são todos exemplos de células sanguíneas. Sem eles, nenhum transporte de oxigênio através do sistema circulatório ocorreria, nosso sangue não coagula e teríamos um sistema imunológico severamente comprometido. A produção de células sanguíneas começa na medula óssea vermelha. (DEAN,2011)
As funções das células sanguíneas podem ser divididas em três grupos principais de acordo com o tipo: transporte de oxigênio, imunidade e processo de coagulação do sangue. Essas funções são o resultado dos eritrócitos, leucócitos e trombócitos, respectivamente. (ROGERS K,2011).
Em condições fisiológicas há equilíbrio entre a produção e a destruição das células sanguíneas, realizada através de microscopia óptica e/ou automatizada, pode revelar possíveis variações fisiológicas ou mesmo situações patológicas. (SPADA,1998)
MATERIAIS:
· Lâminas para leitura (lâminas de esfregaço sanguíneo)
· Óleo de imersão 
· Microscopio
PRODEDIMENTO:
1. O microscópio deve ser colocado sobre uma superfície livre de vibrações.
2. Não mova o microscópio.
3. Posicione a objetiva de menor ampliação na luz movendo o revólver porta-objetivas.
4. Coloque a lâmina (lamela voltada para cima) na platina e coloque-a no suporte.
5. Coloque o condensador na corrediça e acenda a luz.
6. Concentre o esfregaço de sangue em uma imagem nítida medindo macroscopicamente o movimento do parafuso.
7. Use o parafuso micrométrico para aumentar o foco e observar a imagem e os elementos gráficos que podem ser detectados nesta ampliação.
8. Repita o processo com outras objetivas até a objetiva 40X, mas em vez de usar o parafuso macro para focar, use o parafuso micrométrico.
9. ajustar a iluminação
10. Nessa foto já é possível distinguir entre hemácias, plaquetas e glóbulos.
11. glóbulos brancos e observe os diferentes tipos de glóbulos brancos na lâmina.
12. Adicione uma gota de óleo de imersão à lâmina na objetiva 100X.
13. Dentro deste aumento, determine diferenças morfológicas entre neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos e basófilos (se encontrados). Embora diferenças morfológicas funcionais entre linfócitos T, linfócitos B e células NK não possam ser verificadas.
Neutrófilo bastonete
Neutrófilo segmentado
TÉCNICAS DE DILUIÇÃO 
Uma diluição seriada é basicamente uma série de diluições simples que amplifica o fator de diluição. A fonte da amostra para diluição de cada etapa vem da diluição anterior. Todas as diluições na série têm o mesmo fator de diluição, em que a amostra da diluição anterior é usada para fazer a diluição subsequente. Por exemplo, se eu tiver uma diluição 1/2, meu fator de diluição é 2. Todas as diluições seguintes serão multiplicadas por 2.1/2 * 2 = 1/4 * 2 = 1/8 * 2 = 1/16 …O objetivo desse tipo de diluição é ir diminuindo progressivamente a quantidade de soluto (amostra) em relação ao diluente. (MIRAGLIA,2009)
MATERIAIS:
· Meios de culturas
· Tubos de ensaio
· Água 
· Pipeta 10 mL
· Estantes para tubo
· Recipiente para descarte de materiais
PROCEDIMENTO:
Preparação de diluições em série 1:2
1. Dívida 5 recipientes (tubos de ensaio) de igual volume.
2. Pipete 10 mL da diluição em todos os tubos.
3. Adicione 10 mL de solução concentrada ao primeiro tubo.
4. Homogeneização.
5. Transfira 10 mL do primeiro tubo para o segundo tubo.
6. Homogeneização.
7. Repita as etapas anteriores até o tubo 5.
8. Descarte o tubo 5 de 10 mL homogeneizado (para que todos os tubos tenham o mesmo volume).
Preparação de diluições seriadas 1:10
1. Divida 5 recipientes (tubos de ensaio) de igual volume.
2. Pipete 9 mL da diluição em todos os tubos.
3. Adicione 1 mL de solução concentrada ao primeiro tubo.
4. Homogeneização
5. Transferir 10 mL do primeiro tubo para o segundo tubo. 
6. Homogeneizar. 
7. Repetir o procedimento anterior até o tubo 5. 
8. Descartar os 10 mL após homogeneização do tubo 5 (para todos os tubos ficarem com igual volume).
Diluição seriada 1:10
AGLUTINAÇÃO
A aglutinação é o ato ou efeito de aglutinar, o modo pelo qual elementos realidades, coisas, tecidos, células, consciências, pessoas, vocábulos - distintos se unem e integram, formando o todo no qual dificilmente se reconhecem as partes originais. (VIEIRA,2008)
A determinação dos níveis de proteína C reativa vem se tornando uma ferramenta bastante útil na clínica canina para a avaliação de variados tipos de quadros infecciosos e inflamatórios. (VEIGA,2009)
A Proteína C-reativa (PCR) é uma proteína produzida pelo fígado e está presente em pequenas quantidades no plasma de pessoas hígidas. No entanto, sua concentração circulante pode aumentar drasticamente em uma resposta mediada por processos inflamatórios e infecciosos. Esta proteína é considerada um bom marcador de fase aguda por apresentar características como: o tempo de meia-vida curto, entre 8 e 12 horas; resistência à quebra entre a coleta da amostra e o exame laboratorial; e valores normais menores que 5 mg/L, que, em resposta a estímulos inflamatórios podem atingir até 100 vezes o normal em menos de 24 horas e normalizar-se em até 4 dias pela ausência do estímulo crônico. (BARROSO,2016)
MATERIAIS:
· Placa de fundo escuro 
· Palito para homogeneizar os reagentes 
· Pipeta automática de 5 – 20 µL
· Pipetas amarelas (menor volume)
PROCEDIMENTO:
Em cada círculo do prato coloque:
	
	Círculo nº1
	Círculo nº2
	Círculo nº3
	Círculo nº4
	Controle negativo
	50 µL
	-
	-
	-
	Controlo positivo
	-
	50 µL
	-
	-
	Amostra nº1
	-
	-
	50 µL
	-
	** latex fr
	1 gota
	1 gota
	1 gota
	1gota
1. Em cada círculo do prato coloque:
2. Use uma espátula para misturar todo o comprimento de cada círculo lâmina.
3. Agite a lâmina em movimentos circulares durante dois minutos.
4. Observe os resultados.
Reação positiva: nítida aglutinação. 
Reação negativa: ausência de aglutinação (suspensão homogênea).
AGLUTINAÇÃO - HEMAGLUTINAÇÃO
Hemaglutinação passiva para Doença de Chagas.
A doença de Chagas apresenta infecção aguda com alta parasitemia e crônica com queda da parasitemia e aumento de anticorpos. Segundo a RDC nº 36, de 26 de agosto de 2015, os testes de diagnóstico da doença pertencem à classe de risco IV, com obrigatoriedade de registro junto a Agência Nacional de Vigilância Sanitária. O desempenho desses produtos é avaliado na análise laboratorial prévia ao registro, frente a painéis sorológicos compostos por amostras verdadeiro-positivas e negativas. (DA SILVA MACEDO,2020)
Hemaglutinação consiste numa reação muito simples, mais rápida e sensível que o teste de fixação de complemento, na detecção de anticorpos anti-T. cruzi no soro de indivíduos infectados. Baseia-se na aglutinação de hemácias de carneiro, recobertas com antígenos citoplas­máticos de T. cruzi em presença de soro que contenha anticorpos para este parasita. Havendo anticorpos antiantígenos de T. cruzi, os mesmos formarão ligações entre as hemácias, interagindo com os antígenos na sua superfície. Assim, visualmente ocorrerá a formação de um manto nas placas de microtitulação. Em virtude do baixo custo, nitidez dos resultados e simplicidade de execução tem sido amplamente utilizada em situações de rotina. (VITOR,1987)
MATERIAIS:
· Descarte com hipoclorito
· Pipeta automática de 25 – 50 µL
· Kits conforme o descrito
PROCEDIMENTO:
1. Em um tubo de ensaio, diluir a amostra de teste e o soro controle positivo 1/40 (R3) e negativo (R4), adicionar: 10 mL de amostra + 0,4 µL de diluente (R2A). 
2. Adicione 50 µl da diluição (R2A) do 2º poço àmicroplaca. 
3. Transferir 50 µl de amostra diluída para o poço 1. 
4. Transferir 50 µl da amostra diluída para o 2º poço, homogeneizar e transferir 50μl para o 3º poço, misturar e transferir 50μl para o 4º poço e assim por diante Sequência até a câmara 8, 50 μl serão descartados após homogeneização (Ver foto). 
5. Controle positivo: seguir o mesmo protocolo de diluição (item d) até o poço 6, dentre eles, 50μl serão descartados após homogeneização (foto de observação).
6. Controle negativo: Adicionar 50 µl de controle de diluição aos poços 7 e 8.
7. Agite suavemente o frasco para homogeneizar completamente a suspensão de hemácias (R1) e
8. Adicione 25 µl por poço.
9. Bata suavemente na lateral da placa para homogeneizar os reagentes.
10. Deixar a placa em temperatura ambiente em local livre de qualquer substância por 1 hora vibração.
11. Faça a leitura no final da incubação.
Reação positiva: véu uniforme de hemácias recobrindo toda a cavidade, podendo estar às vezes parcialmente retraído nas bordas. 
Reação fracamente positiva: véu pouco nítido, apresentando pequeno depósito de hemácias no fundo da cavidade. 
Reação negativa: botão compacto de hemácias no fundo da cavidade.
ENZIMATICO – ELISA PARA HIV
o início da infecção pelo HIV, a transfusão sanguínea ou hemoderivada era a via mais importante de infecção. Desde 1985, o sangue é analisado com ensaio ELISA para detecção anti-HIV para selecionar os doadores saudáveis. (PEREIRA,2004)
Esta técnica consiste em detectar anticorpos contra o parasita através da utilização de um segundo anticorpo (anti-imunoglobulina humana produzido em animais de laboratório), conjugados a enzimas, que, em presença de substratos específicos, geram produtos coloridos, cuja quantificação é feita espectrofotometricamente. Este método oferece alta sensibilidade, utilização de baixas quantidades de soro, processamento simultâneo de várias amostras e, finalmente, fácil uso em trabalhos realizados em campo (INOUYE,1992)
MATERIAIS:
· Pipeta automática de 5 µl, 25 µl, 50 µl, 100 µl, 500 µl
· Proveta de 50 mL (para diluir tampão de lavagem)
· Balão volumétrico de 200 mL (para diluir tampão de lavagem)
· Ponteiras amarelas (volume até 200 µl)
· Ponteiras azuis (volume até 1000 µl)
· Béquer de 200 mL (para solução de lavagem)
· Pipeta Pasteur de plástico ou vidro (para lavagem)
· Leitora de placas (ELISA)
PROCEDIMENTO:
1. Desenvolver um plano de distribuição e identificação de amostras e controles. 
2. Pipetar 200 µl de diluente + 10 µl de controles positivos, negativos e amostras. pendência Controle branco, onde foram adicionados apenas 200 µl de diluente. 
3. Bata levemente na lateral da placa. 
4. Incubar a 37°C durante 30 minutos. 
5. Despeje o líquido de cada poço e lave 5 vezes com Wash Buffer. 
6. Distribua 50 µl de conjugado anti-Ig peroxidase humana. 
7. Incubar a 37°C durante 30 minutos. 
8. Limpe conforme item 5.
9. Distribua 50 µl de Revelador A + 50 µl de Revelador B (uma gota de cada)
10. Incubar a 37°C durante 30 minutos.
11. Dispensar 50 µl da rolha em cada poço.
Leitura: proceder à leitura da reação em espectrofotômetro para microplacas utilizando filtro 450
REFERÊNCIAS
Dean L. Grupos sanguíneos e antígenos de glóbulos vermelhos [Internet]. Bethesda (MD): Centro Nacional de Informações de Biotecnologia (EUA); 2005. Capítulo 1, sangue e células que ele contém.
Rogers K (Ed). (2011). Sangue: fisiologia e circulação. Nova York, Britannica Educational Publishing.
SPADA, C. et al. Avaliação da contagem diferencial de células sanguíneas por metodologia automatizada e microscopia. Rev. bras. anal. clin, p. 191-3, 1998.
MIRAGLIA, Fabiana et al. Meio de EMJH com 5-fluorouracil e ácido nalidíxico associado a técnica das diluições seriadas usados para recuperar Leptospira spp do sêmen bovino experimentalmente contaminado. Brazilian Journal of Microbiology, v. 40, p. 189-193, 2009.
VEIGA, Angela Patricia Medeiros et al. Utilização de técnica rápida de aglutinação em látex para determinação semiquantitativa dos níveis séricos de proteína C reativa em cães. Acta scientiae veterinariae. Porto Alegre, RS. Vol. 37, n. 2 (2009), p. 151-155, 2009.
BARROSO, Rogério Magno do Vale et al. Determinação das principais proteínas de fase aguda e do índice prognóstico inflamatório nutricional (IPIN) em cachorro-do-mato (Cerdocyon thous-Linnaeus, 1766). 2016.
DA SILVA MACEDO, Gabriella Pires et al. Revalidação do painel sorológico empregado na avaliação dos kits de diagnóstico da doença de Chagas. Vigilância Sanitária em Debate, v. 8, n. 4, p. 124-128, 2020.
VÍTOR, Ricardo Wagner de Almeida; CHIARI, Egler. Avaliação de antígenos do Trypanosoma Cruzi para a reação de hem aglutinação indireta: I. diferentes extratos antigênicos. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, v. 29, p. 178-182, 1987.
PEREIRA, Ana Maria B.; NASCIMENTO, Flávia RF. Prevalência de HIV entre doadores de sangue no banco de sangue do Maranhão. Brazilian Journal of Sexually Transmitted Diseases, v. 16, n. 4, p. 11-13, 2004.