AnaLauraOliveiraDeSaLeitao-DISSERT

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE-UFRN 
CENTRO DE TECNOLOGIA 
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA - PPGEQ 
 
 
 
 
 
 
 
Dissertação de Mestrado 
 
 
 
Avaliação de métodos de rompimento celular e de diferentes metais imobilizados em 
resina Streamline Chelating para purificação do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi. 
 
 
 
 
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão 
Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino Dos Santos 
Coorientador: Dr. Francisco Canindé de Sousa Junior 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
NATAL/RN 
FEVEREIRO/2017
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão 
 
 
 
 
 
 
 
Avaliação de métodos de rompimento celular e de diferentes metais imobilizados em resina 
Streamline Chelating para purificação do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi. 
 
 
 
 
 
Dissertação de mestrado apresentada ao 
Programa de Pós-Graduação em 
Engenharia Química da Universidade 
Federal do Rio Grande do Norte, como 
parte dos requisitos para obtenção do 
título de Mestre em Engenharia Química, 
sob a orientação do Prof. Dr. Everaldo 
Silvino dos Santos e coorientação do Dr. 
Francisco Canindé de Sousa Junior. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
NATAL/RN 
FEVEREIRO/2017
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Catalogação de Publicação na Fonte. 
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN / Sistema de Bibliotecas - SISBI 
Biblioteca Setorial Especializada em Engenharia Química - CT 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Leitão, Ana Laura Oliveira de Sá. 
 Avaliação de métodos de rompimento celular e de diferentes metais imobilizados 
em resina Streamline Chelating para purificação do antígeno 503 de Leishmania i. 
chagasi / Ana Laura Oliveira de Sá Leitão. - Natal, 2017. 
 96f.: il. 
 
 Orientador: Everaldo Silvino dos Santos. 
 Coorientador: Francisco Canindé de Sousa Junior. 
 
 
 Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro 
de Tecnologia. Departamento de Engenharia Química. Programa de Pós-graduação 
em Engenharia Química. 
 
 1. Leishmaniose - Dissertação. 2. Adsorção - Dissertação. 3. Lipopolissacarídeos 
- Dissertação. I. Santos, Everaldo Silvino dos. II. Sousa Junior, Francisco Canindé de. 
III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RN/UF/BSEQ CDU 616.993.161(043.3) 
 
LEITÃO, Ana Laura Oliveira de Sá – Avaliação de métodos de rompimento celular e de 
diferentes metais imobilizados em resina Streamline Chelating para purificação do antígeno 
503 de Leishmania i. chagasi. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Área de 
Concentração: Engenharia Química, Linha de pesquisa: Processos químicos, catalíticos e 
biotecnológicos, 2017, Natal/RN, Brasil. 
 
Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos 
Coorientador: Dr. Francisco Canindé de Sousa Junior 
 
RESUMO 
 
Com o desenvolvimento da indústria biotecnológica, é crescente o interesse por antígenos 
recombinantes purificados para obtenção de vacinas. Porém, para essa aplicação esses 
antígenos precisam apresentar um elevado grau de pureza, e por isso é de grande relevância o 
desenvolvimento de técnicas que permitam a redução do número de operações unitárias 
necessárias ao processo de purificação, permitindo ainda uma elevada recuperação e 
proporcionando uma maior economia na obtenção dos bioprodutos. A Adsorção em Leito 
Expandido (ALE) vem se destacando como uma alternativa propícia para o downstream 
processing, pois é uma técnica cromatográfica de modo simples e de baixo custo, que integra 
as etapas de clarificação, concentração, purificação em uma única operação. Neste contexto, o 
presente trabalho tem como objetivo avaliar os métodos de rompimento celular e os diferentes 
metais imobilizados em resina Streamline chelating para purificação do antígeno 503 de 
Leishmania i. chagasi por ALE bem como remover os lipopolissacarídeos (LPS) liberados 
durante a etapa de rompimento celular. Primeiramente, foi avaliado qual o melhor método de 
rompimento celular para obtenção da proteína intracelular. As estratégias estudadas utilizando 
lisozima, pérolas de vidro, ureia e EDTA foram avaliadas através de quatro planejamentos 
experimentais. Em seguida, foram realizados testes de adsorção em batelada, utilizando-se 
cinco íons metálicos (Cu2+, Ni2+, Zn2+, Co2+ e Fe3+) nas concentrações de 0,1, 0,5 e 0,8 mol/L 
acoplados na resina Streamline chelating, escolhendo-se o metal que apresentou melhor 
adsorção do antígeno para os ensaios usando ALE. Posteriormente, foi estimada a quantidade 
mínima de tensoativo Triton X-114 necessária na etapa de lavagem da ALE para remoção do 
LPS, a fim de obter-se o antígeno 503 livre desse contaminante. E por fim, foram realizados 
ensaios de ALE visando recuperar e purificar a proteína de interesse. Para os ensaios usando 
ALE utilizou-se uma coluna de 2,6 cm de diâmetro por 30 cm de altura, acoplada a uma bomba 
peristáltica. Com os planejamentos experimentais realizados para avaliação do rompimento 
celular, observou-se que maiores quantidades de proteínas totais e do antígeno 503 liberadas 
foram obtidas para o método da ureia e que o único fator significativo para esse planejamento 
foi a concentração, correspondente a 8,0 M. Como resultado para a triagem do íon metálico, o 
cobre (Cu2+) foi o metal que apresentou maior capacidade de adsorção do antígeno 503, 
apresentando valores de capacidade de adsorção de 0,102, 0,128 e 0,111 mg/mL de adsorvente 
para as concentrações de 0,1, 0,5 e 0,8 mol/L, respectivamente. Tem-se ainda que para as três 
condições analisadas (0,01, 0,05 e 0,1 % de Triton X-114) na etapa de lavagem da ALE o 
percentual de remoção de LPS foi elevado e que a concentração mínima utilizada (0,01 %) já 
foi suficiente para a remoção de 99,70 % deste contaminante. Para o teste de ALE utilizando 
eluição isocrática (0,6 M de imidazol) os resultados obtidos mostraram baixa recuperação (3,0 
%) do antígeno 503. Avaliou-se então a eluição em degrau, inicialmente em dois passos, 
aplicando-se 0,6 mol/L e, em seguida, 1,0 mol/L de imidazol. Porém, esta estratégia ainda não 
foi eficiente para recuperar a proteína de interesse. Um novo ensaio foi realizado, com um total 
de três passos de eluição, utilizando 0,3 e 0,6 mol/L. Esse último teste mostrou uma recuperação 
de 15,0 % da proteína de interesse e um fator de purificação de, aproximadamente, 3,0. 
 
Portanto, a técnica cromatográfica de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC) 
mostrou ser uma alternativa eficiente na recuperação e purificação do antígeno 503 a partir do 
homogeneizado de E. coli não clarificado. 
 
Palavras-chave: Adsorção em Leito Expandido, purificação, íon metálico, antígeno 503, 
remoção de LPS. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LEITÃO, Ana Laura Oliveira de Sá – Avaliação de métodos de rompimento celular e de 
diferentes metais imobilizados em resina Streamline Chelating para purificação do antígeno 
503 de Leishmania i. chagasi. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Área de 
Concentração: Engenharia Química, Linha de pesquisa: Processos químicos, catalíticos e 
biotecnológicos, Natal/RN, Brasil. 
 
Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos 
Coorientador: Dr. Francisco Canindé de Sousa Junior 
 
ABSTRACT 
 
Due to the development of biotechnology industry, there is a growing interest in purified 
recombinant antigens to obtain vaccines. However, for this application these antigens require a 
high degree of purity, thus, it is of great relevance the development of techniques that allow the 
reduction in the number of unitary operations required for the purification process, this would 
also allow a high recovery and a greater saving in obtainingbioproducts. The Expanded Bed 
Adsorption (EBA) has shown as a suitable alternative for downstream processing, once it is a 
simple and low cost chromatographic technique that integrates clarification, concentration and 
purification in a single operation. This study aims at evaluating the methods of cell disruption 
and the different metals immobilized in Streamline Chelating resin for purification of 
Leishmania i. chagasi 503 antigen by EBA as well as removing the lipopolysaccharides 
(endotoxin) released during the stage of cell disruption. Firstly, the best method of cell 
disruption to obtain intracellular protein was evaluated. The strategies studied using lysozyme, 
glass beads, urea and EDTA were evaluated through four experimental designs. Then, batch 
adsorption tests were carried out using five metal ions (Cu2+, Ni2+, Zn2+, Co2+ and Fe3+) at 
concentrations of 0.1, 0.5 and 0.8 M coupled in the Streamline chelating resin, selecting the 
metal that showed the best adsorption of the antigen for the assays using EBA. Then, the 
minimum amount of Triton X-114 tensioactive required in the EBA wash stage for LPS removal 
was estimated in order to obtain the 503 antigen free of this contaminant. Finally, EBA assays 
were performed in order to recover and purify the protein of interest. EBA experiments were 
carried out using a column of 2.6 cm in diameter (30 cm height), coupled to a peristaltic pump. 
The experimental plannings carried out to evaluate cell disruption, showed that higher amounts 
of total proteins and 503 antigen released were obtained for the urea method and that the only 
significant factor for this planning was the concentration corresponding to 8.0 M. As a result of 
the metal ion screening, copper (Cu2+) was the metal with the highest adsorption capacity of 
503 antigen, presenting adsorption capacity values of 0.102, 0.128 and 0.111 mg / mL of 
adsorbent at concentrations of 0.1, 0.5 and 0.8 M, respectively. For the three analyzed 
conditions (0.01, 0.05 and 0.1% Triton X-114) in the EBA washing stage, the percentage of 
LPS removal was high and the minimum concentration used (0.01%) was enough to remove 
99.70% of this contaminant. For the EBA test using isocratic elution (0.6 M imidazole) the 
results obtained showed a low recovery (3.0 %) of the 503 antigen. The step elution was then 
evaluated, initially in two steps, applying 0.6 M and then 1.0 M imidazole. However, this 
strategy has not yet been effective in recovering the protein of interest. A new assay was 
performed, with a total of three elution steps, using 0.3 and 0.6 M. This test showed that a 
recovery of 15.0% of the protein of interest and a purification factor of 3.0. Therefore, the 
immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) technique has been shown to be an 
efficient alternative in the recovery and purification of the 503 antigen from the homogenized 
E. coli unclarified. 
 
Keywords: Expanded Bed Adsorption, purification, metallic ion, 503 antigen, LPS removal. 
 
 
 
AGRADECIMENTOS 
 
À Deus, pela vida, força, fé e coragem. 
 
Aos meus pais, Gerardo e Lucinha, e ao meu irmão Bruno, pelo amor, afeto, dedicação e 
confiança sempre depositada. 
 
À minha vovó Laura (in memoriam), por sua infinita bondade, pelo carinho e cuidado de mãe 
e pelas orações a mim ofertadas. 
 
Ao meu orientador Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos, pela orientação, disponibilidade, 
comprometimento e atenção oferecidos durante este trabalho. 
 
Ao meu coorientador Dr. Francisco Canindé de Sousa Junior, pela forma que me acolheu no 
LEB e por ter sido tão solícito durante todo esse tempo de desenvolvimento da pesquisa. 
 
Ao meu namorado Mauro André, pela compreensão, carinho e companheirismo demonstrados 
no decorrer desta jornada. 
 
À minha prima Naylla e minhas amigas Jéssyca, Cleitiane, Patrícia e Jhéssica, pela amizade, 
apoio e incentivo, vocês foram essenciais em todo esse tempo. 
 
As bolsistas de iniciação científica, Fernanda, Laura e Cecília, por toda ajuda e 
comprometimento para a realização deste trabalho. 
 
Aos meus colegas do LEB, Carlos, Sérgio, Millena, Emy e Naldo e aos demais integrantes 
desse laboratório, pela receptividade, companhia, conversas, risadas e disponibilidade em 
ajudar. 
 
Aos servidores do PPGEQ pela disponibilidade e atenção. 
 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
1. Introdução ............................................................................................................................. 16 
2. Objetivos ............................................................................................................................... 19 
2.1 Objetivos Gerais ............................................................................................................. 20 
2.2 Objetivos Específicos ..................................................................................................... 19 
3. Revisão Bibliográfica ........................................................................................................... 22 
3.2 Leishmaniose .................................................................................................................. 22 
3.2.1 Leishmaniose Visceral ............................................................................................. 23 
3.2.1.1 Situação epidemiológica .................................................................................... 23 
3.2.1.2 Agente etiológico e transmissão ........................................................................ 24 
3.2.1.3 Quadro Clínico .................................................................................................. 24 
4.2.1.4 Diagnóstico e tratamento ................................................................................... 25 
3.3 Antígenos Recombinantes .............................................................................................. 26 
3.3.1 Antígeno 503 ............................................................................................................ 26 
3.4 Rompimento Celular ....................................................................................................... 27 
3.4.1 Lise enzimática ......................................................................................................... 28 
3.4.2 Pérolas de vidro ........................................................................................................ 29 
3.4.3 EDTA - Mg2+ ........................................................................................................... 29 
3.4.4 Ureia ......................................................................................................................... 29 
3.5 Purificação de Proteínas .................................................................................................. 30 
3.6 Cromatografia ................................................................................................................. 32 
3.6.1 Adsorção em Leito Expandido ................................................................................. 32 
3.6.1.1 Caracterização do leito expandido ..................................................................... 35 
3.6.2 Cromatografia de Afinidade por Íons Metálicos Imobilizados (IMAC) .................. 36 
3.7 Endotoxinas .................................................................................................................... 38 
4. Metodologia .......................................................................................................................... 42 
4.1 Material ........................................................................................................................... 42 
4.1.1 Adsorvente ............................................................................................................... 42 
4.1.2 Coluna ......................................................................................................................42 
4.1.3 Material Biológico.................................................................................................... 43 
4.1.4 Reagentes e Padrões ................................................................................................. 44 
4.2 Métodos .......................................................................................................................... 44 
4.2.1 Preparo do inóculo ................................................................................................... 44 
 
4.2.2 Cultivo e indução ..................................................................................................... 45 
4.2.3 Escolha do método para o rompimento celular ........................................................ 45 
4.2.3.1 Método de lise enzimática ................................................................................. 46 
4.2.3.2 Método de pérolas de vidro ............................................................................... 46 
4.2.3.3 Método de rompimento celular usando ureia .................................................... 47 
4.2.3.4 Método de rompimento celular usando EDTA - Mg2+ ...................................... 47 
4.2.4 Triagem do íon metálico .......................................................................................... 48 
4.2.5 Isoterma de adsorção ................................................................................................ 49 
4.2.6 Purificação do antígeno 503 e remoção de LPS utilizando ALE ............................. 49 
4.2.7 Determinação da concentração de proteínas totais .................................................. 50 
4.2.8 Eletroforese em gel de poliacrilamida ...................................................................... 51 
4.2.9 Derterminação da concentração de antígeno 503 ..................................................... 51 
4.2.10 Determinação de LPS ............................................................................................. 52 
4.2.11 Cálculos .................................................................................................................. 52 
5. Resultados e Discussões ....................................................................................................... 55 
5.1 Escolha do método para o rompimento celular .............................................................. 55 
5.2 Triagem do íon metálico ................................................................................................. 63 
5.3 Isoterma de adsorção ...................................................................................................... 66 
5.4 Remoção de LPS ............................................................................................................. 67 
5.5 Purificação do antígeno 503 e remoção de LPS utilizando ALE ................................... 69 
6. Conclusões ............................................................................................................................ 78 
7. Referências Bibliográficas .................................................................................................... 80 
Apêndice 1 ................................................................................................................................ 94 
Anexo 1 .................................................................................................................................... 96 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
Figura 1 - Endemicidade da Leishmaniose Visceral em todo o mundo no ano de 2013 (World 
Health Organization, 2014). ..................................................................................................... 23 
Figura 2 - Etapas de um processo genérico de purificação de biomoléculas. Fonte: Pessoa-Jr & 
Kilikian, 2005. .......................................................................................................................... 31 
Figura 3 - Princípio de funcionamento de um processo de adsorção em leito fixo e expandido. 
Fonte: adaptado de Crase & Draeger, 1992. ............................................................................. 33 
Figura 4 - Figura 4: Etapas do processo de adsorção em leito expandido. Fonte: Amersham 
Pharmacia Biotech, 1997. ......................................................................................................... 35 
Figura 5 - Estrutura química dos LPS de E. coli O11:B4 de acordo com Ohmo & Morrison 
(1989). Abreviações - Hep: L-glicerol-D-mano-heptose; Gal: galactose; Glc: glicose; KDO: 
ácido 2-ceto-3-deoxioctônico; NGa: N-acetil-galactosamina e NGc: N-acetil-glic ................. 39 
Figura 6 - Aparato experimental utilizado para os ensaios de ALE. ....................................... 43 
Figura 7 - Biorreator de bancada Biostat B. ............................................................................. 45 
Figura 8 - (a) Diagrama de Pareto para a concentração de proteína total e (b) superfície de 
resposta que apresenta os efeitos da concentração de lisozima (X1) e do tempo (X2) na 
concentração de proteína total obtida. ...................................................................................... 58 
Figura 9 - (a) Diagrama de Pareto para a concentração de antígeno 503 e (b) superfície de 
resposta que apresenta os efeitos da concentração de lisozima (X1) e do tempo (X2) na 
concentração de antígeno 503 obtida........................................................................................ 58 
Figura 10 -(a) Diagrama de Pareto para a concentração de proteína total e (b) superfície de 
resposta que apresenta os efeitos da razão g de pérolas de vidro/mL de suspensão (X1) e do 
tempo (X2) na concentração de proteína total obtida. .............................................................. 59 
Figura 11 - (a) Diagrama de Pareto para a concentração de antígeno 503 e (b) superfície de 
resposta que apresenta os efeitos da razão g de pérolas de vidro/mL de suspensão (X1) e do 
tempo (X2) na concentração de antígeno 503 obtida. .............................................................. 59 
Figura 12 - (a) Diagrama de Pareto para a concentração de proteína total e (b) superfície de 
resposta que apresenta os efeitos da concentração de EDTA (X1) e do tempo (X2) na 
concentração de proteína total obtida. ...................................................................................... 60 
Figura 13 - (a) Diagrama de Pareto para a concentração de antígeno e (b) superfície de resposta 
que apresenta os efeitos da concentração de EDTA (X1) e do tempo (X2) na concentração de 
antígeno 503 obtida. ................................................................................................................. 60 
file:///C:/Users/Mauro/Dropbox/Imprimir%20-%20UNI/Mestrado/2016/Qualificação/Dissertação%20Ana%20Laura.docx%23_Toc471996014
file:///C:/Users/Mauro/Dropbox/Imprimir%20-%20UNI/Mestrado/2016/Qualificação/Dissertação%20Ana%20Laura.docx%23_Toc471996014
 
Figura 14 - (a) Diagrama de Pareto para a concentração de proteína total e (b) superfície de 
resposta que apresenta os efeitos da concentração de ureia (X1) e do tempo (X2) na 
concentração de proteína total obtida. ...................................................................................... 61 
Figura 15 - (a) Diagrama de Pareto para a concentração de antígeno 503 e (b) superfície de 
resposta que apresenta os efeitos da concentração de ureia (X1) e do tempo (X2) na 
concentração de antígeno 503 obtida........................................................................................ 61 
Figura 16 - Gel de eletroforese (SDS-PAGE) mostrando o perfil protéico apresentado para cada 
ensaio do planejamento. Coluna 1: Padrão de massa molecular; Coluna 2: Ensaio 1 (2,0 M e 15 
min); Coluna 3: Ensaio 2 (8,0 M e 15 min); Coluna 4: Ensaio 3 (2,0 M e 60 min). ................ 63 
Figura 17- Capacidade de adsorção do antígeno 503 para os íons estudados. ........................ 64 
Figura 18 - Isoterma de adsorção para o antígeno 503 na resina Streamline Chelating. .......... 66 
Figura 19 - Cromatograma do perfil de purificação do antígeno 503 a partir do homogeneizado 
de E. coli não clarificado utilizando 0,01 % de Triton X-114 na etapa de lavagem e a eluição 
isocrática. .................................................................................................................................. 69 
Figura 20: Gel de eletroforese (SDS-PAGE) do antígeno 503 recuperado a partir do 
homogeneizado de E. Coli usando 0,01 % de Triton X-114 na etapa de lavagem da ALE. Linha 
1: Padrão de peso molecular; Linha 2: Homogeneizado de E. coli; Linha 3: Carga; Linha 4: 
Lavagem: Linha 5: Eluição ...................................................................................................... 71 
Figura 21 - Cromatograma do perfil de purificação do antígeno 503 a partir do homogeneizado 
de E. coli não clarificado utilizando 0,01 % de Triton X-114 na etapa de lavagem e a eluição 
em degrau com 0,6 e 1,0 M. ..................................................................................................... 72 
Figura 22 - Gel de eletroforese (SDS-PAGE) do antígeno 503 recuperado a partir do 
homogeneizado de E. Coli usando 0,01 % de Triton X-114 na etapa de lavagem da ALE. Coluna 
1: Padrão de massa molecular; Coluna 2: Homogeneizado de E. coli; Coluna 3: Carga; Coluna 
4: Lavagem; Coluna 5: Eluição 0,6 M; Coluna 6: Eluição 1 M. .............................................. 74 
Figura 23 - Cromatograma do perfil de purificação do antígeno 503 a partir do homogeneizado 
de E. coli não clarificado utilizando 0,01 % de Triton X-114 na etapa de lavagem e a eluição 
em degrau com 0,3 e 0,6 M. ..................................................................................................... 74 
Figura 24 - Gel de eletroforese (SDS-PAGE) do antígeno 503 recuperado a partir do 
homogeneizado de E. Coli usando 0,01 % de Triton X-114 na etapa de lavagem da ALE. Coluna 
1: Padrão de massa molecular; Coluna 2: Homogeneizado de E. coli; Coluna 3: Carga; Coluna 
4: Lavagem; Coluna 5: Eluição 0,3 M; Coluna 6: Eluição 0,6 M. ........................................... 76 
 
 
file:///C:/Users/Mauro/Dropbox/Imprimir%20-%20UNI/Mestrado/2016/Qualificação/Dissertação%20Ana%20Laura.docx%23_Toc471996033
file:///C:/Users/Mauro/Dropbox/Imprimir%20-%20UNI/Mestrado/2016/Qualificação/Dissertação%20Ana%20Laura.docx%23_Toc471996033
file:///C:/Users/Mauro/Dropbox/Imprimir%20-%20UNI/Mestrado/2016/Qualificação/Dissertação%20Ana%20Laura.docx%23_Toc471996033
file:///C:/Users/Mauro/Dropbox/Imprimir%20-%20UNI/Mestrado/2016/Qualificação/Dissertação%20Ana%20Laura.docx%23_Toc471996033
 
LISTA DE TABELAS 
 
Tabela 1 - Principais características da resina Streamline chelating. ....................................... 42 
Tabela 2 - Composição do meio de cultivo 2xTY (pH 7,0) ..................................................... 44 
Tabela 3 - Fatores, variáveis codificadas e níveis para o planejamento experimental usando 
lisozima. .................................................................................................................................... 46 
Tabela 4 - Fatores, variáveis codificadas e níveis para o planejamento experimental usando 
pérolas de vidro. ....................................................................................................................... 47 
Tabela 5 - Fatores, variáveis codificadas e níveis para o planejamento experimental usando a 
ureia. ......................................................................................................................................... 47 
Tabela 6 - Fatores, variáveis codificadas e níveis para o planejamento experimental usando o 
EDTA - Mg2+. ......................................................................................................................... 48 
Tabela 7- Condições de eluição para purificação do antígeno 503. ......................................... 50 
Tabela 8 - Resultados de concentração de proteína total e antígeno 503 para o método de lise 
enzimática (lisozima). ............................................................................................................... 55 
Tabela 9 - Resultados de concentração de proteína total e antígeno 503 para o método pérolas 
de vidro. .................................................................................................................................... 55 
Tabela 10 - Resultados de concentração de proteína total e antígeno 503 para o método da ureia.
 .................................................................................................................................................. 55 
Tabela 11 - Resultados de concentração de proteína total e antígeno 503 para o método de 
EDTA - Mg2+. ......................................................................................................................... 56 
Tabela 12 - Percentagem de remoção de LPS nos ensaios de ALE. ........................................ 68 
Tabela 13 - Dados da purificação do antígeno 503 a partir do homogeneizado de E. coli não 
clarificado para o ensaio com a eluição isocrática. .................................................................. 69 
Tabela 14 - Dados da purificação do antígeno 503 a partir do homogeneizado de E. coli não 
clarificado para o ensaio com a eluição em degrau com dois passos. ...................................... 73 
Tabela 15 - Dados da purificação do antígeno 503 a partir do homogeneizado de E. coli não 
clarificado para o ensaio com a eluição em degrau com três passos. ...................................... 74 
 
LISTA DE QUADRO 
 
Quadro 1 - Sequência de aminoácidos do fator de alongamento 1-γ de L. infantum. .............. 27 
 
 
file:///C:/Users/Mauro/Dropbox/Imprimir%20-%20UNI/Mestrado/2016/Qualificação/Dissertação%20Ana%20Laura.docx%23_Toc471993539
 
 
LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS 
 
ALE: Adsorção em Leito Expandido 
ANOVA: Análise de variância 
APT: Área de proteína total 
API: Área de proteína de interesse 
BSA: Albumina de Soro Bovino 
cm: Centímetro 
C: Concentração da proteína no equilíbrio na fase líquida 
C0: Concentração inicial da proteína alvo na fase líquida 
CPT: Concentração de proteína total 
Ca503: Concentração do antígeno 503 
cDNA: DNA complementar 
DAT: Teste de Aglutinação Direta 
DEAE: Dietil aminoetil 
DEQ: Departamento de Engenharia Química 
dp: Diâmetro da partícula 
E. coli: Escherichia coli 
EDTA: Ácido etilenodiaminotetracético 
EF-1: Fator de alongamento 1 
ELISA: Enzyme-linked Immunosorbent Assay 
FP: Fator de Purificação 
Fcal: Pontos de percentual calculados da distribuição F 
Ftab: : Pontos de percentual tabelados da distribuição F 
g: Aceleração da gravidade 
Gal: Galactose 
GE: Grau de expansão do leito 
Glc: Glicose 
GTP: guanosina trifosfato 
H: Altura do leito expandido 
H0: Altura do leito fixo 
Hep: L-glicerol-D-mano-heptose 
IDA: Ácido iminodiacético 
IMAC: Cromatografia de Afinidade por Íon Metálico Imobilizado 
 
 
INF-γ: Interferon gama 
Kd: Constante de dissociação no equilíbrio 
kDa: Kilodalton 
KDO: Ácido 2-ceto-3-deoxioctônico 
L: Litro 
LAL: Limulus Amebocyte Lysate 
LC: Leishmaniose Cutânea 
LCM: Leishmaniose Cutâneo-Mucosa 
LV: Leishmaniose Visceral 
LPS: Lipopolissacarídeos 
m: Metro 
mg: Miligrama 
min: Minuto 
mL: Mililitro 
mM: Milimolar 
n: Índice de Richardson-Zaki 
NGa: N-acetil-galactosamina 
NGc: N-acetil-glicosamina 
OMS: Organização Mundial da Saúde 
q: Capacidade de adsorção 
qmáx: Capacidade máxima de adsorção 
R2: Coeficiente de regressão 
RIFI: Reação de Imunofluorecência Indireta 
ReP: Reynolds da partícula 
rpm: Rotações por minuto 
SABs: sistemas aquosos bifásicos 
SDS-PAGE: Eletroforese em gel de poliacrilamidaem condições desnaturantes 
SP: Sulfapropil 
tRNA: Aminoacil-RNA transportador 
U: Velocidade da partícula 
UE: Unidade de endotoxina 
UFRN: Universidade Federal do Rio Grande do Norte 
Ut: Velocidade terminal da partícula 
V: Volume de extrato bruto 
 
 
Vads: Volume de adsorvente utilizado 
%: Percentagem 
º C: Graus celsius 
ε0: Porosidade inicial do leito 
ε: Porosidade do leito 
μ: Viscosidade do fluido 
μL: Microlitro 
ρp: Densidade da partícula 
ρL: Densidade do fluido 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CAPÍTULO I 
INTRODUÇÃO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
16 
1. Introdução 
 
 
 
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017 
 
1. Introdução 
 
Em muitos países, o aumento dos fatores de risco para a Leishmaniose tem despertando 
uma crescente preocupação nos órgãos de saúde pública. Esta é uma doença causada por 
protozoários do gênero Leishmania e classifica-se em três formas: Leishmaniose Visceral (LV), 
Leishmaniose Cutânea (LC) e Leishmaniose Cutâneo-Mucosa (LCM) (World Health 
Organization, 2014). Estima-se que cerca de 88 países são afetados e a população em risco é de 
aproximadamente 350 milhões de pessoas (Desjeux, 2004). 
A Leishmaniose Visceral (LV), umas das manifestações clínicas da Leishmaniose, é 
uma doença crônica e potencialmente fatal para o homem se não tratada (Gontijo & Melo, 
2004). A LV apresenta uma incidência anual de 200.000 a 400.000 novos casos (World Health 
Organization, 2014) e exibe uma extensa distribuição ocorrendo na Ásia, na África, nas 
Américas, na Europa e no Oriente Médio. Na América Latina, 90% dos casos ocorrem no 
Brasil, principalmente na região Nordeste (Ministério da Saúde, 2014). 
Até o presente não existe nenhuma vacina eficaz no tratamento da Leishmaniose em 
humanos. As drogas que vem sendo empregadas, por mais de sessenta anos, para o tratamento 
da doença são os antimoniais pentavalentes. No entanto, essas drogas apresentam custos 
elevados, nem sempre são efetivas e apresentam elevada toxicidade. Diante desses aspectos, 
avanços expressivos dos estudos de biologia molecular vêm contribuindo para a produção de 
antígenos recombinantes purificados que poderão ser utilizados para obtenção de vacinas 
(Gontijo & Melo, 2004). 
Adicionalmente, com o desenvolvimento da indústria biotecnológica, o interesse pelas 
proteínas é cada vez maior, devido a suas atividades enzimáticas e ações terapêuticas. Porém, 
para a maioria de suas aplicações elas precisam apresentar um elevado grau de pureza (Chase, 
1994). As técnicas utilizadas para separação e purificação de proteínas são conhecidas como 
downstream processing (Santos, 2001). Esse processo envolve diferentes operações unitárias 
como, por exemplo, centrifugação, filtração, precipitação, cromatografia e cristalização 
(Padilha, 2013). 
Por outro lado, a Escherichia coli encontra-se como um dos hospedeiros mais utilizados 
na obtenção de proteínas recombinantes, principalmente por apresentar vantagens como 
facilidade de manipulação e grande disponibilidade de informação genética, crescimento 
rápido, alto nível de expressão em meios de baixo custo e facilidade na ampliação de escala 
17 
1. Introdução 
 
 
 
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017 
 
(Huang et al., 2012). Nesses casos em que a proteína recombinante é expressa em E. coli, o 
procedimento de ruptura celular ocasiona a liberação de grandes quantidades de 
lipopolissacarídeos (LPS), uma vez que estes derivam da membrana celular externa de bactérias 
Gram-negativas (Lopes et al., 2010). Esses LPSs apresentam elevada toxicidade sobre os seres 
humanos, por isso é fundamental a sua remoção de produtos biológicos e farmacêuticos e, para 
isso, diversos métodos vêm sendo testados. Uma alternativa que vem mostrando resultados 
promissores na remoção de LPS integrado à purificação da proteína de interesse, é a aplicação 
do Triton-X 114 durante a etapa de lavagem do processo cromatográfico (Sousa Junior, 2015). 
Ainda segundo Sousa Junior (2015), devido ao elevado número de operações unitárias 
necessárias, que é dependente do grau de purificação desejado, a etapa de purificação apresenta 
um alto custo. Portanto, é de grande interesse o desenvolvimento de técnicas econômicas e que 
permitam a redução dessas etapas para a purificação de proteínas. 
 Assim, vem sendo amplamente estudado o desenvolvimento das operações 
integradas, as quais reduzem o número de operações unitárias necessárias ao processo de 
purificação, permitindo uma elevada recuperação e, também, proporcionando uma maior 
economia na obtenção dos produtos (Cavalcanti, 2010). Dessa forma, a Adsorção em Leito 
Expandido (ALE) vem se destacando como uma alternativa promissora na área de recuperação 
e purificação de biomoléculas, pois é uma técnica cromatográfica que integra as etapas de 
clarificação, concentração e purificação em uma única etapa (Anspach et al., 1999). Além disso, 
a mesma permite explorar diferentes técnicas cromatográficas, tais como: troca iônica, 
interação hidrofóbica e afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC) (Zhao et al., 2009). 
Dentre essas técnicas cromatográficas, a IMAC é uma cromatografia de afinidade em que a 
biomolécula se liga reversivelmente ao metal imobilizado na resina e vem sendo bastante 
utilizada na purificação de proteínas recombinantes que possuem caudas de histidina (Iwashita, 
2012). 
 Estudos realizados por Campubrí et al. (2006), Dalal et al. (2008), Yap et al. (2010) e 
Sousa Júnior et al. (2015) confirmam que a utilização da técnica cromatográfica IMAC 
operando em leito expandido vem se mostrando eficiente para processos de purificação. 
Nesse contexto, esse processo que integra a clarificação, recuperação e purificação da 
proteína e remoção de LPS em uma única operação vem sendo estudado pelo grupo de pesquisa 
em Engenharia de Bioprocessos do Departamento de Engenharia Química (DEQ) da 
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) e trata-se de um processo simples e de 
baixo custo quando comparado com outros procedimentos alternativos. 
18 
1. Introdução 
 
 
 
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017 
 
O presente trabalho está dividido em sete capítulos. O Capítulo 1 consiste na introdução 
aos assuntos discutidos no decorrer do trabalho, em seguida, tem-se o Capítulo 2, onde estão 
expostos os objetivos propostos. O Capítulo 3, apresenta uma revisão da literatura com relação 
à Leishmaniose, antígenos recombinantes, rompimento celular, purificação de biomoléculas, 
cromatografia, adsorção em leito expandido, técnica de Cromatografia de Afinidade por Íons 
Metálicos Imobilizados (IMAC) e endotoxinas. O Capítulo 4 irá abordar a metodologia 
utilizada, seguido do Capítulo 5, que irá apresentar os resultados e discussões e no Capítulo 6 
são apresentas as considerações finais. Por fim, o Capítulo 7 relata as referências estudadas para 
a elaboração deste trabalho e em seguida tem-se o apêndice e o anexo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CAPÍTULO II 
OBJETIVOS 
20 
2. Objetivos 
 
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017 
 
2. Objetivos 
 
Os objetivos deste trabalho podem ser divididos em objetivos gerais e específicos. 
 
 2.1 Objetivos Gerais 
 
• Avaliar os métodos de rompimento celular e os diferentes metais imobilizados em 
resina Streamline Chelating para purificação do antígeno 503 de Leishmania i. 
chagasi. 
• Remover os lipopolissacarídeos liberados durante a etapa de rompimento celular. 
 
 2.2 Objetivos Específicos 
 
• Avaliar quatro métodos de rompimento celular, utilizando lisozima, pérolas de 
vidro, ureia e EDTA-Mg2+, para obtenção da proteína intracelular; 
• Analisar a influência dos íons metálicos Cu2+, Ni2+, Zn2+, Co2+ e Fe3+ imobilizados 
na resina Streamline chelating na adsorção do antígeno 503 usandoo 
homogeneizado celular em sistema de batelada; 
• Determinar a quantidade mínima de tensoativo Triton X-114 necessária na etapa de 
lavagem da ALE para remoção do LPS, a fim de obter-se o antígeno 503 livre desse 
contaminante; 
• Recuperar e purificar o antígeno 503 diretamente do homogeneizado bacteriano não 
clarificado por adsorção em leito expandido, utilizando a resina Streamline 
chelating com o metal imobilizado que apresentar melhor capacidade de adsorção. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CAPÍTULO III 
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 
 
 
22 
3. Revisão Bibliográfica 
 
 
 
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017 
 
3. Revisão Bibliográfica 
 
Neste capítulo é elaborada uma revisão da literatura baseada na temática deste trabalho, 
abordando assuntos com relação à purificação de biomoléculas, incluindo processos de 
rompimento celular, a técnica de adsorção em leito expandido e a IMAC. Além disso, um 
contexto geral sobre a leishmaniose, antígenos recombinantes e endotoxinas também foram 
estudados. 
 
 3.2 Leishmaniose 
 
A leishmaniose constitui um complexo de doenças com uma importante diversidade 
clínica e epidemiológica. A doença é causada por um parasita protozoário da família 
Trypanosomatidae, que pertence ao gênero Leishmania. Cerca de 30 espécies foram 
comprovadas, sendo 20 dessas espécies patogênicas para os seres humanos (Desjeux, 2004). 
As manifestações clínicas da doença dependem da espécie de Leishmania e apresenta três 
principais formas: visceral (LV), cutânea (LC) e mucocutânea (LMC) (World Health 
Organization, 2014). 
A doença é considerada endêmica em 88 países, dos quais 72 são países em 
desenvolvimento e 13 estão entre os menos desenvolvidos. A maioria dos casos de leishmaniose 
ocorre em populações rurais pobres e áreas suburbanas de alguns países, como: Índia, Sudão, 
Bangladesh, Nepal, Brasil, Peru, Irã, Afeganistão, Argélia, Síria e Arábia Saudita (Desjeux, 
1996). A Figura 1 apresenta o estado de endemicidade da Leishmaniose Visceral em todo o 
mundo no ano de 2013. 
23 
3. Revisão Bibliográfica 
 
 
 
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017 
 
 
 
3.2.1 Leishmaniose Visceral 
 
3.2.1.1 Situação epidemiológica 
 
A Leishmaniose Visceral (LV), também conhecida como calazar, é a forma clínica mais 
grave, pois é geralmente fatal se não tratada (Boelaert et al., 2000). É uma doença sistêmica 
que atinge as células do sistema monocular fagocitário do homem sendo os órgãos mais 
afetados o baço, fígado, linfonodos, medula óssea e pele (Melo, 2004). 
 No Brasil, inicialmente a LV foi caracterizada como uma doença rural, ocorrendo 
especialmente na região Nordeste. Com o aumento da urbanização houve uma expansão na 
distribuição geográfica da LV e a doença se espalhou para todas as regiões do país, envolvendo 
as regiões Norte, Nordeste, Centro-Oeste e Sudeste (Martins-Melo et al., 2014). Essas 
modificações, do ponto de vista epidemiológico, resultam da alta densidade demográfica, 
alterações climáticas e migração rural para áreas urbanas periféricas (Miranda, 2008). 
Figura 1 - Endemicidade da Leishmaniose Visceral em todo o mundo no ano de 2013 (World Health 
Organization, 2014). 
24 
3. Revisão Bibliográfica 
 
 
 
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017 
 
Em 1998, fora da região Nordeste foram notificados 15% dos casos e, em 2005, essa 
proporção aumentou para 44% (Harhay et al., 2011). Atualmente, a doença está distribuída em 
21 estados brasileiros, com cerca de 3.500 casos anuais (Alvar et al., 2012). Aproximadamente 
41,9% dos casos humanos do país correspondem a crianças com até nove anos de idade 
(Marcondes & Rossi, 2013). 
Os dados epidemiológicos dos últimos anos relatam a periurbanização e a urbanização 
da LV, destacando-se a ocorrência de surtos nas seguintes cidades: Rio de Janeiro (RJ), 
Araçatuba (SP), Santarém (PA), Belo Horizonte (MG), Corumbá (MS), Teresina (PI), São Luís 
(MA), Natal (RN), Fortaleza (CE), Camaçari (BA), Três Lagoas (MS), Campo Grande (MS) e 
Palmas (TO) (Ministério da Saúde, 2014). 
 
3.2.1.2 Agente etiológico e transmissão 
 
A LV é causada por espécies pertencentes ao complexo Leishmania donovani. No 
Brasil, o agente etiológico é a L. chagasi, espécie semelhante à L. infantum encontrada em 
alguns países do Mediterrâneo e da Ásia. Com a realização de estudos envolvendo técnicas 
bioquímicas e moleculares, a L. chagasi e a L.infantum foram consideradas a mesma espécie, e 
por isso este parasita é mencionado como L. infantum chagasi ou L. i. chagasi (Sousa Junior, 
2015). Para que ocorra a transmissão da doença é necessária a presença do vetor susceptível, 
bem como de um hospedeiro e um reservatório também susceptíveis (Gontijo & Melo, 2004). 
No ambiente urbano o cão doméstico é o principal reservatório e fonte de infecção para os 
vetores (Courtenay et al., 2002). 
A principal forma de transmissão do parasita é através da picada de flebotomíneos do 
sexo feminino. Outras formas de transmissão já foram registradas, como: congênita, seringas 
contaminadas e transfusão de sangue (Quinnell & Courtenay, 2009). No Brasil, duas espécies 
de vetores estão relacionadas com a transmissão da doença, Lutzomyia longipalpis e Lutzomyia 
cruzi, sendo a primeira considerada o principal vetor da LV (Gontijo & Melo, 2004). 
 
3.2.1.3 Quadro Clínico 
 
 As manifestações clínicas da LV apresentam as seguintes formas: assintomática, 
oligossintomática e clássica (Sousa Junior, 2015). 
25 
3. Revisão Bibliográfica 
 
 
 
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017 
 
A forma clássica da doença é caracterizada pela presença de febre, anemia, 
hepatoesplenomegalia, manifestações hemorrágicas, linfadenomegalia, perda de peso, 
taquicardia, além de tosse seca e diarréia, sendo estas duas últimas menos frequentes (Pastorino 
et al., 2002). Apenas uma pequena parcela de indivíduos infectados desenvolve sinais e 
sintomas da doença, a maioria desenvolve infecção assintomática ou oligossintomática (Lima 
et al., 2012). De acordo com Ready (2014), aproximadamente 25% dos indivíduos infectados 
evoluem para a forma clássica da doença. 
 
4.2.1.4 Diagnóstico e tratamento 
 
O diagnóstico da LV é baseado em parâmetros epidemiológicos, clínicos e laboratoriais 
(Pastorino et al., 2002). Um dos problemas associado a esse diagnóstico é a semelhança no 
quadro clínico que a LV apresenta com outras doenças presentes nas áreas onde ela ocorre, 
como, por exemplo, Doença de Chagas, Esquistossomose, Malária, Tuberculose e Febre 
Tifóide (Gontijo & Melo, 2004). Diante dos sinais e sintomas que são comuns a outras 
patologias devem-se utilizar os métodos clínicos adjuntos aos métodos parasitológico, 
sorológico e imunológico para construir o diagnóstico da LV (Souza et al., 2012). 
O diagnóstico feito através do método clínico baseia-se em diversas indicações, como: 
febre prolongada, anemia, esplenomegalia, hepatomegalia e leucopenia. O método 
parasitológico, por sua vez, fundamenta-se na visualização direta em cultivo do parasito obtido 
de baço, fígado, medula óssea ou linfonodos. Por outro lado, os métodos sorológicos e 
imunológicos utilizam testes, tais como: a Reação de Imunofluorecência Indireta (RIFI), a 
Reação Imunoenzimática Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) e o Teste de 
Aglutinação Direta (DAT) (Assis et al., 2008). 
 O tratamento da LV vem sendo realizado com cinco medicamentos derivados de 
moléculas naturais e sintéticas: antimônio pentavalente, anfotericina B (AmpB), miltefosine, 
paromomicina e pentamidine. Atualmente, dois compostos antimoniais pentavalentes são 
comercialmente disponíveis: Glucantime® (antimoniato de metilglucamina) e Pentostan® 
(estibogluconato de sódio) (Hwan, 2016). 
 No Brasil, esses medicamentos à base de antimônio, são as drogas de primeira escolha 
para o tratamento da doença e o único composto disponível é o antimoniatoN-metil glucamina, 
sendo a última adquirida previamente por meio da aminação redutora da glicose em presença 
de metilamina (Rath et al., 2003). Devido a toxicidade do antimônio, a Organização Mundial 
26 
3. Revisão Bibliográfica 
 
 
 
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017 
 
da Saúde (OMS) sugere que a dosagem dessa droga não ultrapasse 20 mg/kg/dia, com uma dose 
máxima diária de 850 mg (Balaña-Fouce et al., 1998). Distúrbios cardiovasculares são os 
principais efeitos colaterais do glucantime (Gontijo & Melo, 2004). 
A anfotericina B é uma droga de segunda linha utilizada como tratamento alternativo, 
em caso de resistência aos antimoniais. É um antibiótico antifúngico proveniente de uma cepa 
de Streptomyces nodosus (Rath et al., 2003). O uso desse medicamento é restringido pela sua 
elevada toxicidade, com isso a anfotericina B pode ser incorporada em lipossomas, reduzindo 
a toxidade e elevando os níveis de cura (Freitas-Junior et al., 2012). 
 
 
3.3 Antígenos Recombinantes 
 
Com o surgimento da tecnologia do DNA recombinante, tornou-se possível expressar 
proteínas recombinantes, tornando-se essa técnica uma ferramenta importante nos estudos da 
estrutura, função e identificação de novas proteínas, principalmente com finalidades 
terapêuticas (Vaz, 2008). 
As proteínas recombinantes podem ser obtidas em diversos hospedeiros, tais como: 
bactérias, leveduras, fungos filamentosos e células de mamíferos. A bactéria Gram-negativa, 
Escherichia coli, é um dos hospedeiros mais bem estudados e utilizados para reprodução destas 
proteínas, principalmente por ser bem caracterizada em termos de genética molecular, fisiologia 
e sistema de expressão, permitindo assim que várias técnicas de manipulação genética fossem 
desenvolvidas e aprimoradas (Makrides, 1996; Choi & Lee, 2004; Lima, 2004). 
Proteínas de Leishmania, como por exemplo antígenos de Leishmania chagasi, têm sido 
clonados e produzidos em bactérias para o desenvolvimento de vacinas e kits de diagnóstico 
(Silva, 2013). 
 
3.3.1 Antígeno 503 
 
De acordo com o estudo realizado por Martins et al. (2006), observou-se que uma vacina 
que produz proteção contra a LV deveria possuir mecanismo de ação que consistiria no estímulo 
da produção de interferon gama (INF-γ). Para esse estudo foi gerada uma biblioteca de cDNA 
(DNA complementar) da forma amastigota de Leishmania i. chagasi e os antígenos foram 
27 
3. Revisão Bibliográfica 
 
 
 
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017 
 
identificados através da dupla varredura da biblioteca. O antígeno 503 apresentou 100% de 
identidade com o fator de alongamento 1-γ de L. infantum, sendo observada uma massa de 56 kDa 
e confirmando ainda, o potencial desta proteína como candidata à vacina ou teste para diagnóstico 
específico da LV. 
 O fator de alongamento 1-γ é uma subunidade do fator de alongamento 1 (EF-1). O EF-
1 além de ser o principal fator traducional, é também uma das mais importantes proteínas 
multifuncionais, uma proteína G que desempenha um papel importante na tradução de proteínas 
em células eucarióticas. O EF-1 é composto por quatro subunidades principais: alfa, beta, gama 
e delta (EF-1α, EF-1β, EF-1δ e EF-1γ). A subunidade EF-1α liga o aminoacil-RNA 
transportador (tRNA) ao ribossomos 80s através da hidrólise do guanosina trifosfato (GTP), 
enquanto as outras subunidades (EF-1β, EF-1δ e EF-1γ) apresentam como função a troca do 
nucleotídeo EF-1α-guanosina difosfato (GDP) por EF-1α-GTP (Cañavate et al., 2002; Ejiri, 
2002). 
 O Quadro 1 mostra a sequência de aminoácidos do fator de alongamento 1-γ de L. 
infantum 
 
 
3.4 Rompimento Celular 
 
Existem dois tipos básicos de produtos produzidos por microrganismos: intracelular, 
que são retidos no interior da célula do citoplasma e extracelular que são excretados para um 
meio de crescimento (Geciova et al., 2002). Comparado aos produtos extracelulares, os 
intracelulares dificultam o processo de purificação de biomoléculas, uma vez que exigem o 
rompimento celular (Pessoa-Jr & Kilikian, 2005). 
1 mtykllaplh pesaraqkim vaaayanvdv elkvcqygqe netpefarnc spcmrfpsmq 
61 teegylfesn aimrhiarve ksgaklygat pfessqvdmw ldfasselda hnmpylmetf 
121 agipaaesam atleeslagl elwletrtfl vgermtvadi svafalqwvy rmnvkhgeel 
181 tkkyrnayrl yntvmqqpkt vevlkqwgat fgpakapkka aeakpkaekk pkeavgdeee 
241 qsakeekkan pldalppssf vldaykreys ntdtrtvaap yffehydteg ytcfwaryky 
301 nednkkqfmt anlvrgwfqr mehvrkyafg valiigedaa helvsfwvfr gkgmpeivse 
361 vvdtelfewe eikdvqaeke kitdylcweg ptiprpvleg rcfk 
 
Quadro 1 - Sequência de aminoácidos do fator de alongamento 1-γ de L. infantum. 
Fonte: GenBank número CAC35543.1 
 
28 
3. Revisão Bibliográfica 
 
 
 
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017 
 
De acordo com Pessoa-Jr (2005), o rompimento celular ocorre após a etapa de separação 
e lavagem das células obtidas ao final do cultivo. Alguns fatores como: tamanho da célula, 
necessidade de controle de temperatura, tempo de operação, tolerância a tensões de 
cisalhamento, rendimento do processo, custo e capital de energia, devem ser considerados para 
escolha da técnica de rompimento mais adequada. 
Portanto, a ruptura celular consiste da primeira etapa no processo de recuperação de 
produtos intracelulares e constitui um passo essencial do downstream processing, pois algum 
dano ocasionado ao produto de interesse a ser recuperado, pode influenciar nas etapas seguintes 
(Neves, 2003). 
Os métodos para ruptura celular são classificados como: mecânicos e não-mecânicos. 
Os métodos mecânicos incluem técnicas baseadas em forças de cisalhamento (moinho de bolas, 
ultrassom) ou por pressão (homogeneizador a alta pressão). Os métodos não-mecânicos podem 
ser: físicos (choque osmótico, termólise, congelamento e descongelamento), químicos 
(detergentes, solventes, EDTA) e enzimáticos (lise enzimática) (Harrison, 1991; Ho et al., 
2006). 
 
3.4.1 Lise enzimática 
 
A lise enzimática é um método de rompimento celular atraente em termos da sua 
especificidade, condições suaves de operação, baixo investimento de capital, além de ser 
adequado para a recuperação de biomoléculas sensíveis à tensão de cisalhamento (Harrison, 
1991). 
 Esse método de ruptura baseia-se na remoção da parede celular, com a ação das enzimas, 
acompanhado do rompimento da membrana citoplasmática devido à pressão osmótica interna. 
As enzimas atuam no rompimento, visto que a parede seja seu substrato (Pessoa-Jr, 2005). 
Diferente das bactérias gram-positivas, as gram-negativas possuem uma estrutura mais 
complexa. Estas são constituídas por uma parede de duas camadas: a interior, composta por 
peptidoglicano e a membrana externa formada por fosfolipídios, proteínas, lipoproteínas e 
lipopolissacarídeos. Logo, é necessário um pré-tratamento para remover a membrana externa e 
expor o peptidoglicano ao ataque enzimático, esse pré-tratamento pode ser feito, por exemplo, 
com o detergente Triton X-100 (Andrews & Asenjo, 1987). 
 
29 
3. Revisão Bibliográfica 
 
 
 
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017 
 
3.4.2 Pérolas de vidro 
 
Devido à sua simplicidade, esse método parece ser o mais simples para ruptura celular 
quando equipamento especializado não estiver disponível (Benov & Al-Ibraheem, 2002). 
 O rompimento por pérolas de vidro é um método mecânico e ocorre devido à força de 
cisalhamento aplicada pelas esferas de vidro contra a parede celular das células. Esse método é 
bastante indicado para escala laboratorial, uma vez que não necessita de grande aparato 
operacional. O procedimento desse método consiste, basicamente, da adição das pérolas de 
vidros em um tubo, contendo um determinado volume de suspensão celular, agitado-se o tubo 
vigorosamente por um determinado tempo (Neves, 2003). 
 
3.4.3 EDTA - Mg2+ 
 
O EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) é um agente quelante que causa 
desestabilização ou remoção damembrana externa (Harrison, 1991). No caso da E. coli o 
EDTA é necessário para romper a camada de peptidoglicano na membrana externa e Mg2+é 
adicionado para estabilizar os esferoplastos (Xiang et al., 2002). 
 
3.4.4 Ureia 
 
A expressão de proteínas em E. coli frequentemente leva à produção de proteínas 
agregadas e insolúveis expressas em corpos de inclusão no citoplasma bacteriano. Os agentes 
mais usualmente utilizados para a solubilização de proteínas agregadas são guanidina e ureia. 
Estes levam a formação de estruturas protéicas flexíveis e desordenadas e quando altos níveis 
de concentração destes agentes desnaturantes são utilizados a solubilização pode ser completa 
através da ruptura de interações intramoleculares (Clark, 2001; Singh & Panda, 2005) 
Desse modo, a ureia é um agente caotrópico que age interrompendo as interações fracas 
entre moléculas, como as interações hidrofóbicas entre as proteínas. Agentes caotrópicos são 
eficazes na desnaturação de proteínas e por esse motivo são adicionados nos tampões de lise 
(Geciova et al., 2002; Burden, 2012). 
 
30 
3. Revisão Bibliográfica 
 
 
 
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017 
 
3.5 Purificação de Proteínas 
 
 O interesse por processos de purificação é crescente devido ao desenvolvimento da 
biotecnologia e à demanda das indústrias farmacêutica e química por produtos com elevado 
grau de pureza (Zuñiga et al., 2003). Destacam-se, dentre esses produtos, as proteínas, 
interferons, insulinas, hormônios de crescimento, vacinas, cujas técnicas de separação e 
purificação podem ser agrupadas no downstream processing. Essas operações unitárias são 
bastante dispendiosas, podendo comprometer em até 80% do custo total (Santos, 2001). Dessa 
forma, tem-se grande interesse no estudo e desenvolvimento de técnicas mais simples, ou seja, 
que permita a redução das etapas desse processo, e que ofereça um menor custo para a 
purificação de biomoléculas. 
 Diversas técnicas podem ser utilizadas na purificação de produtos biotecnológicos e a 
seleção do processo mais adequado a ser utilizado vai depender da aplicação final da molécula-
alvo requerendo maior ou menor grau de pureza, das características físico-químicas e também 
das impurezas. Biofármacos (diagnósticos e terapêuticos) são os que demandam maior grau de 
pureza e, assim, acabam elevando a complexidade e os custos do processo de purificação 
(Pessoa-Jr & Kilikian, 2005). 
Na indústria biotecnológica, as técnicas cromatográficas são os métodos mais 
empregados para recuperação e purificação de proteínas, principalmente quando alta 
concentração e alta pureza são necessárias, e a adsorção em leito fixo, especificamente, 
encontra-se com uma das técnicas de mais amplo estudo. Porém, uma das maiores limitações 
desta técnica se dá após os processos fermentativos, onde são necessárias algumas operações 
unitárias prévias, devido à presença de diversos contaminantes e materiais indesejados, como 
subprodutos e resíduos celulares, os quais podem causar obstrução da coluna e, deste modo, 
prejudicar o rendimento do processo de purificação (Azzoni, 2002; Zhao et al., 2009; Lima, 
2014). 
O objetivo de um processo de purificação de proteínas é atingir rendimento máximo 
com alta seletividade, considerando os custos das operações empregadas. Sendo assim, é 
necessário ter uma sequência adequada das etapas envolvidas no processo e um número 
otimizado de operações unitárias envolvidas, reduzindo o tempo de processamento (Silva, 
2000). 
Em geral, o processo de recuperação e purificação envolve uma estratégia que inclui 
quatro passos sequenciais: clarificação (remoção de compostos insolúveis), concentração 
31 
3. Revisão Bibliográfica 
 
 
 
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017 
 
(isolamento do produto), purificação e polimento. Essa abordagem é uma das melhores 
estratégias para a purificação de biomoléculas (Cussler & Ding, 1995; Zuñiga et al., 2003). 
Nesse caso, como comentado anteriormente, técnicas que permitam integrar as etapas de 
clarificação, concentração/purificação são de extrema importância. Dentre essas destacam-se 
os sistemas aquosos bifásicos (SABs) e a adsorção em leito expandido (ALE), sendo essa última 
usada no presente trabalho. A Figura 1 esquematiza as etapas de um processo de purificação de 
biomoléculas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2 - Etapas de um processo genérico de purificação de biomoléculas. Fonte: Pessoa-Jr 
& Kilikian, 2005. 
 
Meio de cultivo com células ou 
microrganismos em suspensão 
Clarificação 
(separação células/meio) 
Células ou microrganismos 
(produtos intracelulares) 
Sobrenadante 
(produtos extracelulares) 
eextracelularesexintracel
ulares) 
Rompimento de células 
 ou microrganismos 
 
Remoção de fragmentos de 
células ou microrganismos 
 
 
Fração sólida 
 
Sobrenadante
e 
 
Separação/Concentração de 
moléculas 
 
Purificação 
 
Tratamentos finais 
 
32 
3. Revisão Bibliográfica 
 
 
 
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017 
 
3.6 Cromatografia 
 
A introdução da cromatografia como técnica analítica ocorreu em 1906, por um 
pesquisador russo, Mikhael Semenovich Tswett, ao descrever sua experiência de separar a 
clorofila de uma mistura de pigmentos de planta (Moraes, 2009). Nas últimas décadas, a 
cromatografia vem se destacando como uma das técnicas mais importantes para separação e 
purificação de biomoléculas, devido ao seu alto desempenho e eficiência (Zhao et al., 2009). 
Essa técnica baseia-se nas características físico-químicas dos componentes de interesse 
e consiste da separação dos componentes entre uma fase móvel, que contém a mistura de 
componentes a serem separados, e outra estacionária, esta normalmente é sólida e formada por 
matriz de partículas empacotadas em uma coluna de forma tubular (Azzoni, 2002; Zuñiga et 
al., 2003). Durante a passagem da fase móvel por meio da fase estacionária, os constituintes da 
amostra são difundidos entre as duas fases, de tal forma que, cada um deles é seletivamente 
retido pela fase estacionária, resultando em uma migração diferencial que promove a separação 
(Collins et al., 2006). 
As técnicas cromatográficas mais utilizadas para purificação de produtos 
biotecnológicos são: cromatografia por exclusão molecular, troca iônica, interação hidrofóbica, 
afinidade e imunoafinidade. Na cromatografia por exclusão molecular a separação ocorre em 
função dos tamanhos das moléculas, enquanto que nos demais processos, as diferentes 
moléculas adsorvem na matriz, e em seguida, ocorre dessorção seletiva, proporcionando a 
separação dos componentes (Pessoa-Jr & Kilikian, 2005). 
 
3.6.1 Adsorção em Leito Expandido 
 
A Adsorção em Leito Expandido (ALE) tende a simplificar de forma significativa o 
downstream processing, pois nessa técnica o caldo bruto proveniente da fermentação pode ser 
utilizado sem que haja uma clarificação prévia, com o material particulado passando através do 
leito sem ser retido. Esta técnica cromatográfica elimina as etapas de filtração, centrifugação e 
concentração, integrando em uma única operação as etapas de clarificação, concentração e 
purificação (Chase & Draeger, 1992; Hjorth, 1997). Essa característica de integrar essas etapas 
em uma única operação unitária é a principal vantagem da utilização da adsorção em leito 
expandido, sobre a técnica cromatográfica convencional em leito fixo. 
33 
3. Revisão Bibliográfica 
 
 
 
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017 
 
A Figura 3 ilustra a comparação entre o funcionamento de um processo de adsorção em 
leito fixo (3a) e expandido (3b), podendo-se observar que no leito fixo o material particulado 
bloqueia a coluna. No entanto, ao ser operada de forma expandida a alimentação contendo o 
material particulado passa pela coluna sem a obstrução do leito (Figura 3b) (Santos, 2001).Figura 3 - Princípio de funcionamento de um processo de adsorção em leito fixo e expandido. 
Fonte: adaptado de Crase & Draeger, 1992. 
 
A ALE baseia-se na fluidização do leito de adsorventes cromatográficos (Padilha, 
2013). Esse processo de fluidização do leito promove uma maior interação entre as matrizes 
adsorventes e as moléculas alvo (Curvelo-Santana et al., 2008). 
As propriedades das partículas adsorventes são de fundamental importância para formar 
uma fluidização perfeita, nesse caso, faz-se necessário o uso de partículas com alta massa 
específica, que permite o estabelecimento de elevadas velocidades de fluxo de líquido através 
do leito expandido. Quando a fase móvel é bombeada em sentido ascendente através da coluna, 
as partículas com tamanhos e densidades diferentes distribuem-se de forma não uniforme ao 
longo da altura do leito (Lin et al, 2013). As partículas adsorventes maiores ou mais densas 
Fluido com partículas 
Partículas 
adsorventes 
Material particulado que 
passa pelo leito 
Torta de Células 
(a) (b) 
34 
3. Revisão Bibliográfica 
 
 
 
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017 
 
localizam-se na parte inferior do leito expandido e as menores ou menos densas na parte 
superior, como pode ser visto na Figura 2b ilustrada acima (Hjorth, 1997). 
 O fluxo ascendente através do adsorvente fornece uma maior fração de vazios no interior 
do leito, o que permite a utilização de material particulado, que passa através da fase sólida 
enquanto a biomolécula alvo é adsorvida (Tong & Sun, 2002). 
 As matrizes adsorventes mais utilizadas para purificação de proteínas são as de celulose, 
agarose, dextrana e poliacrilamida (Sousa Junior, 2015). Os ligantes clássicos (SP – sulfapropil, 
DEAE – dietil aminoetil e IDA – ácido iminodiacético) são acoplados ao suporte das partículas 
adsorventes (agarose-quartzo ou agarose-metal) elevando sua densidade e viabilizando a 
expansão do leito. Estes adsorventes são identificados comercialmente como Streamline, 
comercializados pela GE Healthcare e são compostos de 6% de agarose contendo um núcleo 
de quartzo cristalino, que atua aumentando a densidade do adsorvente, com um tamanho de 
partícula que varia de 100-300 µm, com tamanho médio de 200 µm e densidade em torno de 
1,2 g/mL (Amersham Pharmacia Biotech, 1997; Kilikian & Santos, 2005). 
 O processo de cromatografia em leito expandido corresponde a uma sequência de 
operações, que inclui o equilíbrio da resina, aplicação da amostra, a lavagem das proteínas não 
adsorvidas, a eluição do composto e a regeneração da resina (Moraes, 2009). A ilustração dessa 
sequência é representada na Figura 4. Primeiramente, o adsorvente do leito expandido é 
equilibrado com o tampão de equilíbrio, aplicado em fluxo ascendente, causando a expansão 
do leito em 2 ou 3 vezes, dependendo da velocidade. Após essa etapa, a amostra contendo as 
células e partículas em suspensão é alimentada, no sentido ascendente, no leito estabilizado. 
Dessa forma, a biomolécula alvo adsorve na resina, enquanto as células, restos celulares e 
contaminantes saem pela parte superior da coluna. Nessa etapa, é importante manter o mesmo 
grau de expansão do leito estabelecido e para isso deve-se controlar a velocidade. Em seguida, 
efetua-se a lavagem de modo ascendente usando-se o tampão, para remoção de partículas e 
proteínas fracamente adsorvidas. Depois da lavagem, a eluição da biomolécula de interesse é 
conduzida após sedimentação do leito, ou seja, com o leito empacotado, podendo-se utilizar o 
fluxo na forma ascendente ou descendente. Finalmente, a resina é limpa e regenerada para ser 
novamente utilizada (Amersham Pharmacia Biotech, 1997). 
 
 
 
 
35 
3. Revisão Bibliográfica 
 
 
 
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4 - Etapas do processo de adsorção em leito expandido. Fonte: Amersham Pharmacia 
Biotech, 1997. 
 
3.6.1.1 Caracterização do leito expandido 
 
Para as operações usando a ALE é de fundamental importância conhecer o 
comportamento do leito em função das propriedades físicas das partículas e do fluido (Moraes, 
2009). Uma das formas de conhecer esse comportamento é por meio da correlação de 
Richardson & Zaki (1954), eles estudaram a sedimentação e fluidização de vidro, divinil 
benzeno e balas de chumbo usando soluções como cloreto de sódio, M-cresol, bromofórmio e 
glicerol e obtiveram uma expressão que relaciona a velocidade do fluido e a velocidade terminal 
da partícula, com a porosidade do leito, conforme a Equação (1) (Santos, 2001): 
 
U
Ut
=εn (1)
 
Em que U é a velocidade do fluido, 𝑈𝑡 é a velocidade terminal da partícula, 𝜀 a 
porosidade do leito e n é o índice de expansão (ou índice de Richardson-Zaki), sendo este uma 
função do número de Reynolds terminal (Ret). 
 
Ret=
dPρLUt
μ
 (2) 
 
Leito 
sedimentado 
Equilíbrio 
(expansão do 
leito) 
Aplicação da 
amostra 
Lavagem Eluição da 
proteína 
Regeneração 
36 
3. Revisão Bibliográfica 
 
 
 
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017 
 
No regime de Stokes, em que o 𝑅𝑒𝑝 < 0,1, a velocidade terminal de uma partícula isolada 
𝑈𝑡 é dada por: 
 
Ut=
gdP
2
(ρ
p
-ρ
L
)
18μ
 (3) 
 
Sendo g a aceleração da gravidade, dp é o diâmetro da partícula, μ é a viscosidade do 
fluido, e ρp e ρL são as densidades da partícula e do fluído, respectivamente. 
Outro parâmetro importante na caracterização do leito expandido é o grau de expansão 
(GE), que é um número adimensional e representa a razão entre a altura do leito expandido (H) 
e a altura do leito fixo do adsorvente (𝐻0), para uma dada velocidade aplicada, como segue na 
Equação (4). Para sistemas operando em leito expandido, os valores de GE giram em torno de 
2,0 a 3,0 (Kilikian & Santos, 2005). 
 
GE=
H
H0
 (4) 
 
 A Equação (5) representa a relação entre a porosidade do leito e o grau de expansão: 
 
H
H0
=
(1-ε0)
(1-ε)
 (5) 
 
 Em que ε é a porosidade do leito e 𝜀0 a porosidade inicial do leito (assumindo valor de 
0,4) (Cavalcanti, 2010). 
 
3.6.2 Cromatografia de Afinidade por Íons Metálicos Imobilizados (IMAC) 
 
A IMAC foi introduzida por Porath e colaboradores em 1975 e, desde então, íons 
metálicos imobilizado vem sendo empregados como ligantes gerais em cromatografia de 
afinidade para a purificação de várias biomoléculas (Vançan, 1999). 
Assim como as demais técnicas de cromatografia de afinidade, a IMAC é usada nos 
casos em que se deseja uma purificação rápida e uma elevada pureza do produto. Apresenta 
vantagens quando comparada a essas outras técnicas, como a estabilidade entre IMAC – ligante, 
37 
3. Revisão Bibliográfica 
 
 
 
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017 
 
condições suaves de eluição, regeneração simples e de baixo custo, além da sua aplicabilidade 
em condições desnaturantes, o que muitas vezes faz-se necessário quando as proteínas 
recombinantes são expressas em E. coli na forma de corpos de inclusão, permitindo que as 
proteínas marcadas com histidina possam ser separadas eficientemente na presença de 
concentrações de desnaturantes, como ureia ou guanidina-HCl (Gaberc-Porekar & Menart, 
2001). 
Nessa técnica, a adsorção das proteínas é baseada na interação entre o íon metálico 
imobilizado na matriz do adsorvente e um grupamento doador de elétrons localizados na 
superfície das proteínas (Sousa Junior, 2015). Os íons metálicos mais usualmente empregados 
são, Fe3+, Cu2+, Ni2+, Co2+, Zn2+, Al3+ e Ca2+. Sendo que para purificação de proteínas que 
possuam resíduos de histidina, triptofano e cisteína, os mais utilizados são, Cu2+, Ni2+, Co2+, 
Zn2+, onde esses íons interagem com o nitrogênio aromático dos grupamentos imidazol, indol 
e com o enxofre do grupamento tiol, respectivamente, de cada aminoácido (Bresolin et al., 
2009). 
Bresolin et al. (2009) reportamainda uma predição de afinidade da proteína com o 
ligante IDA baseado em resíduos de histidina acessíveis na superfície de proteínas. Para a 
ocorrência de apenas um resíduo de histidina o Cu2+ é o íon mais indicado para adsorção de 
proteína, quando houver mais de um resíduo de histidina os íons metálicos que devem ser 
utilizados para retenção de proteínas são Cu2+ e Ni2+ e no caso de ocorrer um cluster de histidina 
os íons apropriados para adsorção de proteína são Cu2+, Ni2+, Zn2+ e Co2+. 
Segundo Sulkowski (1989), o par de elétrons presente no nitrogênio aromático do anel 
imidazol da histidina é o principal colaborador na interação entre a proteína e íons metálicos de 
transição (quando quelatados ao ácido iminodiacético, IDA) e que a presença de múltiplas 
histidinas expostas na superfície da proteína a ser separada aumenta o grau desta interação. 
 Poucas são as proteínas que naturalmente contêm resíduos de histidina localizados na 
superfície, porém com o advento da engenharia genética, proteínas que na sua forma original 
não possuíam caudas de histidinas disponíveis para ligação com íons metálicos imobilizados, 
são geneticamente modificadas para receberem uma cauda de histidina, o que facilita a 
purificação da proteína alvo por IMAC (Serpa, 2002). 
Nessa técnica cromatográfica, o processo de purificação depende de diversos fatores, 
como a escolha dos íons metálicos, dos agentes quelantes, das matrizes cromatográficas usadas 
para imobilização dos agentes quelantes e as condições de adsorção e dessorção, buscando 
38 
3. Revisão Bibliográfica 
 
 
 
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017 
 
favorecer a interação entre a proteína e o metal para que alta recuperação e seletividade sejam 
alcançadas (Bresolin et al., 2009). 
 
 
3.7 Endotoxinas 
 
 As endotoxinas são lipopolissacarídeos (LPS) de alta massa molecular, derivados da 
membrana celular de bactérias gram-negativas e são responsáveis pela sua organização e 
estabilidade (Lopes, 2010; Lopes, 2014). A liberação de LPS ocorre durante a morte ou 
multiplicação celular dessas bactérias (Cardoso, 2014). Em indústrias farmacêuticas, é possível 
encontrar endotoxinas durante os processos de produção ou no produto final. Entretanto, a 
presença do LPS mesmo em concentrações muito baixas (<1,0 UE/mL) é indesejável, devido à 
potente reação inflamatória desencadeada por esta molécula, causando graves efeitos 
fisiopatológicos sobre o hospedeiro como choque endotóxico, injúria tecidual e até morte 
(Schädlich et al., 2009). 
 O lipopolissacarídeo é formado pelo núcleo polissacarídico, ao qual se liga a cadeia O-
antigênica e a unidade lipídica A (Lopes, 2014), como mostra a Figura 5. 
 
39 
3. Revisão Bibliográfica 
 
 
 
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017 
 
 
Figura 5 - Estrutura química dos LPS de E. coli O11:B4 de acordo com Ohmo & Morrison 
(1989). Abreviações - Hep: L-glicerol-D-mano-heptose; Gal: galactose; Glc: glicose; KDO: 
ácido 2-ceto-3-deoxioctônico; NGa: N-acetil-galactosamina e NGc: N-acetil-glic. 
 
O lipídeo A é considerado a porção ativa da membrana da bactéria Gram-negativa, 
constituído por um dissacarídeo de glicosamina, sendo altamente substituído por ácidos graxos 
de cadeia longa ligados por ligações do tipo éster ou amida (Fukumori, 2008). Essa região é 
responsável pela maior parte das atividades biológicas da endotoxina, isto é, a sua toxicidade 
(Magalhães et al., 2007). 
A região oligossacarídica possui sua estrutura formada por uma região com o ácido 2-
ceto-3-deoxioctônico (KDO) ligado a heptoses, geralmente L-glicerol-D-mano-heptose (Hep) 
e outra região ligada a hexoses, frequentemente glicose (Glc), galactose (Gal), N-acetil-
galactosamina e N-acetil-glicosamina (NGc) (Erridge et al., 2002). 
A porção O-antígeno geralmente é formada por uma sequência de oligossacarídeos 
idênticos, com unidades repetidas de três a oito monossacarídeos, os quais são específicos para 
40 
3. Revisão Bibliográfica 
 
 
 
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017 
 
cada espécie de bactéria e determinam a sua identidade sorológica, o que permite a classificação 
de mais de 100 sorotipos de E. coli e mais de 1000 de Salmonella (Petsch & Anspach, 2000). 
As endotoxinas apresentam efeitos biológicos muito fortes ao entrar na corrente 
sanguínea de humanos, que vão desde febre e calafrios até hipotensão, síndrome da angústia 
respiratória do adulto, coagulação intravascular disseminada e choque (Gorbet & Sefton, 2005). 
Os antibióticos usados para tratar doenças causadas por bactérias Gram-negativas podem 
quebrar as células bacterianas e isso ocasiona a liberação de LPS, podendo levar a uma piora 
imediata dos sintomas (Magalhães et al., 2007). 
Devido ao potencial tóxico dos LPS, é de extrema importância sua remoção de 
preparações injetáveis e de outros produtos biológicos e farmacêuticos (Lopes et al., 2010). 
Porém, essas moléculas apresentam característica termoestável, ou seja, não é destruída de 
forma eficaz pelos processos de esterilização amplamente utilizados como, por exemplo, o calor 
úmido a 121°C por 30 minutos (Magalhães et al., 2007). Deste modo, diferentes processos têm 
sido desenvolvidos para remover LPS de proteínas, entre eles estão, adsorção por afinidade, 
ultrafiltração, cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica e extração 
por duas fases aquosas. A aplicabilidade desses métodos depende das propriedades da 
biomolécula de interesse (Lin et al., 2005). 
De acordo com estudos realizados por Reichelt et al. (2006), Zimmerman et al. (2006) 
e Sousa Junior (2015), a adição de um detergente não iônico, como o Triton X-114, durante a 
etapa de lavagem dos processos cromatográficos, é uma alternativa eficiente para remoção de 
LPS. 
O tensoativo não-iônico, Triton X-114, auxilia na dissociação da endotoxina de 
proteínas recominantes, proporcionando uma capacidade de separação das fases para a remoção 
da endotoxina dissociada (Aida & Pabst, 1990). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CAPÍTULO IV 
 METODOLOGIA 
42 
4. Metodologia 
 
 
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017 
 
4. Metodologia 
 
Neste item serão apresentados os materiais e as metodologias empregadas para avaliar 
os métodos de rompimento celular e de diferentes metais imobilizados em resina Streamline 
Chelating para purificação do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi, bem como a remoção 
de LPS. 
 
4.1 Material 
 
4.1.1 Adsorvente 
 
A resina Streamline chelating foi utilizada durante os ensaios com IMAC e adquirida 
da GE Healthcare (Uppsala, Suécia). As características desse adsorvente são apresentadas na 
Tabela 1. 
 
Tabela 1 - Principais características da resina Streamline chelating. 
Característica Descrição 
Ligante Ácido iminodiacético (IDA) 
Tamanho médio da partícula 200,0 μm 
 
Variação no tamanho da partícula 100,0 – 300,0 μm 
Densidade média da partícula 1,2 g/mL 
Matriz Ligação cruzada de agarose 6,0 % 
contendo núcleo de quartzo 
pH de trabalho 3,0 – 13,0 
pH de limpeza 3,0 – 14,0 
Grau de expansão a 300 cm/h 2,0 – 3,0 
Condições de estocagem Etanol 20,0 % 
Fonte: adaptado de Amersham Pharmacia Biotech (1997). 
 
4.1.2 Coluna 
 
Uma coluna de vidro especialmente construída para operar em leito expandido, com 
diâmetro igual a 2,6 cm e uma altura de 30,0 cm e equipada com um êmbolo ajustável para 
43 
4. Metodologia 
 
 
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017 
 
minimizar o espaço de topo sobre o leito fluidizado, foi utilizada nos experimentos de ALE. A 
coluna possuía uma régua (escala) na parede externa para registrar a altura do leito. A porção 
inferior da coluna foi preenchida por esferas de vidros para distribuir o fluxo de entrada, 
formando um leito com altura de 4,0 cm. Uma bomba peristáltica, modelo Perimax 12, da 
Spetec, foi utilizada para bombear o