Testes imunológicos - Elisa, Imunofluorescência, IDGA

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ELISA
ELISA (do inglês Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) ou ensaio de
imunoabsorção enzimática é um teste imunoenzimático que permite a detecção
de anticorpos específicos (por exemplo, no plasma sanguíneo).[1] Este teste é usado no
diagnóstico de várias doenças que induzem a produção de imunoglobulinas, entre outras.
Neste teste, é necessário fixar o antígeno a uma superfície sólida, e então ligar ao
antígeno um anticorpo ligado a um marcador enzimático. A detecção se completa ao
analisar a presença do marcador depois de lavar os poços, que - no caso da detecção
enzimática - vai mudar a coloração do substrato cromogênico adicionado a placa de teste.
Princípio
O ELISA se baseia em fixar compostos nos poços e então lavar para remover outros
compostos que não tiveram a especificidade para se fixarem no poço.
O método utilizado para realizar o teste baseia-se na interação antígeno-anticorpo.
Geralmente, o ELISA é realizado em placas com 96 poços, onde são ligados antígenos,
diretamente, ou indiretamente, por meio de um anticorpo já selecionado e ligado ao poço.
É essa ligação e imobilização dos reagente que permite que o ELISA fique mais fácil de se
realizar. O fato de imobilizar os reagentes na placa torna fácil separar os materiais que
foram fixados e os que não foram durante o teste. E essa possibilidade de lavar materiais
é o que torna o ELISA uma ferramenta poderosa de medição de um composto específico
com uma preparação básica.[2]
Diferentes formas do ELISA
Depois de fixar o antígeno, é necessário ligar um marcador acoplado a anticorpo, para
detectar posteriormente a presença do antígeno esperado. Esse marcador pode
ser fluorescente ou pode ser uma enzima que catalize uma reação que produza um
produto mensurável. E essa ligação se dá por anticorpos específicos ao antígeno, por isso
a precisão do teste. O marcador de detecção pode ser ligado diretamente ao anticorpo
primário ou introduzido por meio de um anticorpo secundário que reconhece o anticorpo
primário.[2]
As enzimas de detecção mais utilizadas são peroxidases e fosfatases. Outras enzimas,
como β-galactosidases, acetilcolinesterases e catalases podem ser usadas também, mas
tem um número reduzido de substratos, por isso seu uso é menos difundido. A escolha de
qual marcador utilizar depende da sensibilidade necessária do teste e dos equipamentos
de detecção disponíveis (espectrofotômetro, luminímetro, fluorímetro) .[2]
https://pt.wikipedia.org/wiki/L%C3%ADngua_inglesa
https://pt.wikipedia.org/wiki/Anticorpo
https://pt.wikipedia.org/wiki/Plasma
https://pt.wikipedia.org/wiki/ELISA#cite_note-1
https://pt.wikipedia.org/wiki/Doen%C3%A7a
https://pt.wikipedia.org/wiki/Imunoglobulinas
https://pt.wikipedia.org/wiki/ELISA#cite_note-:0-2
https://pt.wikipedia.org/wiki/Fluoresc%C3%AAncia
https://pt.wikipedia.org/wiki/ELISA#cite_note-:0-2
https://pt.wikipedia.org/wiki/Espectrofot%C3%B4metro
https://pt.wikipedia.org/wiki/Fluor%C3%ADmetro
https://pt.wikipedia.org/wiki/ELISA#cite_note-:0-2
Tipos de Teste
O ELISA pode ser feito com inúmeras modificações do procedimento básico. O passo
crucial, fixar o antígeno, pode ser realizado por adsorção direta ou indireta por meio de um
anticorpo de captura. O antígeno pode ser detectado, também, diretamente, pelo anticorpo
primário, ou indiretamente, pelo anticorpo secundário.
Entretanto, é necessário compreender o procedimento básico: independente do tipo de
ELISA, o antígeno vai ser marcado por um anticorpo conjugado a uma enzima. Após a
lavagem para a retirada dos anticorpos que não se ligaram a nenhum antígeno, é
adicionado ao meio de análise um substrato com a capacidade de reagir com a enzima
que foi acoplada ao anticorpo. Esse substrato, por sua vez, é cromogênico, e após a
reação, muda sua cor. Assim, quando há a presença do antígeno em análise, os
equipamentos de detecção percebem e quantificam a mudança de cor observada, cuja
intensidade se refere a concentração de substrato que reagiu com a enzima, atestando
maior ou menor concentração do antígeno.
ELISA Direto
Corresponde ao procedimento básico do ELISA, ou seja, não utiliza anticorpos de captura
ou alvos de competição. Basicamente corresponde as etapas de: adição de amostra
tamponada a placa de teste; posterior adição de anticorpo primário acoplado a enzima e
adição de substrato cromogênico. Instrumentos como espectrômetros avaliam
qualitativamente e quantitativamente a variação de cor e a presença do antígeno.
Dessa forma, conclui-se que a denominação de ELISA direto se refere somente a
utilização de um anticorpo primário, que marca o antígeno diretamente.
ELISA Indireto
O ELISA indireto faz o uso de dois anticorpos: o anticorpo primário e o anticorpo
secundário. Primeiramente, a amostra é preparada com o anticorpo primário, que possui
especificidade com o antígeno a ser detectado. Caso o antígeno a ser procurado esteja
presenta na amostra, o anticorpo primário irá se ligar ao seu alvo. Em seguida, haverá
uma lavagem para retirar os anticorpos que não se ligaram ao antígeno teste. A seguir,
coloca-se os antígenos secundários que possuem especificidade apenas para os
anticorpos primários. Caso os anticorpos primários tenham se ligado ao antígeno, haverá
ligação entre anticorpo primário e anticorpo secundário e isso que irá permitir a detecção.
Dessa forma, a característica marcante do ELISA indireto é a utilização de anticorpos
secundários para um maior nível de especificidade do teste.
https://pt.wikipedia.org/wiki/Adsor%C3%A7%C3%A3o
FIXAÇÃO COMPLEMENTO
IMUNOFLUORESCÊNCIA
Imunofluorescência (IF) 
A técnica de imunofluorescência utiliza anticorpos marcados com corantes
fluorescentes para revelar a formação de imunocomplexos vírus-anticorpo. Os
anticorpos marcados são chamados de conjugados. O corante fluorescente usado
mais frequentemente em virologia é o isotiocianato de fluoresceína (FITC), o qual
produz uma fluorescência verde-amarelada. 
Imunofluorescência Direta (IF) 
É um método utilizado para identificar muitos antígenos virais. Na IF direta, um
conjugado de especificidade conhecido é adicionado a células infectadas por vírus,
fixados em uma lâmina de microscópio. Se o anticorpo é específico para o antígeno,
ocorre a formação do complexo que é visualizado pela fluorescência, observado ao
microscópio de fluorescência. Se o conjugado não é específico para o antígeno, não há
formação de imunocomplexos, logo não há fluorescência. 
Imunofluorescência Indireta (IFI) 
Esta técnica é usada para identificar antígeno ou anticorpos. O teste é realizado em
duas etapas. Na primeira etapa, anticorpos não-marcados são adicionados a células
infectadas fixadas a uma lâmina de microscópio. Após incubação, as lâminas são
lavadas para remover anticorpos não-ligados. Na segunda etapa, um anticorpo
anti-imunoglobulina conjugado com fluoresceína é adicionado. O tipo de conjugado é
determinado pela espécie do anticorpo usado na primeira etapa. Por exemplo, se uma
imunoglobulina humana é utilizada na primeira etapa, o conjugado anti-imunoglobulina
humana é empregado na segunda etapa. 
A técnica de IFI tem vantagem de não ser preciso obter um antissoro conjugado com o
corante fluorescente para cada tipo de vírus, o que torna o diagnóstico mais barato do
que quando se utiliza apenas a IFD.
IDGA
PCR
Reação em cadeia da polimerase
Termociclador, Aparelho utilizado para realizar uma PCR, sintetizar cDNA
A Reação em cadeia da polimerase - RCP [1] ou Polymerase Chain Reaction - PCR[2] é
uma técnica utilizada na biologia molecular para amplificar uma única cópia ou algumas
cópias de um segmento de DNA em várias ordens de grandeza, gerando milhares a
milhões de cópias de uma determinada sequência de DNA.
Desenvolvido em 1983 por Kary Mullis, que era um funcionário da Cetus Corporation, e
também o vencedor do Prêmio Nobel de Química em 1993 junto com Michael Smith[3], é
uma maneira fácil, barata e confiável de replicar repetidamente um segmento específico de
DNA, um conceito aplicável a vários campos da biologia moderna e das ciências
relacionadas.O PCR é provavelmente a técnica mais utilizada na biologia molecular. Esta
técnica é utilizada na pesquisa biomédica, na forense criminal e na arqueologia molecular.
https://pt.wikipedia.org/wiki/Rea%C3%A7%C3%A3o_em_cadeia_da_polimerase#cite_note-1
https://pt.wikipedia.org/wiki/Rea%C3%A7%C3%A3o_em_cadeia_da_polimerase#cite_note-2
https://pt.wikipedia.org/wiki/Rea%C3%A7%C3%A3o_em_cadeia_da_polimerase#cite_note-3
O PCR é agora uma técnica comum e frequentemente indispensável usada em
laboratórios clínicos e de pesquisa para uma ampla variedade de aplicações. [5] [6] Estes
incluem a clonagem de DNA para sequenciação, clonagem e manipulação de genes,
mutagênese de genes; construção de filogenias baseadas em DNA, ou análise funcional
de genes; diagnóstico e monitoramento de doenças hereditárias; amplificação do DNA
antigo; [4] análise de impressões digitais genéticas para o perfil de DNA (por exemplo, na
ciência forense e teste de parentesco); e detecção de patógenos em testes de ácido
nucleico para o diagnóstico de doenças infecciosas.
A grande maioria dos métodos de PCR dependem do ciclo térmico, o que envolve a
exposição dos reagentes a ciclos de aquecimento e resfriamento repetidos, permitindo
diferentes reações dependentes da temperatura - especificamente, a fusão do DNA e a
replicação de DNA orientada por enzimas - para prosseguir rapidamente várias vezes em
sequência. Os iniciadores (fragmentos de DNA curtos) que contêm sequências
complementares à região alvo, juntamente com uma polimerase de DNA (por exemplo,
Taq polimerase), após o qual o método é designado, permitem amplificação seletiva e
repetida. À medida que o PCR progride, o DNA gerado é usado como um modelo para
replicação, colocando em movimento uma reação em cadeia na qual o modelo de DNA
original é amplificado exponencialmente. A simplicidade do princípio básico subjacente à
PCR significa que pode ser amplamente modificada para realizar uma ampla gama de
manipulações genéticas. O PCR não é geralmente considerado um método de DNA
recombinante, pois não envolve cortar e colar DNA, apenas amplificação de seqüências
existentes.
Quase todas as aplicações de PCR empregam uma polimerase de DNA estável ao calor,
como a polimerase Taq, uma enzima originalmente isolada da bactéria termofílica Thermus
aquaticus. Se a DNA polimerase sensível ao calor for utilizada, ela irá desnaturar todos os
ciclos no passo de desnaturação. Antes do uso da Taq polimerase, a DNA polimerase teve
que ser adicionada manualmente a cada ciclo, que era um processo tedioso e
dispendioso. [5] Esta DNA polimerase monta enzimaticamente uma nova cadeia de DNA a
partir de nucleotídeos livres, os blocos de construção de DNA, usando DNA de cadeia
simples como molde e oligonucleótidos de DNA (os iniciadores mencionados acima) para
iniciar a síntese de DNA.
O PCR, como a tecnologia de DNA recombinante, teve um enorme impacto [6] nos
aspectos básicos e diagnósticos da biologia molecular porque pode produzir grandes
quantidades de um fragmento de DNA específico a partir de pequenas quantidades de um
modelo complexo. As técnicas de DNA recombinante criam clones moleculares ao conferir
a uma sequência específica a capacidade de replicar inserindo-a em um vetor e
introduzindo o vetor em uma célula hospedeira. O PCR representa uma forma de
"clonagem in vitro" que pode gerar, bem como modificar, fragmentos de DNA de
comprimento definido e seqüência em uma simples reação automatizada. Além de suas
muitas aplicações na pesquisa biológica molecular básica, o PCR promete desempenhar
um papel crítico na identificação de seqüências médicamente importantes, bem como um
diagnóstico importante na sua detecção.
Princípios
O PCR amplifica uma região específica de uma cadeia de DNA (o alvo de DNA). A maioria
dos métodos de PCR amplifica os fragmentos de DNA entre 0,1 e 10 quilos de base (kbp),
embora algumas técnicas permitam a amplificação de fragmentos de até 40 kbp de
tamanho. A quantidade de produto amplificado é determinada pelos substratos disponíveis
na reação, que se tornam limitantes à medida que a reação progride. [7]
Uma configuração básica de PCR requer vários componentes e reagentes, [8] incluindo:
● um modelo de DNA que contém a região alvo de DNA para amplificar
https://pt.wikipedia.org/wiki/Rea%C3%A7%C3%A3o_em_cadeia_da_polimerase#cite_note-4
https://pt.wikipedia.org/wiki/Rea%C3%A7%C3%A3o_em_cadeia_da_polimerase#cite_note-5
https://pt.wikipedia.org/wiki/Rea%C3%A7%C3%A3o_em_cadeia_da_polimerase#cite_note-6
https://pt.wikipedia.org/wiki/Rea%C3%A7%C3%A3o_em_cadeia_da_polimerase#cite_note-7
https://pt.wikipedia.org/wiki/Rea%C3%A7%C3%A3o_em_cadeia_da_polimerase#cite_note-8
● uma polimerase de DNA, uma enzima que polimeriza novas cadeias de DNA; A
polimerase Taq resistente ao calor é especialmente comum,[9] , pois é mais provável
que permaneça intacto durante o processo de desnaturação de DNA de alta
temperatura
● dois iniciadores de DNA que são complementares das extremidades 3 '(três primeiras)
de cada uma das cadeias sentido e anti-sentido do alvo de DNA (a polimerase de DNA
só pode se ligar e alongar-se a partir de uma região de DNA de cadeia dupla, sem
primers lá não é um local de iniciação de cadeia dupla no qual a polimerase pode se
ligar); iniciadores específicos que são complementares da região alvo do DNA são
selecionados de antemão e são geralmente feitos sob encomenda em um laboratório
ou comprados de fornecedores bioquímicos comerciais
● desoxinucleósido trifosfatos ou dNTPs (às vezes denominados "desoxinucleótidos
trifosfatos", nucleotídeos contendo grupos trifosfato), os blocos de construção a partir
dos quais a DNA polimerase sintetiza uma nova cadeia de DNA
● uma solução tampão que fornece um ambiente químico adequado para uma atividade
ótima e estabilidade da DNA polimerase
● catiões bivalentes, tipicamente íons de magnésio (Mg) ou manganês (Mn); Mg2 + é o
mais comum, mas Mn2 + pode ser usado para mutagênese de DNA mediada por
PCR, uma vez que uma maior concentração de Mn2 + aumenta a taxa de erro durante
a síntese de DNA
● catiões monovalentes, tipicamente iões de potássio (K)
A reação é comumente realizada em um volume de 10-200 μl em pequenos tubos de
reação (volumes de 0,2-0,5 ml) em um termociclador. O termociclador aquece e esfria os
tubos de reação para atingir as temperaturas exigidas em cada passo da reação. Muitos
cicladores térmicos modernos utilizam o efeito Peltier, que permite o aquecimento e o
resfriamento do bloco que contém os tubos de PCR simplesmente invando a corrente
elétrica. Os tubos de reação de paredes finas permitem uma condutividade térmica
favorável para permitir o equilíbrio térmico rápido. A maioria dos termostatos têm tampas
aquecidas para evitar a condensação no topo do tubo de reação. Os termocicladores mais
antigos que não possuem uma tampa aquecida requerem uma camada de óleo em cima
da mistura de reação ou uma bola de cera dentro do tubo.
Fases do PCR
Normalmente, a PCR consiste em uma série de 20–40 mudanças de temperatura
repetidas, chamadas ciclos, com cada ciclo geralmente consistindo em duas ou três
etapas de temperatura discretas (veja a figura abaixo). O ciclismo é muitas vezes
precedido por um único passo de temperatura a uma temperatura muito alta (> 90 °C) e
seguido por uma retenção no final para a extensão final do produto ou armazenamento
breve. As temperaturas utilizadas e o período de tempo aplicado em cada ciclo dependem
de uma variedade de parâmetros, incluindo a enzima utilizada para a síntese de DNA, a
concentração de íons bivalentes e dNTPs na reação e a temperatura de fusão (Tm) dos
primers . [10]
As etapas individuais comuns à maioria dos métodos de PCR são as seguintes:
1. Inicialização: este passo é necessário apenas para polimerases de DNA que
requerem ativação de calor por PCR de inicialização a quente. [11] Consiste em
aquecer a câmara de reação a uma temperatura de 94–96 °C, ou 98 °C, se forem
utilizadas polimerases extremamente termostáticas, que é então mantida durante
1-10 minutos.https://pt.wikipedia.org/wiki/Rea%C3%A7%C3%A3o_em_cadeia_da_polimerase#cite_note-9
https://pt.wikipedia.org/wiki/Rea%C3%A7%C3%A3o_em_cadeia_da_polimerase#cite_note-10
https://pt.wikipedia.org/wiki/Rea%C3%A7%C3%A3o_em_cadeia_da_polimerase#cite_note-11
2. Desnaturação: Este passo é o primeiro evento regular dos ciclos e consiste em
aquecer a câmara de reação a 94–98 °C por 20 a 30 segundos. Isso faz com que
a fusão do DNA, ou a desnaturação, do modelo de DNA de cadeia dupla rompa as
ligações de hidrogênio entre bases complementares, produzindo duas moléculas
de DNA de cadeia simples.
3. Anelamento: no próximo passo, a temperatura de reação é reduzida para 50-65 °C
durante 20-40 segundos, permitindo o anelamento dos iniciadores para cada um
dos modelos de DNA de cadeia simples. Dois iniciadores diferentes são
tipicamente incluídos na mistura de reação: um para cada um dos dois
complementos de cadeia simples contendo a região alvo. Os primers são
sequências de cadeia simples, mas são muito menores do que o comprimento da
região alvo, complementando apenas sequências muito pequenas na extremidade
3 'de cada vertente. É fundamental determinar uma temperatura adequada para o
passo de recozimento porque a eficiência e a especificidade são fortemente
afetadas pela temperatura de recozimento. Esta temperatura deve ser
suficientemente baixa para permitir a hibridação do iniciador à cadeia, mas
suficientemente alta para que a hibridação seja específica, isto é, o iniciador deve
unir-se apenas a uma parte perfeitamente complementar da corda e em nenhum
outro lugar. Se a temperatura for muito baixa, o iniciador pode se ligar de forma
imperfeita. Se for muito alto, o iniciador pode não se ligar. Uma temperatura de
recozimento típica é de cerca de 3–5 °C abaixo da Tm dos iniciadores utilizados.
As ligações estáveis de hidrogênio entre bases complementares são formadas
apenas quando a sequência iniciadora se aproxima muito da sequência do
modelo. Durante este passo, a polimerase se liga ao híbrido molde-iniciador e
começa a formação de DNA.
4. Extensão / alongamento: a temperatura neste passo depende da DNA polimerase
utilizada; a temperatura de atividade ideal para a polimerase de DNA termoestável
da polimerase Taq (Thermus aquaticus) é de aproximadamente 75–80 °C, [12] [13],
embora uma temperatura de 72 °C seja comumente usado com esta enzima.
Neste passo, a DNA polimerase sintetiza uma nova cadeia de DNA complementar
à cadeia de matriz de DNA por adição de dNTPs livres a partir da mistura de
reação que são complementares ao modelo na direção 5' a 3', condensando o
grupo 5'-fosfato dos dNTPs com o grupo 3'-hidroxi no final da cadeia de DNA
nascente (alongada). O tempo preciso necessário para o alongamento depende
tanto da polimerase de DNA utilizada quanto do comprimento da região alvo de
DNA para amplificar. Como regra geral, na sua temperatura ideal, a maioria das
polimerases de DNA polimerizam mil bases por minuto. Em condições ideais (isto
é, se não houver limitações devido a substratos ou reagentes limitantes), em cada
etapa de extensão / alongamento, o número de sequências alvo de DNA é
duplicado. Com cada ciclo sucessivo, os fios originais do modelo mais todas as
vertentes recém-geradas tornam-se fios de modelo para a próxima rodada de
alongamento, levando a amplificação exponencial (geométrica) da região
específica do alvo de DNA.
Os processos de desnaturação, anelamento e alongamento constituem um único ciclo.
São necessários vários ciclos para amplificar o alvo de DNA para milhões de cópias. A
fórmula usada para calcular o número de cópias de DNA formadas após um determinado
número de ciclos é 2n, onde n é o número de ciclos. Assim, um conjunto de reação para 30
ciclos resulta em 230, ou 1.073.741.824 cópias da região original do alvo de cadeia dupla.
Alongamento final: Este único passo é opcional, mas é realizado a uma temperatura de
70–74 °C (a faixa de temperatura necessária para a atividade ideal da maioria das
polimerases utilizadas na PCR) durante 5–15 minutos após o último ciclo de PCR para
garantir que qualquer DNA de cadeia simples restante seja completamente alongado.
Suporte final: o passo final arrefece a câmara de reação a 4–15 °C por tempo
indeterminado e pode ser empregado para o armazenamento a curto prazo dos produtos
de PCR.
https://pt.wikipedia.org/wiki/Rea%C3%A7%C3%A3o_em_cadeia_da_polimerase#cite_note-12
https://pt.wikipedia.org/wiki/Rea%C3%A7%C3%A3o_em_cadeia_da_polimerase#cite_note-13
Aplicações
A PCR encontra sua principal aplicação em situações onde a quantidade de DNA
disponível é reduzida. Em teoria, é possível amplificar qualquer DNA. Uma das principais
aplicações da PCR é na medicina forense, onde pequenas amostras de DNA retiradas da
cena de um crime (pedaços de cabelo que contenham bulbo, gotas de sangue ou saliva,
pedaços de pelo ou até mesmo a minúscula quantidade de DNA deixada em
uma impressão digital) são amplificadas para serem analisadas pelo método de impressão
digital genética. A PCR também é rotineiramente utilizada em procedimentos científicos
de biologia molecular como amplificação para gerar mutagênese, detecção de mutações
ou preparação de fragmentos de DNA para clonagem (inserção em plasmídeo, por
exemplo) como também pode ser utilizada para identificação de patógenos que estão
presentes em amostras, como por exemplo a identificação de agentes como Cândida
sp, Chlamydia trachomatis, HPV Vírus do papiloma humano e seus genótipos, HIV Vírus
da Hepatite B. etc A PCR também é utilizada na paleontologia para o sequenciamento
gênico de animais pré-históricos. Também é muito utilizada na identificação de
micro-organismos, tendo em vista que apenas 1% dos micro-organismos são cultiváveis e
podendo ser isolados. A PCR é o primeiro passo para o posterior sequenciamento. Após
obter as sequências geradas pelos equipamentos, pode-se consultar bases de dados na
internet para tentar localizar suas possíveis origens, sendo bactérias, archeas ou etc.Elizabeth
van Pelt-Verkuil, Alex van Belkum, John P. Hays
Procedimentos
Oito tubos de PCR, cada tubo contendo 100μl.
A reação em cadeia da polimerase é um método muito sensível de análise e por isso é
realizado com muito cuidado para evitar contaminações que possam inviabilizar ou tornar
errôneo o resultado. O processo consiste basicamente em utilizar os mecanismos da
replicação in vitro. Os cientistas então simplificaram ao máximo o processo de
polimerização das moléculas. A maquinaria para separar as fitas sense e anti-sense são
muito complexas na célula, no lugar utiliza-se a mudança de temperatura. Os ciclos são
https://pt.wikipedia.org/wiki/Medicina_legal
https://pt.wikipedia.org/wiki/Cabelo
https://pt.wikipedia.org/wiki/Sangue
https://pt.wikipedia.org/wiki/Saliva
https://pt.wikipedia.org/wiki/Pelo
https://pt.wikipedia.org/wiki/Impress%C3%A3o_digital_(anatomia)
https://pt.wikipedia.org/wiki/Biologia_molecular
https://pt.wikipedia.org/wiki/Plasm%C3%ADdeo
https://pt.wikipedia.org/wiki/Chlamydia_trachomatis
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https://pt.wikipedia.org/wiki/V%C3%ADrus_da_Hepatite_B
https://pt.wikipedia.org/wiki/V%C3%ADrus_da_Hepatite_B
https://pt.wikipedia.org/wiki/Rea%C3%A7%C3%A3o_em_cadeia_da_polimerase#endnote_Elizabeth_van_Pelt-Verkuil,_Alex_van_Belkum,_John_P._Hays(2008)
https://pt.wikipedia.org/wiki/Rea%C3%A7%C3%A3o_em_cadeia_da_polimerase#endnote_Elizabeth_van_Pelt-Verkuil,_Alex_van_Belkum,_John_P._Hays(2008)
pensados para disponibilizar o sitio alvo para a ligação dos primers, funcionamento da
polimerase e início de um novo ciclo.Bruce A. White Em primeiro lugar, deve-se extrair o material
genético da célula ou outro material a ser estudado (exemplo: vestígios de crimes) sem
danificá-lo. Normalmente o material extraído é o DNA (ADN), mas pode-se trabalhar com
o RNA (ARN) em uma RT-PCR que é um desdobramento da PCR e possui outras
aplicações.
Resultado da PCR após ser realizada uma eletroforeseem gel de agarose ou de poliacrilamida.
Depois de extraído o DNA, a este é adicionada uma mistura (também conhecida como
pré-mix) que contém os dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos), que são as bases
nitrogenadas ligadas com um três fosfato, os primers (também chamados de
oligonucleotídeos ou iniciadores) e a enzima Taq-polimerase em uma solução tampão.
Toda esta mistura é colocada no termociclador, o qual faz ciclos de temperatura
pré-estabelecidos com tempos exatos específicos para cada reação (fragmento a ser
amplificado).Ralph Rapley
Na primeira etapa do ciclo a temperatura é elevada de 94 a 96 °C por pouco tempo para
que haja a separação da dupla cadeia de DNA (Desnaturação, quebra das pontes de
hidrogênio). Na segunda etapa, a temperatura é reduzida entre 50 a 60 °C dependendo da
quantidade de citosina (C) e guanina (G) encontrada no primer, para que os primers se
anelem (emparelham) com a fita molde de DNA (anelamento). Na última etapa do ciclo a
temperatura é elevada a 72 °C para que a enzima possa funcionar sintetizando a nova
molécula (extensão), em seguida um novo ciclo é iniciado. Normalmente são realizados de
25 a 40 ciclos para cada reação na qual a taxa de replicação é exponencial 
O resultado é analisado através de uma eletroforese em gel de agarose ou
de poliacrilamida e depois é interpretado com a ajuda de um profissional competente.
Geralmente um padrão de peso molecular é adicionado em uma das fileiras do gel, assim
poderá se avaliar o tamanho do fragmento amplificado
https://pt.wikipedia.org/wiki/Rea%C3%A7%C3%A3o_em_cadeia_da_polimerase#endnote_Bruce_A._White(1993)
https://pt.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lula
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https://pt.wikipedia.org/wiki/Eletroforese
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