AvaliacaoHLA-GSolAvel-Araujo-2018

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE 
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS 
 
 
 
 
 
 
JÉSSICA NAYARA GÓES DE ARAÚJO 
 
 
 
 
 
 
AVALIAÇÃO DO HLA-G SOLÚVEL E DO PERFIL DE CITOCINAS COMO 
POTENCIAIS BIOMARCADORES PLASMÁTICOS DO CARCINOMA 
PAPILÍFERO DA TIREOIDE 
 
 
 
 
 
 
 
NATAL - RN 
2018 
 
https://www.google.com.br/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwjXqe7k4N_QAhXHGpAKHRbvCN4QjRwIBw&url=http://www.minhapos.com.br/instituicoes/ufrn-universidade-federal-rio-grande-norte.html&psig=AFQjCNHyjFB2Bo-u9vDCPUIBm3gjDyam0A&ust=1481120180543080
 
 
 
JÉSSICA NAYARA GÓES DE ARAÚJO 
 
 
 
 
AVALIAÇÃO DO HLA-G SOLÚVEL E DO PERFIL DE CITOCINAS COMO 
POTENCIAIS BIOMARCADORES PLASMÁTICOS DO CARCINOMA 
PAPILÍFERO DA TIREOIDE 
 
 
 
 
 
 
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação 
em Ciências Farmacêuticas (PPgCF) da Universidade 
Federal do Rio Grande do Norte como requisito para obter 
o título de mestre em Ciências Farmacêuticas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
ORIENTADOR: Prof.a Dr.a Vivian Nogueira Silbiger 
CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. André Ducati Luchessi 
 
 
NATAL-RN 
2018 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN 
Sistema de Bibliotecas - SISBI 
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS 
 
 Araújo, Jéssica Nayara Góes de. 
 Avaliação do HLA-G solúvel e do perfil de citocinas como 
potenciais biomarcadores plasmáticos do carcinoma papilífero da 
tireoide / Jéssica Nayara Góes de Araújo. - 2018. 
 134f.: il. 
 
 Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do 
Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em 
Ciências Farmacêuticas. Natal, RN, 2018. 
 Orientadora: Vivian Nogueira Silbiger. 
 Coorientador: André Ducati Luchessi. 
 
 
 1. Neoplasias da Glândula Tireoide - Dissertação. 2. Carcinoma 
papilífero da tireoide - Dissertação. 3. Biomarcadores - 
Dissertação. 4. HLA-G solúvel - Dissertação. 5. Citocinas - 
Dissertação. I. Silbiger, Vivian Nogueira. II. Luchessi, André 
Ducati. III. Título. 
 
RN/UF/BS-CCS CDU 616.441-006.6 
 
 
 
 
 
 
Elaborado por ANA CRISTINA DA SILVA LOPES - CRB-15/263 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMENTOS 
 
À minha família, que sempre me apoiou e me incentivou, foram ouvidos para 
os momentos de insatisfação e frustação e me ajudaram a seguir perseverando até o 
final. O suporte e amor de vocês sempre me dá forças diante de todas as dificuldades 
e a isso sempre vou ser grata. 
À minha orientadora, Vivian Nogueira Silbiger, e ao meu co-orientador, André 
Ducati Luchessi, por me guiarem todos esses anos de vida acadêmica e por sempre 
acreditarem no meu potencial para conseguir vencer os desafios até mesmo quando 
eu não acreditei em mim mesma. Sou muito grata por todos os ensinamentos e pela 
confiança que depositaram em mim. 
Ao professor Eduardo Antônio Donadi, que forneceu todo o suporte para a 
realização deste estudo e fez valiosas contribuições para a escrita deste trabalho. 
Tenho muito a agradecer por ter me recebido em seu laboratório na FMRP-USP, no 
qual tive a oportunidade de executar os experimentos e aprender muito com seus 
alunos. 
À doutoranda Bruna Cristina Bertol, pela parceria que foi formada durante o 
meu estágio na FMRP-USP e foi essencial para o sucesso e finalização desse estudo. 
Não tenho palavras para agradecer a altura toda a ajuda que você me deu durante 
todo o processo de execução e escrita deste trabalho, e eu espero que essa 
colaboração aqui formada possa render muitos mais frutos. 
 Ao pós-doutorando, Ibrahim Sadissou, por ter me acompanhado nos 
experimentos e análises para esse estudo. Não esqueço todas as palavras de 
motivação que me ajudaram a continuar perseverando e acreditando. 
 Ao pós-doutorando, Raul Hernandes Bortolin, por todo o apoio e contribuições 
para o exame de qualificação. Sua ajuda foi muito importante para me tranquilizar 
durante esse momento. 
 Às professoras, Janaína Cristiana de Oliveira Crispim Freitas e Norma Lucena 
Cavalcanti Licínio da Silva, por todo o suporte e apoio para a realização das missões 
do projeto PROCAD para Recife e Ribeirão Preto, foram experiências muito 
enriquecedoras para o meu mestrado. Também sou muito grata pelas contribuições 
expostas durante o exame de qualificação para aprimorar o trabalho. 
 Ao grupo PPGFriends, por todo o carinho e palavras de motivação durante o 
mestrado. Nossa amizade formada durante a pós-graduação foi um verdadeiro grupo 
 
 
de apoio em todos os momentos, e cada conquista foi muito celebrada. Obrigada por 
caminharem junto comigo! 
 À todos do Laboratório de Bioanálises e Biotecnologia molecular (LBBM), por 
todo apoio sempre, principalmente as alunas de iniciação científica, Layse Raynara, 
Lorenna Larissa, Lorena Ivnyr e Katiene Macedo por assistência durante as coletas 
de sangue na LIGA. Sem vocês nada disso seria possível. 
À toda equipe do hospital Liga Norte-Riograndense Contra o Câncer, em 
especial a Dr.a Sheila Ramos de Miranda Henrique Tarrapp que sempre deu muito 
suporte para a avaliação clínica dos pacientes oriundos do Rio Grande do Norte. 
À todos que estiveram juntos comigo e contribuíram direta e indiretamente para 
a realização de trabalho. Foi uma longa jornada que não teria sido concluída sem a 
ajuda de todos vocês. Muito obrigada por tudo! 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESUMO 
 
O carcinoma papilífero de tireoide (CPT) é o tumor maligno mais frequente da 
tireoide. Limitações no diagnóstico e determinação de prognóstico ainda representam 
um grande desafio para o manejo clínico do CPT, logo a busca por novos 
biomarcadores para o diagnóstico minimamente invasivo torna-se crucial. 
Considerando a reconhecida associação entre o CPT e a inflamação crônica, o 
objetivo do presente estudo foi investigar a concentração plasmática de citocinas e 
HLA-G solúvel como potenciais biomarcadores de diagnóstico e/ou prognóstico do 
CPT. Este estudo avaliou pacientes com CPT antes (n = 85) e após a realização da 
tireoidectomia (n = 77), e controles (n = 80). Os níveis plasmáticos de 13 citocinas 
foram mensurados por citometria de fluxo, e HLA-G solúvel foi mensurado por ELISA. 
Os dados foram avaliados por meio de análises univariada e multivariada, e curvas 
ROC. Os níveis de IL-4, IL-10, TNF, IFN-α e TGF-β1 estavam aumentados no pós-
tireoidectomia comparado ao pré-tireoidectomia. Comparado aos controles: i) os 
níveis de sHLA-G diminuíram pós-tireoidectomia, ii) os níveis de IL-6 aumentaram, 
enquanto os níveis de IL-1β, IFN-α e TGF-β1 diminuíram no pré-tireoidectomia, iii) Os 
níveis de IL-5 e IL-6 estavam aumentados, enquanto IFN-α e o TGF-β1 estavam 
diminuídos no pós-tireoidectomia. IFN-α e TGF-β1 foram capazes de discriminar de 
forma independente os pacientes com CPT de controles, e IFN-α apresentou a melhor 
performance diagnóstica (AUC: 0,94). Aumento de IL-1β e diminuição de IL-12p70 no 
plasma estava associado independentemente com tumores maiores (> 2,0 cm), 
enquanto a diminuição dos níveis de sHLA-G estava associada à presença de 
invasão. Pacientes com resposta bioquímica/estrutural incompleta apresentaram 
níveis mais altos de IL-5 e IFN-α em comparação aos pacientes de resposta 
excelente/indeterminada. Em conclusão, observou-se um perfil diferenciado de 
citocinas nos plasmas pré- e pós-tireoidectomia, e o níveis de IFN-α e o TGF-β1 
mostraram-se bons candidatos a biomarcadores pré-cirúrgicos do CPT. Citocinas 
estavam associadas com fatores de pior prognóstico (IL-1β e IL-12p70) e de resposta 
insatisfatória ao tratamento (IFN-α e IL-5). No entanto,mais estudos são necessários 
para confirmar a relevância clínica dessas moléculas para o CPT. 
 
Palavras-chave: carcinoma papilífero da tireoide; biomarcadores; HLA-G solúvel; 
citocinas; inflamação; 
 
 
ABSTRACT 
 
Papillary thyroid carcinoma (PTC) is the most common thyroid malignancy. 
Limitations in diagnosis and prognosis determination still represent a great challenge 
for clinical management of PTC. Thus, the search for new targets for minimally invasive 
diagnosis became crucial. Considering the recognized association between PTC and 
chronic inflammation, the aim of the present study was to investigate plasma levels of 
cytokines and soluble HLA-G as potential biomarkers for diagnosis and/or prognosis 
of CPT. We studied PTC patients before (n = 85) and after thyroidectomy (n = 77), and 
80 controls. Plasma levels of 13 cytokines were measured by flow cytometry bead-
based assays, and soluble HLA-G was measured by ELISA. Data were evaluated 
using univariate and multivariate analyses, and ROC curves. Compared to pre-
thyroidectomy, IL-4, IL-10, TNF, IFN-α and TGF-β1 levels were increased in post-
thyroidectomy. Compared to controls: i) sHLA-G levels were decreased after 
thyroidectomy, ii) IL-6 levels were increased, while IL-1β, IFN-α and TGF-β1 levels 
were decreased in pre-thyroidectomy, iii) IL-5 and IL-6 levels were increased, while 
IFN-α and TGF-β1 were decreased in post-thyroidectomy. IFN-α and TGF-β1 
discriminated patients from controls after multiple logistic regression analysis, and IFN-
α presented the best diagnostic performance. Increased IL-1β and decreased IL-12p70 
levels presented independent associations with larger tumors (>2.0 cm), while 
decreased sHLA-G levels were associated with invasion. Patients presenting 
biochemical/structural incomplete response presented higher IL-5 and IFN-α levels 
when compared to patients with excellent/indeterminate response. In conclusion, a 
differential cytokine profile was observed in plasma before and after thyroidectomy, 
and IFN-α and TGF-β1 levels seems to be potential biomarkers candidates for PTC 
diagnosis. Cytokines were associated with factors of poor prognosis (IL-1β e IL-12p70) 
and unsatisfactory response to treatment (IFN-α e IL-5). However, further studies are 
needed to confirm the clinical relevance of these molecules for PTC. 
 
 
 
 
Keywords: Papillary thyroid carcinoma; biomarkers; soluble HLA-G; cytokines; 
inflammation; 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
Figura 1 — Isoformas do HLA-G produzidas por splicing alternativo do transcrito 
primário ..................................................................................................................... 27 
Figura 2 — Concentração plasmática das citocinas com expressão diferencial 
estatisticamente significante na comparação pareada entre pré- e pós-tireoidectomia 
dos pacientes com CPT, A: IL-4; B: IL-10; C: TNF; D: IFN-α; E: TGF-β1;................. 38 
Figura 3 — Gráfico de dispersão da correlação positiva baixa entre a concentração 
plasmática de IL-17A e IL-4 nos pacientes com CPT pré-tireoidectomia .................. 41 
Figura 4 — Gráficos de dispersão das correlações mais significativas entre as 
citocinas no plasma pós-tireoidectomia dos pacientes com CPT, A: IL-4 e IL-10; B: IL-
1β; C: IL-12p70 e IL-13; ............................................................................................ 43 
Figura 5 — Concentração plasmática do sHLA-G e citocinas com expressão 
diferencial estatisticamente significante na comparação de pacientes com CPT pré- e 
pós-tireoidectomia com controles, A: IL-6; B: IFN-α; C: TGF-β1; D: IL-1β; E: IL-5; F: 
sHLA-G;..................................................................................................................... 46 
Figura 6 — Curvas ROC para avaliar a capacidade dos níveis plasmáticos de IFN-α 
e TGF-β1 em discriminar pacientes com CPT dos controles. ................................... 48 
Figura 7 — Concentração plasmática pré-tireoidectomia das citocinas com expressão 
diferencial estatisticamente significante na comparação de acordo com o gênero dos 
pacientes com CPT, A: TNF; B: IL-13; ...................................................................... 51 
Figura 8 — Concentração plasmática pré-tireoidectomia das citocinas com expressão 
diferencial estatisticamente significante na comparação de acordo com a presença de 
metástase linfonodal nos pacientes com CPT, A: TNF; B: TGF-β1 .......................... 51 
Figura 9 — Concentração plasmática pré-tireoidectomia da citocina (IFN-α) com 
expressão diferencial estatisticamente significante na comparação de acordo com a 
presença de extensão extratireoidiana nos pacientes com CPT ............................... 52 
Figura 10 — Concentração plasmática pré-tireoidectomia de sHLA-G com expressão 
diferencial estatisticamente significante na comparação de acordo com a presença de 
invasão nos pacientes com CPT. .............................................................................. 52 
Figura 11 — Concentração plasmática pré-tireoidectomia de citocinas com expressão 
diferencial estatisticamente significante na comparação de acordo com o tipo de 
resposta ao tratamento dos pacientes com CPT, A: IL-5; B: IFN-α; .......................... 54 
 
 
 
LISTA DE TABELAS 
 
Tabela 1 — Descrição das características dos pacientes com CPT incluídos no estudo
 .................................................................................................................................. 36 
Tabela 2 — Análise pareada da concentração plasmática de citocinas e sHLA-G em 
pacientes com CPT pré- e pós-tireoidectomia ........................................................... 37 
Tabela 3 — Correlação entre a concentração plasmática de sHLA-G e citocinas em 
pacientes com CPT pré-tireoidectomia ..................................................................... 40 
Tabela 4 — Correlação entre a concentração plasmática de sHLA-G e citocinas em 
pacientes com CPT pós-tireoidectomia ..................................................................... 42 
Tabela 5 — Concentração de sHLA-G e citocinas no plasma de controles, pacientes 
com CPT pré- e pós-tireoidectomia ........................................................................... 45 
Tabela 6 — Análise de regressão logística múltipla dos níveis de citocinas e sHLA-G 
pré-tireoidectomia para predizer CPT ....................................................................... 47 
Tabela 7 — Associação dos níveis plasmáticos de citocinas e sHLA-G com fatores 
clínico-histopatológicos do CPT ................................................................................ 50 
Tabela 8 — Análise de regressão logística múltipla para citocinas associadas a 
características clínico-histopatológicas de CPT ........................................................ 53 
Tabela 9 — Concentração plasmática de sHLA-G e citocinas pré-tireoidectomia de 
acordo com o tipo de resposta ao tratamento de pacientes com CPT ...................... 54 
Tabela 10 — Análise de regressão logística múltipla dos níveis plasmáticos de 
citocinas com o tipo de resposta ao tratamento ........................................................ 55 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS 
 
APC Células apresentadoras de antígeno 
AJCC do inglês, American Joint Comission on Cancer 
ATA do inglês, American Thyroid Association 
AUC do inglês, Area under the curve 
CT Câncer de tireoide 
CDT Carcinoma diferenciado da tireoide 
CFT Carcinoma folicular da tireoide 
CPT Carcinoma papilífero da tireoide 
ELISA do inglês, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay 
HGF Fator de crescimento do hepatócito 
HLA-G Antígeno Leucocitário Humano G 
IARC do inglês, International Agency for Research on Cancer 
INCA Instituto Nacional de Câncer 
IFN Interferon 
IL Interleucina 
MAPK Proteína quinase ativada por mitógenoMHC do inglês, Major Histocompatibility Complex 
MIG monocina induzida por interferon-gama 
NK Célula Natural killer 
NKT Célula T natural killer 
PAAF Punção aspirativa com agulha fina 
PI3K Fosfatidilinositol 3-quinase 
ROC do inglês, Receiver Operating Characteristic 
sHLA-G HLA-G solúvel 
TGF-β Fator de crescimento tumoral β 
TH Tireoidite de Hashimoto 
TH0 Linfócitos T CD4+ precursores 
TH1 Células T CD4+ do tipo 1 
TH2 Células T CD4+ do tipo 2 
TH17 Células T CD4+ do tipo 17 
TNF Fator de necrose tumoral 
 
 
TNM do inglês, Tumor, Node, Metastasis 
Treg Célula T reguladora 
TSH Hormônio tireoestimulante 
T3 Triiodotironina 
T4 Tiroxina 
UICC do inglês, Union for International Cancer Control 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 14 
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA .......................................................................... 16 
2.1 Câncer de Tireoide ........................................................................................... 16 
2.1 Diagnóstico e prognóstico do câncer de tireoide .......................................... 17 
2.2 Patogênese do câncer de tireoide ................................................................ 20 
2.3 Inflamação e o câncer: o papel das citocinas ............................................... 21 
2.4 A molécula imunomoduladora HLA-G e o seu envolvimento com o câncer . 26 
3 OBJETIVOS ....................................................................................................... 29 
3.1 Objetivo geral ............................................................................................... 29 
3.2 Objetivos específicos ................................................................................... 29 
4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................... 30 
4.1 Comitê de Ética em Pesquisa ...................................................................... 30 
4.2 Casuística .................................................................................................... 30 
4.3 Determinação dos níveis plasmáticos de HLA-G solúvel ............................. 32 
4.4 Determinação da concentração plasmática de citocinas pró-inflamatórias e 
anti-inflamatórias .................................................................................................... 33 
4.5 Análise estatística ........................................................................................ 33 
5 RESULTADOS ................................................................................................... 35 
5.1 Características demográficas e clínico-histopatológicas .............................. 35 
5.2 Análise da produção de citocinas e sHLA-G no plasma dos pacientes com 
CPT pré- e pós-tireoidectomia ............................................................................... 37 
5.3 Correlações entre os níveis plasmáticos de citocinas e sHLA-G em pacientes 
com CPT pré- e pós-tireoidectomia ........................................................................ 39 
5.4 Análise da produção de citocinas e sHLA-G no plasma dos pacientes com 
CPT pré- e pós-tireodectomia comparado aos controles. ...................................... 44 
5.5 Avaliação do potencial dos níveis plasmáticos de citocinas e sHLA-G para 
discriminar pacientes com CPT dos controles ....................................................... 47 
5.6 Associação dos níveis plasmáticos de citocinas e sHLA-G com parâmetros 
clínico-histopatológicos do CPT ............................................................................. 48 
5.7 Associação dos níveis plasmáticos de citocinas com o tipo de resposta ao 
tratamento de pacientes com CPT ......................................................................... 53 
6 DISCUSSÃO ...................................................................................................... 56 
 
 
7 CONCLUSÕES .................................................................................................. 62 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 63 
PARTICIPAÇÃO EM EVENTOS ............................................................................... 74 
RESUMOS EM ANAIS DE CONGRESSO ................................................................ 74 
ARTIGOS PUBLICADOS .......................................................................................... 77 
aceitos para publicação ......................................................................................... 77 
artigos submetidos ................................................................................................. 78 
ANEXOS ................................................................................................................... 79 
ANEXO A ............................................................................................................... 79 
ANEXO B ............................................................................................................... 81 
ANEXO C ............................................................................................................... 82 
 
 
 
 
 
 
14 
 
1 INTRODUÇÃO 
 
O câncer de tireoide (CT) é o tumor maligno mais comum do sistema endócrino, 
representando aproximadamente 90% das neoplasias malignas endócrinas (GALDIERO; 
VARRICCHI; MARONE, 2016). A International Agency for Research on Cancer (IARC) 
estimou para 2012 cerca de 298.102 novos casos de CT no mundo, correspondendo a 
2,1% de todos os cânceres, e foram estimados 39.771 óbitos, representando 0,5% das 
mortes por câncer no mundo (FERLAY et al., 2015). A incidência de CT tem aumentado 
notavelmente nas duas últimas décadas, no entanto, a taxa de mortalidade tem se 
mantido estável. Acredita-se que isso se deve principalmente à melhoria nas técnicas 
para diagnóstico, que permitiram identificar com maior frequência até os nódulos < 1 cm 
(MORRIS et al., 2013; NIXON et al., 2017). No entanto, ainda se discute se essa 
tendência poderia ser um verdadeiro aumento relacionado a fatores ambientais como o 
aumento da exposição à radiação (NIXON et al., 2017; VIGNERI; MALANDRINO; 
VIGNERI, 2015). Segundo a última estimativa do Instituto Nacional de Câncer (INCA), o 
CT será a quinta neoplasia maligna mais frequente em mulheres no Brasil em 2018, e as 
regiões nordeste e sudeste apresentarão o maior número de novos casos (INCA, 2017). 
O carcinoma papilífero da tireoide (CPT) é um tipo de carcinoma diferenciado que 
corresponde a 80% de todos os casos de CT, que em sua maioria apresentam um bom 
prognóstico quando tratado adequadamente, com índices de mortalidade similares aos 
da população geral. A taxa de sobrevida em 10 anos desse tipo de malignidade excede 
90%, mas alguns indivíduos com CPT apresentam tumores de comportamento mais 
agressivo e ainda não existem biomarcadores eficazes para diferenciar esses casos 
(MAIA et al., 2007; SONDERMANN et al., 2015). A análise citológica do nódulo tireoidiano 
por punção aspirativa com agulha fina (PAAF) é o método padrão-ouro para discriminar 
entre lesões benignas e malignas, porém aproximadamente 25% dos casos recebem 
diagnóstico indeterminado, necessitando da remoção da glândula tireoide para obter um 
diagnóstico definitivo através da análise histopatológica (NIXON et al., 2017). Dessa 
forma, torna-se imprescindível a busca de novos biomarcadores de malignidade, 
minimamente invasivos e precisos que auxiliem no diagnóstico de lesões malignas, assim 
como, na identificação de indivíduos com doença mais agressiva, detecção de doença 
15 
 
persistente ou recorrente e na predição da eficiência do tratamento (GRAHAM et al., 
2015; NUNES et al., 2013). 
Estudosrecentes têm destacado uma associação importante entre inflamação 
crônica e câncer. Há relatos na literatura demonstrando que a inflamação relacionada ao 
câncer promove o desenvolvimento e progressão tumoral, estimulando a angiogênese, 
possibilitando a proliferação e sobrevivência celular, induzindo mutações gênicas e 
comprometendo a resposta imune antitumoral. As citocinas parecem ter um papel 
relevante nesse processo, através da promoção de inflamação ou imunossupressão 
(WANG; LI; HU, 2017). Neste contexto, a avaliação da produção de ambas citocinas pró-
inflamatórias e anti-inflamatórias é importante para entender a complexidade do 
desenvolvimento tumoral e a modulação da resposta imune no CT (CUNHA et al., 2016). 
Nos últimos anos, diversos estudos vêm investigando a concentração sérica de diferentes 
citocinas no contexto do câncer e algumas estão sendo apontadas como potenciais 
biomarcadores do CT. Esses estudos destacam a importância de continuar estudando 
essas moléculas na busca por uma melhor compreensão da interação global entre 
células tumorais e o sistema imune, assim como identificar novos biomarcadores não-
invasivos do CT (KAMMOUN-KRICHEN et al., 2012; LINKOV et al., 2009; STANCIU et 
al., 2015; ZIVANCEVIC-SIMONOVIC et al., 2016). 
A molécula do antígeno leucocitário humano G (HLA-G) também está atraindo 
atenção nos últimos anos no contexto de doenças tumorais, devido a sua capacidade de 
inibir a atividade citotóxica de células natural killer (NK) e linfócitos T CD8+ citotóxicos, e 
de induzir tolerância nas células apresentadoras de antígeno, células cruciais para o 
estabelecimento de uma resposta imune antitumoral (PISTOIA et al., 2007). Estudos 
investigando a concentração plasmática da forma solúvel do HLA-G (sHLA-G) relataram 
seu papel promissor como biomarcador de diagnóstico e prognóstico de diversas 
malignidades (CAO et al., 2011; LI et al., 2017b; PAN et al., 2016), incluindo o CPT 
(DARDANO et al., 2012). Porém, nenhum estudo se propôs a comparar a concentração 
de sHLA-G antes e após a remoção do tumor tireoidiano. 
Considerando que a expressão de HLA-G modula o padrão de citocinas produzidas, 
e vice-versa (DONADI et al., 2011), e a necessidade de novos biomarcadores 
minimamente invasivos para auxiliar no diagnóstico e prognóstico de CPT, este estudo 
16 
 
teve como objetivo avaliar os níveis plasmáticos de sHLA-G e um painel de citocinas 
inflamatórias e regulatórias em pacientes com CPT e indivíduos controles, assumindo 
como desfechos principais: i) a presença do câncer de tireoide (diagnóstico do CPT) e ii) 
a existência de características clinico-histopatológicas desfavoráveis e/ou não 
responsividade ao tratamento (prognóstico do CPT). Como resultado, espera-se que a 
expressão diferencial de sHLA-G e/ou citocinas no plasma de pacientes com CPT seja 
capaz de distingui-los de indivíduos controles, bem como de caracterizar aqueles com 
pior prognóstico da doença, auxiliando os médicos numa melhor avaliação dos pacientes 
e planejamento do tratamento, reduzindo a realização de tireoidectomias desnecessárias. 
 
 
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 
 
 2.1 Câncer de Tireoide 
 
As taxas de incidência de CT têm aumentado nas últimas décadas na maior parte 
do mundo. Esse tipo de neoplasia foi o oitavo câncer mais frequentemente diagnosticado 
entre as mulheres em todo o mundo, representando cerca de 3,5% de todos os novos 
casos de câncer diagnosticados em 2012, enquanto que em homens foi menos comum, 
representando < 1% do número total (SIERRA; SOERJOMATARAM; FORMAN, 2016; 
VEIGA et al., 2013). De acordo com a última estimativa do INCA, 9.610 novos casos de 
CT são esperados no Brasil para cada ano do biênio 2018-2019, com um risco estimado 
de 1,49/100 mil homens e 7,57/100 mil mulheres. Rio Grande do Norte e São Paulo estão 
entre os estados com as mais altas taxas de incidência por 100 mil mulheres, 
correspondendo a 6,82 e 9,48, respectivamente (INCA, 2017). 
A glândula tireoide é composta principalmente de dois tipos celulares: as células 
foliculares e as células parafoliculares. A maioria dos tumores malignos da tireoide são 
carcinomas e mais de 90% desses carcinomas são derivados das células foliculares, que 
são responsáveis pela produção dos hormônios tireoidianos: triiodotironina (T3) e tiroxina 
(T4). Baseado em fatores histológicos e clínicos, os carcinomas derivados de células 
17 
 
foliculares podem ser divididos em bem diferenciados, pouco diferenciados e 
indiferenciados ou anaplásicos. Os carcinomas medulares são derivados das células 
parafoliculares e representam cerca de 5% dos casos, podendo ser esporádicos ou 
familiares (PALLANTE et al., 2014; YUAN; YANG; ZHENG, 2014). 
Os carcinomas diferenciados da tireoide (CDT) são subdivididos em: carcinoma 
papilífero da tireoide (CPT) que corresponde a 80% dos casos e carcinoma folicular da 
tireoide (CFT) que representa 10% dos casos, aproximadamente (PALLANTE et al., 
2014). Ambos podem se desdiferenciar por acúmulo de anormalidades genéticas, 
progredindo para carcinomas pouco diferenciados ou carcinoma anaplásico, que 
corresponde a menos de 5% dos carcinomas derivados de células foliculares, são muito 
agressivos com crescimento rápido e prognóstico desfavorável (LEONARDI et al., 2012; 
LIEBNER; SHAH, 2011; PALLANTE et al., 2014). 
O CPT tem evolução lenta e acomete três vezes mais mulheres do que homens, 
ocorrendo em qualquer idade, mas principalmente entre a terceira e quarta década da 
vida. Dentre todos, geralmente é o menos agressivo e com melhor prognóstico, 
apresentando uma taxa de sobrevida de 10 anos superior a 90% (SONDERMANN et al., 
2015). No entanto, metástases para linfonodos cervicais são encontradas em 20–50% 
dos casos e recorrência locorregional da doença é observada em até 5-20% dos 
pacientes que passaram pela remoção cirúrgica da glândula (HAUGEN et al., 2016; HU 
et al., 2017). O CFT também é mais comum em mulheres e tende a aparecer em idades 
mais avançadas do que o CPT. Em cerca de 20% dos casos ocorre metástase a 
distância, particularmente para o pulmão e ossos (PALLANTE et al., 2014). 
 
2.1 Diagnóstico e prognóstico do câncer de tireoide 
 
Os nódulos tireoidianos representam a principal manifestação clínica de uma série 
de doenças tireoidianas e são comumente encontrados incidentalmente, podendo ser 
vistos em até 50% dos pacientes com mais de 60 anos. Apesar da grande maioria 
representar lesões benignas, é necessário excluir a presença de CT, que corresponde a 
5-10% dos casos (HSIAO; NIKIFOROV, 2014; MAIA et al., 2007) 
18 
 
O diagnóstico do CT envolve a investigação de fatores de risco associados à 
malignidade como histórico familiar de CT, sexo, idade e exposição à radiação ionizante, 
assim como a avaliação do hormônio tireoestimulante (TSH). Além disso, a 
ultrassonografia da glândula tireoide também é realizada para buscar sinais que indiquem 
maior chance de malignidade como nódulos sólidos, hipoecóicos, com presença de 
microcalcificações e margens irregulares, porém não é possível diferenciar a natureza do 
nódulo através desse método. Dessa forma, os nódulos > 1 cm que apresentam os sinais 
de possível malignidade são encaminhados para avaliação citológica por meio do PAAF 
(HAUGEN et al., 2016). A realização desse procedimento é o padrão ouro para 
diferenciação entre nódulos malignos e benignos, porém trata-se de um procedimento 
invasivo e de alta complexidade para execução, pois exige um bom treinamento e 
conhecimento de quem o executa. 
Cerca de 15-25% dos nódulos avaliados por meio da análise citológica, não tem 
diagnóstico conclusivo, devido à erros de amostragem e dificuldade em discriminar 
lesões foliculares. Nesses casos, a aspiração pode ser repetida ou é realizada a 
tireoidectomia, cirurgia de retirada parcial ou total da tireoide, para obter o diagnóstico 
definitivo. No entanto, uma proporção significativados nódulos tem histopatologia 
benigna, logo, muitos indivíduos são submetidos a tireoidectomia sem necessidade, 
estando susceptíveis aos riscos que estão associados a esse procedimento, como lesão 
do nervo laríngeo e hipoparatireoidismo, e a necessidade de reposição hormonal 
contínua. Dessa forma, torna-se imperativa a busca de novos biomarcadores no sangue 
periférico, que sejam mais precisos e eficazes para um diagnóstico pré-cirúrgico, 
minimamente invasivo, mais reproduzível e seguro (NIXON et al., 2017; WEI et al., 2016). 
A American Thyroid Association (ATA) recomenda que o manejo do CPT seja 
baseado no estadiamento da doença e avaliação de risco dos pacientes. O tratamento 
consiste na remoção cirúrgica da glândula e demais linfonodos locorregionais com 
suspeita de malignidade, administração de doses ablativas de iodo radioativo 
(radioiodoterapia) quando necessário, e terapia de supressão do TSH através da 
administração contínua de levotiroxina, um análogo do T4. O acompanhamento da 
evolução clínica do paciente à longo prazo incluem a vigilância de doença recorrente ou 
19 
 
persistente através de dosagem sérica de tireoglobulina e anticorpo anti-tireoglobulina, e 
exames de imagem (HAUGEN et al., 2016). 
Diversos sistemas de classificação são utilizados para avaliar o estadiamento do 
CPT, que auxiliam na predição de sobrevida e prognóstico, influenciando a escolha do 
tratamento. Para essas classificações, são avaliadas características como idade, gênero, 
e informações histopatológicas obtidas após a tireoidectomia como, por exemplo, 
tamanho do tumor, presença de extensão extratireoidiana e metástase distante 
(GONZALEZ-GONZALEZ et al., 2011). No entanto, esses sistemas não conseguem 
prever o risco de recorrência da doença (PACINI et al., 2012). Dessa forma, existem 
outras classificações para predição do risco de recorrência e persistência, como a 
recomendada pela ATA (HAUGEN et al., 2016), que avaliam não somente as 
características clinicopatológicas do indivíduo no momento do diagnóstico, mas também 
informações clínicas após o tratamento inicial com cirurgia e radioiodoterapia 
(TARASOVA; TUTTLE, 2016). O sistema de estadiamento mais amplamente utilizado é 
o TNM (do inglês Tumour, Node, Metastasis) da Union for International Cancer Control 
(UICC) e American Joint Comission on Cancer (AJCC). Esse sistema classifica os 
pacientes em estadios segundo o tamanho do tumor primário e presença de extensão 
extratireoidiana (T), presença de metástase em linfonodos regionais (N) ou a distância 
(M), visando estimar a severidade do caso e sobrevida relativa desses pacientes (ANEXO 
A) (GUO; WANG, 2014; SOBIN et al., 2009). 
Entre as características clínicas que podem indicar o pior prognóstico do paciente 
com CPT estão a idade ao diagnóstico (>45 anos), sexo masculino, tamanho do tumor > 
2 cm, presença de extensão extratireoidiana, metástase para linfonodos regionais ou à 
distância (GUO; WANG, 2014). Além disso, algumas variantes histológicas do CPT estão 
associadas com um comportamento mais agressivo do tumor. Entre elas, estão as 
variantes de células altas, variante esclerosante difusa, variante sólida e variante folicular 
(LIVOLSI, 2011). Entretanto, um comportamento agressivo do tumor ao diagnóstico não 
é necessariamente seguido por um resultado clínico negativo (DARDANO et al., 2012) e 
os sistemas de classificação para a estratificação de risco inicial representam apenas 
cerca de 15-20% da variabilidade no resultado clínico que eles estão tentando prever 
(MOMESSO; TUTTLE, 2014). Dessa forma, a estratificação inicial pode ser modificada 
20 
 
de acordo com a situação clínica do paciente durante o acompanhamento da resposta 
ao tratamento, que pode ser classificada em quatro categorias: excelente (sem evidência 
bioquímica, estrutural ou funcional de doença), bioquímica incompleta (persistência de 
valores anormais de tireoglobulina ou níveis de anticorpos anti-tireoglobulina aumentando 
na ausência de doença localizável), estrutural incompleta (identificação de persistência 
ou recindivas por metástases locorregionais ou distantes) e indeterminada (achados 
bioquímicos ou estruturais inespecíficos que não podem ser classificados com confiança 
como benignos ou malignos). Os critérios para cada categoria são definidos de acordo 
com a terapia inicial do paciente: tireoidectomia total e radioiodoterapia, somente 
tireoidectomia total, e somente tireoidectomia parcial (ANEXO B) (MOMESSO; TUTTLE, 
2014). 
Considerando todo esse contexto, observa-se que é muito importante prosseguir a 
busca por novos biomarcadores para auxiliar o diagnóstico de nódulos tireoidianos e na 
melhor predição do prognóstico dos pacientes com CPT. A identificação adequada dos 
casos que realmente são de alto risco, pode ajudar o médico de forma mais eficaz no 
planejamento do tratamento e levar a redução da realização de tireoidectomia quando 
ela é dispensável. 
 
2.2 Patogênese do câncer de tireoide 
 
Alguns fatores de risco estão relacionados a maior predisposição ao CT, como uma 
dieta com consumo insuficiente de iodo, exposição à radiação ionizante, obesidade e 
fatores hereditários. No entanto, a maioria das pessoas com CT não tem fatores de risco 
aparentes e outras pessoas com um ou mais fatores de risco podem não desenvolver a 
doença (LINKOV et al., 2009). O desenvolvimento de tumores tireoidianos envolve uma 
complexa interação entre predisposição genética, mutações somáticas e modulação 
epigenética contribuindo para a heterogeneidade e comportamento desses tumores 
(LIEBNER; SHAH, 2011) 
A patogênese molecular da maioria dos CT está relacionada a mutações em genes 
que codificam moléculas que participam das vias de sinalização da proteína quinase 
ativada por mitógeno (MAPK) e da fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K)/AKT (GALDIERO; 
21 
 
VARRICCHI; MARONE, 2016). A via MAPK é muitas vezes ativada através de mutações 
pontuais dos genes BRAF e RAS, assim como também os rearranjos genéticos RET/PTC 
e TRK (HSIAO; NIKIFOROV, 2014; LIEBNER; SHAH, 2011). 
A ativação frequente da via MAPK por esses genes leva a ativação de um programa 
de transcrição pró-inflamatória que envolve citocinas, quimiciocinas e seus receptores. 
Essas moléculas por sua vez agem de forma autócrina e parácrina e tem o potencial de 
manter as características fenotípicas malignas dos tumores, por estimular a angiogênese, 
promover o recrutamento de células inflamatórias e o remodelamento tecidual. Dessa 
forma, as citocinas podem contribuir para a proliferação, sobrevivência e invasão tumoral 
(GUARINO et al., 2010). 
 
2.3 Inflamação e o câncer: o papel das citocinas 
 
A inflamação é uma resposta fisiológica protetora desencadeada pelo organismo 
em resposta a estímulos provocados por injúria tecidual e/ou infecção. Quando esse 
estímulo se torna persistente ou ocorre uma falha nos mecanismos em resposta a 
inflamação, caracteriza-se como um processo crônico, levando a um processo de 
estresse oxidativo no tecido causado pela liberação constante de espécies reativas de 
oxigênio e nitrogênio pelos leucócitos no local. Esses metabólitos induzem a produção 
de agentes mutagênicos que podem provocar mutações pontuais e rearranjos genômicos 
em células que estão proliferando, resultando em uma maior probabilidade de um 
oncogene ser ativado ou de um gene supressor de tumor perder a função. Assim, esse 
estresse oxidativo pode levar ao desenvolvimento e progressão do câncer (BAN et al., 
2012; BEKSAC et al., 2017; COUSSENS; WERB, 2002). 
 O microambiente tumoral compreende uma diversidade de células, como células 
estromais, endoteliais e células da imunidade inata e adquirida, que interagem entre si, 
formando o sistema complexo que envolve o tumor. Além disso, a diversidade fenotípica 
das células imunes infiltrantes no tumor podem influenciar de forma negativa ou positiva 
o desenvolvimentotumoral e o prognóstico do paciente (CARVALHO et al., 2017). 
Células T CD8+, células NK e células T natural killer (NKT) atuam como importantes 
supressores de tumor por causa da sua função citotóxica que leva a destruição de células 
22 
 
tumorais, enquanto células T reguladoras (Treg) ou células T CD4+ secretoras de 
interleucina (IL)-10 e fator de crescimento tumoral β (TGF-β), por exemplo, têm a 
habilidade de inibir o sistema imune, induzindo tolerância e permitindo que as células 
tumorais escapem a imunidade antitumoral (WEBER, 2014). As citocinas secretadas 
pelas células tumorais e imunológicas são mediadores da inflamação essenciais para a 
ativação, crescimento, diferenciação e recrutamento de células efetoras do sistema 
imune para o local do tumor (CARVALHO et al., 2017). 
 As células T CD4+ desempenham um papel muito importante na modulação do 
sistema imune. De acordo com citocinas e outros estímulos do microambiente tumoral, 
os linfócitos T CD4+ precursores (TH0) podem se diferenciar em subpopulações que 
secretam citocinas funcionalmente distintas: células T CD4+ do tipo 1 (TH1), tipo 2 (TH2), 
tipo 17 (TH17) ou células Treg, desencadeando um perfil de resposta característico 
(WEBER, 2014). O perfil de resposta TH1 é induzido pela presença da interleucina 12 (IL-
12) e o fator de necrose tumoral (TNF) α, promovendo uma resposta celular e pró-
inflamatória, através da produção das citocinas interferon (IFN)-γ, TNF-α e IL-2. As 
células TH2 são estimuladas pela presença da IL-4 e estabelece uma resposta imune 
humoral, secretando principalmente IL-4, IL-5 e IL-13 (CARVALHO et al., 2017; ZHU; 
YAMANE; PAUL, 2010). No contexto de células tumorais, a maioria dos estudos sugerem 
que a secreção de citocinas do perfil TH1 teria ação antitumoral, enquanto que secreção 
de citocinas do perfil TH2 contribuiriam para a progressão do tumor. Porém, não somente 
o TH1, como o perfil de resposta TH2 também já foi implicado no estabelecimento de uma 
resposta imune antitumoral através do estímulo da proliferação dos linfócitos T CD8+ 
citotóxicos (CARVALHO et al., 2017; ZIVANCEVIC-SIMONOVIC et al., 2015a). 
As células Treg são caracterizadas pela presença do fator de transcrição FOXP3 e 
induzidas pela presença de IL-2 e TGF-β, levando a inibição da atividade antitumoral 
mediada por célula T. As células TH17 são induzidas através da presença de IL-6 e IL-
21, assim como o TGF-β, e mantidas pela presença de IL-1β e IL-23. Essa subpopulação 
secreta as citocinas pró-inflamatórias: IL-17A, IL-17F e IL-22, que são responsáveis por 
aumentar a imunidade e as defesas do hospedeiro, mas por outro lado na literatura há 
relatos do envolvimento dessas citocinas com a promoção e progressão do câncer, 
23 
 
estimulando a angiogênese (CARVALHO et al., 2017; LEE et al., 2015; ZHU; YAMANE; 
PAUL, 2010). 
A relação entre inflamação e CT é complexa e não está totalmente compreendida, 
porém frequentemente o CT ocorre associado a outras doenças autoimunes tireoidianas 
e o tecido tumoral encontra-se infiltrado por células inflamatórias (GUARINO et al., 2010). 
Acredita-se que cerca de 20-50% dos casos de CPT ocorrem no contexto de inflamação 
crônica (BEKSAC et al., 2017). A tireoidite de Hashimoto (TH) é a doença autoimune 
tireoidiana mais comum e sua associação com o CT, principalmente o CPT, é muito 
discutida na literatura. No entanto, ainda há informações conflitantes sobre essa 
associação, uma vez que alguns estudos sugerem que o CPT e o TH estão positivamente 
correlacionados, e outros não conseguiram encontrar essa associação (WEBER, 2014). 
O infiltrado linfocitário difuso que é um dos achados característicos do TH, quando 
presente em pacientes com CPT, já foi correlacionado a melhor sobrevida livre de doença 
e doença menos agressiva ao diagnóstico nesses pacientes. A incidência de infiltrado 
linfocitário é significativamente alta em pacientes com CPT, mesmo na ausência de 
outros sinais de tireoidite autoimune, como a produção de autoanticorpos. Além disso, 
alguns estudos reportam que CTs com pior prognóstico, como os carcinomas pouco 
diferenciado e o anaplásico, são caracterizados por uma redução significativa no infiltrado 
linfocitário quando comparado ao CPT, sugerindo que essas células podem 
desempenhar um papel protetor no CT (CARVALHO et al., 2017; GUARINO et al., 2010; 
UGOLINI et al., 2007; WEBER, 2014). Em contrapartida, a presença de células da 
imunidade inata no infiltrado inflamatório, como macrófagos e mastócitos, está associada 
a um prognóstico desfavorável e pode contribuir para a progressão do câncer (GUARINO 
et al., 2010). Duas subpopulações de macrófagos com funções diferentes já foram 
descritas, os macrófagos do tipo M1 cuja função principal é fagocitose em resposta a 
estímulo por bactérias ou citocinas do tipo TH1 e os macrófagos do tipo M2 cuja função 
principal é imunossupressão e atividade trófica em resposta a citocinas do tipo TH2 
(CUNHA; MARCELLO; WARD, 2014). Um estudo que realizou uma análise fenotípica 
dos macrófagos associados ao CPT revelou uma expressão aumentada de genes 
relacionados ao perfil M2, e indicou um papel pro-tumorigênico dessas células, uma vez 
que a redução delas levavam a regressão do tumor (RYDER et al., 2013). Porém, 
24 
 
também há relato de que o infiltrado de macrófagos já foi associado a uma melhor 
sobrevida livre de doença (CUNHA et al., 2012), e acredita-se que esses resultados 
conflitantes estão relacionados ao fato de que o papel dos macrófagos no TC 
provavelmente depende de outros fatores do microambiente tumoral, destacando a 
complexidade da resposta imunológica envolvida no desenvolvimento do TC (CUNHA; 
MARCELLO; WARD, 2014). 
Nesse contexto, as citocinas são secretadas principalmente pelas células imunes 
do infiltrado inflamatório, mas também são secretadas pelas células foliculares da 
tireoide, atuando como importantes mediadores da inflamação que favorecem vários 
aspectos da iniciação e crescimento do CT (LI et al., 2017a). Dessa forma, a análise de 
mudanças no perfil de citocinas na circulação sistêmica é uma alternativa atraente para 
entender melhor a patogênese desse tipo de câncer, assim como também identificar 
potenciais biomarcadores minimamente invasivos de diagnóstico e prognóstico. 
Nas duas últimas décadas, estudos têm examinado a concentração sérica de 
determinadas citocinas em pacientes com CPT. Um estudo avaliando mudanças nos 
níveis séricos de IL-6 e TNF-α relacionadas ao tratamento com radioiodoterapia em 14 
pacientes com CPT, foi observado que a IL-6 estava significativamente aumentada após 
a realização de tratamento (ÖZATA et al., 2000). Um outro estudo avaliando a 
concentração sérica de um painel de 19 citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento 
em 23 pacientes com CT e 24 pacientes com nódulos benignos, os autores observaram 
que a análise simultânea de IL-8, fator de crescimento do hepatócito (HGF), monocina 
induzida por interferon-gama (MIG) e IL-12p40, discriminavam satisfatoriamente entre 
doenças malignas e benignas da tireoide (LINKOV et al., 2009). Kobawala et al. (2011) 
avaliou 32 pacientes com CT, 21 com bócio adenomatoso e 16 com doenças autoimunes, 
e observaram que os níveis de IL-8 e IFN-α estavam aumentados em pacientes com 
doenças malignas e benignas da tireoide quando comparados a controles. IL-8 estava 
particularmente aumentado em pacientes nos estágios avançados do câncer. Em mais 
um estudo avaliando um painel de citocinas, porém agora 17 citocinas em diferentes 
distúrbios tireoidianos (115 pacientes, dentre eles apenas 15 com CPT), os autores 
observaram que a concentração sérica de IL-1β permitia discriminar entre tireoidites 
atróficas e CPT (KAMMOUN-KRICHEN et al., 2012). Um outro estudo avaliando um 
25 
 
painel de 10 citocinas em 20 pacientes com CT e 38 com doenças benignas da tireoide, 
demonstrou que IL-6, IL-7, IL-10 e IL-13 apresentaramníveis séricos significativamente 
aumentados, enquanto IL-8 estava significativamente diminuída no pré-operatório em 
ambas doenças benignas e malignas da tireoide (PROVATOPOULOU et al., 2014). 
Stanciu et al. (2015) avaliaram 80 pacientes com CPT e 40 pacientes com CPT e 
TH antes da radioiodoterapia e observaram níveis significativamente mais elevados de 
IL-4 e IL-10 em pacientes com CPT ou CPT associado a TH que apresentaram 
recorrência ou persistência da doença. Outro estudo também avaliou a influência da 
associação entre CPT e TH (12 pacientes com CPT apenas e 4 com CPT e TH) no perfil 
de citocinas, mas as citocinas foram mensuradas no sobrenadante da cultura das células 
do sangue periférico dos pacientes. Esse estudo mostrou que pacientes com essas duas 
doenças apresentavam níveis significativamente mais altos de IL-4, IL-6, IL-9, IL-13 e 
IFN-γ do que pacientes com CPT sem TH (ZIVANCEVIC-SIMONOVIC et al., 2015b). Os 
mesmos autores, em um outro estudo agora avaliando 13 indivíduos com CPT em 
comparação a controles, demonstraram que o sobrenadante da cultura de sangue 
periférico de pacientes com CPT tinha níveis significativamente mais elevados de IL-5, 
IL-13 e IL-9 que controles no pós-tireoidectomia. Enquanto que, a radioiodoterapia levou 
a produção significativamente reduzida de IL-4, IL-5 e IL-13 (ZIVANCEVIC-SIMONOVIC 
et al., 2015a). Já em 2016, esses autores avaliaram 22 pacientes com CPT e reportaram 
que a concentração de TGF-β1 no sobrenadante de cultura do sangue periférico de 
pacientes com CPT é significativamente mais baixa que os controles. Tal resultado não 
foi observado ao comparar essa mesma citocina no soro desses pacientes. Kobawala et 
al. (2016) reportou que a análise da concentração sérica de IL-6 conseguiria discriminar 
eficientemente os pacientes com CPT, doenças benignas e controles, em um estudo que 
avaliou 83 pacientes com CPT e 67 indivíduos com doenças benignas. Por fim, Li et al. 
(2017a) avaliou 50 pacientes com CPT e 20 pacientes com doença benigna, observando 
que os níveis séricos de IFN-γ e IL-35 estavam significativamente aumentados em 
pacientes com CPT e TH concomitante. Além disso, esse marcador estava associado a 
fatores de pior prognóstico do CPT. A maioria desses estudos foram realizados em um 
tamanho de amostra pequeno, de forma que, mais estudos avaliando o perfil de citocinas 
pró-inflamatórias e anti-inflamatórias à nível sistêmico em amostras maiores e em 
26 
 
diferentes populações são necessários para verificar o potencial dessas moléculas como 
biomarcadores de diagnóstico e prognóstico e o possível envolvimento delas com a 
patogênese do CT. 
 
2.4 A molécula imunomoduladora HLA-G e o seu envolvimento com o câncer 
 
 O HLA-G é uma molécula não-clássica do MHC (do inglês, major histocompatibility 
complex) de classe I que foi inicialmente descrita como expressa de forma seletiva na 
interface materno-fetal pelas células do citotrofoblasto, contribuindo para a tolerância 
materno-fetal. Apesar do HLA-G não ser expresso na maioria dos tecidos adultos, sua 
expressão ectópica tem sido vista em condições patológicas, tais como infecções virais, 
doenças autoimunes e em vários tipos de câncer. O HLA-G difere de outras moléculas 
clássicas do complexo HLA de classe I (-A, -B e -C) por apresentar limitada variabilidade, 
possuir 7 diferentes isoformas geradas por splicing alternativo de seu transcrito primário 
e ter expressão constitutiva restrita a alguns tecidos saudáveis como o trofoblasto, timo, 
pâncreas, córnea e precursores eritróides e endoteliais (DE FIGUEIREDO-FEITOSA et 
al., 2017; DONADI et al., 2011; NUNES et al., 2013). 
 Tanto as formas ligadas a membrana (HLA-G1, -G2, -G3 e G4) quanto as formas 
solúveis do HLA-G (HLA-G5, -G6 e G7), exercem uma função imunomoduladora e 
supressora em relação a imunidade inata e adquirida, através da interação com os 
receptores inibidores presentes na superfície de células efetoras do sistema imune, ILT-
2, ILT-4 (conhecidos também como LIR-1 e LIR-2, LILRB-1 e LILRB-2 e CD85j e CD85d, 
respectivamente) e KIR2DL4 (conhecido também como CD158d). Essas interações 
levam a inibição das funções citotóxicas de células NK e linfócitos T CD8+, assim como 
também indução de um perfil tolerogênico em células apresentadoras de antígeno (APC) 
(DARDANO et al., 2012; REBMANN et al., 2016; ZILBERMAN et al., 2012). Além disso, 
HLA-G também induz a apoptose de linfócitos T CD8+ ativados, suprime a proliferação 
da célula T CD4+ e estimula a secreção de citocinas que conduzem a polarização para o 
padrão TH2 de resposta imune (DE FIGUEIREDO FEITOSA et al., 2014; KEMP et al., 
2003). 
27 
 
 A estrutura do HLA-G1 e HLA-G5 é constituída de uma cadeia pesada formada 
por três domínios (α1, α2 e α3), ligada de forma não-covalente à cadeia leve β2-
microglobulina. Entretanto, a primeira molécula está ligada a membrana, enquanto a 
segunda é solúvel. As outras isoformas (-G2, -G3, -G4, -G6, -G7) não possuem um ou 
dois domínios α e não estão associadas a β2-microglobulina. Por fim, todas as isoformas 
possuem o domínio α1. As principais isoformas de HLA-G encontradas no plasma são a 
HLA-G1, que pode ser gerada por clivagem proteolítica da porção transmembrana, e a 
HLA-G5 secretada pela célula como isoforma solúvel (Figura 1). Os monócitos, 
macrófagos e células dendríticas são os principais produtores de sHLA-G em condições 
fisiológicas (CAROSELLA et al., 2008; DONADI et al., 2011; PISTOIA et al., 2007). 
 
 
 
Figura 1 — Isoformas do HLA-G produzidas por splicing alternativo do transcrito primário. Fonte: 
Adaptado de Cell. Mol. Life Sci. (2011) 68:369–395. 
 
 
Diversos fatores do microambiente podem estar implicados na indução de 
expressão da molécula HLA-G, como os polimorfismos nas regiões 3’UTR e 5’UTR do 
gene HLA-G, o estresse, a escassez de nutrientes, hormônios e o padrão de expressão 
de citocinas (CAROSELLA et al., 2008). As citocinas IL-10, IFNs, TNF-α, TGF-β por 
exemplo, estão associadas com o aumento da expressão de HLA-G em diferentes tipos 
celulares (ABEDIANKENARI; GHASEMI; KIM, 2011; AMIOT; VU; SAMSON, 2014a; 
CAROSELLA et al., 2008; GREGORI et al., 2010). Por outro lado, o HLA-G também pode 
modular a expressão de citocinas. A presença de HLA-G já foi associada a diminuição 
da expressão das citocinas do perfil de resposta TH1, como IL-2 e IFN-γ, porém aumento 
da expressão de IL-10, IL-13 e IL-4, que correspondem ao perfil TH2 (AGAUGUÉ; 
28 
 
CAROSELLA; ROUAS-FREISS, 2011; NAJI et al., 2014; PISTOIA et al., 2007). No 
entanto, alguns estudos sugerem que sHLA-G, ao contrário do HLA-G ligado à 
membrana, estimularia a produção de citocinas do perfil TH1, como IFN-γ e TNF-α (KANAI 
et al., 2001; VAN DER MEER et al., 2007). 
 A expressão anormal de HLA-G em diferentes tipos de câncer tem sido 
relacionada a uma estratégia adicional das células tumorais para evasão da resposta 
imune do hospedeiro (PISTOIA et al., 2007). As células tumorais podem expressar o HLA-
G na superfície, secretá-lo ou incorporá-lo em pequenas vesículas extracelulares 
(exossomos) derivadas de sua membrana. O transporte de HLA-G através de exossomos 
constitui um interessante mecanismo de imunomodulação ao redor do tumor, uma vez 
que células NK ao adquirir essas vesículas, passam a expressar o HLA-G e comportam-
se como células reguladoras capazes de inibir a atividade citotóxica de outras células NK 
(CAROSELLA et al., 2008). Dessa forma, a expressão de HLA-G é fator notável na 
resistência a resposta antitumoral e manutenção da sobrevivência de células tumorais. 
 Na literatura há estudos descrevendo que a expressão do HLA-G e a presença de 
polimorfismos que induzem sua expressão está associada ao CT e a variáveis clínico-
histopatológicas indicativas de pior prognóstico (DARDANO et al., 2012; DE 
FIGUEIREDO-FEITOSA et al., 2017; DE FIGUEIREDO FEITOSA et al., 2014; NUNES et 
al., 2013).Por meio de imunohistoquímica, Nunes et al. (2013) demonstraram que a 
expressão de HLA-G no tecido tumoral de pacientes com CPT estava associada ao 
aumento de metástase para linfonodos regionais e invasão capsular. Figueiredo-Feitosa 
et al. (2014) também avaliaram a expressão de HLA-G por imunohistoquímica, mas, 
desta vez, compararam tecido tumoral tireoidiano maligno, benigno e tecido normal da 
tireoide. Eles mostraram que o tecido normal tireoidiano não expressava HLA-G, mas 
havia um aumento gradual na expressão de HLA-G de acordo com a severidade da 
alteração histológica, regiões de bócio hiperplásico apresentaram uma expressão fraca, 
lesões benignas tinham expressão intermediária e lesões malignas de carcinoma 
tireoidiano tinham alta expressão. Dardano et al. (2012) avaliaram a concentração 
plasmática de sHLA-G em pacientes com CPT, porém apenas após eles já terem 
passado pela tireoidectomia, pacientes com TH, assim como em controles, mostrando 
que indivíduos com sHLA-G detectável apresentavam um comportamento mais agressivo 
29 
 
da doença. Por fim, um estudo mais recente de Figueiredo-Feitosa et al. (2017) também 
corrobora o papel desfavorável do HLA-G no CT, revelando que a presença de 
polimorfismos na região 3’UTR do gene do HLA-G, implicados na regulação de sua 
expressão, estão associados aos carcinomas diferenciados da tireoide e variáveis 
indicativas de pior prognóstico. Portanto, assim como as citocinas inflamatórias, o HLA-
G pode representar uma importante estratégia para auxílio de diagnóstico e prognóstico 
do CT. 
 
 
3 OBJETIVOS 
 
3.1 Objetivo geral 
 
 Investigar o HLA-G solúvel e um painel de citocinas pró-inflamatórias e anti-
inflamatórias como possíveis biomarcadores plasmáticos de diagnóstico e/ou prognóstico 
do CPT. 
 
3.2 Objetivos específicos 
 
• Comparar a concentração plasmática do HLA-G solúvel e das citocinas pré- e pós-
tireoidectomia. 
• Investigar uma possível correlação entre as diferentes moléculas analisadas nos 
plasmas dos pacientes com CPT pré- e pós-tireoidectomia. 
• Comparar a concentração plasmática do HLA-G solúvel e das citocinas entre 
pacientes com CPT e controles. 
• Investigar uma possível relação entre as características demográficas e clínico-
histopatológicas do CPT com os níveis plasmáticos das moléculas analisadas. 
• Investigar a possível associação das moléculas analisadas com o tipo de resposta 
ao tratamento apresentada pelo paciente pós-tireoidectomia. 
30 
 
4 MATERIAL E MÉTODOS 
 
4.1 Comitê de Ética em Pesquisa 
 
 O presente estudo seguiu às diretrizes regulamentadas da pesquisa envolvendo 
seres humanos, que constam na resolução do Conselho Nacional de Saúde nº 196/96 e 
nº340/04. Este estudo faz parte de um projeto multicêntrico aprovado pelo edital 
PROCAD da CAPES, intitulado: “Contribuição de Moléculas Imunoregulatórias HLA-G, 
HLA-E, Foxp3, PD-1, IL-17 no Câncer: Polimorfismo Gênico, Perfil de Expressão de 
mRNAs, Regulação por miRNAS e Perfil da Resposta Imune em Ensaios de Atividade 
Antitumoral de Compostos”, EDITAL N° 071/2013 - PROGRAMA NACIONAL DE 
COOPERAÇÃO ACADÊMICA – PROCAD, com parecer consubstanciado emitido pelo 
comitê de ética em pesquisa através da Plataforma Brasil, que encaminhou o mesmo 
para apreciação do comitê de ética local. A coleta de espécimes clínicos foi iniciada após 
aprovação pelos comitês de ética locais, CAAE: 39856714.2.2007.5292 e 
39856714.2.1001.5440. Os indivíduos selecionados foram informados sobre o protocolo 
de estudo e somente participaram aqueles que assinaram o Termo de Consentimento 
Livre e Esclarecido e responderam a um questionário. 
 
4.2 Casuística 
 
Neste estudo, foram incluídos oitenta e cinco indivíduos submetidos à tireoidectomia 
total por suspeita de malignidade e que tiveram diagnóstico de CPT confirmado após 
análise histopatológica, sendo trinta e quatro indivíduos oriundos do Hospital LIGA 
NORTE RIOGRANDENSE CONTRA O CÂNCER (LNRCC), Natal-RN. Cinquenta e um 
indivíduos oriundos do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto 
(HCFMRPUSP), Ribeirão Preto-SP, em colaboração com o Prof. Dr. Eduardo Antônio 
Donadi. Pacientes com precedente ou diagnóstico simultâneo de alguma outra neoplasia 
foram excluídos. Oitenta doadores de sangue oriundos do Hemocentro de Ribeirão Preto-
SP foram incluídos como controles. Todos os controles não tinham diagnóstico prévio de 
31 
 
câncer e tiveram resultado negativo para a presença de anticorpos antiperoxidase (anti-
TPO). Características clínicas de pacientes e controles foram obtidas através de 
questionários e registros nos prontuários hospitalares. 
As análises citopatológicas e histopatológicas do tumor foram realizadas nos 
respectivos hospitais por médicos patologistas como parte da rotina clínica de 
seguimento dos pacientes. O estadiamento tumoral e estratificação dos pacientes com 
CPT foi baseado na 7ª edição do sistema de classificação e estadiamento TNM (SOBIN 
et al., 2009), recomendado pela UICC e AJCC, no qual há a determinação da extensão 
do tumor (T), comprometimento de linfonodos regionais (N) e metástase à distância (M) 
(Anexo A). Informações relacionadas à evolução pós-operatória dos pacientes foram 
colhidas nos prontuários hospitalares. A resposta dos pacientes ao tratamento foi 
avaliada por pelo menos 18 meses pós-tireodectomia e foi classificada de acordo com 
critérios apresentados no ANEXO B (MOMESSO; TUTTLE, 2014). Essa classificação 
determina que a resposta ao tratamento corresponde ao excelente quando não existe 
evidência clínica, bioquímica ou estrutural da presença de doença, enquanto que 
bioquímica e estrutural incompleta correspondem a presença de alterações bioquímica e 
estruturais relacionadas a doença. Indivíduos indeterminados estão relacionados a 
evidências inespecíficas que não podem ser classificados como excelentes ou 
bioquímica e estrutural incompleta, inspirando continuação mais frequente do 
acompanhamento. 
 Os pacientes com CPT tiveram 10 mL de sangue periférico colhido em tubos 
contendo anticoagulante EDTA para obtenção de plasma em dois momentos: antes da 
tireoidectomia (pré-tireoidectomia) e em média trinta dias após a cirurgia, no retorno ao 
ambulatório de cirurgia de cabeça e pescoço (pós-tireodectomia). Apenas uma única 
coleta de 5 mL de sangue periférico em tubo contendo anticoagulante EDTA foi realizada 
para obtenção de plasma dos controles. O sangue total foi centrifugado em duas etapas 
a 1000 xg por 10 min cada (4°C) para minimizar ao máximo a presença de células no 
plasma e então este foi armazenado a -80ºC até o momento das análises laboratoriais. 
 
 
32 
 
4.3 Determinação dos níveis plasmáticos de HLA-G solúvel 
 
 Os níveis plasmáticos da molécula sHLA-G foram determinados por meio do 
ensaio imunoenzimático ELISA (do inglês, enzyme-linked immunosorbent assay) 
realizado no Laboratório multiusuário de biologia molecular da FMRP/USP-RP, 
coordenado pelo professor Dr. Eduardo Antônio Donadi, utilizando um protocolo validado 
(REBMANN et al., 2005). Placas de poliestireno de 96 poços (Corning, Nova Iorque, USA) 
foram incubadas overnight com o anticorpo primário de captura MEM-G/9 (EXBIO, 
Vestec, Czechia), na diluição 1:100. Esse anticorpo reconhece as isoformas mais 
abundantes da molécula no plasma: sHLA-G1, isoforma originalmente de membrana, 
liberada por degradação proteolítica e sHLA-G5, isoforma solúvel. Após a etapa de 
bloqueio com diluente DAKO por duas horas, 50 μL de plasma de pacientes (pré- e pós-
tireoidectomia) e de indivíduos controles foram transferidas para as placas e incubadas 
por duas horas. Os complexos sHLA-G/anticorpo anti-HLA-G imobilizados na placa foram 
detectados por meio do anticorpo secundário de coelho anti-humano β2-microglobulina 
(DAKO) na diluição 1:10.000. Após uma hora de incubação sob agitação, adicionou-se 
um anticorpo anti-coelho conjugadocom peroxidase (DAKO ENVISION System HRP 
rabbit) por uma hora. Todas as etapas de incubação foram realizadas a temperatura 
ambiente. Cada passo foi seguido de quatro etapas de lavagem com um tampão 
específico contendo água, PBS 1X e 0,1% de Tween 20 (SIGMA, Saint Louis, Missouri, 
EUA). Finalmente, os poços foram incubados com o substrato tetrametilbenzidina 
(3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine Liquid Substrate, Supersensitive, for ELISA – SIGMA, 
Saint Louis, Missouri, EUA) em sala escura por cerca de 20 minutos e a reação foi 
interrompida com adição de solução ácida. A absorbância resultante da formação de um 
produto amarelo foi mensurada por espectofotometria a 450 nm. As concentrações da 
molécula HLA-G no plasma foram determinadas utilizando-se uma curva de calibração 
padrão de cinco pontos (6.25-100 ng/mL) com quantidades conhecidas de HLA-G5. O 
HLA-G5, utilizado para a construção da curva de calibração, foi obtido de cultura celular 
de linhagem de melanoma (M8) transfectada com pcDNA contendo o gene HLA-G, de 
forma que a molécula HLA-G5 é liberada no sobrenadante. Os testes foram realizados 
em duplicata e os resultados expressos em ng/ml. Como controle negativo, utilizou-se 
33 
 
sobrenadante de células M8 transfectadas com pcDNA vazio. Quando abaixo do limite 
detectável, o resultado foi considerado 0 ng/mL. 
 
4.4 Determinação da concentração plasmática de citocinas pró-inflamatórias e 
anti-inflamatórias 
 
As citocinas pró- e anti-inflamatórias analisadas foram escolhidas com base no 
conhecimento da fisiopatologia da malignidade e alguns marcadores já relatados na 
literatura. A concentração plasmática de todas as citocinas foi mensurada no Laboratório 
multiusuário de biologia molecular da FMRP/USP-RP, utilizando o kit BD Cytometric Bead 
Array (CBA) Human Soluble Protein Flex Set System (BD Biosciences, San Diego, CA) 
de acordo com as instruções do fabricante. Um ensaio multiplex foi montado para a 
quantificação simultânea das seguintes citocinas: IFN-γ, TNF, IL-12p70, IL-1α, IL-4, IL-5, 
IL-13, IL-10, IL-17A, IL-1β, IL-6. Além disso, as citocinas IFN-α e TGF-β1 também foram 
quantificadas em ensaios single-plex. A fluorescência produzida pelo sistema CBA foi 
mensurada em citômetro de fluxo FACSCanto I e analisada usando o software FCAP 
Array (BD Biosciences). Os limites de detecção para essas citocinas são 1.5 pg/mL para 
IFN-α, 2.3 pg/mL para IL-1β, 1.1 pg/mL para IL-5, 0.6 pg/mL para IL-12p70, 1.4 pg/mL 
para IL-4, 1.0 pg/mL para IL-1α, 0.6 pg/mL IL-13, 1.6 pg/mL para IL-6, 1.2 pg/mL para 
TNF, 0.3 pg/mL IL-17A, 0.13 pg/mL para IL-10, 0.8 para IFN-γ e 14.9 pg/ml para TGF-β1. 
Quando a concentração da citocina estiva abaixo do limite de detecção, esta foi 
considerada 0 pg/mL. 
 
4.5 Análise estatística 
 
 O programa Statistical Package for the Social Science v. 20.0 (SPSS Inc., Illinois, 
EUA) foi utilizado para a análise estatística. As variáveis categóricas foram apresentadas 
em frequências relativas e absolutas, enquanto que, as variáveis contínuas por 
apresentarem uma distribuição assimétrica foram apresentadas como mediana e 
intervalo interquartil. O teste não-paramétrico de Wilcoxon foi utilizado para a 
34 
 
comparação pareada dos níveis plasmáticos pré- e pós-tireoidectomia de citocinas e de 
sHLA-G dos pacientes com CPT. A correlação de Spearman foi adotada para verificar a 
existência de correlação entre as diferentes moléculas mensuradas pré- e pós-
tireoidectomia. Os coeficientes de 0,3 a 0,5 foram considerados como baixa correlação, 
0,5 até 0,7 moderados e acima de 0,7 alta correlação (MUKAKA, 2012). Os valores de p 
inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significantes. 
O teste de Mann-Whitney foi utilizado para comparar os níveis plasmáticos de 
citocinas e sHLA-G entre pacientes e controles, em uma abordagem univariada. O 
mesmo foi realizado para analisar a associação de tais moléculas com variáveis clínicas 
e histopatológicas, e resposta ao tratamento dos pacientes com CPT. Resultados cujos 
valores de p foram inferiores a 0,15 foram considerados elegíveis para análise 
multivariada através de regressão logística múltipla, a fim de evidenciar o potencial 
dessas moléculas em diferenciar pacientes de controles, assim como também verificar 
associações independentes com características histopatológicas e a resposta ao 
tratamento (p < 0,05). Nos modelos multivariados investigou-se a presença de valores 
padronizados excedendo 3 desvios padrão. 
A análise de curva ROC (do inglês, Receiver Operating Characteristic) foi realizada 
a partir dos achados nas análises multivariadas em uma ferramenta online baseada na 
linguagem R - EasyROC: a web-tool for ROC curve analysis (versão. 1.3) (GOKSULUK 
et al., 2016). O teste se baseia nos princípios de sensibilidade e especificidade para 
mensurar a performance de um teste diagnóstico e prognóstico, investigando a sua 
capacidade de distinguir pacientes de indivíduos controles e pacientes que respondem 
ou não ao tratamento, respectivamente. A área sob a curva (do inglês, Area under the 
curve - AUC) é a medida do desempenho do teste, que pode ter valor de 0 a 1. Quanto 
mais próximo for esse valor de 1, melhor a performance do teste, de forma que um teste 
ideal é aquele cuja AUC é igual a 1 (PARK; GOO; JO, 2004). Testes cujos valores de 
AUC são abaixo de 0.5 são considerados incapazes de distinguir os grupos. O ponto de 
corte (também chamado de ponto do cut-off) é o ponto que separa as duas populações, 
fornecendo o diagnóstico/prognóstico (UNAL, 2017). Para a determinação do ponto do 
cut-off nos níveis plasmáticos das moléculas, o índice de Youden foi adotado (YOUDEN, 
1950). 
35 
 
5 RESULTADOS 
 
5.1 Características demográficas e clínico-histopatológicas 
 
Um total de 85 pacientes com CPT tiveram o plasma pré-tireoidectomia analisado 
neste estudo, mas 8 desses pacientes não compareceram a coleta pós-tireoidectomia, 
de forma que, as análises pós-tireoidectomia foram realizadas em apenas 77 desses 
pacientes. A média etária dos pacientes com CPT foi de 48 ± 15 anos (máxima de 80 
anos e mínima de 16 anos), enquanto que os controles tinham média de 34 ± 11 anos 
(máxima de 64 anos e mínima de 18 anos). O grupo de pacientes CPT consistiu de 75 
mulheres e 10 homens, enquanto o grupo de controles consistiu de 65 mulheres e 15 
homens. Não houve diferença na distribuição de gênero entre os grupos estudados (p = 
0,211), contudo o grupo de indivíduos controles é composto por uma população em média 
mais jovem do que o grupo de indivíduos com CPT (p < 0,001). As características clínico-
histopatológicas e de resposta ao tratamento dos pacientes com CPT estão resumidas 
na Tabela 1. De acordo com o sistema de estadiamento TNM, 50 pacientes com CPT 
foram estratificados em estágios iniciais (I e II) e 35 pacientes em estágios avançados (III 
e IV) neste estudo. Após acompanhamento da evolução clínica dos pacientes, foi 
possível classificar a situação de resposta ao tratamento de apenas 55 pacientes com 
CPT. Os demais pacientes ainda necessitavam de mais avaliações e exames para 
estabelecer uma conclusão sobre o caso. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
36 
 
Tabela 1 — Descrição das características dos pacientes com CPT incluídos no estudo 
 
Pacientes com CPT 
N = 85 
 N % 
 Estadiamento TNMa 
 Estágios iniciais (I e II) 
 Estágios avançados (III e IV) 
 
50 
35 
 
58,8 
41,2 
 Tamanho do tumor 
 ≤ 2 cm 
 > 2 cm 
 
57 
28 
 
67,1 
32,9 
 Variante histológica 
 Clássica 
 Folicular 
 Clássica e folicular 
 Outrosb 
 
49 
15 
7 
14 
 
57,6 
17,6 
8,3 
16,5 
 Extensão extratireoidiana 
 Sim 
 Não 
 
36 
49 
 
42,4 
57,6 
 Invasãoc 
 Sim 
 Não 
 
23 
62 
 
27,1 
72,9 
 Multicentricidade 
 Sim 
 Não 
 
35 
50 
 
41,2 
58,8 
 Linfonodos metastáticosd 
 SimNão 
 
25 
60 
 
29,4 
70,6 
 Tireoidite de Hashimoto 
 Sim 
 Não 
 
26 
59 
 
30,6 
69,4 
 Resposta ao tratamentoe 
 Excelente 23 25,9 
 Indeterminada 18 22,3 
 Bioquímica incompleta 10 11,8 
 Estrutural incompleta 4 4,7 
 Desconhecidaf 30 35,3 
a Estabelecido ao diagnóstico inicial para todos os pacientes. Classificação de acordo com Sobin et al, 
2009. TNM, T - tamanho do tumor, N - metástase para linfonodos, M - metástase distante 
b Oxifílica e subtipos mistos 
c Angiolinfática, vascular, capsular e perineural 
d Metástase apresentada ao diagnóstico inicial 
e Classificados de acordo com Momesso et al., 2014 
f Pacientes cuja informação sobre resposta ao tratamento ainda são inconclusivas 
 
 
 
 
 
37 
 
5.2 Análise da produção de citocinas e sHLA-G no plasma dos pacientes com 
CPT pré- e pós-tireoidectomia 
 
A produção de 13 citocinas (IFN-γ, TNF, IL-12p70, IL-1α, IL-4, IL-5, IL-13, IL-10, 
IL-17A, IL-1β, IL-6, IFN-α e TGF-β1) e sHLA-G foi mensurada nos pacientes com CPT 
em que se obteve plasma pré-tireoidectomia e pós-tireoidectomia, e a comparação 
pareada entre os níveis plasmáticos pré- e pós-tireoidectomia está descrita na tabela 2. 
Os níveis de IL-4, IL-10, TNF, IFN-α e TGF-β1 foram significativamente mais elevados 
pós-tireoidectomia (p = 0,006, p = 0,013, p = 0,045, p < 0,001, p = 0,001, respectivamente; 
figura 2). No entanto, os níveis das demais citocinas e sHLA-G não apresentaram 
diferença significativa. 
 
Tabela 2 — Análise pareada da concentração plasmática de citocinas e sHLA-G em pacientes com CPT 
pré- e pós-tireoidectomia 
Moléculas Pré-tireoidectomia Pós-tireoidectomia p-valora 
IL-4 0,02 (0-0,19) 0,19 (0,02-0,29) 0,006 
IL-5 0,08 (0,02-0,21) 0,10 (0,04-0,21) 0,563 
IL-6 1,15 (0,56-1,75) 1,30 (0,86-1,97) 0,617 
IL-1α 0,21 (0-0,61) 0,35 (0-0,85) 0,180 
IL-1β 0,77 (0,50-1,03) 0,86 (0,50-1,21) 0,236 
IL-17A 0 (0-0) 0 (0-0,50) 0,204 
IL-10 0,49 (0,33-0,59) 0,59 (0,39-0,70) 0,013 
IFN-γ 0,08 (0-0,26) 0,13 (0-0,26) 0,483 
TNF 0,39 (0,28-0,71) 0,61 (0,39-0,82) 0,045 
IL-12p70 0,19 (0,11-0,42) 0,26 (0,11-0,42) 0,869 
IL-13 0,23 (0,15-0,33) 0,23 (0,15-0,30) 0,649 
IFN-α 0,22 (0,10-0,34) 0,33 (0,22-0,46) <0,001 
TGF-β1 46,4 (8,55-109,60) 102,1 (28,4-519,54) 0,001 
sHLA-G 0,96 (0-6,80) 0 (0-3,71) 0,217 
Valores correspondem a mediana e (intervalor interquartil) em pg/ml para citocinas e ng/ml para sHLA-G 
a p-valor do Teste de Wilcoxon, valores estatisticamente significativos em negrito
38 
 
 
Figura 2 — Concentração plasmática das citocinas com expressão diferencial estatisticamente significante na comparação pareada entre pré- e 
pós-tireoidectomia dos pacientes com CPT, A: IL-4; B: IL-10; C: TNF; D: IFN-α; E: TGF-β1; Valores correspondem a mediana e intervalo interquartil. 
P-valor refere-se ao teste de Wilcoxon.
39 
 
 
5.3 Correlações entre os níveis plasmáticos de citocinas e sHLA-G em 
pacientes com CPT pré- e pós-tireoidectomia 
 
A maior parte das correlações obtidas entre os níveis plasmáticos de sHLA-G e 
citocinas pré- e pós-tireoidectomia dos pacientes com CPT eram fracas nos dois 
momentos (valor de r < 0,3). No entanto, entre as correlações mais significativas a IL-17A 
apresentou uma correlação positiva baixa com IL-4 (r = 0,472, p < 0,001; figura 3) no 
plasma pré-tireoidectomia. Além disso, entre os níveis plasmáticos pós-tireoidectomia, as 
correlações mais significativas eram correlações positivas baixas entre IL-10 e IL-4 (r = 
0.402; p < 0,001), IL-17A e IL-1β (r = 0,416; p < 0,001), e IL-13 e IL-12p70 (r = 0,416; p < 
0,001) (figura 4). A análise das correlações entre os níveis plasmáticos das moléculas 
pré- e pós-tireoidectomia está apresentada nas tabelas 3 e 4. 
 
 
40 
 
Tabela 3 — Correlação entre a concentração plasmática de sHLA-G e citocinas em pacientes com CPT pré-tireoidectomia 
 
sHLA-
G 
IL-4 IL-5 IL-6 IL-1α IL-1β IL-17A IL-10 IFN-γ TNF 
IL-
12p70 
IL-13 IFN-α 
sHLA-G 
IL-4 
0.120 
(0.274) 
 
IL-5 
0.006 
(0.956) 
0.164 
(0.133) 
 
IL-6 
0.041 
(0.712) 
0.113 
(0.304) 
0.354 
(<0.001) 
 
IL-1α 
-0.037 
(0.735) 
0.248 
(0.022) 
0.348 
(0.001) 
0.237 
(0.029) 
 
IL-1β 
0.089 
(0.418) 
0.340 
(0.001) 
0.296 
(0.006) 
0.148 
(0.176) 
0.216 
(0.047) 
 
IL-17A 
0.031 
(0.777) 
0.472 
(<0.001) 
0.219 
(0.044) 
0.137 
(0.210) 
0.192 
(0.078) 
0.379 
(<0.001) 
 
IL-10 
0.058 
(0.596) 
0.137 
(0.212) 
0.328 
(0.002) 
0.178 
(0.103) 
0.120 
(0.276) 
0.075 
(0.486) 
0.159 
(0.146) 
 
IFN-γ 
0.032 
(0.771) 
0.227 
(0.037) 
0.078 
(0.479) 
0.124 
(0.258) 
0.091 
(0.410) 
0.057 
(0.681) 
0.184 
(0.092) 
0.055 
(0.617) 
 
TNF 
-0.013 
(0.906) 
0.235 
(0.031) 
0.345 
(0.001) 
0.252 
(0.020) 
0.363 
(0.001) 
0.335 
(0.002) 
0.220 
(0.043) 
-0.003 
(0.980) 
0.125 
(0.253) 
 
IL-
12p70 
-0.016 
(0.881) 
0.342 
(0.001) 
0.243 
(0.025) 
0.201 
(0.065) 
0.259 
(0.017) 
0.349 
(0.001) 
0.182 
(0.095) 
0.243 
(0.025) 
0.191 
(0.080) 
0.172 
(0.116) 
 
IL-13 
0.075 
(0.493) 
0.197 
(0.071) 
0.291 
(0.007) 
0.113 
(0.303) 
0.154 
(0.161) 
0.229 
(0.035) 
0.222 
(0.041) 
0.061 
(0.579) 
0.093 
(0.397) 
0.207 
(0.057) 
0.239 
(0.028) 
 
IFN-α 
0.227 
(0.037) 
0.192 
(0.079) 
0.096 
(0.381) 
0.083 
(0.449) 
0.197 
(0.071) 
0.317 
(0.003) 
0.271 
(0.012) 
-0.005 
(0.967) 
-0.084 
(0.445) 
0.222 
(0.041) 
0.136 
(0.213) 
0.081 
(0.462) 
 
TGF-β1 
-0.038 
(0.728) 
-0.001 
(0.995) 
0.102 
(0.355) 
-0.046 
(0.673) 
-0.093 
(0.398) 
-0.125 
(0.256) 
0.073 
(0.504) 
-0.054 
(0.623) 
0.178 
(0.103) 
0.097 
(0.376) 
-0.072 
(0.515) 
0.071 
(0.518) 
0.052 
(0.634) 
Valores representam o coeficiente de correlação de Spearman e (p-valor); Correlações estatisticamente significativas com r > 0,3 estão destacadas 
 em negrito. 
41 
 
 
Figura 3 — Gráfico de dispersão da correlação positiva baixa entre a concentração plasmática de IL-17A 
e IL-4 nos pacientes com CPT pré-tireoidectomia. (coeficiente de Spearman: 0,472) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
IL -1 7A
IL
-4
0 2 4 6 8
0 .0
0 .2
0 .4
0 .6
0 .8
1 .0
r
2
= 0 .2 7 2
42 
 
 
 
Tabela 4 — Correlação entre a concentração plasmática de sHLA-G e citocinas em pacientes com CPT pós-tireoidectomia 
 sHLA-G IL-4 IL-5 IL-6 IL-1α IL-1β IL-17A IL-10 IFN-γ TNF 
IL-
12p70 
IL-13 IFN-α 
sHLA-G 
IL-4 
0.109 
(0.345) 
 
IL-5 
-0.077 
(0.506) 
0.369 
(0.001) 
 
IL-6 
-0.002 
(0.989) 
0.253 
(0.027) 
0.105 
(0.363) 
 
IL-1α 
-0.213 
(0.063) 
0.370 
(0.001) 
0.239 
(0.037) 
0.199 
(0.082) 
 
IL-1β 
0.127 
(0.271) 
0.281 
(0.013) 
0.270 
(0.017) 
-0.084 
(0.469) 
0.147 
(0.201) 
 
IL-17A 
0.147 
(0.203) 
0.292 
(0.010) 
0.185 
(0.107) 
0.056 
(0.628) 
0.186 
(0.106) 
0.416 
(<0.001) 
 
IL-10 
-0.046 
(0.693) 
0.402 
(<0.001) 
0.252 
(0.027) 
0.236 
(0.039) 
0.278 
(0.014) 
0.319 
(0.005) 
0.134 
(0.246) 
 
IFN-γ 
0.066 
(0.568) 
0.113 
(0.327) 
0.121 
(0.294) 
0.315 
(0.005) 
0.203 
(0.076) 
0.065 
(0.573) 
0.189 
(0.099) 
0.197 
(0.085) 
 
TNF 
0.198 
(0.085) 
0.282 
(0.013) 
0.175 
(0.129) 
0.113 
(0.328) 
0.231 
(0.043) 
0.358 
(0.001) 
0.325 
(0.004) 
0.081 
(0.485) 
-0.020 
(0.861) 
 
IL-
12p70 
-0.046 
(0.693) 
0.205 
(0.074) 
0.047 
(0.682) 
0.089 
(0.442) 
0.062 
(0.593) 
0.218 
(0.057) 
0.311 
(0.006) 
0.030 
(0.793) 
0.131 
(0.256) 
0.253 
(0.026) 
 
IL-13 
-0.120 
(0.299) 
0.280 
(0.014) 
0.326 
(0.004) 
0.129 
(0.264) 
0.156 
(0.177) 
0.229 
(0.045) 
0.215 
(0.060) 
0.256 
(0.025) 
0.087 
(0.453) 
0.231 
(0.043) 
0.416 
(<0.001) 
 
IFN-α 
0.124 
(0.278) 
0.236 
(0.038) 
-0.034 
(0.771) 
-0.118 
(0.308) 
0.091 
(0.430) 
0.274 
(0.016) 
0.105 
(0.364) 
0.133 
(0.247) 
0.041 
(0.722) 
0.213 
(0.063) 
0.117 
(0.309) 
0.083 
(0.475)