TSA metodos

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Testes de sensibilidade aos antimicrobianos 
“in vitro”. (TSA)
Profa. Patrícia Laguna Miorin
Testes de suscetibilidade antimicrobiana
• É realizado em bactérias isoladas de amostras clínicas de um processo 
infeccioso, no qual a sensibilidade aos an+microbianos não é 
previsível.
• Quando o micro-organismo possa pertencer a uma espécie capaz de 
apresentar resistência aos agentes an+microbianos normalmente 
usados.
As orientações sobre os an?bió?cos mais adequados para cada grupo de 
micro-organismo e informações sobre os métodos de sensibilidade estão 
no BrCAST.
BrCAST
Versão brasileira do European Committee
on Antimicrobial Susceptibility Testing: 
BrCAST”.
Consenso entre: 
European Committee on
Antimicrobial Susceptibility Testing (EuCAST) 
e 
Clinicas and Laboratory Standart Institute
(CLSI).
CLSI e EUCAST
BrCAST
BrCAST
O Ministério da Saúde publicou a Portaria nº 64 de 11/12/2018: 
“Determina aos laboratórios de rede pública e rede privada, de todas 
as Unidades Federadas, a uGlização das normas de interpretação para 
os testes de sensibilidade aos anGmicrobianos (TSA), tendo como base 
os documentos da versão brasileira do European CommiQee
on AnGmicrobial SuscepGbility TesGng, o BrCAST”.
http://brcast.org.br
Métodos para a avaliação da resistência aos 
an4microbianos
Teste de susce4bilidade an4microbiana
TSA
• Método Qualitativo: 
• Disco em difusão ou antibiograma.
• Métodos Quantitativos (concentração inibitória mínima: 
CIM). 
• E-test
• Microdiluição em caldo
Disco em difusão
(antibiograma)
Capacidade de difusão do antibiótico através de um meio 
de cultura sólido.
Disco em difusão: ágar Muller-Hinton
• Melhor meio para as provas de suscetibilidade devido fornecer
um crescimento satisfatório para a maioria dos patógenos não
exigentes:
• pH adequado (7,3 ± 0,2): (valores abaixo: halos de inibição diminuídos para 
aminoglicosídeos (gentamicina), clindamicina e macrolídeos e diâmetro de halo 
aumentado para tetraciclina) Valores acima: efeito inverso.
• Concentração de timina no meio adequado (↑ [ ] falsa R sulfonamidas)
• Espessura adequada (4 - 4.5 mm)
• Controle de qualidade:
• Controle de esterilidade: uma placa incubada a 35 ± 2oC/24h.
• Controle de crescimento: E.coli ATCC 25922.
• As placas devem ser refrigeradas (4-8ºC).
Agar Muller-Hinton
Espessura das placas de 4 a 4,5 mm
Disco em difusão: preparo do inóculo
• Padronização do inoculo pelo método direto:
• Inocular uma colônia do patógeno em 3 ml de solução 
salina estéril a 0,90%.
• Comparar a turbidez com a escala de McFarland 0.5 
(cloreto de bário + ácido sulfúrico): equivalente a 1 -2 x
108 UFC/ml: visualmente, turbidímetro ou 
espectrofotômetro 625nm.
• Realizar a semeadura para antibiograma do inóculo
padronizado com um swab no meio de cultura dentro de 
15 minutos.
Escala de McFarland
Fotômetro calibrado para 
a escala 0.5 de MacFarland
Inoculação na placa de meio de cultura: swab
semeadura para antibiograma
Regra dos 15:
Semear o inóculo dentro de 15 minutos,
aguardar 15 min para absorção do inóculo e incubar após aplicação dos discos dentro de 15 min.
Disco em difusão
aplicação dos discos
• Após semear o inoculo, deixar a placa secar por 5-15 minutos 
para absorção do mesmo antes de aplicar os discos.
• Os discos de papel-filtro são impregnados com antibióticos 
em concentrações padronizadas.
• Colocar os discos sobre a superfície do ágar previamente 
semeado.
• Após aplicação dos discos pressionar levemente com o auxílio 
de uma pinça a superfície de cada disco. A droga difunde-se 
no meio de cultura (placa de 150mm até 12 discos).
• Os discos de antibióticos a serem utilizados estão descritos nas tabelas de 
pontos de corte e controle de qualidade em EUCAST (versão em português 
BrCAST).
Incubação
Inverter a placa e incubar em até 15 minutos após a aplicação dos 
discos.
Incubação: 35±1oC, 16-20h, atmosfera normal.
• Exceção 1 –Glicopeptídeos (vancomicina) para Enterococcus sp. –
realizar leitura em 24h completas (colônias resistentes não são 
visíveis antes).
• Exceção 3: Streptococcus spp, Haemophilus spp, Neisseria spp, outros 
fastidiosos em CO2 (4-6%).
Leitura dos halos
Disco difusão
Halômetro
Paquímetro 
Identificação de contaminantes
E 
Heteroresistência
Clones resistentes
Leitura dos halos
• Superfície escura com luz posicionada diretamente sob a placa.
• Auxílio de uma régua sobre o fundo da placa.
• Meios com sangue – placa aberta – crescimento, não hemólise.
• Caso a droga seja eficaz contra a bactéria, forma-se um halo de inibição 
de crescimento no ponto de encontro da droga com a bactéria.
• Diâmetro do halo:
• Sensível (formação do halo)
• Intermediário (sensível, aumentando exposição)
• Resistente
Redefinição S, I e R 2019 - www.eucast.org
• S – Sensível (dose padrão) : Um micro-organismo é categorizado como 
Sensível, quando há uma alta probabilidade de sucesso terapêu:co
u:lizando o regime de dosagem padrão do agente. 
• I – Intermediário: (nova terminologia mas ainda com abreviatura I) –
Sensível, aumentando exposição. 
• R - Resistente: um micro-organismo é categorizado como Resistente 
quando há alta probabilidade de falha terapêu:ca mesmo quando há
aumento da exposição.
Tabela pontos de corte
Tabela de 
Pontos de 
Corte 
Clínicos do 
BrCAST -
EUCAST, 
válida a 
partir de 15-
03-2021 
http://brcast.org.br/documentos/
Ignorar véu de Proteus sp.
Deslizamento do disco
Identificação de contaminantes
e 
Heteroresistência
An#biograma(disco-difusão)
(Kirby e Bauer)
• Método mais utilizado. 
• Vantagens:
• Facilidade de execução
• Baixo custo (reduzida utilização de materiais e 
reagentes)
• Identificação de contaminantes
• Desvantagem: não estipula CIM.
Determinação da concentração
inibitória mínima
(CIM)
Microdiluição em caldo
E-test
Indicações da CIM
• Pacientes graves que não houve boa resposta clínica, apesar do disco-
difusão mostrar sensibilidade.
• Casos de sepse, endocardite, meningite. Para o=mizar o uso de drogas
tóxicas, reduzindo efeitos colaterais.
• Vigilância de resistência de patógenos mais prevalentes na comunidade para 
avaliar o desempenho das drogas u=lizadas.
E test
teste de gradiente
• An#microbiano com um gradiente exponencial de 
concentração distribuído ao longo da fita. (0,002-32 
μg/mL ou 0,016 -256 μg/mL).
• Padronização do inóculo a 0.5 de MacFarland e 
semeadura para an#biograma.
• Formação de elipse após incubação.
• Vantagens: fácil realização, resultado quan#ta#ve, 
iden#ficação de contaminantes ou clones 
resistentes.
• Desvantagens: poucos an#bió#cos para uma cepa.
Etest
Fita de plástico 
com gradiente 
exponencial de 
concentração 
de antibiótico 
em µg/ml
Formação de 
elipse após 
incubação.
Clones resistentes ou eventual contaminação?
Microdiluição em caldo
• Diluições sequenciais múltiplas de 2 do antibiótico: 0; 1; 2; 4; 8; 16; 32; 64 
μg/ml (50μL de cada diluição de antibiótico em cada orifício).
• Padronização do inóculo: 0.5 MacFarland (diluir 1:100 em salina e pipetar
50μl nos orifícios (final de 5x105UFC/mL).
• Resultado da CIM em μg/mL: a menor concentração do antibiótico onde não
houve crescimento bacteriano.
• Vantagens: testar vários ATBs simultaneamente; resultado quantitative; as 
placas prontas podem ser armazenadas a -70oC até 1 ano.
• Desvantagens: trabalhoso e não permite identificação de contaminantes.
Microdiluição- leitura
64 μg/ml 32 16 8 4 2 
oxacilina
cefoxi5na
amoxacilina
clindamicina
eritromicina
Controle negativo (somente meio)
h"ps://youtu.be/QwHk6VM1leo
https://youtu.be/QwHk6VM1leo
Controle de qualidade
de rotina dos antibióticos
• Frequência do teste de controle de qualidade dos an1bió1cos: 
• A cada novo lote de meio de cultura
• A cada novo lote de an1bió1cos recebidos no laboratório
• U1lização de cepas ATCC (American Type Culture Collec1on)
• Cepa comprada liofilizada.Principais classes de antibióticos
• Agrupados de acordo com a estrutura molecular principal e seu 
mecanismo de ação.
• Classes de antibióticos betalactâmicos (inibem síntese da PC (ligam-se 
nas PBPs):
• Penicilinas: penicilina, oxacilina, meticilina, ampicilina, amoxicilina.
• Cefens: celalotina (1a), cefoxitina (2a), ceftazidima (3a).
• Monobactamicos: aztreonam
• Carbapenêmicos: imipenem, meropenem, ertapenem.
• Aminoglicosídeos (inibe a síntese proteica ribossomal (30S) ): amicacina, 
gentamicina.
• Quinolonas e fluoroquinolonas (inibição da DNA-girase (replicação DNA): 
ciprofloxacina.
• Macrolídeos (eritromicina, azitromicina) e Lincosamidas (clindamicina): 
inibe a síntese proteica ribossomal (50S).
• Glicopentídeos (inibição da síntese da PC (ligam-se a componentes 
químicos do peptideoglicano): vancomicina.
• Tetraciclina (inibe síntese proteica ribossomal (30S).
Anel β-lactâmico
da oxacilina.
PBPs (penicillin Binding
Proteins): proteínas presentes
na face externa da membrana
plasmática. Participam da 
síntese do peptídeoglicano da 
parede celular da bactéria em 
multiplicação.
Métodos automatizados
• Vitek®, Vitek-2®, Walk-Away® e BD Phoenix® : 
• iden:ficação de bactérias Gram-posi:vas e Gram-nega:vas aeróbios e 
microaeróbios, fungos e TSA (resultado qualita:vo e CIM). 
• Provas bioquímicas e concentrações dos an:bió:cos em micro poços dos 
painéis. Paneis par Gram posi:vas e Gram nega:vas.
• Realizar o Gram e padronizar a bactéria na escala 0.5 MacFarland e colocar 
nos painéis. Colocar os paneis no Phoenix para incubação a 35oC/ 16h.
• Maldi-tof: 
• técnica que usa ionização para diagnos:car as proteínas de uma bactéria 
(espectrometria de massa). 
• Iden:ficação de micro-organismos aeróbios, anaeróbios, microbactérias, 
leveduras e fungos filamentosos. 
• Não é necessário Gram. Inocular 1 colônia + 1 uL de ácido fórmico a 70% para 
a extração proteica e colocar na placa do Maldi. 
• Iden:ficação de um conjunto de proteínas ribossomais que são específicos 
para cada espécie bacterina (banco de dados do equipamento).
• Resultados em minutos e não faz TSA.
BD
Maldi-tof