roteiro-aulas-teorico-praticas-imuno-f-2017

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Unesp - UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 
CÂMPUS DE JABOTICABAL 
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS 
Departamento de Patologia Veterinária 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ROTEIRO DE AULAS TEÓRICO-PRÁTICAS EM 
IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA 
 
 
HÉLIO JOSÉ MONTASSIER 
(Professor Titular - Disciplina de Imunologia Veterinária ) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
JABOTICABAL - SP 
- 2017 - 
 
 
 
 
 
Prof. Hélio José Montassier 
FCAV – UNESP - Jaboticabal 
 
1 
 
 
 
ÍNDICE 
Introdução as técnicas de laboratório em Imunologia...................................................... 3 
Preparo de antígenos para imunização de camundongos e cobaias para a obtenção de 
soros precipitantes e aglutinantes.................................................................................... 
 
8 
Purificação parcial dos anticorpos presentes no soro normal através da precipitação da 
fração gama-globulina com sulfato de amônio................................................................ 
 
13 
Purificação de IgG através de cromatografia de troca iônica.......................................... 17 
Reação quantitativa de soroprecipitação.......................................................................... 20 
Caracterização da fração gama globulina precipitada por imunoeletrofores................ 24 
Imunohemólise - experiência de Erlich Morgenroth Modificada.............................. 28 
Técnica de Imunodifusão Dupla em Gel de Agar para Titulação de Soro Anti-Gama 
Globulina..................................................................................................................... 
 
31 
Reação de Soroaglutinação para Titulação de Anticorpos Anti-Hemácias de 
Carneiro....................................................................................................................... 
34 
Método indireto de ELISA para detecção e titulação de anticorpos de cobaia anti-
gamaglobulina bovina..................................................................................................... 
 
37 
Técnicas de SDS-PAGE e de WESTERN-BLOTTING……………………………... 41 
Testes Rápidos de Sorodiagnóstico – Testes Imunocromatográficos 43 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Prof. Hélio José Montassier 
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3 
 
 
 
 
INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS DE LABORATÓRIO EM IMUNOLOGIA 
 
São imprescindíveis para o estudo e o desenvolvimento do conhecimento em 
Imunologia a experimentação e a manipulação de materiais denominados antígenos, cuja 
principal propriedade é a capacidade de induzir respostas imunes (no caso de serem antígenos 
completos) e de reagir com os produtos de tais respostas imunes (sejam antígenos completos 
ou incompletos/haptenos), particularmente com anticorpos. Os antígenos mais utilizados na 
experimentação em Imunologia são provenientes de fontes naturais, como proteínas séricas ou 
de ovos de galinha (soro albumina, gama globulina e ovoalbumina, etc.), eritrócitos 
(eritrócitos de carneiro, eritrócitos de galinha etc.) e microrganismos (bactérias e vírus). A 
maioria desses antígenos naturais possuem muitos sítios antigênicos diferentes, em uma única 
molécula; e se forem considerados os antígenos presentes em uma membrana ou parede 
celular (eritrócitos e bactérias) há um número muito maior de sítios antigênicos, que fazem 
parte da estrutura de cada molécula, a qual faz parte da constituição de tal membrana ou 
parede celular. Os exercícios apresentados a seguir descrevem o preparo de dois tipos básicos 
de preparações antigênicas: um de natureza macromolecular solúvel (soro albumina bovina) e 
o outro de natureza particulada (eritrócitos de carneiro). Deve ser salientado que esses dois 
tipos de antígenos representam dois grupos importantes (um de natureza solúvel e o outro de 
natureza particulada) e para efeito de estudo e experimentação se constituem em ótimos 
modelos de trabalho, substituindo muito bem preparações antigênicas de microrganismos que 
podem oferecer riscos quando são manipulados por indivíduos não experientes. 
 
Principais preparações antigênicas usadas em atividades experimentais em 
imunologia: 
 Antígenos particulados: apresentam dimensão de uma célula e, ao se adicionar 
um diluente apropriado, forma-se uma suspensão. Ex: bactérias e células eucariontes, como 
hemácias (carneiro, galinha). 
 Antígenos solúveis: apresentam dimensão de macro-molécula e, ao se 
adicionar um diluente apropriado, forma-se uma solução. Ex: proteínas (ovoalbumina, 
gamaglobulina) e polissacarídeos. 
 
 
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Tipos de diluentes 
 Solução salina (NaCl 0,15 M) 
 PBS ou Tampão Fosfato Bicarbonato 
 
01. Preparo de suspensão de hemácias de carneiro a 2%: (Antígeno Particulado 
Indutor de Anticorpos Soroaglutinantes). 
Os eritrócitos de uma dada espécie animal revelam propriedades antigênicas marcantes 
quando são injetados em animais de uma outra espécie. Os anticorpos anti-eritrocitários são 
induzidos diretamente contra determinantes antigênicos presentes nas membranas dessas 
células. Essas membranas celulares se constituem, por sua vez, de misturas complexas de 
proteínas fibrosas, lipídeos e mucopolissacarídeos, sendo que os lipídeos são ligados mais ou 
menos firmemente a algumas dessas proteínas. As variações na estrutura molecular das 
proteínas, lipídeos e carboidratos nas membranas celulares dos eritrócitos de diferentes 
espécies animais e mesmo entre indivíduos de uma mesma espécie são os principais 
responsáveis pelo amplo espectro de determinantes antigênicos diferentes que essas células 
apresentam. 
Além de serem usados como antígenos particulados para a produção e titulação de 
anticorpos específicos aglutinantes, os eritrócitos podem ser empregados na montagem da 
técnica de hemaglutinação passiva condicionada e para a detecção de anticorpos contra 
antígenos solúveis que, nesse caso, são ligados à superfície de eritrócitos. 
As suspensões de eritrócitos podem ser padronizadas volumetricamente e 
espectrofotometricamente. A primeira técnica é suficiente para se prepararem suspensões de 
hemácias para serem usadas na imunização de animais, mas a técnica de padronização 
espectrofotométrica é necessária para preparar suspensões de hemácias que são empregadas 
em reações de imuno-hemólise, ou na detecção/titulação de anticorpos hemolíticos, isto é, 
fixadores do complemento. Em virtude de sua grande sensibilidade a mudanças do ambiente 
físico e químico, os eritrócitos recém-colhidos devem ser manipulados com muito cuidado e 
as suspensões preparadas para serem usadas nas titulações de anticorpos não devem ser 
armazenadas por mais de um dia, em temperatura de geladeira. 
 
 
 
1.- Materiais e Métodos: 
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1.1. Sangue de carneiro colhido em solução anti-coagulante de Alsever
1
 (v : v) 
(Figura01) 
1.2. Filtrar em Algodão hidrófilo. 
1.3. Centrifugar a 2500 rpm/4 minutos. 
1.4. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 15 volumes de solução 
salina 0,l5M. (Figura 02) 
1.5. Centrifugar a 2500 rpm/4 minutos. 
1.6. Repetir os ítens l.4. e l.5. mais uma vez. 
1.7. Preparar a suspensão de hemácias a 2% em solução salina(v:v), aferição e 
padronização volumétrica. 
1.8. Para aferição ou padronização espectrofotométrica de uma suspensão de 
eritrócitos a 1%, proceder como no protocolo abaixo descrito: 
1.8.1. Pipete 4 ml de água destilada em 1 tubo e adicione 1 ml de uma suspensão de 
eritrócitos a 2%. Misture bem para promover a lise, invertendo o tubo, previamente coberto 
com papel filme sobre o polegar. 
1.8.2. Leia a densidade óptica(DO) da solução de lisado de eritrócitos contra um 
branco de água destilada, no espectrofotômetro, e no comprimento de onda de 550 nm. A 
seguir, aplique a fórmula abaixo: Vf = Vi x DO / 0,300 e Vf - Vi = Volume de diluente que 
deve ser acrescentado para proporcionar uma suspensão de eritrócitos de carneiro com 
concentração padronizada de 1%. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 01 
 
1
 Tipos de soluções anti-coagulantes: solução de Alsever (citrato de sódio + glicose + NaCl + ácido cítrico), 
oxalato, EDTA, heparina. 
Sangue 
+ 
Anti- Coagulante 
Após 
passos 1.2 
e 1.3 
Sobrenadante 
Salina 
4ml 
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02. Preparo de solução de soroalbumina bovina a l,0% e 5%, considerando que você 
vai usar um volume de 5ml para inocular os animais 
 
(Exercício teórico) (Antígeno Solúvel Indutores de Anticorpos Soroneutralizantes) 
 
03. Técnica de diluições seriadas: 
3.1. Séries com razão constante e diluições sucessivas. Nesta técnica, transferem-se 
volumes sucessivamente de um tubo para outro seguinte, ao qual se adicionou quantidade 
adequada de diluente. 
 
Exemplo 1. Diluições sucessivas com razão constante igual a 2 (figura 03) 
1) Distribuir numa série de tubos com l ml de diluente. 
2) Ao tubo l adicionar l ml do material. 
3) Transferir l ml do tubo l para o tubo 2. 
Figura 02 
4) Transferir l ml do tubo 2 para o tubo 3. 
5) Prosseguir da mesma maneira até o último tubo da série. 
As diluições obtidas serão: l:2; l:4; l:8; l:l6; l:32;l:64 
Exemplo 2. Diluições sucessivas com razão constante igual a l0 (figura 04) 
1) Distribuir 9ml de diluente numa série de tubos. 
2) Ao tubo 1 adicionar 1 ml do material não diluído. 
3) Transferir 1 ml do tubo 1 para o tubo 2. 
1/2 
2 3 4 5 
1ml 1ml 1ml 1ml 
1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 
6 1 
1ml 
Material 
1ml 
1ml de 
salina em 
todos 
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4) Transferir 1 ml do tubo 2 para o tubo 3. 
5) Prosseguir da mesma maneira até o último tubo da série. 
As diluições obtidas serão: 1:10; 1:100; 1:1000; 1:10.000; e 1:100.000. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 03 
Problemas: 
1. Como você faz para diluir um soro a 1/50;1/100;1/200;1/400 e 1/800? 
2. Como você procede para diluir um vírus de 10
-3
 a 10
-8
? 
 
Perguntas: 
1. Qual o procedimento geral para se preparar uma suspensão antigênica bacteriana a 
5%? 
2. Como se faz para preparar uma solução antigênica de gamaglobulina bovina a 0,1%, 
num volume final de 5ml? 
3. Qual das preparações antigênicas acima (exercícios 1 e 2) será usada para a 
obtenção de soros: 
a) Precipitantes b) Aglutinantes 
4. Qual(is) a(s) principal(is) finalidade(s) de se fazer uma escala de diluições seriadas? 
5. O que são: 
a) Solução anti-coagulante de Alsever 
b) Solução salina d) Soro 
c) Plasma e) Solução salina tamponanda 
 
1/10 
2 3 4 5 
1ml 1ml 1ml 1ml 
1/100 1/1.000 1/10.000 1/100.000 
1 
1ml 
Material 
Assunto 01- figura 03 
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PREPARO DE ANTÍGENOS PARA IMUNIZAÇÃO DE CAMUNDONGOS 
E COBAIAS PARA A OBTENÇÃO DE SOROS PRECIPITANTES E 
AGLUTINANTES 
 
ESTUDAR AS BASES DA IMUNOLOGIA 
 
ESTUDAR MODELOS DE FENÔMENOS IMUNOLÓGICOS 
 
Antígeno + Estímulo do Sistema Imune = Resposta Imune (Resposta Imune 
Humoral e/ou Resposta Imune Celular) 
 
Características fundamentais das respostas imunes: 
 Reconhecimento 
 Especificidade 
 Memória 
 
I - PREPARO DE SOLUÇÃO DE GAMA GLOBULINA BOVINA 
1. Preparar uma solução de Gama Globulina Bovina (GGB) a 2 ml/ml. (figura01) 
2. Após a dissolução misturar 1ml da solução de GGB com 1ml de adjuvante completo 
de Freund (ACF) ou com 1ml de adjuvante incompleto de Freund (AIF).(figura 02) 
3. Misturar a solução de GGB com a de hidróxido de alumínio a 2,5% na proporção de 
7 volumes da primeira para 3 volumes da segunda.(figura 03) 
4. Imunizar a cada 15 dias durante 30 dias as cobaias, sendo cada grupo para um 
adjuvante diferente. Imunizar um grupo só com a solução de antígeno sem adjuvante. A via de 
injeção é subcutânea, devendo-se inocular 0,5ml por animal. 
5. Sangrar os animais 2 semanas após o início e, ao final, l semana após a 
reimunização. Separar os soros, nos 2 casos e fazer a titulação deles por imunodifusão dupla 
em gel de ágar. 
 
 
 
 
 
 
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5ml da solução 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1ml de ACF ou 1ml deAIF 
 
 
 
 
 7 volumes de GGB 3 volumes de Hidróxido 
 de sódio 
Figura 04 
 
 
 
 GGB a 2mg/ml 
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II - PREPARO DE SUSPENSÃO ANTIGÊNICA DE ERITRÓCITOS DE 
CARNEIRO 
1. O sangue é retirado previamente com anticoagulante (solução de alsever) de um 
carneiro, conforme o descrito no roteiro anterior. (figura 04) 
2. Passar o sangue colhido por um funil com algodão hidrófilo. 
3. Recolher o sangue filtrado e centrifugá-lo a baixa rotação por 5 minutos. 
4. Dispensar o sobrenadante com pipeta pasteur ou com trompa de vácuo. 
5. Colocar cerca de l0ml de salina, homogeneizar e centrifugar novamente, para lavar 
as hemácias. 
6. Repetir os ítens (4) e (5) mais 2 vezes, ou até quando o sobrenadante estiver claro. 
7. Preparar a suspensão de hemácias a l0% (v/v) em solução salina. Homogeneizar 
bem. 
8. Injetar 3 grupos de camundongos de 5 camundongos cada, por via subcutânea 
(0,1ml/animal). Em 5 camundongos injetar hemácias de carneiro com adjuvante completo de 
Freund, em outros 5 camundongos injetar a mistura de hemácias de carneiro mais adjuvante 
incompleto de Freund e nos outros 5 camundongos restantes injetar a suspensão de hemácias 
sem adjuvante. (figura 05) 
9. Repetir as imunizações depois de l5 dias, e sangrar 20 dias depois da última 
imunização. (figura 06) 
 
Figura 05 
 
 
 
 
Hemácias Hemácias Hemácias 
 + + sem Adjuvante 
ACF Grupo 1 AIF Grupo 2 Grupo 3 
Figura 06 
 
Sangue 
+ 
Anti- Coagulante 
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Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 
0,1 ml 0,1 ml 0,1ml 
 
 
 
 
 
Figura 07 
 
Espera-se que ocorra: 
Antígeno Sistema Imunológico Respostas Imunológicas 
 Estímulo 
Figura 08 
 
 
Inoculados 
Organismos 
Macrófagos ou Células 
dendríticas 
Fragmentos 
Peptídicos 
Lisossoma 
Antígeno 
MHC II + Fragmentos 
Peptídicos 
B 
T 
Fragmentos 
Peptídicos 
Lisossoma 
Estímulo Secundário 
1ª Etapa 
2ª Etapa 
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12 
 
 
Principais fatores que interferem na imunogenicidade dos Ags: 
 Peso molecular 
 Complexidade molecular 
 Concentração 
 Digestibilidade 
 
Adjuvantes 
São imunomodeladores, ou seja, substâncias capazes de potenciar, inespecificamente, 
as respostas imunes contra os antígenos. 
Tipos: 
 Minerais – Ex: Al(OH)3, óleo mineral/emulsionante (Adjuvante Incompleto de 
Freund – AIF) 
 Orgânicos – Ex: Saponina, óleos vegetais e lecitina de soja 
 Produtos derivados de microrganismos – Ex: bactérias (Mycobacterium spp.; 
Propyonabacterium acnes; bactérias gram negativas - LPS), fungos (Sacharomyces cerevisae 
- Glucana) 
OBS: O Adjuvante Completo de Freund (ACF) é composto de óleo mineral + 
emulsionante + Mycobacterium spp. 
Efeitos principais dos Adjuvantes: 
 Efeito depósito 
 Aumentar resposta inflamatória no local da inoculação 
 Ativação de células imunocompetentes ou apresentadoras de antígenos 
 
PERGUNTAS 
1. Em quais formas principais podem-se apresentar os antígenos e qual a natureza 
química deles? 
2. O que são adjuvantes, quais as principais formas e para queeles são usados? 
3. Quais as principais vias de administração de um antígeno no organismo normal? 
4. Por que são feitas várias inoculações de um antígeno, durante o processo de 
imunização? 
5. Após o término da imunização, qual a modalidade de Resposta Imune que será 
avaliada? 
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 PURIFICAÇÃO PARCIAL DOS ANTICORPOS PRESENTES NO SORO 
NORMAL ATRAVÉS DA PRECIPITAÇÃO DA FRAÇÃO 
GAMA-GLOBULINA COM SULFATO DE AMÔNIO. 
 
 
1. INTRODUÇÃO - GENERALIDADES 
 
Para estudar a estrutura dos Acs é necessário purificá-los previamente. Tal purificação 
é de grande interesse prático, pois diminui consideravelmente as reações produzidas pelos 
soros quando eles são utilizados com finalidades profilática ou terapêutica. 
Os métodos usados para purificação dos Acs se filiam a duas modalidades: métodos 
não específicos e específicos. Os primeiros se baseiam em técnicas de fracionamento físico ou 
físico-químico e não permitem separar as gamaglobulinas normais dos Acs. Os métodos 
específicos, por outro lado, baseiam-se na dissociação ou eluição dos imunocomplexos e 
permitem obter os Acs em alto grau de pureza, livres de imunoglobulinas (Igs) inespecíficas. 
São os métodos de escolha para estudos experimentais, porém, não podem ser aplicados aos 
soros terapêuticos em virtude de baixo rendimento inerente ao processo de purificação. 
O método de precipitação com sais neutros ("Salting-out") é de uso corrente e utiliza, 
sobretudo, o sulfato de amônio e o sulfato de sódio. 
De modo geral, quando se deseja precipitar todas as globulinas de um soro sanguíneo, 
adiciona-se sulfato de amônio a 50% de saturação ou sulfato de sódio a 22% de saturação (a 
37ºC) permanecendo solúvel apenas a fração albumina. Outra maneira é precipitar as frações 
Gama e Beta globulina que contêm praticamente a maior parte das proteínas com função de 
Acs com sulfato de amônio a 40% de saturação ou com sulfato de sódio a l9% de saturação (a 
37ºC). 
No nosso caso, será utilizado o método de precipitação das frações gama e beta 
globulina com sulfato de amônio a 40% de saturação. 
 
 
 
 
 
 
 
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14 
 
 
2. MATERIAL 
- 5ml de soro sanguíneo 
- 5ml solução salina tamponada com fosfatos (PBS) 
- solução de sulfato de amônio a l00% de saturação 
- becker de 50ml 
- pipeta de lml, 2ml, 5ml, l0ml 
- tubos cônicos plásticos de centrífugas 
- bastões de vidro pequenos e grandes 
- provetas de 25, 50ml e 1000ml 
- saco de diálise, cordonê 
- becker de 2 litros 
- pipeta pasteur e tetina 
- erlenmeyer de 125 e 250 ml 
 
 
 
 
Figura 09 
 
3. MÉTODOLOGIA 
 
3.1. Juntar 5ml de soro com 5ml de P.B.S. 
 
3.2. Calcular o volume de sulfato de amônio a l00% de saturação que deverá ser 
acrescentado a mistura de soro mais P.B.S. no volume final de l0ml; volume de sulfato de 
amônio a l00% de saturação onde: 
 
V - volume final de soro + PBS 
C - A saturação do sulfato de amônio desejado (40%) 
 
V x C 
 X = ------- 
 l00-C 
 
10ml de 
solução 
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15 
 
 
3.3. Sob agitação cuidadosa, acrescentar gota a gota o volume calculado do sulfato de 
amônio a l00% de saturação, para dar uma saturação final de 40%. 
 
 
 
 
 
 
Figura 10 
 
 
3.4. Continuar agitando por mais 30 minutos. 
3.5. Transferir o volume para os tubos de centrífuga e levar a centrífuga a 3000rpm 
por l5 minutos. 
 
 
 
 
 
 
Figura 11 
 
3.6. Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento com solução de sulfato de amônio a 
42% de saturação, isto é deve-se centrifugar e descartar o sobrenadante, ressuspender com 
cuidado o sedimento na solução de sulfato de amônio a 42% de saturação. 
 
Obs.: Cálculo da solução do sulfato de amônio a 42% de saturação: 
X = V x C X = Vol. de sulfato de amônio a 100% de saturação 
 100 - C 
 
X = 30 x 42 V = Vol. desejado da solução (30 mL) 
 100 – 42 
 C = Saturação final do sulfato de amônio (42% de saturação) 
X = 21,72 mL de sulfato de amônio a 100% de saturação + 30 mL de água destilada 
Soro + PBS 
Proteínas solúveis 
Proteína 
 O 
 H H 
Proteína / 
Globulinas 
Camada de Solvatação 
+ Sulfato de Amônio 
Precipitação das Globulinas 
Remoção da Camada de Solvatação 
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Figura 12 
3.7. Após a última lavagem, descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 
1 mL de PBS com cuidado e com o uso de pipeta Pasteur. 
3.8. O sedimento ressuspenso deve ser colocado dentro do saco de diálise, esse deve 
ser fechado e se coloca para dialisar contra salina. Deixa-se dialisar por 2 dias a 4ºC, com 
duas trocas de líquido de diálise ao dia. 
4. Retira-se a fração precipitada do saco de diálise e guarda-se em congelador a -20ºC 
para ser testada por imunodifusão. 
 
PERGUNTAS 
 
1) O que são imunoglobulinas e quais as suas principais propriedades físico-químicas 
e biológicas? 
2) Qual o objetivo de se purificar anticorpos? 
3) Como atua o sulfato de amônio sobre moléculas de imunoglobulinas e por que é 
importante se conhecer o grau de saturação sulfato de amônio para fazer a separação das 
imunoglobulinas? 
4) O que é diálise, e por que esse processo é empregado nesse caso? 
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PURIFICAÇÃO DE IgG ATRAVÉS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA 
IÔNICA 
 
1.- INTRODUÇÃO E GENERALIDADES 
 
São reconhecidos, no mínimo, dois métodos diferentes que podem ser usados, 
separadamente ou combinados, para se obter uma preparação de IgG ou de IgM com grau de 
elevada pureza. Um desses métodos é a cromatografia de troca iônica e o outro é a filtração 
em gel. A cromatografia de troca iônica é um dos métodos mais conhecidos para se fazer a 
separação de proteínas séricas e o isolamento de imunoglobulinas. Esse método se 
fundamenta no fato de as proteínas apresentarem cargas elétricas e poderem se ligar 
eletrostaticamente na matriz de troca iônica, a qual possui uma carga oposta à das proteínas. A 
força de interação com que as proteínas se ligam a esse tipo de matriz de troca iônica depende 
da densidade de cargas elétricas da proteína bem como do pH e da força iônica do meio onde 
a proteína se encontra. Dessa forma, para se eluir (“desligar”) as proteínas adsorvidas 
eletrostaticamente a esse tipo de matriz, deve-se aumentar a força iônica do meio, 
aumentando-se a concentração dos sais do tampão de eluição, uma vez que os sais 
adicionados vão competir com as proteínas pelos sítios carregados dessa mesma matriz. Outra 
forma de se promover a eluição é alterar o pH do tampão de eluição, pois, à medida em que o 
pH do meio onde se encontra a proteína se aproxima do ponto isoelétrico dessa mesma 
proteína, a somatória da carga elétrica da mesma se aproxima de zero, de forma que essa 
proteína perde a capacidade de continuar ligada à matriz de troca iônica. 
Há dois tipos básicos de matrizes de troca iônica: uma delas é recomendada para a 
interação com proteínas carregadas positivamente, sendo a matriz trocadora de cátions, como 
é o caso do carboxi-metil-celulose (CM-celulose), enquanto que o outro tipo é recomendado 
para a interação com proteínas carregada negativamente, sendo a matriz trocadora de ânions, 
como o dietil-amino-etil-celulose (DEAE-celulose). No caso de se fazer a separação de IgG, a 
resina ou matriz recomendada é DEAE-celulose. 
O método mais indicado para se conseguir um melhor grau de pureza e de rendimento 
da fração IgG é se fazer primeiramente a precipitação da fração gama-globulina de um soro 
sanguíneo com sulfato de amônio ou sulfato de sódio, tal como foi feito na aula anterior. Essa 
fração gama globulina depois de dialisadapara se eliminar o excesso de sais usados na 
precipitação, depois de ter a sua concentração protéica determinada, é colocada em uma 
coluna previamente montada de DEAE – celulose. 
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18 
 
 
2.- Método para preparação da coluna deDEAE–celulose para a separação de Ig G 
2.1.- Materiais 
2.1.1- DEAE – celulose previamente embebido e carregado por tratamento com 
soluções de ácido (HCl) em seguida álcali (NaOH). 
2.1.2- Fração gamaglobulina previamente precipitada com sulfato de amônio e 
dialisada com o mesmo tampão de eluição a ser usado na coluna de DEAE – celulose. A 
concentração protéica dessa coluna deve ser previamente determinada. 
2.1.3.- Coluna cromatográfica pequena (seringa de 10ml) já montada e preparada para 
ser preenchida com DEAE-celulose e acompanhada de cânulas de pequenas pinças para 
regulagem do fluxo da coluna. 
2.1.4.- Tampão fosfato 0,01M pH 8,0. 
2.1.5.- Frascos pequenos de coleta (frascos do tipo penicilina), rotulados com a 
numeração de 1 a . 
 
2.2.- Método 
 
2.2.1.- Deixe o volume de tampão imediatamente acima da coluna abaixar abrindo 
cuidadosamente a coluna, e aproveite para regular o fluxo da coluna para 12 gotas por minuto. 
Quando não houver mais tampão acima da resina e com a coluna fechada, deve ser adicionada 
a solução de gama globulina, com muito cuidado e com o auxílio da micropipeta. Em seguida, 
abrir vagarosamente a coluna para deixar o solução de gama globulina entrar na resina, 
fechando a coluna quando isso ocorrer. Adicionar, a seguir, com muito cuidado, um volume 
de tampão de eluição. Conectar com o frasco de tampão com cânula e sifonado de modo a 
permitir um fluxo continuado de tampão para a coluna de resina. Abrir o fluxo da coluna, 
começar a colher as frações de 3 ml cada uma, aferindo o fluxo novamente para 12 gotas por 
minuto. 
2.2.2.- Faça a leitura das frações colhidas em espectrofotômetro UV, no comprimento 
de onda de 280nm, contra um branco de tampão fosfato 0,005M pH 8,0. 
2.2.3.- Faça um pool das frações com maior concentração proteíca e armazene a -20ºC 
para ser testada na próxima aula, por imunoeletroforese. 
 
 
 
 
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19 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 13 
 
PERGUNTAS 
1.- Qual o fundamento do processo de purificação de IgG por cromatografia de troca 
iônica? 
2.- A obtenção de IgG em alto grau de pureza poderia contribuir em quais aspectos ou 
em que técnicas ? 
3.- Que outros métodos são também indicados para a separação de imunoglobulinas 
em elevado grau de pureza? 
4.- Para a separação de IgG é indicado o uso de coluna cromatográfica trocadora de 
ânions (DEAE-celulose). No caso da necessidade de separar uma proteína com cargas opostas 
a da IgG, qual resina seria então recomendada? 
 
 
 
 
 
Gama-Globulina 
3ml 
12 gotas/min 
Assunto 04- figura 01 
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REAÇÃO QUANTITATIVA DE SOROPRECIPITAÇÃO 
 
Uma das primeiras observações da interação antígeno-anticorpo (Ag-Ac) é a formação 
de precipitados que aparecem em um tubo de reação em meio líquido depois que tais 
reagentes tenham-se combinado em determinadas proporções relativas. 
 A reação quantitativa de soro-precipitação se fundamenta nesse fato. Este teste se 
constituiu com base de todos os estudos que foram feitos sobre os fenômenos decorrentes da 
interação Ag-Ac. 
 Nesse tipo de reação, via de regra, quantidades crescentes de Ags são adicionadas a 
diferentes tubos de ensaio apropriados contendo uma concentração constante de Ac e, ao 
final, são determinadas as concentrações do precipitado Ag-Ac formado em cada tubo da 
reação. 
Nesse experimento, você determinará: 
 a-) A concentração de Acs de um soro teste 
 b-) O número de determinantes antigênicos (sítios que ligam os anticorpos) presentes 
em uma molécula de Ag. 
Materiais: 
 Soro de Coelho anti-BSA com um título desconhecido (concentração) - fonte de 
Acs. 
 Soro Albumina Bovina (4mg/ml) - o Ag. 
 Salina tamponada com fosfatos (PBS) pH 7,2. 
 NaOH 0,1M. 
 8 tubos de ensaio para precipitação. 
 Micropipetadores de volume ajustável de 1000, 100 e 10l. 
 Banho-Maria 
 Geladeira 
 Espectrofotômetro UV e cuvetas de quartzo para UV. 
Metodologia: 
 Marque cada um dos tubos de uma série de 6 com o volume de Ag que será a ele 
adicionado. 
 Adicone os seguintes volumes de Ag em cada tubo: 0, 5, 20, 35, 50, 100l. 
 Adicione PBS a cada tubo para completar um volume de 300 l. 
 Adicione 100µl de antissoro a cada tubo e misture bem. 
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21 
 
 
 Incube por 1h a 37ºC em Banho-Maria e a seguir a 4ºC em geladeira por 1h. 
 Centrifugue os tubos testes a 4000 (2000g) rpm/10 min. 
 Remova o sobrenadante e transfira-o para um outro tubo devidamente identificado 
como estava o tubo inicial. 
 Conserve o precipitado (pellet). 
Para calcular a concentração de Ac no antissoro: 
 Lave o precipitado, ressuspendendo-o em PBS e re-centrifugando a 4000 (2000g) 
rpm/10 min. 
 Remova o PBS do sobrenadante e descarte-o. 
 Ressuspenda o pellet colocando cada um dos tubos em um vórtex. 
 Adicione 1ml de NaOH 0,1M a cada precipitado e leve para solubilizar no vórtex e 
conserve mais 1ml de NaOH 0,1M para servir como branco no espectrofotômetro. 
 Faça a leitura da absorbância no comprimento de onda de 280nm (A280) em um 
espectrofotômetro UV. 
Calcule a quantidade de Acs específicos contra BSA/ml de antissoro: 
 A partir do gráfico, anote a quantidade de antígeno no ponto de equivalência, (o 
ponto onde a quantidade máxima de precipitado se forma). Vide o exemplo abaixo: 
 
a) A280 = 0,100  0l de Ag. 
b) A280 = 0,370  5l de Ag. 
c) A280 = 0,850  20l de Ag. 
d) A280 = 1,08  35l de Ag***. 
e) A280 = 0,740  50l de Ag. 
f) A280 = 0,170  100l de Ag. 
 
 Quantidade de Ag usado = 0,035ml (= 35l) x 4 (mg/ml BSA) = 0,140mg. 
 Transformar essa quantidade de antígeno em A280nm, considerando que 1,9mg/ml 
de BSA dá um A280nm = 1,0, então (0,140 x 1)/1,9= 0,073. 
 Subtraia este valor da A280nm total do precipitado para obter a A280 da concentração 
de Ac: A280 / Ac = A280(ppt) - A280(Ag). 1,08 – 0,073 = 1,007 
 Transformar essa A280nm em quantidade de anticorpo, isto é IgG (mg/ml), 
considerando que 0,7 mg de IgG corresponde a uma A280 = 1,0, você pode calcular 
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22 
 
 
a concentração de Acs no ponto de equivalência (não se esqueça de levar em conta 
todas as diluições que foram feitas): 
 A280 (Ac) = 1,08 (= A280(pptado.) - 0,073 (=A280(Ag) = 1,007. 
 1,007 x 0,7 (mg IgG=A280 1,0) = 0,705mg. 
 100µl de antissoro foram usados em cada tubo, portanto a concentração de 
anticorpos no soro original é 0,705 x 10= 7,05mg/ml. 
 
Estimativa do Número de Determinantes Antigênicos na Molécula de Soroalbumina 
Bovina: 
O número de determinantes antigênicos em cada molécula de Ag pode ser estimado 
quando se considera que em uma condição de extremo excesso de anticorpos todo 
determinante antigênico vai estar ligado com pelo menos uma molécula individual de Ac. Se a 
quantidade de Ac no precipitado formado sob essas circunstâncias é calculada, então os 
números relativos de moléculas de Ac e Ag podem ser calculados, isto é: 
 
 
 
Em soros hiperimunes a maior parte dos Acs são do isótipo IgG que tem P.M de cerca 
de 150.000 D. O Ag, BSA, apresenta um P.M. de 68.000. A relação entre as concentrações 
molares de Ac para a molécula de Ag na sua menor concentração de Ag fornecerá uma 
estimativa do número de determinantes antigênicos presentes em uma determinada molécula 
de Ag. 
 
 
 
 
 
 
Portanto há 2 sítios ligantes na molécula de Ag (BSA), considerando um erro 
experimental de aproximação de 2,28 para 2.Concentração de Ag : Concentração de Ac 
 P.M. Ag P.M. Ac 
Concentração de Ag : Concentração de Ac 
 P.M. Ag P.M. Ac 
= 0,14 : 0,705 . 
 68.000 150.000 
 
 2,058 Moles BSA : 4,693 Moles IgG 
Razão = 1 : 2,28, ou 
aproximadamente 1 : 2 
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23 
 
 
PERGUNTAS 
 
1.- Como os Ags e Acs interagem? 
 
2.- Responda verdadeiro (V) ou falso (F): 
a) A maioria dos Acs reage com estruturas topográficas que dependem da conformação nativa 
da molécula do Ag (epítopos conformacionais) ( ) 
b) Ags e Acs interagem através de ligações covalentes. ( ) 
c) Cada determinante antigênico em uma molécula de Ag representa um agrupamento de 
epítopos dominantes. ( ) 
d) As forças de ligação que mantém ligado um Ag a um Ac são inversamente proporcionais à 
distância entre essas moléculas. ( ) 
e) A especificidade do reconhecimento do Ac para o Ag é absoluta. ( ) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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24 
 
 
- + 
- + 
CARACTERIZAÇÃO DA FRAÇÃO GAMA-GLOBULINA PRECIPITADA 
POR IMUNOELETROFORESE. 
 
1) REAÇÃO DE DE IMUNOELETROFORESE DE FRAÇÃO PURIFICADA 
DE ANTICORPOS 
 
1.1. Introdução e Generalidades 
A imunoeletroforese é a combinação de eletroforese e de dupla difusão em gel de ágar; 
é uma técnica que permite a discriminação de substâncias com base na carga elétrica, peso 
molecular, tamanho, forma, concentração e propriedades antigênicas. O método original de 
Grabar e William (l953-54) é feito em gel de ágar, procedendo-se na primeira etapa à 
separação eletroforética dos componentes e, a seguir, cada componente se difunde, a partir de 
seu centro de difusão, contra o imune-soro, formando, como na dupla imunodifusão, uma 
linha ou arco de precipitação. 
Somente na eletroforese teríamos: 
 
 
 
 
Posição do soro antes da eletroforese 
 
 
 
 
 Posição do soro após a eletroforese 
 
 
 
 
 Albumina Alfa Beta Gama 
 
 
Figura 15 
 
Centro 
Gama-
Globulina 
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25 
 
 
 
Assim, este método permite a caracterização de uma substância simultaneamente por 3 
parâmetros: 
a) Características eletroforéticas (mobilidade em campo elétrico) 
b) Velocidade de difusão (coeficiente de Difusão) 
c) Especificidade imunoquímica (estrutura e composição dos determinantes 
antigênicos). 
Este método é atualmente aplicado a todos os ramos da pesquisa biológica, por seu 
alto poder resolutivo, bastando mencionar que, enquanto a eletroforese permite a evidenciação 
de 5 a 6 componentes no soro sanguíneo, a imunoeletroforese permite distinguir cerca de 30 
componentes. Não se trata de maior sensibilidade, mas de maior poder discriminativo. 
No micro-método são aplicados 2 a 5ul de soro sanguíneo ou de mistura protéica no 
orifício do gel. Ao se passar a corrente elétrica, o soro se separa nos 5 componentes clásicos 
da eletroforese de Tiselius: Albumina, Alfa-l, Alfa-2, Beta e Gama-globulinas de acordo com 
suas cargas elétricas. Em função de seus coeficientes de difusão e da concentração, cada 
componente difunde-se encontrando o Ac que lhe corresponde, forma-se um precipitado em 
forma de arco de maior ou menor curvatura dependendo da dispersão dos Ags e cuja 
intensidade é função da concentração do Ag e também da relação Ag/Ac. 
 
1.2. Material 
a) Solução de Bacto Ágar (Difco) a 1% em tampão Tris-Acetato pH 8,2 e 
força iônica = 0,06; 
b) Lâminas de Microscopia; 
c) Pipetas de 5ml; 
d) Micropipetadores e ponteiras para 10ul e 50ul; 
e) Molde perfurador para imunoeletroforese; 
f) Bomba de vácuo aplicada com kitassato, cânulas e pipetas Pasteur; 
g) Placa de Preti com gaze umidecida e suportes para lâminas (Câmara 
úmida); 
h) Tampão tris-acetato pH 8,2 e força iônica de 0,113; 
i) Fonte e cuba para eletroforese; 
j) Antissoros anti-proteínas totais séricas de bovinos e de cobaias; 
l) Tiras de papel de filtro; 
m) "Cotonete" com gaze; 
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26 
 
 
 
1.3. Técnica 
a) Fundir o ágar em água fervente; 
b) Aplicar com um cotonete sobre a lâmina uma camada de ágar, esperar secar; 
c) Colocar, com pipeta, 2ml de ágar sobre as lâminas previamente revestidas com ágar 
e tomar cuidado para não formar bolhas nem deformidades, esperar esfriar e solidificar; 
d) Com o molde perfurador adequado, fazer os orifícios no gel e, em seguida, retirar os 
fragmentos de ágar com a trompa de vácuo; (figura 03) 
e) Cortar tiras de papel de filtro da largura da lâmina para fazer a ponte entre o tampão 
e as lâminas; 
f) Montar dentro da cuba, previamente preenchida com tampão, as lâminas, fazendo as 
pontes entre os polos de cuba com tiras de filtro; 
g) Aplicar em cada cavidade do ágar de 5 a 10ul da amostra a ser submetida à 
eletroforese; 
h) Fechar a cuba, ligar a fonte e regular a corrente para 6ml/lâmina, o que dá cerca de 
50v/lâmina. Deixar a corrida prosseguir por 2h; (figura 04) 
i) Desligar a fonte e retirar as lâminas. Em seguida, remover, com o auxílio da tampa 
de vácuo, a canaleta de gel e adicionar dentro da canaleta o antissoro específico; 
j) Levar as lâminas, com cuidado, para a câmara úmida e fazer a leitura 24-48 horas 
depois; 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 16 
 
 
IgG Bovina 
Soro Total 
Bovino 
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 Albumina alfa beta Gama 
Figura 17 
 
PERGUNTAS 
1) Como podemos identificar imunologicamente a fração gama-globulina precipitada 
e da IgG purificada por cromatografia de troca iônica? 
2) Quais os princípios da prova de imunodifusão dupla em gel de ágar e qual a sua 
utilidade dentro da imunologia e, nesse caso, em particular? 
3) Quais os princípios da prova de imunoeletroforese e qual a sua principal utilidade 
dentro da imunologia e, nesse caso, em particular? 
4) Qual dessas 2 técnicas (Imunodifusão dupla em gel de ágar e Imunoeletroforese) 
fornece respostas mais completas e esclarecedoras, a respeito das características 
imunoquímicas de uma mistura antigênica? 
V 
+ - 
Fonte de Energia 
Tampão 
de Corrida 
Papel 
IgG Bovina Soro Total 
Bovino 
Soro anti 
soro bovino 
IgG 
Assunto 05- figura 04 
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IMUNOHEMÓLISE - Experiência de Erlich Morgenroth Modificada 
 
I. OBJETIVOS 
 
Demonstrar os elementos que participam da reação de imunohemólise de hemácias de 
carneiro: (figura 01) 
(Ag) Antígeno - Hemácias de carneiro (E) 
(Ac) Anticorpos - Hemolisina de coelho anti-E 
(C) Complemento - Soro normal de cobaia 
 
 
 
 
 
Figura 18 
 
 
II. MATERIAL 
l) Estante para tubo de hemólise (l2x75mm) 
2) 3 tubos de ensaio l2x75mm 
3) 4 pipetas de lml com graduação centesimal 
4) Suspensão de hemácias de carneiro a 5% 
5) Hemolisina (já diluída) 
6) Complemento (soro normal de cobaio) já titulado 
7) Solução fisiológica 
 
III. TÉCNICA 
 
l) Numerar os tubos l, 2 e 3 
2) Pipetar 0,lml de suspensões de hemácias nos 3 tubos 
3) Pipetar 0,lml de hemolisina nos tubos l e 2 
4) Pipetar 0,5ml de complemento nos tubos l e 3 
5) Pipetar solução fisiológica: (figura 02) 
 
C 
Ac 
Ag 
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29 
 
 
 - 0,8ml no tubo l 
 - l,3ml no tubo 2 
 - 0,9ml no tubo 3 
6) Incubar em B.M. a 37ºC por 30 minutos 
 1 2 3 
 
 
 
 
 
Figura 19 
 
 
IV - RESULTADOS E INTERPRETAÇÃO 
 
Uma vez realizada a leitura da experiência procedente, prosseguir do seguinte modo: 
(figura 03) 
7) Centrifugar os tubos 2 e 3 
8) Abandonaro sobrenadante do tubo 2 
9) Decantar o sobrenadante do tubo 3 sobre as hemácias do tubo 2 e agitar este tubo 
para ressuspender as hemácias 
10) Sobre o sedimento do tubo 3, colocar hemolisina (0,lml) e solução salina (l,3ml). 
Agitar para ressuspender as hemácias 
11) Incubar os tubos 2 e 3 em B.M. a 37ºC por 30 minutos (figura 04) 
 
 
 
 
 
Solução Tampão 
Complemento 
 Hemolisina 
Hemácia
s 
0,5ml 
0,8ml 
0,1ml 
0,1ml 
1,3ml 
0,1ml 
0,1ml 
0,5ml 
0,9ml 
 
0,1ml 
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30 
 
 
 
 
 
 
 
 Figura 20 Tubo 1 Figura 21 Tubo 2 
 
 
 
 
 
 Figura 22 Tubo 3 
 
 
V. RESULTADOS FINAIS E INTERPRETAÇÃO 
 
 2 3 
 
 
 
 
 
 Tubo 2 Tubo 3 
Figura 23 
 
 PERGUNTAS 
 
1) Quais os elementos que participam de uma reação de imunohemólise e qual o papel 
de cada um deles nessa reação? 
2) O que é Sistema Complemento? 
3) Em que circunstâncias o Sistema Complemento é ativado na ausência de 
anticorpos? 
4) Explique o que ocorreria com a reação de imunohemólise se o soro normal de 
cobaia tivesse sido incubado por 30 min a 56ºC? 
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31 
 
 
TÉCNICA DE IMUNODIFUSÃO DUPLA EM GEL DE AGAR PARA 
TITULAÇÃO DE SORO ANTI GAMA-GLOBULINA 
 
Imunodifusão: Termo utilizado para designar testes sorológicos realizados em meio 
gelificado, no qual os reagentes só se misturam por difusão. 
Este teste foi introduzido para substituir o teste de precipitação em meio líquido, que 
tem alguns inconvenientes, por um teste de difusão e precipitação em gel de ágar que tem 
algumas vantagens. 
- Difusão simples em uma dimensão - Oudin 
- Difusão dupla em duas dimensões - Ouchterlony 
Dupla difusão em gel de ágar: Reação de precipitação entre o Ag e o Ac específico 
em meio gelificado, onde ambos os reagentes se difundem um contra o outro, formando uma 
linha ou arco de precipitação (figura 01) na área de reação. 
Essa técnica permite avaliar com relativa facilidade os "componentes antigênicos" 
encontrados em misturas complexas. Permite também revelar se duas ou mais substâncias são 
imunologicamente idênticas ou independentes. 
Essa prova geralmente é feita sobre lâminas de microscopia ou placas de Petri, 
revestida com uma camada de gel de ágar em solução fisiológica ou tamponada. Vários 
fatores influem na velocidade da difusão, entre as quais, o tamanho dos poros de gel, a 
temperatura, a concentração e pureza do ágar e, os mais importantes, as concentrações das 
substâncias reagentes e o tamanho e forma molecular dos reagentes. 
 
 
 
 
 
 
 Figura 26 
 
 
 
 
Material 
 
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32 
 
 
1) Solução de ágar a l% em solução fisiológica 
2) Lâmina de microscopia 
3) Pipeta graduada de 5ml 
4) Micropipetadores de 10 e 20 ul 
5) Solução do Ag (Gama Globulina a lmg de proteína por/ml) 
6) Soros de cobaios imunizados com Gama Globulina e adjuvante completo de Freund 
ou com adjuvante incompleto de Freund ou com Al(OH)3 mais saponina e com Al(OH)3 
contendo, portanto, Acs anti-Gama Globulina. 
7) Molde perfurador de ágar 
8) Placas de Petri com algodão umidecido (Câmara úmida) 
9) l5 tubos de hemólise e estantes 
10) Pipetas de lml 
11) Solução salina 
 
Metodologia: 
 
1) Fundir o ágar em banho-maria de água fervente; 
2) Aplicar com cotonete sobre a lâmina uma camada de ágar. Esperar secar; 
3) Colocar, com a pipeta, 3ml de ágar sobre as lâminas previamenrte revestidas com 
cuidado para não formar bolhas, nem deformidades. Esperar esfriar e solidificar. Manter as 
lâminas em câmara úmida para não dessecar o gel; 
4) Com o molde perfurador adequado, fazer os orifícios no gel e, em seguida, retirar os 
fragmentos de ágar com uma agulha hipodérmica. Manter a lâmina em câmara úmida para 
evitar o dessecamento do gel; 
5) Diluir os soros de cobaio anti-gama globulina a l/2, l/4, l/8, l/l6 e l/32, distribuindo 
em cada um dos 5 tubos 0,5ml de solução salina e, depois, no lº tubo colocar 0,5ml de soro. 
Homogeneizar bem e passar 0,5ml para o 2º tubo e assim sucessivamente até o último tubo; 
6) Aplicar, usando um micropipetador, 10 ul para cada amostra, Ag, gama globulina 
(lmg/ml), as diluições do soro de cobaio anti-gama globulina de acordo com o seguinte 
esquema (figura 02): 
 
 
 
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33 
 
 
0,5ml salina 0,5 ml salina 0,5ml salina 0,5ml salina 0,5ml salina 
0,5ml soro 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Figura 27 
 
No centro, colocar o Ag (Solução de gamaglobulina na concentração de 1mg/ml), nos 
poços numerados e periféricos, colocar o soro: no nº lº - soro puro, nº 2 - soro diluído 1/2, n
o
 3 
- diluído1/4, nº 4 – diluído 1/8, n
o
5 – diluído 1/16 e no n
o
 6 – diluído 1/32. (figura 02) 
7) Colocar a lâmina dentro de uma placa de Petri com um algodão molhado dentro 
para manter a umidade; 
8) Fazer a leitura após 24-48 horas, anotando até que diluição houve reação. 
 
PERGUNTAS 
1) Que tipos de antígenos são revelados pela reação de soroprecipitação? 
2) Qual o mecanismo da reação de soroprecipitação? 
3) Quais as utilidades do emprego da reação de imunodifusão dupla em gel de Agar, 
em medicina veterinária? 
4) Como se faz para titular anticorpos de um soro precipitante?
1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 
0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 
1/2 
1/4 
1/8 
1/16 
1/32 
Soro puro 
Ag 
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REAÇÃO DE SOROAGLUTINAÇÃO PARA TITULAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-
HEMÁCIAS DE CARNEIRO 
 
As reações de aglutinação são reações de floculação celular em que o antígeno é 
constituído por suspensão homogênea de células. Estas células podem ser bactérias, hemácias 
etc, que normalmente são vistas no microscópio, mas quando aglutinadas, elas formam flocos 
ou flóculos que são aglomerados visíveis a olho nu. Um dos requisitos essenciais para se 
proceder a reação de aglutinação é que se possua uma suspensão celular estável. É óbvio, 
também, que tal reação se verifica somente com antígenos que estão situados na superfície 
celular. 
Características dos antígenos e anticorpos envolvidos na reação de soroaglutinação: 
 Antígenos aglutinantes – de natureza particulada (insolúveis), como células 
procariotas e eucariotas. 
 Devem ser, no mínimo, bivalentes. 
 
Características dos anticorpos envolvidos na reação de soroaglutinação: 
 Depende da classe isotípica – Ig M tem maior atividade aglutinante, enquanto 
que a Ig G tem menor atividade. 
 Anticorpos devem ser, no mínimo, bivalentes quanto à capacidade de se ligar 
aos antígenos específicos. 
Explicação do fenômeno da aglutinação: 
Duas explicações são mais correntemente aventadas: 
1) Revestimento da superfície do antígeno pelo anticorpo o que transformaria a 
suspensão celular de hidrófila em hidrófoba e daí a aglutinação. (figura 01) 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 29 
 
Antígenos 
particulados 
hidrófilos 
Perda da camada 
de solvatação 
Hidrófobo Agregação - Aglutinação 
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2) Teoria "das malhas" da qual os aglomerados seriam constituídos de células ligadas entre si 
pelos anticorpos. (figura 02) 
 
 
 
 
 
 
 
Excesso de Anticorpos Excesso de Antígenos 
 
 
 
 
 
 
 Zona de Equivalência 
Figura 30 
Técnicas das reações de aglutinação: 
As reações de aglutinação podem ser executadas sobre lâminas de microscopia ou 
placas de vidro, em tubos de ensaio e em microplacas. Elas podem ser: 
1) Reações qualitativas. 
2) Reações quantitativas. 
Na aula prática, os alunos terão uma demonstração sobre reação de aglutinação 
quantitativa feita em placas (micrométodo) usando soros anti-hemácias de carneiro e 
suspensão antigênica de hemácias de carneiro. 
 
Materialnecessário: 
1) Microplacas plásticas para hemaglutinação. 
2) Soros de camundongos (imunização feita em aula prática pelos grupos 2, 6, 3 e 7). 
3) Suspensão de hemácias de carneiro a 1%. 
4) Solução salina (0,l5M). 
5) Micropipetadores de 25 ul 
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Técnica da Reação: 
1) Adicionar um volume de 25ul de diluente (PBS) em todas as cavidades das fileiras 
A e B da microplaca (0,025ml). 
2) Colocar na primeira cavidade da fileira A1 e B1 25ul (0,025ml) do soro positivo de 
camundongos 
3) Com uma micropipeta de 25ul , começar a homogeneizar a primeira cavidade da 
fileira A, contendo o soro e, sem tocar na superfície ou na borda da placa, transferir 25ul para 
a segunda cavidade da fileira A2. Novamente homogeneizar bem e, com os mesmos cuidados, 
transferir 25ul para a terceira cavidade e assim sucessivamente até a 11ª cavidade (A11), pois 
para a última não será transferida nenhum volume da diluição dos soros e esta cavidade 
servirá como controle da suspensão antigênica de hemácias. No final, portanto, teremos as 
seguintes diluições dos soros: l/2, l/4, l/8, l/l6, l/32, l/64, l/l28, l/256, l/5l2, l/l024, l/2048. 
4) Repetir a mesma operação para a fileira B. 
5) Colocar em todas as cavidades das duas fileiras 25ul (0,025ml) da suspensão de 
hemácias de carneiro. 
6) Agitar com cuidado a placa e incubar por 40-60 minutos à temperatura ambiente. 
7) Fazer a leitura da reação e, comparando os resultados dos soros e fazer a 
interpretação dos resultados. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 31 
PERGUNTAS 
1) Quais os mecanismos da reação de soroaglutinação? 
2) Que tipos de antígenos participam da reação de soroaglutinação? 
3) Qual(is) a(s) utilidade(s) da reação de soroaglutinação, no sorodiagnóstico em 
medicina veterinária? 
4) Como se procede para titular anticorpos de um soro aglutinante? 
1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 
A 
B 
C 
D 
E 
F 
Controle 
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MÉTODO INDIRETO DE ELISA PARA DETECÇÃO E TITULAÇÃO DE 
ANTICORPOS DE COBAIA ANTI-GAMAGLOBULINA BOVINA 
 
Trata-se de um método extensivamente usado para detecção e/ou titulação de 
anticorpos específicos presentes em soros sangüíneos. A especificidade desse ensaio 
imunoenzimático é direcionada pelo antígeno presente na fase sólida (superfície da 
microplaca), o qual pode ser uma preparação altamente purificada, ou então preparações 
semi-purificadas, ou até mesmo brutas. Após adição e incubação do antígeno (Ag), as 
cavidades da microplaca serão lavadas para eliminar o excesso e os antígenos não ligados à 
superfície dessas mesmas cavidades. Os soros contendo os anticorpos contra esse Ag podem 
ser então adicionados, diluindo-os em tampão apropriado que impeça a ligação não específica 
dos anticorpos a sítios livres presentes na superfície da microplaca, os quais não foram 
ocupados pelas molécula de Ag. Os soros podem ser adicionados com diluição única, ou com 
diluição seriada. Após incubação das diluições séricas, as cavidades devem ser novamente 
lavadas para se eliminar o excesso de anticorpos não ligados. 
Os anticorpos combinados ao Ag são então detectados após incubação com o 
conjugado imunoenzimático anti-imunoglobulinas ou anti-Ig G da espécie cujos anticorpos se 
pretende titular. O conjugado deve ser diluído no mesmo tampão em que foram diluídos os 
soros. Após incubação e lavagem das cavidades da microplaca, é adicionada às cavidades uma 
solução de substrato imunoenzimático (água oxigenada) e cromógeno (orto-fenilenodiamina), 
incubando-se a reação para desenvolvimento de cor e, ao final, depois de bloqueada a reação 
enzimática, devem ser lidas as densidades ópticas (DOs),em leitor de microplacas no 
comprimento de onda de 490nm. 
 
 
O esquema básico do método indireto do Elisa é o seguinte: 
 Ag + Ac (?) + conjugado I.E. + S leitura de Dos 
Ag – preparação antigênica solúvel de gamaglobulina bovina 
Ac – soros-teste de cobaia 
Conjugado I. E. – conjugado de Ig G de coelho anti-Ig G de cobaia com peroxidase 
S – substrato 
Observar esquema abaixo (figura 01): 
 
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 Antígeno Soro Antiglobulina Substrato Reação 
 Marcada com enzimático de cor 
 enzima 
 
 
 
 
 
 
 
 Lavagem Lavagem Lavagem 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Figura 34 
Material 
 Preparação antigênica solúvel de gamaglobulina bovina 
 Soros-teste de cobaias imunizadas anteriormente com antígeno citado + 
adjuvantes distintos (ACF – Adjuvante Completo de Freund; AIF – Adjuvante Incompleto de 
Freund; Al(OH)3 – Hidróxido de alumínio) 
 Conjugado de Ig G de coelho anti-Ig G de cobaia com peroxidase (enzima) 
 Peróxido de hidrogênio (H2O2 – água oxigenada) a 3% (substrato) 
 Orto-Fenileno-Diamina – OPD (cromógeno) 
 Microplacas para Elisa 
 Tampão Carbonato-Bicarbonato pH 9,6 a 0,05M 
 Tampão PBS pH 7,4 
 Tampão PBST pH 7,4 + 10% de LPD (Leite em Pó Desnatado) 
 Solução de HCl concentrado 2N 
Antígeno 
Anticorpo 
Substrato Enzimático 
Antiglobulina marcada com 
enzima 
Bloqueador 
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Procedimento 
1. Adicionar volumes de 50L da solução antigênica em sua diluição ideal de uso 
(1g/mL) preparada em Tampão Carbonato-Bicarbonato (1:12500). Incubar a reação over-
night, em geladeira. Ao final, lavar as cavidades da microplaca 4 – 5 vezes com PBS. 
2. Bloquear as cavidades da microplaca através da adição de LPD a 10% em 
TCB, incubar a reação por 45 minutos a 37
º
C. Ao final, lavar a microplaca como no item 
anterior. 
3. Adicionar as diluições das amostras de soros-teste preparadas em tampão 
PBST + LPD. Incubar a reação por 60 minutos a 37
º
C. Ao final, lavar novamente, conforme 
já descrito. 
4. Adicionar o conjugado em sua diluição ideal de uso (1:2000) preparada em 
tampão PBST + LPD. Incubar por mais 60 minutos a 37
º
C. Ao final, lavar novamente. 
5. Adicionar a solução de substrato (H2O2) + OPD. Incubar, sob proteção da luz, 
por 15 minutos e, então, bloquear a reação com HCl. 
6. Fazer a leitura (figura 02) das DOs. Determinar a DO média dos controles para 
obtenção dos títulos de Acs presentes nos soros. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 35 
 
 
 
 
 
1/100 
 
1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/25600 1/100240 1/12800 1/51200 
 8 1 
 
 2 3 4 5 6 7 9 10 11 12 
A 
B 
D 
E 
F 
C 
G 
H 
ACF 
AIF 
AlOH 
Sem 
Adjuvante 
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PERGUNTAS 
1) Em que se baseia e quais são os mecanismos / passos principais da reação 
imunoenzimática de ELISA? 
2) Que tipos de antígenos e anticorpos participam da reação imunoenzimática de 
ELISA? 
3) Qual(is) a(s) utilidade(s) do teste de ELISA, no sorodiagnóstico em medicina 
veterinária? 
4) Como se procede para titular anticorpos de um soro no teste de ELISA? 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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 SDS-PAGE e Western blotting 
 
Soro normal de bovino, gamaglobulina bovina e IgG bovina 
 
1. Preparo do gel (gel a 12%) 
No preparo do gel, são feitos dois géis, um para ser corado com Comassie blue 
e outro para ser transferido para a membrana de PVDF, na quais era feito o 
western blotting. Obs: Um gel é o espelho do outro. 
 
Gel de separação 
 
Gel de empilhamento 
 
Separating gel buffer (pH8,8) – 4 mL 
 
Stacking gel buffer (pH6,0) – 3 mL 
 
Acrilamida-bisacrilamida – 3,2 mL 
 
Acrilamida-bisacrilamida– 0,5 mL 
 
Água MilliQ – 0,8 mL 
 
Persulfato de amônio 10% - 80 µL 
 
Persulfato de amômio 10% - 120 µL 
 
TEMED – 8 µL 
 
TEMED – 12 µL 
 
 
 
 Preparo da amostra 
60 µL da amostra (proteína a ser testada) (soro normal bovino, gamaglobulina 
bovina e IgG bovina) 
20 µL tampão da amostra 4X 
8 µL de ß-mercaptoetanol 
Ferver por 2 minutos e aplicar no gel 30µg de proteína a ser testada. 
 
2. Eletroforese do gel de poliacrilamida 
A corrida é feita em média por 2 horas a 100 V, logo após este período um dos 
géis é corado com Comassie blue e o outro é tranferido para a membrana. 
 
3. Transferência para a membrana 
 
Tampão de transferência 
100 mL de CAPS 10X 
100 mL de metanol 
800 mL de Água MilliQ 
Cortar 2 papéis Watmann de 3mm nas seguintes medidas: 10X7cm 
Técnicas de SDS-PAGE e de Western-Blotting
 SDS-PAGE e Western blotting 
 
Soro normal de bovino, gamaglobulina bovina e IgG bovina 
 
1. Preparo do gel (gel a 12%) 
No preparo do gel, são feitos dois géis, um para ser corado com Comassie blue 
e outro para ser transferido para a membrana de PVDF, na quais era feito o 
western blotting. Obs: Um gel é o espelho do outro. 
 
Gel de separação 
 
Gel de empilhamento 
 
Separating gel buffer (pH8,8) – 4 mL 
 
Stacking gel buffer (pH6,0) – 3 mL 
 
Acrilamida-bisacrilamida – 3,2 mL 
 
Acrilamida-bisacrilamida – 0,5 mL 
 
Água MilliQ – 0,8 mL 
 
Persulfato de amônio 10% - 80 µL 
 
Persulfato de amômio 10% - 120 µL 
 
TEMED – 8 µL 
 
TEMED – 12 µL 
 
 
 
 Preparo da amostra 
60 µL da amostra (proteína a ser testada) (soro normal bovino, gamaglobulina 
bovina e IgG bovina) 
20 µL tampão da amostra 4X 
8 µL de ß-mercaptoetanol 
Ferver por 2 minutos e aplicar no gel 30µg de proteína a ser testada. 
 
2. Eletroforese do gel de poliacrilamida 
A corrida é feita em média por 2 horas a 100 V, logo após este período um dos 
géis é corado com Comassie blue e o outro é tranferido para a membrana. 
 
3. Transferência para a membrana 
 
Tampão de transferência 
100 mL de CAPS 10X 
100 mL de metanol 
800 mL de Água MilliQ 
Cortar 2 papéis Watmann de 3mm nas seguintes medidas: 10X7cm 
Técnicas de SDS-PAGE e de Western-Blotting
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Cortar a membrana de PVDF: 9X6cm 
Para a transferência deve-se montar um “sanduíche” onde todos os materiais 
envolvidos (papel Watmann, esponjas, cassete de transferência, membrana de PVDF) devem 
ser embebidos no tampão de transferência. 
O “sanduíche” deve obedecer a seguinte seqüência: 
- placa preta, - esponja, - papel watmann, - gel, - membrana de PVDF, - papel 
watmann, - esponja, - placa branca 
Após a montagem do sanduíche este é colocado no cassete de transferência, e esta é 
feita por 45 minutos, a 4ºC, a 90V. 
 
1. Western blotting 
Após a transferência das proteínas do gel para a membrana de PVDF, segue-se o 
western blotting: 
1. Retirar a membrana e colocar Ponceau sob agitação para detectar a transferência. 
2. Lavar com água MilliQ sob agitação, para retirar o Ponceau 
3. Bloquear a membrana com PBS-T + 2% BSA (0,5g de BSA + 10 mL de PBS-
T), incubar por 2 horas sob agitação. 
4. Adicionar o conjugado anti-IgG bovina, na diluição de 1:1000 (10 µL do 
conjugado anti-IgG bovina + 5 mL de PBS-T), incubar por 1 hora sob agitação. 
5. Lavar a membrana 4X com PBS-T por 5 minutos 
6. Lavar a membrana 1X com PBS por 10 minutos 
7. Diluir 3 comprimidos de DAB e 3 comprimidos de uréia em 3 mL de água 
MilliQ, sob agitação. Adicionar esta solução a membrana, esperar alguns 
minutos até que apareça algum sinal, no máximo 5 minutos, e após este período 
bloquear a reação com água MilliQ. 
 
2. Coloração do gel de poliacrilamida 
- Retirar o gel da cuba e depois do suporte com a ajuda dos espaçadores. Cortar o 
gel de empilhamento. 
- Mergulhar o gel na solução descorante-corante sob agitação por 5 minutos. 
- Passar para a solução corante (Comassie Blue) sob agitação por 15 minutos. 
- Transferir para a solução descorante. Deixar por 3 horas, trocando a solução 
quando esta estiver saturada. 
 
PERGUNTAS 
1) Em que se baseia e quais são os passos principais das técnicas de poliacrilamida 
gel-eletroforese (PAGE) e de Western-blotting (W.B.)? 
2) Que tipos de antígenos e anticorpos participam da técnica de Western-blotting? 
3) Qual(is) a(s) utilidade(s) das técnicas de PAGE e de W.B., no sorodiagnóstico em 
medicina veterinária? 
4) Como se procede para caracterizar um antígeno proteico pelas técnicas de PAGE e 
de W.B.? 
 
 
 
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TESTES RÁPIDOS DE SORODIAGNÓSTICO – 
TESTES IMUNOCROMATOGRÁFICOS 
 
 
A ampliação do acesso ao diagnóstico é um desafio aos programas de saúde humana e 
veterinária. Os testes laboratoriais convencionais de sorodiagnóstico são operacionalmente 
complexos, requerem profissionais especializados e infraestrutura laboratorial apropriada. 
Além disso, o prazo para entrega dos resultados desses testes pode ser longo, levando o 
indivíduo a se desinteressar pelo resultado do teste e à consequente perda deste pelo sistema 
de saúde, ou não atender a demanda por decisões mais rápidas para o estabelecimento de 
procedimentos terapêuticos e, principalmente, medidas mais efetivas de controle. 
No início da década de 1990, uma nova estratégia diagnóstica surgiu. Chegaram ao 
mercado, os testes rápidos. Com o avanço das tecnologias de desenvolvimento e produção, 
esses testes revelaram-se eficientes na investigação de doenças infectocontagiosas. Desde 
2005, a utilização dos testes rápidos permite atender à crescente demanda pelo diagnóstico de 
agravos relevantes à saúde publica, visto que sua utilização aumenta a agilidade da resposta 
aos indivíduos e permite seu rápido encaminhamento para assistência médica e início de 
tratamento. 
 
Testes rápidos são aqueles cuja execução, leitura e interpretação dos resultados são 
feitas em, no máximo, 30 minutos. Além disso, são de fácil execução e não necessitam de 
estrutura laboratorial. 
 
Testes rápidos são, primariamente, recomendados para exames presenciais de 
sorodiagnóstico. Podem ser feitos com amostra de sangue total obtida por punção venosa ou 
da polpa digital, ou com amostras de fluido oral. Dependendo do fabricante, podem também 
ser realizados com soro e (ou) plasma. A execução dos testes rápidos, habitualmente, é muito 
simples e a capacitação de pessoal pode ser realizada presencialmente, ou por meio de ensino 
a distância. 
 
A primeira vantagem significativa dos testes rápidos é que eles possibilitam a 
liberação dos resultados e a tomada de decisões sobre o diagnóstico em uma única ocasião em 
que se obtém amostras de um paciente ou de um indivíduo suspeito de ter sido acometido por 
uma doença infecciosa. 
Os testes rápidos não necessitam de estruturas laboratoriais ou de profissionais 
graduados para sua execução, assim como dispensam o transporte de amostras e a necessidade 
de coleta de sangue venoso. Além disso, a aplicação de testes rápidos auxilia na prevenção da 
transmissão vertical de agentes infecciosos, facilita o diagnóstico em populações-chave. 
Esses testes, que podem ser realizados durante atendimento ou consulta em qualquer 
local, aumentam a probabilidade de solucionar os diagnósticos de doenças infecciosas aos 
indivíduos acometidos e também podem fornecer dados importantes sobre a situação 
imunológica desses indivíduos. 
 
Dentre os testes rápidos de sorodiagnóstico destaca-se a técnica de testes 
imunocromatográficos, que é uma metodologia de detecção baseada na utilização de tiras de 
um material de suporte (nitrocelulose) impregnadas com reagentes dessecados / liofilizados 
(anticorpos ou antígenos conjugados a partículas coloridas constituídas por ouro ou prata 
coloidais) que são ativadas, interagem com os analitos das amostras testes e migram porProf. Hélio José Montassier 
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44 
 
 
cromatografia pelos microcanais da membrana do suporte após a aplicação de amostras testes 
fluidas, revelando ao final resultados em locais do suporte sólido nos quais estão imobilizados 
anticorpos de captura para cada sistema ou alvo do analito que se busca detectar. Aplicações 
desta metodologia incluem testes para detecção de patógenos e/ou de seus anticorpos 
específicos, drogas, hormônios e metabolitos presentes em amostras médicas, veterinárias, 
alimentos, e de análises ambientais e outros. 
 
Como funciona para a detecção de anticorpos anti-antígenos específicos? 
 
1. A amostra de soro teste é colocada no local indicado, na membrana (área A). 
2. A solução tampão é colocada sobre a amostra. 
3. Os anticorpos da amostra fluem lateralmente pela membrana, passando pela área I, 
onde se inicia a ligação com o conjugado e prosseguem em direção à área de teste (T). 
4. Na área T, o complexo anticorpo-conjugado liga-se aos antígenos do agente 
infeccioso investigado que está imobilizado em uma linha da membrana do suporte, 
formando uma linha (ou banda) colorida. 
5. O conjugado não ligado ao anticorpo e o excesso do complexo imune continuam a 
migração, ao longo da membrana de nitrocelulose, em direção à área C, onde são capturados 
por anticorpos anti-imunoglobulina, formando outra linha (ou banda) colorida. 
 
Detecção de Ag do vírus da cinomose pelo teste imunocromatográfico:- 
 
 Amostra: mucosa nasal, conjuntiva, saliva, urina, soro e plasma; 
 
 Kit: diluente, swab esterilizado, conta-gotas (pipeta) e dispositivo teste; 
 
 Materiais necessários não fornecidos: solução salina e cronômetro. 
 
 
 Quando o teste começar a reagir , deve-se observar uma cor rosa se movendo através 
da janela de resultado no centro do dispositivo de teste. 
 Se esta não for visualizada após 1 minuto, adicionar mais uma gota da amostra + 
diluente no orifício; 
 Interpretar o resultado do teste entre 5 e 10 minutos. Não interpretar o resultado em 
um tempo superior a 12 minutos. 
 
 
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