ArthurSergioCavalcantiDeFranca-TESE

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Universidade Federal do Rio Grande do Norte 
Programa de Pós-Graduação em Neurociências 
 
 
Arthur Sérgio Cavalcanti de França 
 
 
 
 
 
 
O papel de oscilações beta2 e de interneurônios OLMα2 da 
região CA1 do hipocampo de camundongos na memória de 
reconhecimento de objetos 
 
 
 
 
 
 
 
Natal 2016 
Universidade Federal do Rio Grande do Norte 
Programa de Pós-Graduação em Neurociências 
 
 
 
 
O papel de oscilações beta2 e de interneurônios OLMα2 da 
região CA1 do hipocampo de camundongos na memória de 
reconhecimento de objetos 
 
 
 
Tese apresentada como requisito parcial à obtenção 
do título de Doutor em Neurociências, do Programa 
de Pós-Graduação em Neurociências, da 
Universidade Federal do Rio Grande do Norte. 
 
 
Orientador: Prof. Dr. Adriano B. L. Tort 
Co-orientador: Prof. Dr. Richardson N. Leão 
Aluno: Arthur S. C. França 
 
 
 
Natal 2016 
 
 Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN 
Sistema de Bibliotecas - SISBI 
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Instituto do Cérebro - ICE 
 França, Arthur Sérgio Cavalcanti de. 
 O papel de oscilações beta2 e de interneurônios OLMa2 da 
região CA1 do hipocampo de camundongos na memória de 
reconhecimento de objetos / Arthur Sérgio Cavalcanti de França. - 
Natal, 2016. 
 146 f.: il. 
 
 Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Instituto do 
Cérebro, Programa de Pós-Graduação em Neurociências 
Orientador: Adriano Bretanha Lopes Tort. 
 Coorientador: Richardson Naves Leão. 
 
 
 1. Hipocampo. 2. CA1. 3. OLMa2. 4. Memórias. 5. 
Reconhecimento de Objeto. I. Tort, Adriano Bretanha Lopes. II. 
Leão, Richardson Naves. III. Título. 
 
RN/UF/Biblioteca Setorial Árvore do Conhecimento - Instituto do 
Cérebro CDU 159.953 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dedico este trabalho aos meus pais, 
que são minha fonte diária de exemplos e 
que me inspiram a ser um ser humano melhor 
 
Agradecimentos 
 
Antes de qualquer coisa, gostaria de agradecer à minha família. Nela encontro todo apoio 
e incentivo necessários para enfrentar qualquer caminho que eu escolha trilhar. 
Sou uma pessoa que gosta de se embebedar de exemplos e sou felizardo de ter tido a 
chance de conviver com pessoas que me dão inúmeros exemplos, em todos os aspectos 
da vida. 
Gostaria de agradecer à minha mãe, meu exemplo de compaixão e da sede por 
conhecimento. Ao meu pai, meu exemplo de dedicação e otimismo. Ter sido criado por 
vocês foi a maior felicidade que poderia ter sonhado, amo vocês de forma imensurável. 
Agradeço de coração às minhas irmãs e minhas queridas avós, seus cuidados e amor são 
sentidos mesmo de longe, amo muito vocês. 
Gostaria de agradecer à minha namorada Mayara Medeiros, minha companheira na dança 
da vida. 
Gostaria de agradecer aos meus pais científicos e a todos que contribuíram ao longo dessa 
jornada. Primeiramente à minha primeira orientadora, Juliana Espada, que me inspirou a 
seguir o caminho da pesquisa. A Bruno Lobão e Sidarta Ribeiro com quem construí e 
trilhei meus primeiros passos na neurociência. Ao meu co-orientador Richardson Leão, o 
maior experimentalista com quem já tive oportunidade de trabalhar. Agradeço também 
ao meu supervisor no exterior Klas Kullander por todo suporte dado durante a minha 
estadia na Suécia, e por sua confiança depositada em mim. 
Quero fazer um agradecimento especial ao meu orientador Adriano Tort. Ele foi e é o 
maior exemplo que já tive no meio científico. Ao longo desses 4,5 anos só aumentou 
minha admiração pelo seu jeito de fazer ciência, pela sua integridade e seriedade. Nunca 
trabalhei em um ambiente tão bom e produtivo, com tanto compartilhamento de 
informação e pessoas se ajudando. Não acredito em sorte, então acredito que você é o 
maior fomentador desse ambiente. Não é à toa que todas as pessoas que saem desse 
laboratório querem continuar o vínculo com você. Parabéns! 
Gostaria de agradecer aos professores Marcos Costa, Katarina Leão, Olavo Amaral e 
Diego Laplagne pelas discussões que geraram impacto direto na construção do meu 
trabalho. 
Agradeço aos meus colegas do laboratório sueco, Julia, Sanja, Samer, Stefano e Fábio. 
Vocês tornaram minha estadia muito mais prazerosa e produtiva do que eu poderia 
imaginar. Sem vocês tudo teria sido mais difícil. 
Gostaria de agradecer aos meus colegas de laboratório, Bryan, Pavão, André, Zé, Alan e 
Hindiael. Obrigado pelas inúmeras discussões científicas e não científicas, pelas festinhas 
e pelo bullying diário. Vocês tornaram meu trabalho extremamente prazeroso e produtivo. 
Agradeço aos meus colegas Vitor, João, Robson e Aron. Ao Neuro Revolución! O grupo 
de pessoas que mais desenvolvi afinidade científica. Vocês são exemplos não só de 
integridade científica, mas também de aspiração por uma sociedade melhor. 
A todos os meus amigos que fizeram parte diretamente ou não da minha construção 
científica, dando suporte pessoal ou científico, Daniela Moura, Marina Siqueira, Annie 
Souza, Thawann Malfatti, Annara Soares, Eduardo Queiroz, Eduardo Leite, Stefano 
Marlon, Felipe Farias, Dyêgo Siqueira e Aderson Stanrley. 
Gostaria de agradecer à Alexandra Elbakyan, graças a ela tive acesso aos artigos 
necessários para embasar boa parte da minha investigação científica. Parabéns por sua 
contribuição para divulgação científica no mundo. 
Por último, agradeço ao governo brasileiro por ter pago meu salário nesses últimos 12 
anos, da graduação ao doutorado. Graças a isso, tive oportunidade de me qualificar e 
espero retornar esse investimento para a sociedade. 
 
 
 
 
 
 
Resumo 
O hipocampo é relacionado com a formação de memórias explicitas e com a capacidade 
de reconhecer novos objetos. No presente trabalho visamos contribuir para uma maior 
compreensão do papel da região CA1 do hipocampo nestes processos. Através da 
aplicação de técnicas de eletrofisiologia, comportamento animal, psicofarmacologia e 
optogenética em camundongos transgênicos e selvagens, encontramos que células 
OLMα2 do CA1 atuam na codificação da representação de objetos em uma tarefa de 
reconhecimento de objetos, e também influenciam a codificação de memórias aversivas 
em uma tarefa associativa de medo ao contexto. Além disso, descrevemos uma nova 
atividade oscilatória no potencial de campo local do CA1 na frequência beta 2 (23-30 
Hz), que é caracteristicamente transitória e ligada à detecção de novos objetos durante 
uma tarefa de reconhecimento de objetos. Estes resultados sugerem potenciais 
mecanismos celulares e de rede neuronal na região CA1 subjacentes ao seu papel na 
formação de memórias e na detecção de novidade. 
 
 
Abstract 
The hippocampus is associated to novelty detection and formation of explicit memories. 
The present work aims at better understanding the role of the CA1 region of the 
hippocampus in these processes. By employing electrophysiology, animal behavior, 
psychopharmacology and optogenetic techniques in transgenic and wild-type mice, we 
found that CA1 OLMα2 cells influence the formation of new object representations in an 
object recognition task, as well as the encoding of aversive memories in a contextual fear 
memory task. Furthermore, we characterized a new oscillatory activity in the local field 
potential of CA1 at beta 2 frequency (23-30 Hz), which was typically transient and linked 
to the amount of novelty in an object recognition task. These results suggest potential 
cellular and network mechanisms that underlie the role of CA1 in memory formation and 
novelty detection. 
 
 
 
 1 
 
 
Sumário 
1.0 – Introdução .................................................................................................... 2 
1.1 – Neuroanatomia e citoarquitetura da formação hipocampal ..................... 2 
1.2 – Formação hipocampal e memória ..........................................................12 
1.2.1 – Mecanismos eletrofisiológicos e plásticos da memória ...................... 12 
1.2.2 – Formação hipocampal e a memória reconhecimento ......................... 20 
1.3 – Modulação da codificação de memória de reconhecimento pelas células 
OLMα2 (Artigo 1). ..................................................................................................... 22 
1.3.1 – Sistema Cre-loxp, optogenética e o controle das células OLMα2. ..... 23 
1.3.2 – Células OLMα2 e o controle das entradas do córtex entorrinal ......... 26 
1.4 – Oscilações hipocampais e detecção de novidade (Artigo 2) ................. 29 
2.0 – Artigo 1 ...................................................................................................... 34 
3.0 – Artigo 2 ...................................................................................................... 65 
4.0 – Discussão ................................................................................................... 76 
4.1 – Artigo 1 .................................................................................................. 76 
4.2 – Artigo 2 .................................................................................................. 80 
4.3 – Discussão geral ...................................................................................... 81 
5.0 – Referências ................................................................................................ 85 
6.0 – Anexos ....................................................................................................... 96 
 
 
 
 
 
 2 
 
 
1.0 – Introdução 
Os artigos que serão apresentados aqui visam aumentar nosso entendimento 
acerca dos mecanismos que permitem ao hipocampo desempenhar seus papeis cognitivos, 
em particular a capacidade de reconhecimento de novidade. Para melhor situar nossa 
contribuição ao campo, a seção de introdução é dividida em diferentes subseções. Será 
feita inicialmente uma breve descrição sobre a neuroanatomia e citoarquitetura da 
formação hipocampal, bem como sobre as principais conexões entre as estruturas que a 
compõem. Iremos trazer também um breve histórico sobre o estudo da memória e os 
correlatos eletrofisiológicos, plásticos e comportamentais que tangem esse campo de 
estudo. Posteriormente, iremos introduzir os assuntos tratados nos dois artigos científicos 
que constituem o corpo de resultados desta tese. Finda a introdução, apresentaremos os 
artigos na íntegra nas seções intuladas “Artigo 1” e “Artigo 2”, e finalizaremos a tese com 
uma discussão geral sobre os resultados apresentados e como estes se inserem na literatura 
atual. Por fim, como anexo desta tese fornecemos a título de registro três outros artigos 
científicos também elaborados durante o período de doutoramento. 
 
1.1 – Neuroanatomia e citoarquitetura da formação hipocampal 
O hipocampo é uma das estruturas chave ligadas a memórias declarativas 
(Scoville and Milner, 1957), bem como a funções de orientação espacial (O’Keefe & 
Dostrovsky, 1971), em conjunto a outras áreas da formação hipocampal como o córtex 
entorrinal (Hafting et al., 2005). A estrutura anatômica da formação hipocampal começou 
a ser detalhadamente investigada a partir do final do século XIX, se destacando nesse 
período os trabalhos de Camilo Golgi, Luigi Sala, Karl Schaffer e Santiago Ramón y 
Cajal (Bentivoglio & Swanson, 2001; López-Muñoz et al., 2006; Szirmai et al., 2012). 
No trabalho intitulado “On the fine structure of the pes Hippocampi major, 1886” Camilo 
Golgi, utilizando a técnica criada por ele de coloração por nitrato de prata em 1873 
(Figura 1), descreveu as camadas que formam o hipocampo, bem como fez a descoberta 
do giro denteado como uma estrutura separada do Corno de Amon (CA; Bentivoglio & 
Swanson, 2001). Posteriormente, trabalhos como o de Karl Schaffer (Szirmai et al., 2012) 
 
 
 3 
 
 
e Santiago Ramón y Cajal (López-Muñoz et al., 2006) descreveram a conectividade entre 
as áreas do hipocampo. Santiago Ramón y Cajal e em seguida Lorente de Nó, proponente 
das subdivisões do corno de Amon em CA1, CA2 e CA3 (Lorente De Nó, 1934), 
montaram um esquema de conexão entre as áreas do hipocampo e das vias de entrada e 
saída de informação que é muito próximo ao modelo aceito atualmente (López-Muñoz et 
al., 2006). 
Figura 1. Exemplos de neurônios 
da formação hipocampal de coelho 
corados através da técnica de 
nitrato de prata, desenvolvida por 
Camilo Golgi. (Lâmina XIV, 
Golgi 1886). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Atualmente o hipocampo é dividido em três subáreas distintas: CA1, CA2 e CA3. 
Além deste, compõem a formação hipocampal o córtex entorrinal, o parasubículo, o 
présubículo, o subículo e o giro denteado (Amaral & Witter, 1989; Schultz & Engelhardt, 
2014). O conjunto de conexões entre essas áreas formam uma unidade funcional 
associada a várias capacidades cognitivas (Amaral & Witter, 1989; Hafting et al., 2005; 
O’Keefe & Dostrovsky, 1971; Szirmai et al., 2012), entre elas a formação de memórias 
declarativas (Scoville & Milner, 1957). Para exercer tal função, a formação hipocampal 
 
 
 4 
 
 
recebe informação sensorial e multimodal de diversas áreas do encéfalo, bem como envia 
informação processada para diferentes regiões (Figura 2; Andersen et al., 2006) 
Figura 2. Esquema de vias de projeções de 
informações sensoriais e multimodais que 
chegam à formação hipocampal de um roedor 
(Brown & Aggleton, 2001). 
 
 
 
 
Das estruturas mencionadas, o córtex entorrinal é o principal componente de 
entrada e saída de informação de outras áreas do cérebro para a formação hipocampal 
(Dolorfo & Amaral, 1998; Insausti et al., 1997). O córtex entorrinal é dividido nos 
domínios lateral e medial; sua parte lateral recebe projeções multimodais do córtex 
perirrinal, olfatório, insular e da amígdala, enquanto a parte medial recebe projeções do 
córtex occipital, pósrinal e pressubículo (van Groen et al., 2003). No que tange sua 
citoarquitetura, o córtex entorrinal é formado por 6 camadas. As camadas II e III enviam 
projeções para o hipocampo e giro denteado e a camada V e VI recebem projeções do 
hipocampo (Dolorfo & Amaral, 1998; Insausti et al., 1997; van Groen et al., 2003). 
Neurônios piramidais glutamatérgicos compõem os principais neurônios excitatórios do 
córtex entorrinal, e os interneurônios GABAérgicos os principais neurônios inibitórios 
(Andersen et al., 2006; Dolorfo & Amaral, 1998; Insausti et al., 1997). Os neurônios 
piramidais do córtex entorrinal da camada II projetam seus axônios para o giro denteado 
através de um feixe de axônios denominado de via perforante, e seus terminais acabam 
principalmente nas espinhas dendríticas das células granulares (Amaral et al., 2007; 
Dolorfo & Amaral, 1998), enquanto os neurônios e interneurônios da camada III projetam 
bilateralmente para a região CA1 (Basu et al., 2016; van Groen et al., 2003) através de 
uma subdivisão da via perforante nomeada via têmporo-amônica (Remondes & Schuman, 
 
 
 5 
 
 
2004). Um esquema detalhado com entradas para o córtex entorrinal e saídas para o 
hipocampo pode ser visto na Figura 3. 
 
 
Figura 3. Representações esquemáticas de neurônios e conexões do córtex entorrinal lateral e 
medial. Setas indicam entrada e saída de projeções para as várias camadas do córtex entorrinal. 
Abreviaturas: ACC: córtex cingulado anterior; Amygd: Amígdala; CA1-CA3: subáreas do 
hipocampo; DG: giro denteado; IL: córtex infralímbico; INC: córtex insular; OB: bulbo 
olfatório; OLFC: córtex olfatório; AP: parasubículo; PER: córtex perirrinal; PL: córtex 
prelímbico; POR: córtex posrinal; PPC: córtex parietal posterior; PRS presubiculum; prox: 
proximal; RSC: córtex retroesplenial; sub: subículo; subcort: estruturas subcorticais tais como 
prosencéfalo basal, amígdala; superf: superficial. (Grillner, 2010). 
 
Como dito anteriormente, o giro denteado é um dosprincipais alvos de projeções 
do córtex entorrinal, recebendo através da via perforante axônios da camada II (Amaral 
et al., 2007; Dolorfo & Amaral, 1998). O giro denteado recebe estas projeções na camada 
molecular, que, junto com as camadas granular e polimórfica, formam sua estrutura 
 
 
 6 
 
 
citoarquitetônica (Amaral et al., 2007; Andersen et al., 2006). A camada molecular é 
caracterizada pelos dendritos oriundos dos corpos celulares das células granulares do giro 
denteado (Figura 4), bem como pela presença dos axônios oriundos do córtex entorrinal 
e um pequeno número de interneurônios (Amaral et al., 2007). A camada de células 
granulares, como o nome sugere, é onde os corpos celulares das células granulares se 
localizam, formando uma camada densa de neurônios (Amaral et al., 2007). Por último, 
a camada polimórfica é composta principalmente por interneurônios, entre eles as células 
musgosas (Amaral et al., 2007; Kobayashi, 2010). As células musgosas possuem 
dendritos na região hilar, enquanto seus axônios projetam para a camada molecular tanto 
ipsilateral como contralateral do giro denteado, e têm como principal alvo as células 
granulares (Freund & Buzsáki, 1996). O giro denteado também pode ser caracterizado 
através de seu formato, em “V” ou “U”, sendo a porção voltada para a região CA1 
chamada de suprapiramidal, a região abaixo do CA3 é chamada de infrapiramidal, e a 
interseção é chamada de crista (Amaral et al., 2007; Schultz & Engelhardt, 2014). A 
principal saída do giro denteado se dá através das fibras musgosas para a região CA3 do 
hipocampo; os axônios oriundos do giro denteado são particularmente grossos, e capazes 
de desencadear potenciais de ação na região CA3 com um único disparo pré-sináptico 
(Kobayashi, 2010). 
 
 
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Figura 4. Ilustração original de Karl Schaffer (1892) do giro denteado e região CA3 e CA1 da 
formação hipocampal do coelho. Em destaque a entrada para o giro denteado oriundo do córtex 
entorrinal através da via perforante; a projeção de axônios das células granulares do giro 
denteado formando as fibras musgosas para as os neurônios piramidais da região CA3; as 
conexões intra CA3 através das colaterais recorrentes; e as conexões de CA3 para CA1 via as 
colaterais de Schaffer (Szirmai et al., 2012). 
 
A região CA3 recebe entradas do giro denteado e entradas diretas do córtex 
entorrinal em suas diferentes camadas (Amaral & Witter, 1989; Dolorfo & Amaral, 1998). 
A região CA3 possui em sua citoarquitetura 5 camadas ou estratos, que são similares às 
outras áreas do hipocampo (Andersen et al., 2006): (1) stratum oriens é a camada 
localizada entre o stratum pyramidale e alveus; o stratum oriens é caracterizado por 
possuir os dendritos basais dos neurônios piramidais, e é a região onde há saídas axonais 
(Figura 4). Nessa região também se localiza uma diversidade de interneurônios. (2) 
Stratum pyramidale é a camada em que se localiza os corpos celulares dos neurônios 
 
 
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piramidais. (3) Stratum lucidum é uma camada que ocorre exclusivamente na região CA3. 
Essa camada localizada abaixo do stratum pyramidale é caracterizada por projeções das 
fibras musgosas oriundas do giro denteado. (4) Stratum radiatum, camada em que na 
região CA3 é localizada abaixo do stratum lucidum, é caracterizada pela chegada de 
projeções oriundas do próprio CA3 (colaterais recorrentes; Figura 4) e por possuir uma 
variedade de interneurônios. (5) Stratum lacunosum-moleculare, camada localizada infra 
stratum radiatum, é caracterizada por possuir os terminais das conexões oriundas da 
camada II do córtex entorrinal e por possuir uma variedade de interneurônios (Andersen 
et al., 2006; Cherubini & Miles, 2015). 
Subsequente a região CA3, se localiza a região CA2 no hipocampo. O CA2 é uma 
pequena região de transição entre as regiões CA3 e CA1, cuja área total é 
significativamente menor que estas. Porém, possui características singulares como o 
padrão de projeções em relação às outras áreas (Shinohara et al., 2012). A região CA2, 
diferentemente da região CA3, possui somente 4 camadas: (1) stratum oriens; (2) stratum 
pyramidale; (3) stratum radiatum; (4) stratum lacunosum-moleculare (Amaral & Witter, 
1989; Andersen et al., 2006). 
A região CA1 possui as mesmas camadas que a região CA2, porém com diversas 
características próprias. O stratum pyramidale é formado por neurônios piramidais com 
formato mais homogêneos e em geral menores quando comparados com a região CA3 
(Andersen et al., 2006). A região CA1 recebe inputs da região CA3, através das colaterais 
de Schaffer, no stratum radiatum (Amaral et al., 2007). Recebe também inputs da camada 
III do córtex entorrinal, através da via perforante e têmporo-amônica, no stratum 
lacunosum-moleculare (Brun et al., 2008). Na Figura 5 podemos ver um esquema de 
neurônios piramidais que povoam as três regiões do hipocampo. 
 
 
 
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Figura 5. Representação esquemática dos neurônios piramidais e das camadas encontradas nas 
três regiões do hipocampo (CA1, CA2 e CA3). Podem ser observadas as principais conexões de 
entrada do córtex entorrinal (CE) e giro denteado (GD) para o hipocampo (linhas verde musgo, 
rosa e magenta) e saída (linha verde) entre das regiões hipocampais, bem como as conexões 
intra-hipocampais (linhas azul e laranja). 
 
A atividade dos neurônios piramidais do hipocampo é modulada por vários tipos 
de interneurônios GABAérgicos (Freund & Buzsáki, 1996; Klausberger & Somogyi, 
2008). Da diversidade de interneurônios presentes no hipocampo, podemos citar alguns 
que se diferenciam pela localização, velocidade de atividade neuronal e projeções: (1) 
Células em candelabro (Freund & Buzsáki, 1996) ou células axo-axônicas (Woodruff et 
al., 2010) são um conjunto de interneurônios que possuem seu corpo celular no stratum 
pyramidale, dendritos no stratum radiatum e lacunosum-moleculare (Freund & Buzsáki, 
1996), e projeções axonais que inibem o segmento inicial do axônio das células 
piramidais (Wang et al., 2016; Woodruff et al., 2010). (2) Células em cesto correspondem 
a um grupo diverso de interneurônios, que possuem seus corpos celulares em estratos 
diferentes como o pyramidale e o radiatum, e são caracterizadas por projetarem axônios 
 
 
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que inibem a região perisomatica dos neurônios piramidais, e também por dispararem 
rapidamente (fast-spiking) (Freund & Buzsáki, 1996; Klausberger & Somogyi, 2008). (3) 
As células biestratificadas possuem seus corpos celulares no stratum pyramidale, e 
inibem os dendritos basais das células piramidais no stratum oriens, e os dendritos apicais 
no stratum radiatum; possuem ainda disparo regular (regular-spiking) (Ferrante & 
Ascoli, 2015; Klausberger & Somogyi, 2008; Wheeler et al., 2015). (4) As células oriens 
lacunosum-moleculare (OLM) possuem corpos celulares no stratum oriens e enviam 
projeções axonais para o stratum lacunosum-moleculare, inervando os dendritos apicais 
distais das células piramidais, bem como outros interneurônios no stratum radiatum 
(Klausberger & Somogyi, 2008; Leão et al., 2012); elas regulam a atividade oscilatória 
dos neurônios piramidais (Forro et al., 2015). Um esquema da variedade de 
interneurônios e projeções recebidas e enviadas pode ser visto na Figura 6. 
 
 
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Figura 6. Esquema mostrando diferentes interneurônios e suas projeções. Podemos ver em azul 
uma representação de neurônios piramidais e suas projeções. Em amarelo e verde podemos ver 
uma variedade de células em cesto. Em marrom é representado a célula biestratificada. Em 
vermelho a célula em candelabro ou axo-axônica. Por último, em magenta vemos a célula OLM 
e sua projeção para os dendritos apicais distais (Klausberger & Somogyi, 2008) 
O subículo, área da formação hipocampal localizada entre o córtex entorrinal e o 
hipocampo, possui três principais camadas: (1) molecular,(2) piramidal e (3) camada 
polimórfica (Ding, 2013). A camada piramidal possui grandes neurônios piramidais que 
têm dendritos apicais na camada molecular e os dendritos basais nas porções mais 
profundas da camada piramidal (O’Mara, 2005). O subículo é uma das estruturas que 
mais recebe saídas do hipocampo, especificamente da região CA1 que projeta para todas 
 
 
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as camadas do subículo, e posteriormente projeta para o córtex entorrinal e outras diversas 
áreas corticais (Amaral et al., 1991; Ding, 2013; O’Mara, 2005). 
 
1.2 – Formação hipocampal e memória 
A unidade funcional que compõe a formação hipocampal descrita na seção 1.1 
possui um papel fundamental no processo de formação de memórias declarativas. Apesar 
das primeiras evidências encontradas nos anos 30 (McGaugh, 2000), o indício mais forte 
da participação da formação hipocampal no processo de formação de memórias 
declarativas foi visto duas décadas mais tarde no artigo intitulado “Loss of recent memory 
after bilateral hipocampal lesions” de William Scoville e Brenda Milner (1957). Nesse 
trabalho, os autores descreveram as cirurgias realizadas em 10 pacientes, onde o paciente 
H.M. (caso 1), que teve remoção bilateral da formação hipocampal, se tornou a principal 
evidência da estreita relação entre os processos relacionados à memória e a formação 
hipocampal (Scoville & Milner, 1957). Esse mesmo paciente sofreu de amnésia 
anterógrada, e retrógrada parcial, de memórias declarativas e episódicas (Scoville & 
Milner, 1957), porém manteve a capacidade de aprender e reter habilidades motoras 
(Milner et al., 1968; Scoville & Milner, 1957). 
Após os achados desse artigo, várias descobertas foram feitas ao longo das 
décadas seguintes no que concerne o papel de cada região da formação hipocampal no 
processo de formação e consolidação de memórias, da anatomia funcional de conexões 
entre as regiões hipocampais, passando pelos mecanismos moleculares até a codificação 
específica de informações (Amaral & Witter, 1989; Bliss & Lomo, 1973; Kandel, 2001; 
O’Keefe & Dostrovsky, 1971). 
 
1.2.1 – Mecanismos eletrofisiológicos e plásticos da memória 
As investigações sobre o processo de formação de memórias ao longo do século 
XX parecem ter seguido os preceitos propostos por Donald Hebb no livro intitulado “The 
Organization of Behavior” (Hebb, 1949). Nesse livro, Hebb propõe que a formação de 
 
 
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traços de memória se daria por conexões funcionais que guardariam informações em rede. 
Através da facilitação de conexões entre os neurônios, esses formariam conjuntamente 
unidades de informação; essas unidades foram intituladas por Hebb de “assembleias 
neuronais”. Pela ativação sequencial de múltiplas assembleias neuronais, intitulada de 
“sequência de fase”, teríamos a codificação de informações mais complexas (Hebb, 
1949). As ideias propostas por Hebb levaram ao início de uma variedade de investigações 
em diversas áreas das neurociências, incluindo o campo da aprendizagem e memória 
(Brown & Milner, 2003). A posteriori, tais investigações desencadearam a descoberta de 
características das bases bioquímicas e eletrofisiológicas subjacentes à formação dos 
traços de memória (Brown & Milner, 2003). 
O postulado sobre a aprendizagem hebbiana, onde a eficiência da conexão 
funcional entre neurônios seria proporcional ao grau de atividade entre os neurônios pré 
e pós-sináptico, obteve o primeiro correlato biológico na década de 70. O mecanismo 
denominado de potenciação de longa duração (LTP, do inglês long term potentiation) foi 
descrito por Bliss e Lomo em 1973 em um trabalho de estimulação elétrica em coelhos 
anestesiados. Os animais, dentre alguns experimentos realizados, foram estimulados com 
eletrodos de forma rítmica e rápida (estímulos tetânicos de 15 Hz por 10 segundos) na via 
perforante e registrados em duas localizações: na região da camada molecular conectada 
monossinapticamente à região de registro (via experimental), e na camada molecular 
alguns milímetros distantes da região da via experimental (via controle). A estimulação 
na via experimental resultou no aumento de amplitude no potencial pós-sináptico 
excitatório populacional na camada granular do giro denteado, que pôde ser visto horas 
depois do protocolo de estimulação. Porém, a estimulação registrada na via controle não 
resultou no mesmo aumento de amplitude do potencial pós-sináptico (Figura 7; Bliss e 
Lomo, 1973). 
 
 
 
 14 
 
 
 
Figura 7. Experimento realizado por Bliss e Lomo em coelhos anestesiados. (A,B) Traçados de 
potenciais de campo registrados na via experimental e controle antes do protocolo de 
estimulação (A) e depois do protocolo de estimulação (B). (C) Amplitude dos potenciais pós-
sinápticos excitatórios populacionais registrados na região da via controle (círculos brancos) e 
na região da via experimental (círculos pretos). Os valores representam a porcentagem de 
quanto a amplitude variou em relação aos registros anteriores ao procedimento de estimulação. 
Podemos ver o fenômeno de potenciação de longa duração no grupo experimental (Bliss & 
Lomo, 1973). 
Ao longo das quatro décadas seguintes, houve vários avanços sobre a relação entre 
o LTP e mecanismos de plasticidade celular; porém, somente em 2006 foi mostrado que 
o processo de aprendizagem era capaz de gerar LTP no hipocampo de animais (Whitlock 
et al., 2006). Após um protocolo de aprendizagem com a tarefa de esquiva inibitória em 
ratos, Whitlock e colaboradores demonstraram que a região CA1 do hipocampo responde 
de forma diferenciada, onde pode ser observado aumento, diminuição ou manutenção nos 
potenciais de campo pós-sinápticos excitatórios populacionais (Whitlock et al., 2006). 
 
 
 15 
 
 
Estes achados puderam ser vistos mesmo horas após a aprendizagem (Figura 8; Whitlock 
et al., 2006). Uma das características vistas neste estudo, em que neurônios diminuem a 
responsividade a outros, é chamada de depressão de longa duração (LTD, do inglês long 
term depression). O LTD foi posteriormente evidenciado como tão importante quanto o 
LTP para a plasticidade de conexões funcionais entre neurônios (Feldman, 2012), apesar 
de não contemplado por Hebb em sua teoria. Para Hebb, o mecanismo de 
enfraquecimento de conexões não era um fenômeno ativo e sim uma resposta passiva ao 
fortalecimento de outras conexões (Hebb, 1949). O fenômeno de LTD foi visto pela 
primeira vez nas fibras musgosas das células de Purkinje do cerebelo (Ito et al., 1982). 
 
Figura 8. Experimento com esquiva inibitória 
realizado por Whitlock et al. (2006). (A) 
Localização dos eletrodos de registro no 
hipocampo. (B) Exemplo de traçados 
registrados por dois eletrodos distintos no 
painel de cima. O painel debaixo mostra a 
porcentagem de variação das inclinações das 
respostas evocadas nos potenciais de campo 
em relação aos registros antes da tarefa 
comportamental. As cores quentes mostram 
registros de eletrodos que exibiram aumento 
das respostas evocadas e as cores frias 
eletrodos que exibiram a diminuição ou 
manutenção das respostas evocadas. 
 
 
Além da ausência de postulados sobre o enfraquecimento de conexões, outra 
característica pouco explorada por Hebb foi a questão do tempo entre disparos como 
variável chave na plasticidade das conexões entre neurônios. Apesar de apresentar uma 
ideia de causalidade temporal ao postular que as assembleias seriam formadas por 
 
 
 16 
 
 
sequência de ativação de um neurônio após outro, nenhuma ideia nesse sentido foi 
aprofundada. Desta forma, a teoria de aprendizagem hebbiana clássica vem sendo 
atualizada desde sua formulação; podemos enumerar alguns postulados que a teoria mais 
atual trata: (1) a atividade conjunta entre um neurônio pré e pós sináptico; (2) a 
participação de moduladores nesse processo (Frémaux & Gerstner, 2015); (3) a relação 
de tempo entre os potenciais de ação prée pós sináptico como indutor de plasticidade 
(Figura 9; STDP, do inglês spike-timing-dependent plasticity; Feldman, 2012); (4) o 
enfraquecimento de conexões como mecanismo importante na plasticidade (Caporale & 
Dan, 2008; Feldman, 2012; Frémaux & Gerstner, 2015). 
Figura 9. Mecanismo de plasticidade 
dependente do tempo de disparo. Painel de 
cima mostra dois esquemas de pareamento 
pré-pós sinaptico, onde o neurônio pós-
sináptico dispara depois (esquerda) ou 
antes (direita) do neurônio pré-sináptico. 
Painel abaixo mostra que quando há 
pareamento entre os disparos dos 
neurônios pré e pós há indução de LTP ou 
LTD, a depender do tempo relativo de 
disparo entre eles. A ativação não pareada 
do neurônio pré- ou pós-sináptico não 
induz LTP ou LTD. Painel debaixo mostra 
que a magnitude da plasticidade (em %) é 
inversamente proporcional ao tempo entre 
os disparos dos neurônios pré e pós 
sinápticos (Feldman, 2012). 
 
 
 
 
 
 
 17 
 
 
As modificações vistas no LTP só são possíveis através de mudanças em cadeias 
bioquímicas que alteram a estrutura funcional do neurônio, indo das variações de níveis 
de cátions e ânions em botões sinápticos, até alterações de transcrições de DNA (Caporale 
& Dan, 2008). Essas diferenciações de mecanismos bioquímicos, genéticos e celulares, 
necessárias para codificação e manutenção dos traços de memória, são denominadas de 
plasticidade sináptica, termo cunhado por Jerzy Konorski (Konorski, 1948). 
Posteriormente, a plasticidade sináptica foi postulada por Hebb como o mecanismo 
responsável para guardar informação no cérebro (Hebb, 1949). 
Um grande número de cascatas bioquímicas (Giese & Mizuno, 2013), 
modificações de expressão de genes (Bliim et al., 2016) até alterações estruturais (Leal et 
al., 2015) relacionadas a codificação e manutenção de traços de memória foram descritas 
ao longo do século XX e XXI (Andersen et al., 2006). As alterações mencionadas 
parecem estar ligadas a modulação do funcionamento de receptores glutamatérgicos do 
tipo AMPA e NMDA, e seus segundos mensageiros, cujas mudanças são induzidas por 
proteínas cinases (Izquierdo & Medina, 1997). 
Bastante resumidamente, após a ativação de receptores glutamatérgicos do tipo 
NMDA, há aumento nos níveis de cálcio intracelular que por sua vez se liga a 
calmodulinas (Izquierdo & Medina, 1997). Essas calmodulinas ativam cinases, sendo 
CAMKII uma das principais cinases envolvidas. Por conseguinte, CAMKII é capaz de 
afetar a atividade de outras proteínas que participam do remodelamento sináptico 
(Okamoto et al., 2009), e na modulação de expressão de genes imediatos (Okuno et al., 
2012). Seus níveis são aumentados durante o aprendizado (Cammarota et al., 1998), e sua 
inativação resulta em prejuízos na formação da memória (Lisman et al., 2002). Outras 
cinases como a família de PKA, C e G, MAPK, ou vias dependentes de segundo 
mensageiros como cAMP (do inglês, cyclic adenosine monophosphate), são igualmente 
importantes no processo de modificação sináptica e regulação de expressão gênica 
(Bernabeu et al., 1997; Giese & Mizuno, 2013). Uma das funções apresentadas pelas 
cinases envolve a modulação da expressão de genes imediatos que são capazes de regular 
a expressão de outros genes, bem como se autorregular (Minatohara et al., 2015). O Zif-
268 e o Arc são dois genes imediatos com papeis conhecidos na indução de plasticidade 
 
 
 18 
 
 
sináptica relacionada a formação e manutenção de memórias (Izquierdo & Cammarota, 
2004; Minatohara et al., 2015), e tanto a indução de LTP como novas experiências 
resultam no aumento de expressão de Zif-268 (Ribeiro et al., 2007, 2002; Ribeiro & 
Nicolelis, 2004). Outro componente na cadeia de plasticidade sináptica que possui grande 
importância no processo de formação e manutenção de memórias é o fator trófico 
derivado do cérebro (BDNF, do inglês brain-derived neurotrophic factor) (Bekinschtein 
et al., 2014; Leal et al., 2015). Podemos ver um esquema da relação das cinases, genes 
imediatos e fatores neurotróficos na Figura 10. 
 
Figura 10. Figura 
exemplificando, 
numa conexão entre 
CA3 e CA1, 
mecanismos 
plásticos 
relacionados ao 
LTP. É mostrada 
uma sequência de 
modificações que vai 
do botão sináptico 
(PK e CAMKII), 
passando por 
alterações de 
expressão gênicas 
(CREB) até efetores 
que induzem 
modificação 
estrutural (BDNF). 
 
 
 
 
 19 
 
 
Tão importante quanto o funcionamento de receptores glutamatérgicos, são as 
ações de sistemas de neurotransmissores moduladores, seja através da modulação da 
atividade dos receptores glutamatérgicos como também das cascatas bioquímicas e de 
expressão gênica tratadas acima (Blake et al., 2014; Hansen & Manahan-Vaughan, 2012; 
Knox, 2016; Rossato et al., 2009; Zhang & Stackman, 2015). Sistemas como o 
colinérgico, noradrenérgico, serotonérgico e dopaminérgico possuem projeções para 
formação hipocampal (Andersen et al., 2006), e modulam a atividade de cinases, genes 
imediatos e fatores neurotróficos relacionados a aprendizagem, aquisição e consolidação 
de memórias (Cammarota et al., 2008; Hansen & Manahan-Vaughan, 2012; Rossato et 
al., 2009). 
O sistema dopaminérgico, por exemplo, é implicado tanto na aquisição como na 
manutenção da memória (França et al., 2016, 2015; Rossato et al., 2009). Já foi visto que 
a modulação da atividade de receptores dopaminérgicos da família D1 no hipocampo leva 
a persistência de memórias de longo prazo (Rossato et al., 2009). Essa persistência da 
memória é relacionada à plasticidade induzida por BDNF, na janela de tempo de 12 horas 
após a aquisição da memória (Rossato et al., 2009). Mais especificamente, é relacionada 
à indução de plasticidade nos dendritos apicais de neurônios piramidais da região CA1 
(Navakkode et al., 2012) e à plasticidade induzida em interneurônios parvalbumina 
positivos da região CA1 (Karunakaran et al., 2016). A modulação de receptores 
dopaminérgicos do tipo D2 também é relacionada ao processo de aquisição e 
consolidação das memórias (França et al., 2016, 2015). A injeção de antagonista de 
receptores D2 leva à diminuição em cadeia da cinase dependente de cálcio ao longo de 3, 
6 e 12 horas após a injeção; a diminuição da expressão do gene imediato Zif-268 é vista 
6 horas após a injeção e, por último, a diminuição de BDNF é vista 12 horas após a injeção 
(França et al., 2015). Estes resultados estão de acordo com a janela de tempo da ação de 
BDNF (Navakkode et al., 2012; Rossato et al., 2009). Possivelmente, a ação de receptores 
D2 se dá através do controle do sono REM (França et al., 2015), que é relacionado aos 
processos plásticos da consolidação das memórias (Ribeiro et al., 2007; Ribeiro & 
Nicolelis, 2004). 
 
 
 20 
 
 
O sistema colinérgico também é relacionado ao processo de aprendizagem (Martí 
Barros et al., 2004) e sua ação é estreitamente ligada ao sistema dopaminérgico, 
ocorrendo através de inputs colinérgicos em núcleos dopaminérgicos (de Kloet et al., 
2015; Subramaniyan & Dani, 2015). Diferentes receptores colinérgicos do tipo nicotínico 
participam de diferentes processos cognitivos (Levin, 2002), e a transmissão colinérgica 
modula a potenciação de longa duração na região CA1 (Al-Onaizi et al., 2016). Os anexos 
1, 2 e 3 desta tese discutem o papel dos sistemas dopaminérgicos e acetilcolinérgicos, 
trazendo evidências comportamentais, moleculares e eletrofisiológicas em intervenções 
psicofarmacológicas em camundongos submetidos a tarefas cognitivas hipocampo-
dependentes. 
 
 1.2.2 – Formação hipocampal e a memória reconhecimento 
Em geral, as investigações sobre memória envolvem a manipulação 
farmacológica (sistêmica ou localizada). ou lesões específicas de estruturas ou vias da 
formação hipocampal (descrita na seção 1.1). Tais manipulações são acompanhadas da 
verificação do comportamento do animal em alguma tarefa e/ou a verificaçãodos níveis 
de moléculas relacionadas à memória (descritas na seção 1.2). 
Dentro desse contexto, testes de reconhecimento de objetos foram propostos em 
1988, sendo mostrado a tendência natural do roedor de explorar a novidade em detrimento 
da familiaridade (Ennaceur & Delacour, 1988). Posteriormente, esses testes foram 
empregados para investigar a função de regiões, circuitos, células e moléculas na 
formação, consolidação e evocação de memória (Antunes & Biala, 2012; Blaser & 
Heyser, 2015). Vale citar que a utilização do paradigma de reconhecimento de objetos 
também é aplicado para o estudo de doenças relacionadas ao sistema nervoso central, 
como esquizofrenia (Rajagopal et al., 2014), Alzheimer (Bengoetxea et al., 2015), 
Parkinson e autismo (Grayson et al., 2015). 
A capacidade de reconhecimento de padrões, objetos, lugares e contextos está 
ligada à formação hipocampal (Brun et al., 2002a; Daumas et al., 2005; Dere et al., 2007; 
Nakazawa et al., 2002; Suzuki et al., 1997). Como explicitado na seção 1.2.1, o 
 
 
 21 
 
 
funcionamento de receptores NMDA como indutor de plasticidade, seja por mecanismo 
de LTP ou LTD, está ligado ao processo de manutenção de memória. Foi observado por 
Kem e Manahan-Vaughan (2004) que a exploração de objetos novos facilita o mecanismo 
de LTD e dificulta o mecanismo de LTP no stratum radiatum da região CA1 (Kemp & 
Manahan-Vaughan, 2004). O uso de drogas antagonistas à ação de AMPA ou NMDA, 
aplicadas sistemicamente ou intra-hipocampal, prejudica a aquisição e a consolidação de 
memórias ligadas ao reconhecimento de objetos (Dere et al., 2007). Mais 
especificamente, camundongos knock-out para a subunidade 1 do receptor NMDA (que 
inviabiliza a função do receptor) na região CA1 do hipocampo possuem prejuízo no 
reconhecimento de objetos e na tarefa de associação de medo ao contexto; no entanto, a 
capacidade de reconhecimento é recuperada ao induzir plasticidade na região CA1 através 
de exposição a ambientes enriquecidos (Rampon et al., 2000). Já animais knock-out para 
os receptores NMDA na região CA3 possuem capacidade de reconhecimento e reativação 
de memória espacial; porém, estes animais exibem prejuízo da memória quando há 
diminuição das pistas espaciais no momento da reativação, o que revela o envolvimento 
de CA3 em memórias associativas ao contexto (Nakazawa et al., 2002). 
A modulação de receptores dopaminérgicos influencia na discriminação de 
objetos e contextos (França et al., 2016, 2015; Melichercik et al., 2012; Puma et al., 1999; 
Tian et al., 2015). Animais knock-out total ou parcial para o transportador de recaptação 
da dopamina da fenda sináptica (modelos de hiperdopaminergia) apresentam mudança no 
padrão da procura e interação com objetos novos (Pogorelov et al., 2005), déficit em 
reconhecimento de objetos (França et al., 2016) e no completamento de padrões (Li et al., 
2010). Estes resultados mostram a importância da dopamina balanceada no momento da 
codificação de memórias. A capacidade de discriminação de objetos é recuperada ao 
utilizar antagonista de receptores D2 (haloperidol 0.05 mg/Kg) na fase de codificação da 
memória nos camundongos com knock-out parcial para o transportador dopaminérgico 
(França et al., 2016). Quando o antagonista de receptores D2 (haloperidol 0.3 mg/Kg) é 
utilizado em camundongos selvagens na fase posterior à codificação dos objetos, pode 
ser observado o prejuízo na discriminação de objetos junto a uma diminuição de cascatas 
moleculares relacionadas a traços de memória (França et al., 2015). Drogas que modulam 
 
 
 22 
 
 
receptores D1/D5 também interferem na discriminação de objetos; por exemplo, um 
agonista D1/D5 injetado pós-treino (SKF 10 mg/Kg) prejudica a discriminação de objetos 
novos (de Lima et al., 2011). 
A modulação da atividade de receptores colinérgicos também pode causar 
prejuízo ou aumentar a discriminação de objetos novos e contextos (Anexo 3; Gould & 
Lommock, 2003; Kutlu & Gould, 2015; Puma et al., 1999; Tian et al., 2015). A nicotina, 
que atua em receptores colinérgicos, leva a um aumento na discriminação de objetos e 
contextos em baixas doses (0.1 – 0.4 mg/Kg) (Gould & Lommock, 2003; Puma et al., 
1999; Rezvani & Levin, 2001), mas em altas doses (1.5 mg/Kg) prejudica a discriminação 
de objetos e espaços (Anexo 3). Camundongos submetidos à dose de 1.5 mg/Kg pré-
treino passam a preferir o objeto familiar em detrimento do objeto novo (Anexo 3). A 
mesma dose injetada após a fase de codificação de memória reverte o padrão de 
exploração (Anexo 3). 
A exploração de contextos novos leva a uma assinatura eletrofisiológica na 
atividade de campo local nas regiões CA1 e CA3 do hipocampo (Berke et al., 2008), 
enquanto a associação contextual leva a um aumento no acoplamento entre a atividade 
oscilatória de teta e gama na região CA3 (Tort et al., 2009). A conexão entre o córtex 
entorrinal e CA1 parece ter papel chave para localização e reconhecimento espacial, já 
que a ausência de CA3 não afeta o reconhecimento de novos ambientes; a conexão entre 
o córtex entorrinal e CA1 parece ser suficiente para manter a codificação de espaço por 
células de lugar em CA1, e a capacidade de reconhecimento de lugar (Brun et al., 2002). 
Tais características relacionadas a atividades oscilatórias serão discutidas na seção 1.4. 
 
1.3 – Modulação da codificação de memória de reconhecimento pelas células 
OLMα2 (Artigo 1). 
Como dito seção 1.1, o hipocampo apresenta uma variedade de interneurônios 
GABAérgicos em diferentes camadas que modulam a atividade das células piramidais 
(Freund & Buzsáki, 1996). As projeções axonais perisomáticas tendem a inibir as saídas 
dos neurônios piramidais, enquanto que as dendríticas inibem as entradas (Klausberger 
 
 
 23 
 
 
& Somogyi, 2008). Os interneurônios na região CA1 que possuem corpos celulares no 
stratum oriens e projeções axonais enviadas para o stratum lacunosum-moleculare são 
denominadas de células OLM (Figura 5 e 11). As células OLM modulam a atividade dos 
neurônios piramidais através da inibição de seus dendritos apicais distais (Amaral & 
Witter, 1989). As células OLM recebem projeções diretas de neurônios colinérgicos, que 
por sua vez são relacionados a aprendizagem e consolidação de memórias (Bunce et al., 
2004; Easton et al., 2012; Elvander et al., 2004). 
 
 Figura 11. Imagem de reconstrução do 
neurolúcida de dois interneurônios. Em preto o 
soma e dendritos, e em vermelho os axônios de 
um interneurônio IS-III que modula a atividade 
de células OLM. Em verde o corpo celular e os 
dendritos no stratum oriens, e em azul os 
axônios projetados no stratum lacunosum-
moleculare de um célula OLM (Chamberland 
& Topolnik, 2012). 
 
 
1.3.1 – Sistema Cre-loxp, optogenética e o controle das células OLMα2. 
As células OLM foram caracterizadas através de animais transgênicos, e 
ferramentas eletrofisiológicas e optogenéticas por Leão e colaboradores (2012). Nesse 
trabalho foi verificado que a subunidade α2 do receptor colinérgico (Chrnα2) é expressa, 
dentro do hipocampo, exclusivamente nas células OLM do CA1, o que possibilitou usá-
la como marcador molecular desta subpopulação de células OLM (Leão et al., 2012; 
Mikulovic et al., 2015), aqui referida como “células OLMα2”. 
Para conseguir controlar a atividade dos interneurônios OLMα2 de forma 
específica, foi utilizado o sistema de manipulação genético Cre-loxp (Leão et al., 2012). 
Esse sistema foi descoberto no vírus bacteriófago P1, que o utiliza para reparação e 
 
 
 24 
 
 
estabilização de ADN durante a infecção da bactéria alvo (Sauer, 1998). O Cre-loxp 
utiliza duas variáveis importantes: (1) Cre recombinase, uma enzima que identifica pares 
de sequências específicas de ADN e inverte sua sequência (por exemplo, 3’-5’ para 5’-
3’); e (2) loxp, que é uma sequência de 13-bp invertida identificada pela Cre recombinase 
(Brault et al.,2007; Fenno et al., 2011; Sauer, 1998). O uso desse sistema de identificação 
e inversão da sequência de ADN pode ser associado a uma grande variedade de 
manipulações genéticas (Brault et al., 2007). Por exemplo, através da inserção de genes 
de interesse flanqueados pela sequência de loxp, e pela interação com a Cre recombinase, 
é possível estabelecer o knock-out e o knock-in de genes específicos, ou a expressão de 
genes em células específicas (Brault et al., 2007). 
A optogenética é uma técnica experimental moderna que utiliza rodopsinas para 
manipular a atividade de subtipos específicos de neurônios (Fenno et al., 2011). As 
rodopsinas são estruturas proteicas que incluem canais ou bombas iônicas, cuja 
conformação tridimensional é modificada na presença de luz em faixas comprimento de 
onda específicos (Deisseroth, 2011). Existem diversos canais ou bombas iônicas sensíveis 
à luz; por exemplo, o canal de cátions ChR2 (channelrodopsin-2) é oriundo de uma 
espécie de alga verde, e a bomba de prótons Arch (archaerhodopsin) oriunda de archaea 
bactérias (Madisen et al., 2012; Schneider et al., 2015). O canal de cátions ChR2 é 
sensível ao comprimento de onda de ~473 nm, que corresponde ao azul. Na presença da 
luz azul, sua conformação é modificada e o canal permite a passagem de cátions 
(principalmente sódio) para dentro da célula, provocando a despolarização da membrana 
e facilitando a atividade neuronal (Schneider et al., 2015). Já a bomba de prótons Arch é 
sensível à luz de comprimento de onda 532 nm; na presença de luz verde, Arch retira 
prótons de dentro para fora da célula, provocando hiperpolarização da membrana 
(Madisen et al., 2012). 
Leão e colaboradores (2012) associaram o sistema de Cre-loxp à optogenética 
para manipular especificamente as células OLMα2. Um animal transgênico foi 
desenvolvido utilizando Chrnα2 (a proteína que é expressa no hipocampo exclusivamente 
nas células OLM) como promotor da expressão de Cre recombinase e de um marcador 
bioluminescente vermelho (tomato) para identificar as células Cre+. Dessa forma, 
 
 
 25 
 
 
somente os neurônios OLM se tornaram Cre+ (Leão et al., 2012). Posteriormente, 
utilizando a estratégia doublefloxed inverted open-reading-frame (DIO; Figura 12), foram 
injetados nos animais Chrnα2-Cre/Tomato vetores virais duplamente flanqueados por lox 
contendo o gene de ChR2. Dessa maneira, o canal ChR2 foi exclusivamente expresso em 
células Chrnα2-Cre/Tomato infectadas (Leão et al., 2012). Um esquema da associação 
entre as ferramentas Cre-loxp e optogenética pode ser visto na Figura 12. 
 
Figura 12. Esquema do funcionamento do sistema Cre-loxp utilizando a estratégia de 
doublefloxed inverted open-reading-frame (DIO). Podemos observar em (a) o esquema da 
injeção viral, que infecta tanto células Cre+ (onde o Cre é expresso) e Cre- (onde não há 
expressão de Cre). A inversão da sequência específica de ADN só ocorre nas células Cre+. (b) 
Esquema do conteúdo da injeção viral. A primeira sequência gênica possui 5 genes: EF1α 
corresponde ao promotor; loxp corresponde à sequência a ser identificada e invertida por Cre; 
lox2722 é a sequência de parada; eYFP é o gene que codifica uma proteína bioluminescente; 
ChR2 é o gene que codifica o canal sensível à luz. Note que a sequência de eYFP e ChR2 está 
invertida. Ao final do processo, Cre identifica o loxp e inverte a sequência de eYFP e ChR2, que 
passam a ser expressas exclusivamente nas células Cre+ (Fenno et al., 2011). 
 
 
 
 26 
 
 
1.3.2 – Células OLMα2 e o controle das entradas do córtex entorrinal 
Leão e colaboradores (2012) verificaram que as células OLMα2 modulam a 
atividade dos neurônios piramidais inibindo os dendritos apicais distais no stratum 
lacunosum-moleculare, e tal modulação diminui entradas do córtex entorrinal (Figura 13; 
Leão et al., 2012). Essa evidência foi obtida através de protocolos de indução de LTP em 
fatias de hipocampo. Em particular, os autores estimularam eletricamente a via têmporo-
amônica (via de comunicação entre o córtex entorrinal com a região CA1) e registraram 
respostas de potencial de campo no stratum lacunosum-moleculare. Foram investigados 
dois animais transgênicos: (1) animal Chrna2-cre, e (2) animal Chrna2-cre/Viaatloxp/loxp, 
que não possuem transportadores vesiculares GABAérgicos nas células OLMα2, 
inviabilizando a função inibitória destes interneurônios. Ambos animais foram sujeitos à 
injeção hipocampal de vírus contendo o gene de ChR2 flanqueado por lox; portanto, em 
ambos animais as células OLMα2 tornaram-se sensíveis à luz azul. Ao estimular a via 
têmporo-amônica e registrar nas fatias dos animais Chrna2-cre sem incidência 
concomitante de luz, houve um aumento das respostas em relação à linha de base, 
indicando um aumento de excitabilidade característica do fenômeno de LTP (Leão et al., 
2012). Entretanto, ao associar a estimulação elétrica da via têmporo-amônica com a 
incidência da luz azul, a potenciação da resposta pós-sináptica foi significativamente 
menor, indicando que as células OLMα2 – estimuladas optogeniticamente – inibiram a 
indução de LTP (Leão et al., 2012). Por último, ao utilizar animais Chrna2-
cre/Viaatloxp/loxp, pôde-se verificar uma potenciação ainda maior que nas duas condições 
anteriores, corroborando a função inibitória das células OLMα2 sobre a via têmporo-
amônica (Leão et al., 2012). Esse trabalho também mostrou que as células OLMα2 inibem 
interneurônios localizados no stratum radiatum que modulam as entradas de CA3 pela 
via colateral de Schaffer, facilitando assim a conexão CA3-CA1 (Leão et al., 2012). Por 
último, foi verificado que as células OLMα2 se conectam entre si por sinapses elétricas e 
recebem projeções colinérgicas diretas (Leão et al., 2012). Um esquema da conectividade 
apresentada pelas OLM pode ser visto na Figura 14. 
 
 
 27 
 
 
Figura 13. Experimento de 
estimulação da via temporo-
amônica em três condições 
experimentais: (1) Fatias de 
hipocampo de animais Chrna2-
cre que expressam canais de 
sódio sensíveis à luz (ChR2) 
mas na ausência de luz 
(branco). (2) Como em (1) mas 
na presença de luz azul (preto). 
(3) Fatias de animais Chrna2-
cre que expressam ChR2 mas não expressam transportador vesicular de GABA nas células 
OLMα2 (vermelho). Nesse experimento, a via têmporo-amônica é estimulada e o registro ocorre 
no stratum lacunosum-moleculare. As fatias da condição 2 exibem menor LTP, mostrando que 
as células OLMα2 modulam sinapses do córtex entorrinal para a região CA1. 
 
Figura 14 Esquema de conexões entre 
as células OLMα2 (laranja) e 
neurônios piramidais (preto) da 
região CA1. Pode ser visto as 
conexões elétricas entre as células 
OLMα2, a conexão inibitória entre 
células OLMα2 e interneurônios do 
stratum radiatum, e conexão 
inibitória entre células OLMα2 e 
neurônio piramidal no stratum 
lacunosum-moleculare. Pode ser 
visto também o input oriundo de 
neurônios colinérgicos (verde) a 
células OLMα2 (Leão et al., 2012). 
 
A região CA1 do hipocampo está implicada em aprendizagem e consolidação de 
memórias (Tsien et al., 1996), bem como na codificação de informações do ambiente 
 
 
 28 
 
 
(Lenck-Santini et al., 2005), reconhecimento de objetos (Rampon et al., 2000), e 
condicionamento ao medo (Ji & Maren, 2008; Lee & Kesner, 2004). Levando em conta 
que (1) lesão da camada do córtex entorrinal que projeta para a região CA1 prejudica a 
localização espacial e a atividade das células de lugar (Brun et al., 2008; Van Cauter et 
al., 2008), e que (2) as células OLM atuam na organização temporal de oscilações na 
frequência de teta (Forro et al., 2015) relacionadas a processos cognitivos hipocampo-
dependentes (Tort et al., 2009), nós hipotetisamos que as células OLMα2 podem controlar 
a formação de memórias hipocampo-dependentes. 
Para testar nossa hipótese, o artigo 1 desta tese investigou a participaçãodas 
células OLMα2 na modulação da codificação da memória de objetos explorados em um 
campo aberto, e também na formação de uma nova memória associativa de medo a um 
contexto. Utilizando camundongos Chrna2-cre e ferramentas optogenética, fomos 
capazes de modular especificamente a atividade das células OLMα2 nas tarefas de 
reconhecimento de objetos (NOR, do inglês novel object recognition) e numa tarefa de 
esquiva contextual passiva. Descobrimos que a ativação optogenética de células OLMα2 
pareada ao momento em que os animais exploram um objeto específico ("objeto 
iluminado") prejudica o seu reconhecimento subsequente, mas não afeta o 
reconhecimento de um segundo objeto que não teve pareamento com a ativação de células 
OLMα2 ("objeto não iluminado"). Por outro lado, a inibição de células OLMα2 aumenta 
seletivamente a memória de reconhecimento para o “objeto iluminado". A estimulação 
de células OLMα2 enquanto os animais não estavam engajados na exploração dos objetos 
não afetou a memória de reconhecimento. Finalmente, descobrimos que a ativação de 
células OLMα2 durante o treino na tarefa de esquiva contextual passiva também prejudica 
a aquisição desta memória associativa. Concluímos que as células OLMα2 possuem papel 
chave no controle da codificação das memórias hipocampo-dependentes, seja de objeto 
ou contextual. Provavelmente esse resultado é devido à capacidade das células OLMα2 
de filtrar informação multimodal transmitida do córtex entorrinal para o hipocampo. 
 
 
 
 29 
 
 
1.4 – Oscilações hipocampais e detecção de novidade (Artigo 2) 
Como dito na seção 1.2, o processo de aprendizagem, aquisição e consolidação de 
memórias leva a algumas assinaturas eletrofisiológicas (Berke et al., 2008; Hafting et al., 
2005; O’Keefe & Dostrovsky, 1971; Tort et al., 2009). O estudo de oscilações em 
potenciais de campo local (LFPs, do inglês local field potential) é uma abordagem 
importante para o entendimento do funcionamento do sistema nervoso central. A 
compreensão dos ritmos cerebrais pode elucidar diversas características fisiológicas, 
desde atividades sinápticas até os circuitos envolvidos na formação de memórias e na 
transferência de informações entre regiões do cérebro. Diversos estudos ao longo das 
últimas décadas visaram relacionar a atividade oscilatória neuronal com a expressão de 
comportamentos (Brankack et al., 1993; Buzsáki et al., 2012; Buzsáki & Draguhn, 2004; 
Buzsáki & Watson, 2012). 
As oscilações corticais resultam de atividades eletroquímicas das membranas 
excitáveis; há participação de neurônios excitatórios e inibitórios com diferentes pesos na 
formação das oscilações (Buzsáki et al., 2012). As oscilações podem ser detectadas em 
neurônios individuais (Kamondi et al., 1998), mas são comumente investigadas na escala 
mesoscópica do potencial de campo local (Buzsáki & Draguhn, 2004), que representa a 
atividade de um conjunto de neurônios (Figura 15). Entre as funções atribuídas à atividade 
oscilatória, estão a modulação da excitabilidade de neurônios, sincronia de atividade 
neuronal, transferência de informações entre áreas do cérebro e combinação de 
informações (Buzsáki & Draguhn, 2004). 
 
 
 30 
 
 
 
Figura 15 Exemplo de registros de atividade de neurônio individual e de populações neuronais 
(LFP) (Buzsáki et al., 2012). 
No hipocampo, muitos estudos têm centrado no papel das oscilações teta (5-12 
Hz; Buzsáki, 2002; Vanderwolf, 1969; Winson, 1978), oscilações gama (30-100 Hz; 
Colgin et al., 2009; Csicsvari et al., 2003; Montgomery & Buzsáki, 2007), oscilações de 
alta-frequência (110-160 Hz; Scheffer-Teixeira et al., 2013, 2012; Tort et al., 2013), e 
oscilações ripples (150-250 Hz; Buzsáki et al., 1992; Ego-Stengel & Wilson, 2010; 
Girardeau et al., 2009) em diferentes comportamentos e estados cognitivos (Figura 16). 
Estas oscilações neuronais também variam de acordo com o estágio do ciclo sono e vigília 
(Gervasoni et al., 2004). 
Entre resultados recentes que relacionaram oscilações neuronais com funções 
cerebrais, citamos a modulação de oscilações de altas frequências por oscilações de baixas 
frequências durante tomada de decisão (Tort et al., 2008); o aumento de acoplamento 
entre teta e gama durante uma tarefa de distinção de contextos (Tort et al., 2009); e o 
déficit de memória espacial em ratos através de supressão da atividade de ondas ripples 
do hipocampo (Ego-Stengel & Wilson, 2010; Girardeau et al., 2009). 
 
 
 31 
 
 
 
Figura 16. Exemplos de traçados de sinais brutos de potenciais de campo local do hipocampo. 
Cores dos traçados correspondem a faixa de frequência indicada na escala de cor abaixo, em 
preto o sinal de potencial de campo local filtrado nas frequências indicadas. 
De relevância para a presente tese, o trabalho de Berke e colaboradores (2008) 
mostrou uma associação entre o aumento de potência da oscilações beta2 (23 -30 Hz) e a 
exploração de ambientes novos. Esse trabalho mostrou que o beta2 aumenta de forma 
transiente no início da exploração de um ambiente novo, e que os neurônios da região 
CA1 e CA3 do hipocampo são acoplados a esta oscilação (Figura 17; Berke et al., 2008). 
Nesse trabalho é colocada a hipótese de que a oscilação beta2 constitui um estado 
funcional discreto do hipocampo que permite a plasticidade durante a aprendizagem de 
novos contextos (Berke et al., 2008). Beta2 seria dependente de transmissão de receptores 
NMDA (Berke et al., 2008), que por sua vez é envolvido com aprendizagem rápida 
(Nakazawa et al., 2003). 
 
 
 32 
 
 
 
Figura 17 Espectros de potência onde pode ser visto o aumento transitório de potência na faixa 
23-30 Hz em um ambiente novo, mas não em um familiar (Berke et al., 2008). 
De toda forma, se torna curioso o porquê de uma oscilação que é sugerida como 
componente do processo de aprendizagem de novos contextos não ter sido descrita 
anteriormente na literatura, principalmente levando-se em conta que o hipocampo é uma 
estrutura bastante estudada e que, segundo os achados de Berke e colaboradores (2008), 
a oscilações beta2 possuiriam magnitude similar às bem descritas oscilações teta. 
O artigo 2 desta tese investiga o aparecimento de oscilações beta2 na detecção de 
novidade. Através de registros com múltiplos eletrodos isolados no hipocampo, córtex 
motor primário e córtex somato-sensorial primário, caracterizamos as oscilações beta2 
em camundongos durante o teste de reconhecimento de objetos. Encontramos que beta2 
aparece de forma transiente durante a exploração de novos objetos. Verificamos também 
que esta oscilação não está presente no córtex motor primário nem no córtex somato-
sensorial, mas somente no hipocampo. Consistente com esse achado, somente neurônios 
hipocampais são modulados pela fase de beta2, mas não neurônios neocorticais. 
Verificamos também que uma intervenção farmacológica que prejudica a consolidação 
 
 
 33 
 
 
da memória de reconhecimento é capaz de modificar o padrão de aparecimento das 
oscilações beta2. Estes resultados dão suporte à hipótese de que as oscilações beta2 
participam no processo de detecção de novidade, provavelmente sinalizando períodos 
para a ocorrência de plasticidade na rede. 
 
 
 
 34 
 
 
2.0 – Artigo 1 
Submetido para Neuron como Report 
OLMα2 cells control encoding of recognition and avoidance memory 
Arthur S. C. França1#,, Samer Siwani2#, Amilcar Reis2, Sanja Mikulovic2, Markus 
M. Hilscher1,2, Steven J. Edwards2, Richardson N. Leão1,2, Adriano B. L. Tort1, 
Klas Kullander2* 
# The first two authors contributed equally to this work. 
Running title: OLMα2 cells control memory encoding 
1Brain Institute, Federal University of Rio Grande do Norte, Brazil. 
2Developmental Genetics, Department of Neuroscience, Uppsala University, 
Uppsala, Sweden. 
*Corresponding author: 
Klas Kullander: klas.kullander@neuro.uu.se 
 
Keywords: OLM cells; ObjectRecognition; Passive Inhibitory Avoidance; 
Memory. 
 
 
 35 
 
 
SUMMARY 
 
Learning and memory depend on several brain structures and a variety of 
cell types within these structures. That inhibitory interneurons participate 
in mnemonic processes is undisputed; however, defined roles for identified 
interneuron populations are still scarce. Oriens lacunosum-moleculare 
(OLM) interneurons are positioned to control the flow of information into 
CA1. In particular, a subpopulation of OLM cells genetically defined by the 
expression of the nicotinergic receptor α2 subunit has been shown to gate 
information carried by either the temperoammonic pathway or Schaffer 
collaterals in vitro. Here we set out to determine whether selective 
modulation of OLMα2 cell activity can affect learning and memory in vivo. 
Our data show that OLMα2 cells control encoding of object and contextual 
fear memories in freely moving mice, suggesting that OLMα2 cells are an 
important component in the CA1 microcircuit regulating learning and 
memory processes. 
 
 
 
 
 36 
 
 
INTRODUCTION 
The hippocampus has a variety of GABAergic interneurons that inhibit 
pyramidal cells in distinct subcellular domains (Freund and Buzsáki, 1996). While 
interneurons targeting perisomatic domains gate pyramidal cell output, dendritic-
targeting interneurons modulate pyramidal cell input (Klausberger and Somogyi, 
2008). Among the latter, oriens lacunosum-moleculare (OLM) cells have soma 
located in stratum oriens and send axonal projections to the distal dendrites of 
pyramidal cells in stratum lacunosum-moleculare, where inputs from the 
temporo-ammonic pathway arrive (Leão et al., 2012). OLM cells are thus 
positioned to control the entrance of multimodal information from the entorhinal 
cortex into the hippocampus. 
The hippocampal CA1 area is involved in the recognition of familiar objects 
(Basu et al., 2016; Rampon et al., 2000) as well as in contextual fear conditioning 
(Basu et al., 2016; Ji and Maren, 2008; Lee and Kesner, 2004), but the underlying 
neuronal circuitry remains largely unknown. In CA1, OLM cells that specifically 
express the nicotine acetylcholine receptor α2 subunit (encoded by the Chrna2 
gene) form a genetically defined population of neurons (Leão et al., 2012), 
referred to as OLMα2 cells. We have previously shown that OLMα2 cells control 
the flow of information into CA1, facilitating transmission from CA3 while inhibiting 
entorhinal cortex inputs (Leão et al., 2012; Mikulovic et al., 2015). Interestingly, 
OLMα2 cells receive direct cholinergic transmission (Leão et al., 2012), and 
acetylcholine has been implicated in learning and memory processes (Elvander 
et al., 2004; Tian et al., 2015). Further, the interconnectivity between the 
neocortex and hippocampus is essential to memory formation (Brun et al., 2008). 
Because multimodal information about objects and contexts reaches CA1 
through the temporoammonic pathway (Amaral and Witter, 1989), we 
hypothesized that OLMα2 cells could play a role in the encoding of new object 
representations and contextual fear memory. To test this hypothesis, we 
activated or silenced OLMα2 cells in freely moving Chrna2-cre mice during 
 
 
 37 
 
 
training in novel object recognition (NOR) and contextual passive avoidance 
tasks. 
 
RESULTS 
To study the role of OLMα2 cells in memory encoding, we crossbred Chrna2-cre 
with tdTomato reporter mice to visualize red fluorescent Chrna2-cre expressing 
cells in the hippocampus (Figure 1A). Corroborating our previous study (Leão et 
al., 2012), the tomato protein was specifically expressed in OLM cells, that is, 
interneurons with soma in stratum oriens and massive projections to stratum 
lacunosum-moleculare (Figure 1A and Video S1). We delivered the light-gated 
cation channel channelrhodopsin (ChR2) or the proton pump archeorhodopsin 
(Arch) via bilateral injection of double-floxed inverted open-reading-frame adeno-
associated viral vectors to the intermediate hippocampus (Figure 1B and D). 
Successfully infected OLMα2 cells also expressed the virally encoded yellow 
fluorescent protein (EYFP) (Figure 1A-D). We performed patch-clamp recordings 
to corroborate that OLMα2 cells became responsive to light. Rhythmic application 
of blue light at 8 Hz increased spiking in OLMα2 cells expressing ChR2 (Figure 
1C). Conversely, green light inhibited spiking in OLMα2 cells expressing Arch 
(Figure 1E). We also examined the expression of the immediate early gene c-Fos 
following light stimulation of ChR2-expressing OLMα2 cells in freely moving 
animals implanted with optical fibers (Figure 1F and G; see Experimental 
Procedures). The number of cells in the stratum oriens that became 
immunopositive for c-Fos after in vivo light stimulation in ChR2 animals (Chrnα2-
cre mice injected with ChR2 virus) was significantly increased compared to 
control mice (Chrnα2-cre mice injected with a sham virus; Figure 1G). These 
results show that optogenetic tools can control OLMα2 cell activity in freely 
moving animals. 
We next investigated the behavioral consequence of activating OLMα2 
cells in hippocampal-dependent memory tasks. The recognition of novel objects 
 
 
 38 
 
 
constitutes a test of episodic-like memory and is impaired in rodents with 
hippocampal lesions (Antunes and Biala, 2012; Blaser and Heyser, 2015). We 
used a novel object recognition task in which animals were allowed to explore 
two different objects during 10 minutes in two sessions, named training and test 
sessions. We first subjected mice to experimental protocols in which - in the 
training session - a computer coupled to a detection system delivered blue light 
to both hippocampi of control and ChR2 animals during exploration of one of the 
two objects (lit object) but not during exploration of the other object (non-lit; Video 
S2). In the test session performed 24 hours later, the mice were re-exposed to 
one familiar and one new object. In the protocol named “non-lit object replaced”, 
animals were exposed to the previously lit object and a new object in the test 
session. Control animals spent more time exploring the new object than ChR2 
animals, who explored the new and the previously lit object equally (Figure 2A, 
Tables S1 and S2), indicating impairment in object recognition. In a control 
experiment (“lit object replaced”), animals were exposed to the non-lit object and 
a new object, i.e. two objects not previously associated with OLMα2 cell 
modulation. In this protocol, both ChR2 and control animals spent more time 
exploring the new object, with no difference between groups (Figure 2B, Table 
S1 and S2). Thus, light-stimulation of OLMα2 cells during encoding selectively 
impaired encoding of memory for the lit object. 
Since the length of the intersession interval relates to performance in the 
object recognition test (Hammond et al., 2004), we next investigated if activating 
OLMα2 cells would also impair object recognition with an intersession interval of 
one hour. We found similar results as in the 24-hour protocols: ChR2 animals 
spent equal time with the new and previously lit object, but recognized the non-lit 
object (Figure 2C and D, Tables S1 and S2). We therefore used 1-hour 
intersession intervals in subsequent protocols. 
We next investigated the effect of inhibiting OLMα2 cells on object 
recognition. To that end, we delivered green light during training to mice whose 
OLMα2 cells expressed Arch (Arch animals). In the test session with the non-lit 
 
 
 39 
 
 
object replaced, both Arch and control animals exhibited preference for the new 
object (Table S2). Remarkably, Arch animals spent significantly more time 
exploring the new object than the previously lit object compared to control animals 
(Figure 2E, Tables S1 and S2). In contrast, replacing the lit object by a new objectdid not result in any significant differences between groups (Figure 2F, Tables S1 
and S2), showing that light-inhibition of OLMα2 cells selectively improved 
discrimination for the lit object. 
In a set of control experiments, we stimulated OLMα2 cells while ChR2 
animals were in the arena but disengaged from object exploration. This had no 
effect on the object preference in the test session (Figure 2E and Tables S1 and 
S2). Likewise, light stimulation of OLMα2 cells after the training session did not 
produce any measurable differences between ChrR2 animals and controls, with 
both groups showing the expected exploration preference for the novel object in 
the test session (Figure 2G and Tables S1 and S2). Interestingly, and consistent 
with our findings above, ChR2 but not control animals explored the lit object 
significantly more when both the lit and non-lit objects were kept in the test 
session (Figure 2I, Table S1 and S2), suggesting that ChR2 animals perceived 
the previously lit object as a new object. 
Previous studies have shown that CA1 is involved in contextual fear 
conditioning (Corcoran et al., 2005; Rudy and Matus-Amat, 2005), and that 
somatostatin positive interneurons play a role in fear learning (Lovett-Barron et 
al., 2014). We next investigated whether OLMα2 cells may also be involved in 
the encoding of contextual fear memories using a passive inhibitory avoidance 
task. We used an arena with a brightly lit and a dark compartment. During training 
sessions, the animals received a foot shock in the dark compartment in order to 
acquire an aversion to this normally preferred compartment in future exposures 
to the arena (test sessions). ChR2 animals that were light-stimulated during 
training (i.e., during foot shock delivery) displayed significantly lower latency to 
enter the dark compartment in the test sessions compared to control animals 
(Figure 3, Table S3 and Video S3). Moreover, ChR2 mice also showed 
 
 
 40 
 
 
significantly higher velocity compared to controls. In contrast, mice whose OLMα2 
cells expressed Arch and were light-inhibited during the training sessions showed 
no difference in latency or velocity compared to controls (Figure 3, Table S3). 
Thus, whereas inhibition of OLMα2 cells had no effect, activation of OLMα2 cells 
impaired contextual fear memory encoding. 
DISCUSSION 
Our results show that OLMα2 cells can control memory encoding, either 
object or contextual representations. Light-mediated activation of OLMα2 cells 
resulted in impaired learning when animals were tested for object as well as 
emotion-related memories. In contrast, inhibition resulted in improved object 
recognition but did not affect emotion-related memories. 
In this in vivo study, light was applied only when animals were interacting 
with the object, as automatically determined by a computer by snout direction and 
proximity to the object. This ensured objectivity in onset of light-induced activation 
or inhibition of OLMα2 cells. In addition, we have focused on behaviors that were 
readily quantifiable and objectively measured by computer software. Post-
experiment analysis confirmed the proper location of viral injections and insertion 
of the light probe into the intermediate hippocampus. We used stimulation 
frequencies matching those previously measured in vivo in OLMα2 cells (Forro 
et al., 2015; Mikulovic et al, submitted), to as far as possible mimic endogenous 
activity. By using the clarity method (Chung and Deisseroth, 2013), we estimated 
the number of OLMα2 cells reached on each side to 338 out of a total of 3124 in 
the cleared hippocampus, based on our measured light power at ~1.5 mW/mm2 
at 1 mm, which should suffice to induce activity (Video S1; Histed and Maunsell, 
2014; Niyuhire et al., 2007). Corroborating this, we observed robust changes in 
behavior associated to light stimulation. 
In CA1, the intrahippocampal input from CA3 projects on proximal apical 
dendrites of pyramidal cells whereas the direct external input from the entorhinal 
 
 
 41 
 
 
cortex contacts the distal apical tuft dendrites (Kajiwara et al., 2008; Takahashi 
and Magee, 2009). The intrahippocampal and indirect pathway is primarily 
responsible for pattern separation and completion and association of diverse sets 
of information, whereas the direct pathway seems more important for recognizing 
the novelty of an event or context (Andersen et al., 2006; Lisman and Otmakhova, 
2001). Part of the multimodal information necessary for object and context 
recognition is directly related to the EC-CA1 connections through the 
temporoammonic pathway (Brun et al., 2008; Daumas et al., 2005; van Groen et 
al., 2003). Consistent with this, our findings suggest that when CA1 OLMα2 cells 
are activated and suppress distal direct inputs, learning is severely attenuated 
due to blockade of information mediated by the direct inputs from the entorhinal 
cortex. In further support, in the reverse situation, when OLMα2 cells were 
inactivated during learning, object recognition was improved. This result suggests 
that OLMα2 cells can potentially be used as a target for improving learning. Of 
note, dysfunctional OLM cell activity has been recently associated to memory 
deficits in an animal model of Alzheimer’s disease (Schmid et al., 2016). 
We found that OLMα2 cell activation also affected contextual fear learning. 
In the passive inhibitory avoidance test, mice which received OLMα2 cell 
activation concomitant with a foot shock maintained similar latency to enter in the 
dark compartment (shock associated) as in the training day, while control animals 
increased the latency showing normal encoding for the contextual fear memory. 
Indeed, rodents depend on the integrity of the hippocampus to produce 
contextual fear memories (Rudy and Matus-Amat, 2005; Wiltgen et al., 2006). In 
contrast, however, OLMα2 cell inactivation did not affect context fear memories. 
This is seemingly at odds with a previous study, which demonstrated that the 
inactivation of somatostatin positive interneurons in the oriens layer prevented 
fear learning (Lovett-Barron et al., 2014). This may be explained by the use of 
different genetic mouse lines (Mikulovic et al., 2015), genetic tools or stimulation 
protocols (Shapiro et al., 2012). In particular, it has been reported that the 
dynamic characteristics of the Cl- channel NphR3 can lead to a rebound action 
 
 
 42 
 
 
potential after release of light (Madisen et al., 2012; Raimondo et al., 2012). This 
could in principle generate activation instead of the intended inactivation. In 
addition, the areas of stimulation differed between the two studies (dorsal and 
intermediate hippocampus). Recent studies have reported on functional 
subdivisions of the hippocampus along both the transverse and dorsoventral axis 
(Cembrowski et al., 2016; Ito and Schuman, 2012). Importantly, nicotine has 
opposite effects in the dorsal and ventral hippocampus: while nicotine 
administered in the dorsal hippocampus impairs contextual fear memory, when 
administered in the ventral hippocampus nicotine enhances it (Kenney et al., 
2012). Since nicotine activates OLMα2 cells (Leão et al., 2012), this could 
indicate why we get similar results as Lovett-Barron through stimulation of 
OLMα2 cells in the intermediate hippocampus as was found by them through 
inhibition of somatostatin positive cells in the dorsal hippocampus. In this respect, 
it is also noteworthy that the number of OLMα2 cells displays a graded 
dorsoventral distribution, with a higher number of cells present ventrally 
(unpublished observations). 
In conclusion, this study provides direct evidence for a role of OLMα2 cells 
in memory formation processes, likely through gating of sensory information 
transmitted from the entorhinal cortex to hippocampus. 
 
 
 
 43 
 
 
 
EXPERIMENTAL PROCEDURES