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RUTHNALDO RODRIGUES MELO DE LIMA 
CARACTERIZAÇÃO DO NÚCLEO PRÉ-
GENICULADO DO SAGUI (Callithrix jacchus): 
PROJEÇÃO RETINIANA, NEUROQUÍMICA E 
ATIVIDADE CELULAR (Expressão de FOS). 
 
 
 
 
 
Natal-RN
2008
Dissertação apresentada à Universidade 
Federal do Rio Grande do Norte, para 
obtenção do título de Mestre em 
Psicobiologia. 
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RUTHNALDO RODRIGUES MELO DE LIMA 
CARACTERIZAÇÃO DO NÚCLEO PRÉ-
GENICULADO DO SAGUI (Callithrix jacchus): 
PROJEÇÃO RETINIANA, NEUROQUÍMICA E 
ATIVIDADE CELULAR (Expressão de FOS). 
Dissertação apresentada à Universidade 
Federal do Rio Grande do Norte, para 
obtenção do título de Mestre em 
Psicobiologia. 
Orientador: Jeferson de Souza Cavalcante 
Natal-RN 
2008
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Título 
CARACTERIZAÇÃO DO NÚCLEO PRÉ-GENICULADO DO SAGUI 
(Callithrix jacchus): PROJEÇÃO RETINIANA, NEUROQUÍMICA E 
ATIVIDADE CELULAR (Expressão de FOS). 
Autor 
RUTHNALDO RODRIGUES MELO DE LIMA
Data da Defesa 
30 / 04 / 2008
Banca Examinadora 
______________________________________________________ 
Profª Raquel Simoni Pires 
Universidade Cidade de São Paulo, UNICID 
______________________________________________________ 
 Profª Miriam Stela Maris de Oliveira Costa 
 Universidade Federal do Rio Grande do Norte, RN 
 
______________________________________________________ 
 Profº Jeferson de Souza Cavalcante 
 Universidade Federal do Rio Grande do Norte, RN 
5
AGRADECIMENTOS 
“Aos meus pais, por toda dedicação e transposição dos seus sonhos nas minhas 
realizações”. 
“Aos irmãos e demais familiares, pelo apoio e incentivo aos meus objetivos”. 
“A todos aqueles que um dia foram meus professores. Em especial ao Prof° Jeferson de 
Souza Cavalcante e a Profª Miriam Stela Maris de Oliveira Costa, por me 
proporcionarem toda a inspiração e transpiração de que necessita um cientista”. 
“A todos os amigos cientistas. Em especial aos que colaboraram para realização desse 
projeto (Equipe do LabNeuro-UFRN, Profª Carolina Virgínia, Cristiane, Aline e 
Gutemberg) e aos contemporâneos da turma de Psicobiologia de 2006, pelo feedback 
positivo proporcionado na partilha do conhecimento”. 
“Aos meus amigos. Em especial a Marcos Daniel e Rilton, pelo companheirismo nos 
bons e maus momentos da minha vida”. 
“A João Carlos Galvão e família, a Fernando Varela e família e a Renato Torres e 
família, pelos bons princípios e pelo generoso acolhimento”. 
“Aos compadres e comadres Harold e Andressa e João Guilherme e Larissa, pela 
amizade e consideração”. 
“Aos concunhados, pela amizade e disponibilidade”. 
“Aos músicos do Processo Uncinado e do Os Etílicos, pelas novidades e experiências 
proporcionadas”. 
“Aos funcionários dos Departamentos de Morfologia, Fisiologia e do Núcleo de 
Primatologia da UFRN, por proporcionarem um ambiente saudável de trabalho”. 
“Aos meus ex-alunos de Anatomia, por me ensinarem a ensinar”. 
“Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo 
apoio a pesquisa”. 
“A Camila Regalado Galvão, pelos passados, presentes e futuros frutos do nosso amor”. 
4
“Um homem é um sucesso quando pula da cama de manhã e 
vai dormir à noite e, nesse meio tempo, só faz o que gosta”. 
(Bod Dylan) 
“Algo só é impossível até que alguém duvida e resolve provar 
o contrário”. 
(Albert Einstein) 
8
LISTA DE TABELAS E FIGURAS 
TABELA 1 – Discriminação dos reagentes utilizados na imunohistoquímica. 
FIG. 1 – Esquemas de secções coronais através do complexo geniculado lateral do tálamo 
(Macaca mullata). 
FIG. 2 – Curvas de resposta de fase para estímulos fóticos e não-fóticos. 
FIG. 3 – Desenho experimental da aplicação dos pulsos de escuro. 
FIG. 4 – Citoarquitetura do núcleo pré-geniculado (técnica de Nissl). 
FIG. 5 – Citoarquitetura do núcleo pré-geniculado (Imunohistoquímica contra NeuN). 
FIG. 6 (A, B e C) – Citoarquitetura do núcleo pré-geniculado e relações anatômicas (NeuN). 
FIG. 7 – Morfologia celular do núcleo pré-geniculado (Nissl x NeuN) 
FIG. 8 – Projeções retinianas ao núcleo pré-geniculado (subunidade B da toxina colérica). 
FIG. 9 – Imunorreatividade contra NPY no núcleo pré-geniculado. 
FIG. 10 – Imunorreatividade contra ENK no núcleo pré-geniculado. 
FIG. 11 – Imunorreatividade contra GAD no núcleo pré-geniculado. 
FIG. 12 – Imunorreatividade contra 5-HT no núcleo pré-geniculado. 
FIG. 13 – Imunorreatividade contra SP no núcleo pré-geniculado. 
FIG. 14 – Imunorreatividade contra PV no núcleo pré-geniculado. 
FIG. 15 – Imunorreatividade contra CR no núcleo pré-geniculado. 
FIG. 16 – Imunorreatividade contra CB no núcleo pré-geniculado. 
FIG. 17 – Imunorreatividade contra GFAP no núcleo pré-geniculado. 
FIG. 18 – Imunorreatividade contra FOS no núcleo pré-geniculado (Experimental x Controle). 
FIG. 19 – Imunorreatividade contra FOS no núcleo pré-geniculado (Experimental x Controle). 
FIG. 20 – Gráfico: N° de células FOS-positivas (Experimental x Controle). 
FIG. 21 – Gráfico: N° de células FOS-positivas (NPGli x NPGle / Experimental x Controle). 
FIG. 22 – Anatomia do complexo geniculado lateral de primatas (proposta) 
FIG. 23 – Gráfico: Registro de atividade locomotora diária: antes, durante e pós-pulso. 
9
FIG. 24 – Actograma: Registro de atividade locomotora diária: antes, durante e pós-pulso. 
FIG. 25 – Gráfico: Registro de atividade locomotora por hora circadiana. 
FIG. 26 – Gráfico: Registro de atividade locomotora nas horas circadianas 3 e 4, com e sem 
estímulo. 
FIG. 27 – Gráfico: Registro de atividade locomotora nas horas circadianas 12 e 17, com e sem 
estímulo. 
FIG. 28 – Curva de resposta dependente de fase. 
6
LISTA DE ABREVIATURAS 
5-HT = Serotonina 
τ = Período endógeno 
ABC = Protocolo avidina-biotina complexo peroxidase 
APP = polipeptídeo pancreático das aves 
AvF = Avanço de fase 
AtF = Atraso de fase 
CB = Calbindina 
CC = Claro constante 
CP = Pedúnculo cerebral 
CR = Calretinina 
CRF = Curva de resposta dependente de fase 
CTb = Subunidade B da toxina colérica 
Dors = Dorsal 
DS = Dia subjetivo 
ENK = Encefalina 
FIG = Folheto intergeniculado 
FT = Fator transcricional 
FTC = Fator transcricional constitutivo 
FTI = Fator transcricional induzido 
GABA = Ácido gama-aminobutírico 
GAD = Descarboxilase do ácido glutâmico 
GFAP = Proteína acídica fibrilar glial 
GLD / LGN= Núcleo geniculado lateral dorsal 
GLV = Núcleo geniculado lateral ventral 
GLU = Glutamato 
HC = Hora circadiana 
IC = Cápsula interna 
IEGs = Genes de expressão imediata 
Lat = Lateral 
Med = Medial 
7
MF = Mudança de fase 
NAAG = N-acetil-aspartil glutamato 
NeuN = Proteína neuronal nuclear específica 
NPG = Núcleo pré-geniculado do tálamo 
NPGle / PGNol = Lâmina externa do núcleo pré-geniculado 
NPGli / PGNil = Lâmina interna do núcleo pré-geniculado 
NPY = Neuropeptídeo-Y 
NS = Noite subjetiva 
NSQ = Núcleo supraquiasmático 
NT = Neurotensina 
OR = Radiação óptica 
OT = Tracto óptico 
PACAP = Polipeptídio ativador de adenilatociclase pituitária 
Pp = Núcleo peripeduncular 
PV = Parvalbumina 
PVT = Núcleo paraventricular 
RT / RN = Núcleo reticular do tálamo 
SP = Substância P 
STC = Sistema de temporização circadiana 
Stl = Núcleo subtalâmico 
TGH = Tracto geniculo-hipotalãmico 
TRH = Tracto retino-hipotalâmico 
Ventr = Ventral 
VIP = Peptídeo intestinal vasoativo 
VP = Vasopressina 
VPI = Núcleo ventral póstero-inferior do tálamo 
ZI = Zona incerta 
ZSPV = Zona subparaventricular 
10
SUMÁRIO: Pág.
RESUMO 13
ABSTRACT 15 
1. INTRODUÇAO 16
1.1 - A Natureza Rítmica e o Surgimento da Cronobiologia 16 
1.2 – Bases Neurais dos Ritmos Biológicos 18
1.2.1 – O Núcleo Supraquiasmático 18
1.2.2 – O Folheto Intergeniculado 22
1.2.3 – O Núcleo Pré-geniculado 25
1.3 – Estímulos Fóticos e Não-fóticos 28
1.4 – Marcando a Atividade Celular 30 
1.5 – Genes de Expressão Imediata e o Sistema de Temporização Circadiana 31
1.6 – Estudos Eletrofisiológicos32
2. JUSTIFICATIVA 34 
3. OBJETIVOS 35
4. MATERIAL E MÉTODOS 36
4.1 – Animais 36
4.2 – Viveiros e Gaiolas 36
4.3 – Alimentação 37
4.4 – Projeção Retiniana e Neuroquímica 37
4.5 – Processamento do tecido 38
4.5.1 – Perfusão e Microtomia 38 
4.5.2 – Imunohistoquímica 39 
4.5.2.1 – Imunoperoxidase simples 39
4.5.3 – Técnica de Nissl (Tionina) 41 
4.7 – Expressão de proteína FOS 42
4.7.1 – Grupo Experimental 42
4.7.2 – Grupo Controle 46 
4.7.3 – Curva de Resposta Dependente de Fase (CRF) 46 
4.7.4 – Registro de Atividade Locomotora 46 
5. RESULTADOS 48
5.1 – O Núcleo Pré-geniculado 48
5.1.1 – Citoarquitetura (Nissl e NeuN) 48
5.1.2 – Projeções Retinianas 49
5.1.3 – Neurotransmissores 49
11
Imunoreatividade contra NPY 49 
Imunoreatividade contra ENK 49
Imunoreatividade contra GAD 49
Imunoreatividade contra 5-HT 49 
Imunoreatividade contra SP 50 
5.1.4 – Proteínas Ligantes de Cálcio 50 
Imunoreatividade contra PV 50 
Imunoreatividade contra CR 50 
Imunoreatividade contra CB 50 
5.1.5 – Glia 51 
Imunorreatividade contra GFAP 51 
5.1.6 – Atividade Celular 51 
Imunorreatividade contra FOS 51
5.2 – Atividade Locomotora 51
5.3 – Curva de Resposta de Fase 52
FIGURAS 53
FIG. 4 – Citoarquitetura do núcleo pré-geniculado (Nissl) 53 
FIG. 5 – Citoarquitetura do núcleo pré-geniculado (NeuN) 54 
FIG. 6 (A, B e C) – Citoarquitetura do núcleo pré-geniculado e relações anatômicas 55 
FIG. 7 – Morfologia celular do núcleo pré-geniculado 57 
FIG. 8 – Projeções retinianas ao núcleo pré-geniculado 57 
FIG. 9 – Imunorreatividade contra NPY no núcleo pré-geniculado 59 
FIG. 10 – Imunorreatividade contra ENK no núcleo pré-geniculado 60 
FIG. 11 – Imunorreatividade contra GAD no núcleo pré-geniculado 61 
FIG. 12 – Imunorreatividade contra 5-HT no núcleo pré-geniculado 62 
FIG. 13 – Imunorreatividade contra SP no núcleo pré-geniculado 63 
FIG. 14 – Imunorreatividade contra PV no núcleo pré-geniculado 64 
FIG. 15 – Imunorreatividade contra CR no núcleo pré-geniculado 65 
FIG. 16 – Imunorreatividade contra CB no núcleo pré-geniculado 66 
FIG. 17 – Imunorreatividade contra GFAP no núcleo pré-geniculado 67 
FIG. 18 – Imunorreatividade contra FOS no núcleo pré-geniculado 68 
FIG. 19 – Imunorreatividade contra FOS no núcleo pré-geniculado 69 
FIG. 20 – Gráfico: N° de células FOS-positivas 70 
FIG. 21 – Gráfico: N° de células FOS-positivas 70 
FIG. 22 – Anatomia do complexo geniculado lateral de primatas 71
12
FIG. 23 – Gráfico: Registro de atividade locomotora diária 72
FIG. 24 – Actograma: Registro de atividade locomotora diária 72
FIG. 25 – Gráfico: Registro de atividade locomotora por hora circadiana 73 
FIG. 26 – Gráfico: Registro de atividade locomotora (HC 3 e 4) 74 
FIG. 27 – Gráfico: Registro de atividade locomotora (HC 12 e 17) 75 
FIG. 28 – Curva de resposta dependente de fase 76 
6. DISCUSSÃO 77
6.1 – Citoarquitetura do Núcleo Pré-geniculado 77
6.2 – Projeção Retiniana 80
6.3 – Neuroquímica 81 
6.4 – Expressão de FOS 85
6.5 – Atividade Locomotora 86
6.7 – Curva de Resposta de Fase 87
7. CONCLUSÕES 89
8. REFERÊNCIAS 90
13
RESUMO 
O sistema de temporização circadiana (STC) é responsável pela geração e 
modulação dos ritmos circadianos que são oscilações endógenas manifestadas pelos 
seres vivos para a maioria das funções e comportamentos, com período em torno de 24 
horas. Estes ritmos são sincronizados principalmente ao ciclo claro-escuro diário. O 
STC é constituído por um conjunto de estruturas neurais interligadas, incluindo na sua 
composição um marca-passo encarregado da geração do ritmo, vias sincronizadoras e 
de saída aos efetores comportamentais. 
O núcleo supraquiasmático do hipotálamo (NSQ) é tido como principal marca-
passo circadiano. A lesão desse conjunto de células deixa o animal arrítmico para 
algumas funções circadianas. A principal via direta de sincronização é o tracto retino-
hipotalâmico (TRH), que leva informação fótica ambiental da retina ao NSQ. Uma 
segunda via, tida como de sincronização indireta para o NSQ, é o tracto genículo-
hipotalâmico (TGH), que se origina das células produtoras de neuropeptídeo Y (NPY) 
do folheto intergeniculado (FIG) do complexo geniculado lateral do tálamo de 
roedores. Essas células também recebem projeção direta da retina. Em primatas essa 
estrutura ainda não foi identificada. No entanto, um conjunto de células medial ao 
núcleo geniculado lateral dorsal (GLD) do tálamo, denominado de núcleo pré-
geniculado (NPG), se apresenta como possível estrutura homóloga ao FIG dos 
roedores, já que algumas células do NPG apresentam imunorreatividade ao anticorpo 
contra NPY em diversos primatas estudados. 
Sabe-se que o sistema FIG-TGH além de estar relacionado à modulação fótica 
do NSQ, parece também estar fortemente envolvido na sincronização não-fótica desse 
sistema. Ainda, as células imunorreativas a NPY estão claramente mais envolvidas na 
sincronização não-fótica, comprovado pela marcação da atividade metabólica 
envolvendo o gene c-fos (gene de expressão imediata). Considerando este aspecto 
funcional e a dificuldade de identificar com precisão uma estrutura homóloga ao FIG 
em primatas, realizamos a caracterização neuroquímica, analisamos o padrão da 
projeção retiniana e a expressão da proteína do gene c-fos após pulso de escuro, para 
melhor definir o papel do NPG dentro do STC. Para isso, usamos como modelo 
14
experimental um primata do novo mundo, o Callitrhix jacchus, conhecido 
popularmente como sagüi. 
Nossos dados confirmaram a hipótese inicial de que o NPG, ou parte dele, seria 
homólogo ao FIG de roedores. Encontramos, em toda extensão do NPG do sagüi, 
neurônios imunorreativos a NPY e uma densa projeção retiniana em uma região 
localizada mais próxima ao GLD. Concluímos que esta área situada mais 
internamente, em relação ao complexo geniculado lateral do tálamo, corresponde ao 
FIG e a porção mais externa ao núcleo geniculado lateral ventral dos roedores. 
Palavras-chave: Núcleo supraquiasmático, folheto intergeniculado, Núcleo pré-
geniculado, Pulso de escuro, c-Fos. 
15
ABSTRACT 
In rodents, the suprachiasmatic nucleus (SCN) and the intergeniculate leaflet 
(IGL) are the main components of the circadian system. The SCN is considerate the 
site of an endogenous biological clock because can to generate rhythm and to 
synchronize to the environmental cues (zeitgebers) and IGL has been related as one of 
the main areas that modulate the action of SCN. Both receive projections of ganglion 
cells of retina and this projection to SCN is called retinohypothalamic tract (RHT). 
Moreover, the IGL is connected with SCN through of geniculohypothalamic tract 
(GHT). In primates (include humans) was not still demonstrated the presence of a 
homologous structure to the IGL. It is believed that the pregeniculate nucleus (PGN) 
can be the answer, but nothing it was still proven. Trying to answer that question, the 
objective of our study is to do a comparative analysis among PGN and IGL through of 
techniques immunohystochemicals, neural tracers and FOS expression after dark 
pulses. For this, we used as experimental model a primate of the new world, the 
common marmoset (Callithrix jacchus). Ours results may contribute to the elucidation 
of this lacuna in the circadian system once that the IGL is responsible for the 
transmission of nonphotic information to SCN and participate in the integration 
between photic and nonphotic stimulus to adjust the function of the SCN. In this way 
to find a same structure in primates represent an important achieve in the 
understanding of the biological rhythms in those animals. 
Keywords: Suprachiasmaticnucleus, Intergeniculate leaflet, Pregeniculate nucleus, 
Biological Rhythms, Dark pulse, c-Fos. 
16
1. INTRODUÇÃO. 
1.1 – A Natureza Rítmica e o Surgimento da Cronobiologia. 
O fenômeno de rotação da terra durante seu curso de translação ao redor do sol 
fornece um estímulo de periodicidade regular que, durante o processo evolutivo, 
certamente causou uma enorme pressão seletiva sobre os organismos vivos e serviu de 
base adaptativa para o que hoje chamamos de ritmos circadianos. O ciclo claro-escuro 
diário parece ser o principal agente sincronizador desses ritmos e apresenta duração de 
aproximadamente 24 horas, com cada uma de suas fases consumindo, de forma 
contínua, metade deste tempo. Entretanto, quando levamos em consideração regiões de 
altas latitudes ou determinadas épocas do ano, maiores discrepâncias entre a duração 
de cada fase podem ser evidenciadas e, da mesma maneira, diferenças na organização 
temporal do seres vivos. O primeiro relato formal demonstrando a relação do ciclo 
claro-escuro com um evento comportamental data de 1729, momento em que um 
astrônomo francês, Jean-Jacques D'Ortous de Mairan, descreveu um movimento 
cíclico de abertura e fechamento das folhas da planta Mimosa pudica. Ele ainda notou 
que mesmo após a privação da planta ao ciclo claro-escuro ambiental tal fenômeno 
continuava a ocorrer normalmente, ou seja, provavelmente possuía um caráter 
endógeno. Esse experimento trouxe um novo paradigma à biologia da época, já que a 
idéia de ritmos biológicos eram nada menos que reflexos das flutuações ambientais. 
Hoje, sabemos que a organização temporal de um ser vivo se expressa tanto pela 
reação aos estímulos ambientais quanto pela ritmicidade endógena (Moore, 1999; 
Rotenberg et al. 2003). 
Provavelmente, os ritmos circadianos representam a forma de adaptação mais 
usualmente utilizada pelos organismos e podem ser identificados tanto em indivíduos 
procarióticos quanto em eucarióticos. Eles podem ser ajustados pelos ciclos ambientais 
externos (Zeitgebers), conhecidos também como agentes sincronizadores. Dentre as 
oscilações exógenas, o ciclo claro-escuro, como dito anteriormente, parece ser a 
principal pista ambiental utilizada no ajuste dos ritmos biológicos para a maioria dos 
animais. No entanto, pistas sociais, auditivas, olfativas e alimentares são também de 
fundamental importância, tanto é que indivíduos cegos são perfeitamente capazes de 
sincronizar seus ritmos ao ciclo claro-escuro diário utilizando somente essas pistas. 
17
 Embora existam ritmos biológicos sem correlação com o ciclo claro-escuro 
ambiental, percebemos que este último tem uma enorme influência em diversos desses 
fenômenos fisiológicos. Em mamíferos, o ciclo sono-vigília, a temperatura corporal 
central e a secreção de hormônios são os mais claros exemplos dessa organização 
rítmica. Assim, podemos dizer que os ritmos circadianos estão normalmente 
sincronizados ao ciclo claro-escuro diário e que a relação mantida entre ambos é de 
fase estável. Vale salientar que são considerados ritmos circadianos oscilações 
endógenas dentro de uma faixa limite, situada entre 20 e 28 horas. Caso a 
periodicidade do Zeitgeber se encontre fora desse limite de sensibilidade o ritmo 
endógeno não conseguirá sincronizar ao agente externo e entrará em livre curso, 
situação em que o indivíduo expressa seu ritmo endógeno (Moore, 1999; Rotenberg et 
al. 2003). 
A descrição de fenômenos rítmicos associados a diversos ciclos geofísicos 
como a oscilação das marés, estações do ano, fases da lua e o dia e a noite datam de 
mais de 300 anos, todavia, esses relatos são de abordagem essencialmente 
fenomenológica. O termo “Cronobiologia”, usado para designar e formalizar o ramo 
do conhecimento responsável pelo estudo sistemático das características temporais da 
matéria viva, é bastante recente. Para a maioria dos pesquisadores em cronobiologia a 
realização do Cold Spring Harbor Symposium on Biological Clock, organizado por 
Colin Pittendrigh em 1960, Massachussets, EUA, é considerada como marco inicial da 
cronobiologia como disciplina formal. Para Pittendrigh era importante abordar as 
propriedades fundamentais dos ritmos circadianos e as bases biológicas dos 
osciladores e de seus mecanismos. Assim, a partir da década de 60, alguns 
pesquisadores buscavam encontrar nos seres vivos algum sistema ou estrutura capaz 
de responder pelos ritmos biológicos (Araújo e Marques, 2002; Rotenberg et al. 2003). 
Na época, a sugestão era de que essa estrutura se encontraria provavelmente no 
hipotálamo, já que era sabido da sua importância no controle do meio interno e por 
estar sob influência de diversos sistemas sensórios (Harris, 1955; Powell et al. 1965). 
Também, já tinha sido demonstrado uma diversidade de efeitos neuroendócrinos após 
alteração dos níveis de iluminação ambiental. Desse modo, concluiu-se que o sistema 
visual estaria fornecendo tal informação luminosa ao hipotálamo (Harris, 1955; 
Critchlow, 1963). Experimentos pioneiros realizados por Curt Richter (1967), lesando 
18
progressivamente o sistema nervoso e verificando o efeito das lesões nos ritmos 
biológicos, também apontavam para o mesmo caminho. Com a predição de que o 
principal agente sincronizador é o ciclo claro-escuro, Moore e Lenn (1972) começaram 
a buscar o “relógio biológico” pelos olhos e identificaram uma projeção das células 
retinianas a um pequeno par de núcleos no assoalho do hipotálamo, tal projeção foi 
denominada de tracto retino-hipotalâmico (TRH). Essas estruturas estavam situadas 
lateralmente ao terceiro ventrículo e logo acima do quiasma óptico e foram, portanto, 
identificadas como núcleos supraquiasmáticos (NSQs). Posteriormente, demonstrou-se 
que a lesão dos NSQs de ratos abolia os ritmos circadianos de atividade, ingestão de 
água e liberação de corticosterona (Moore e Eischler, 1972; Stephan e Zucker, 1972). 
 Outros estudos subseqüentes vieram a consolidar o NSQ como responsável pela 
geração dos ritmos biológicos e a ampliar o modelo de controle desses ritmos 
inferindo uma participação integrada de diversas regiões do sistema nervoso, ficando 
conhecido como “sistema de temporização circadiana”. Hoje, sabe-se que esse sistema 
consiste de um conjunto de estruturas neurais interligadas, incluindo na sua 
composição um marca-passo encarregado da geração do ritmo, vias sincronizadoras e 
vias de saídas aos efetores comportamentais (Moore-Ede et al. 1982; Moore e Card, 
1994b; Moore, 1999). 
 Em suma: (1) as principais características dos ritmos biológicos são sua geração 
endógena, capacidade de sincronização a um ciclo ambiental e compensação às 
variações de temperatura; (2) O estudo desses ritmos é o campo de interesse da 
Cronobiologia; (3) e, em mamíferos, a expressão de comportamentos rítmicos estão 
sob o comando de um conjunto de estruturas neurais integradas, as quais compõem o 
sistema de temporização circadiana. 
1.2 – Bases Neurais dos Ritmos Biológicos 
1.2.1 – O Núcleo Supraquiasmático 
Estudos pioneiros no início da década de 70, baseado nos resultados das 
projeções retinianas e experimentos de lesão, apontavam o NSQ do hipotálamo como 
o possível marca-passo circadiano. Em diversos mamíferos estudados (ratos, porcos da 
índia, coelhos, gatos e macacos), as projeções retinianas ao NSQ se mostraram 
19
bastante variadas, com predominância contralateral ou ipsilateral ou ainda de forma 
simétrica, dependendo da espécie em questão (Hendrickson et al. 1972). Também, na 
maior parte dos indivíduos estudados, foi vista uma distribuição destas fibras 
concentradas na porção ventrolateral do núcleo. Este conjunto de fibras ficou 
conhecido como tracto retino-hipotalâmico (TRH) (Hendrickson et al. 1972; Moore e 
Lenn, 1972). Trabalhos realizados em primatas também confirmam essas projeções 
(Magnin et al. 1989; Costa et al. 1999; Cavalcante et al. 2002). O TRH constitui a 
principal viade sincronização ao ciclo claro-escuro ambiental e sozinho pode manter o 
animal sincronizado (Klein e Moore, 1979). A lesão dessas fibras priva o NSQ de tal 
informação e leva o animal a entrar em livre-curso (Johnson et al. 1988a). 
Demonstrou-se que o TRH é formado por projeções axonais de um grupo especial de 
células fotorreceptoras retinianas, as células ganglionares (Berson et al. 2002), e que 
algumas continham um fotopigmento identificado como melanopsina (Provencio et al. 
1998; 2000; Gooley et al. 2001; Hattar et al. 2002). Esse grupo especial de células 
parece contribuir massivamente no número total das eferências retinianas aos 
principais centros do sistema circadiano, como o NSQ, o folheto intergeniculado (FIG) 
e a zona subparaventricular (ZSPV) (Morin et al. 2003; Gooley e Saper, 2003). 
Também, não se descarta a possibilidade dos fotorreceptores clássicos participarem da 
fotorrecepção circadiana. 
Sabe-se que o glutamato (GLU) é o principal neurotransmissor envolvido na 
ação das células ganglionares do TRH que se projetam para o NSQ e FIG (Ebling, 
1996). Outras substâncias foram igualmente identificadas e parecem ser de suma 
importância no controle da atividade do marca-passo circadiano, sendo estes, o n-
acetilaspartil glutamato (NAAG) (Moffet et al. 1990), a substância P (SP) (Takatsuji et 
al. 1991a) e o polipeptídio ativador da adenilatociclase pituitária (PACAP) (Hannibal 
et al. 1997; Piggins et al. 2001a). 
A partir de 1970, inúmeros artigos foram publicados consolidando o NSQ como 
a sede dos ritmos biológicos. Estudos de lesão do NSQ mostravam a perda da 
ritmicidade circadiana para uma série de funções (Moore e Eichler, 1972; Stephan e 
Zucker, 1972). Foi também observado que as células do NSQ apresentavam 
ritmicidade circadiana na sua freqüência de disparo de potenciais de ação (Gillette, 
1991), bem como na atividade metabólica (Schwartz, 1991; Newman, 1991). Outro 
20
trabalho importante veio a consolidar o NSQ como o principal oscilador circadiano, 
em que o transplante do NSQ fetal recuperava a ritmicidade circadiana para uma série 
de funções de animais arrítmicos em conseqüência da lesão bilateral dos seus NSQ 
(Drucker-Colin et al. 1984). 
Embora apresente variações morfológicas, o NSQ de todos os mamíferos 
pesquisados, até o momento, se apresenta como um grupo de células localizado 
dorsalmente ao quiasma óptico e lateralmente ao terceiro ventrículo, separado da 
parede do mesmo apenas por uma faixa de células que constitui o núcleo 
periventricular (Moore-Ede et al. 1982; Cassone et al. 1988). 
O NSQ tem sido bastante estudado no que diz respeito a sua caracterização 
citoarquitetônica e citoquímica, no qual identificamos duas principais sub-populações 
de neurônios. Nos mamíferos, de uma forma geral, encontramos a primeira população 
neuronal localizada na região dorsomedial do núcleo, sendo caracterizada por produzir 
vasopressina (VP) e a segunda localizada na porção ventrolateral do núcleo, produtora 
de polipeptídeo intestinal vasoativo (VIP) (Card et al. 1981; Card e Moore, 1984; 
Cassone et al. 1988). 
No NSQ de hamsters (Card e Moore, 1984; Morin e Blanchard; 1995) e ratos 
(Moore et al. 2002; Morin et al. 2006) terminais imunoreativos a NPY foram 
encontrados somente na porção ventrolateral do núcleo (região retinorecipiente). O 
mesmo resultado foi obtido em sagüis (Costa et al. 1999; Cavalcante et al. 2002). 
Nessas espécies de roedores, a presença de NPY parece ser, em quase sua totalidade, 
proveniente dos neurônios do FIG, visto que a lesão do FIG provoca uma drástica 
redução desse neurotransmissor em seus NSQ (Harrington et al. 1985; Morin e 
Blanchard, 2001). 
Fibras e terminais imunorreativos à serotonina (5-HT) foram descritas presentes 
na porção retinorecipiente (ventral ou ventrolateral) do NSQ de vários mamíferos, 
incluindo ratos (Van den Pol e Tsujjimoto, 1985), hamsters (Card e Moore, 1984), 
camundongos (Cassone et al. 1988) e em gatos e macacos (Ueda et al. 1983). Em 
contrapartida, a distribuição dessas fibras no NSQ do sagüi está concentrada na região 
dorsal (Cavalcante et al. 2002). A fonte de 5-HT do NSQ é proveniente do núcleo 
mediano da rafe mesencefálica (Meyer-Bernstein e Morin, 1996; Hay-Schmidt et al. 
2003) e desempenha um importante papel na regulação dos ritmos circadianos, como 
21
demonstrado em estudos de lesão (Smale et al. 1990; Meyer-Bernstein e Morin, 1998) 
ou de estimulação elétrica (Meyer-Bernstein e Morin, 1999). 
Além do FIG e da rafe mesencefálica, o controle da atividade do NSQ está sob 
influência de uma vasta rede neural proveniente de várias regiões do sistema nervoso, 
sendo essa diversidade observada tanto do ponto de vista da localização quanto da 
função da região que fornece a aferência. Estudos realizados em diversas espécies de 
roedores, desde o início da década de 80, utilizando técnicas de traçadores neurais, tem 
mostrado essas múltiplas aferências ao NSQ, entre elas podemos destacar: córtex 
infralímbico, núcleos septais, subastância innominata, subículo ventral, órgão 
subfornical, hipotálamo ventromedial, núcleo arqueado, hipotálamo posterior, núcleos 
pré-tectais, lócus ceruleus, núcleo parabraquial, zona incerta, núcleo paraventricular do 
tálamo, entre outros. Essas conexões descritas acima representam aferências diretas ao 
NSQ, sendo conhecidas como projeções monossinápticas e, como estas, encontram-se 
catalogadas inúmeras outras regiões. Experimentos utilizando traçadores virais 
identificaram aferências de segunda e terceira ordens ao NSQ, conhecidas como 
projeções polissinápticas, como por exemplo: regiões do córtex cerebral, hipocampo, 
amígdala, sistema olfativo, diversas regiões do tálamo e hipotálamo, tronco encefálico 
(núcleos oculomotores e vestibulares) e medula espinal (Pickard, 1982; Bina et al. 
1993; Mikkelsen e Vrang, 1994; Moga e Moore, 1997; Pickard et al. 2002; Krout et al. 
2002). 
Conexões eferentes monossinápticas do NSQ destinam-se, em sua maioria, a 
regiões talâmicas e hipotalâmicas, sendo estas: núcleo paraventricular do tálamo, 
núcleo septal lateral, núcleo intersticial da estria terminal, área pré-óptica medial, zona 
subparaventricular, núcleos hipotalâmicos (paraventricular, dorsomedial e 
ventromedial), área pré-mamilar, núcleo olivar pré-tectal, entre outros. As conexões 
polissinápticas incluem: lócus ceruleus, núcleo vestibular medial, glândula pineal, 
sistema nervoso autônomo (simpático e parassimpático), áreas de convergência das 
projeções retinianas e do sistema olfatório e regiões específicas do sistema límbico 
(Watts et al. 1987; Johnson et al. 1988a; Morin et al. 1994; Larsen, 1999; Kalsbeek et 
al. 2000; Aston-Jones et al. 2001; Horowitz et al. 2005). O estudo da conectividade do 
NSQ reflete o alto nível de complexidade no controle dos ritmos biológicos, visto que 
22
o marca-passo circadiano, como foi apresentado, está sob influência de sinais fóticos, 
neuroendócrinos, autonômicos e comportamentais. 
1.2.2 – O Folheto Intergeniculado 
Na medida em que o NSQ se firmava como principal marca-passo circadiano, 
um estudo realizado em por Swanson et al. (1974), em gatos e ratos, e outro por Ribak 
e Peters (1975), em ratos, mostraram que a injeção de aminoácidos marcados no corpo 
geniculado lateral ventral (GLV) revelava uma projeção bilateral, com predominância 
ipsilateral, para o NSQ e que esta projeção era restrita a região ventrolateral. Hickey e 
Spear (1976), baseado na diferença das projeções retinianas para o complexo 
geniculado lateral do tálamo, observaram uma estrutura localizada entre o núcleo 
geniculado lateral dorsal (GLD) e o GLV. Assim, denominaram-na de folheto 
intergeniculado (FIG), devido sua forma fina e alongada e por localizar-se entre os 
núcleos geniculados laterais. Quase uma década mais tarde, Pickard (1985), mostrou 
que essas projeções retinianas ao FIG são provenientes das mesmascélulas 
ganglionares que se projetam para o NSQ, devido à bifurcação de seus axônios. Card e 
Moore (1982) identificaram a presença de terminais imunorreativos ao polipeptídeo 
pancreático das aves (APP) na região ventrolateral do NSQ e de neurônios marcados 
na borda dorsal do GLV. A lesão do GLV levava a uma diminuição da 
imunorreatividade a APP no NSQ, então, eles concluíram tratar-se de uma nova 
projeção ao marca-passo circadiano. Moore et al. (1984), encontraram resultados 
semelhantes para neuropeptídeo-Y (NPY). Foi denominado de tracto geniculo-
hipotalâmico (TGH) a projeção do FIG ao NSQ, entretanto, sua confirmação somente 
foi possível a partir de estudos com traçadores neurais. A injeção de um traçador 
retrógrado no NSQ e uma técnica de dupla marcação imunohistoquímica para NPY e o 
respectivo traçador revelaram que alguns neurônios NPY-positivos do FIG projetam-
se para o NSQ (Harrington et al. 1987; Goel et al. 1999; Moore e Card, 1994b). 
Existem basicamente dois tipos de neurônios no FIG de roedores. Um tipo é 
caracterizado pela co-localização de ácido gama-aminobutírico (GABA) e encefalina 
(ENK), e se projeta exclusivamente para o FIG contralateral. O outro grupo é 
caracterizado pela co-localização de GABA e NPY, que se projeta predominantemente 
para o NSQ através do TGH (Moore, 1992; Moore e Card, 1994a; Morin e Allen 
23
2006). Em hamsters, ainda pode ser identificado um terceiro tipo de neurônio 
imunorreativo a neurotensina (NT) que apresenta uma alta co-localização com NPY 
(Morin e Blanchard, 2001). Nesses animais o TGH possui contribuição das células 
produtoras de GABA e ENK (Morin e Blanchard, 1995). Sem dúvida, uma das 
principais características desse folheto é a presença dessa população de neurônios 
imunorreativos a anticorpos contra NPY e que se projetam para o NSQ, num padrão 
que se superpõe à distribuição de fibras do TRH (Mantyh e Kemp, 1983). 
Também pode ser encontrado imunorreatividade contra proteínas ligantes de 
cálcio no FIG de roedores. Em diversos trabalhos com essas espécies, tem se mostrado 
neurônios imunorreativos à calbindina (CB) e calretinina (CR) e uma ausência de 
reação positiva para parvabumina (PV) (Célio, 1990; Arai et al. 1993; Moore e Card, 
1994a). 
Um dos aspectos anatômicos mais importantes do FIG é o seu impressionante 
número de conexões com as diversas áreas do encéfalo em que, na maioria das vezes, 
se mostram bilaterais e recíprocas e com variações na densidade de inervação (Morin e 
Blanchard, 1999; Vrang et al. 2003). Utilizando técnicas de traçadores neurais, 
demonstrou-se que a magnitude da conectividade do FIG envolve extensas conexões 
hipotalâmicas (Mikkelsen, 1990), telencefálicas e diencefálicas (Morin e Blanchard, 
1999; Moore et al. 2000) e com o tronco encefálico (Morin e Blanchard, 1998; Vrang 
et al., 2003; Morin e Blanchard, 2005). As conexões hipotalâmicas incluem o NSQ 
(marca-passo circadiano), o hipotálamo anterior, a área pré-óptica, a área 
retroquiasmática, o núcleo paraventricular, a zona subparaventricular (reforço no 
controle do NSQ sobre os sistemas efetores), a área hipotalâmica ventrolateral 
(mecanismo do sono, orexina / hipocretina), os núcleos ventromedial e dorsomedial, o 
hipotálamo posterior e o dorsal, a área pré-mamilar e o núcleo supramamilar. As 
principais conexões talâmicas são o núcleo paraventricular, o paratenial e o dorsal 
anterior, os núcleos reuniens, rhomboide, paraventricular, centromedial e centrolateral, 
os núcleos laterodorsal, pré-comissural e subgeniculado, a zona incerta e o FIG 
contralateral. Dentre as conexões com o prosencéfalo basal encontramos a área septal, 
o núcleo intersticial da estria terminal, a amigdala, o córtex piriforme, o núcleo lateral 
do tracto olfatório e o tubérculo olfatório. No tronco encefálico identificamos 
conexões com a substância cinzenta periaquedutal, os núcleos pré-tectais, os núcleos 
24
do nervo oculomotor e troclear, o núcleo de Edinger-Westphal, núcleos tegmentar 
lateral dorsal, cuneiforme caudal e pedúnculo-pontino (complexo oculomotor), os 
núcleos terminais lateral e dorsal (sistema óptico acessório), locus coeruleus 
(mecanismo do sono), núcleo intersticial do fascículo longitudinal medial, oliva 
inferior e núcleo dorsal da rafe (modulação dos ritmos circadianos) (Horowitz et al. 
2004). Esses resultados descritos acima comprovam a complexidade funcional em que 
está envolvido o FIG, todavia, suas conexões indicam que o mesmo preferencialmente 
participa da regulação do ciclo sono-vigília, do controle visuomotor e da ritmicidade 
biológica (Harrington, 1997; Morin e Blanchard, 2005). 
 O FIG tem uma grande importância para a modulação dos ritmos circadianos, 
como sugerido por estudos farmacológicos ou combinados com estudos de lesão. 
Embora esses estudos mostrem que o FIG não está envolvido diretamente com a 
sincronização diversos outros aspectos comportamentais confirmam sua importância 
para a ritmicidade biológica (Albers et al. 1984; Johnson et al. 1989; Biello et al. 
1991; Meyer-Bernstein et al. 1993; Huhman e Albers, 1994; Pickard, 1994). Alguns 
pesquisadores sugerem uma participação do FIG na transmissão de informação fótica 
para o NSQ (Harrington e Rusak, 1988; Aronin et al. 1990). Em acordo com essa 
idéia, outros autores mostram, por exemplo, que: hamsters com lesão do FIG 
apresentam um maior atraso de fase no início da noite subjetiva e um menor avanço de 
fase no final da noite subjetiva na CRF (curva de resposta dependente de fase) para 
luz; também mostram um encurtamento do período em livre-curso em claro constante, 
não se verificando o aumento deste quando são transferidos da condição de escuro 
para claro constante (Harrington e Rusak, 1986; Pickard et al. 1987); a lesão bilateral 
do FIG desses animais leva a um maior tempo de ressincronização após mudanças de 
fase em condições ambientais de claro-escuro (Johnson et al. 1989) e o fenômeno da 
dissociação (spliting) dos NSQ, quando submetidos a condições de claro constante, é 
menos freqüente (Harrington e Rusak, 1988). Esses efeitos podem ser interpretados 
como o papel fótico do FIG, entretanto, eles também podem ser devido a uma redução 
da atividade locomotora do animal (Janik e Mrosovsky, 1994), muito embora alguns 
trabalhos não tenham identificado tais alterações após lesão do FIG. Mesmo assim, a 
maioria dos estudos aponta para a importância do papel não-fótico do FIG e diversos 
fatores estão ao seu favor, já que foram observados em vários experimentos de lesão 
25
bilateral do FIG desses roedores uma drástica diminuição de sua atividade locomotora, 
uma inibição ou redução das mudanças de fase provocadas por estímulos não-fóticos 
(administração de triazolam, roda de atividade, entre outros) (Janik e Mrosovsky, 
1994) e um aumento do período em livre-curso nas condições de escuro constante 
(Pickard, 1994). A hipótese do papel não-fótico do FIG é apoiada ainda pelas respostas 
obtidas a partir de estudos de sua própria estimulação elétrica (Rusak et al. 1989), bem 
como de injeções de NPY dentro do NSQ. Ambos os estímulos promovem mudanças 
de fase nos ritmos circadianos, no entanto, essas mudanças são diferentes daquelas 
promovidas pela luz. As CRF para esses estímulos se assemelham a uma CRF não-
fótica. Em resumo, a ativação do sistema FIG-TGH resulta em mudanças de fase que 
são diferentes das provocadas pela luz, e incluem avanço de fase durante o dia 
subjetivo e atraso durante a noite subjetiva. Isto parece ser um mecanismo de 
“feedback” que regula a função do marca-passo e parece estar associado com o 
aumento de atividade locomotora durante o estímulo (Moore, 1992; 1999), embora 
alguns trabalhos mostrem que nem todos os estímulos não-fóticos mediados pelo FIG 
estão associados a incremento de atividade locomotora (Biello et al. 1991; 1993). 
Moore e Card (1994a) sugerem que o FIG, através da projeção de suas célulasprodutoras de NPY para o NSQ pelo TGH, integra as informações fóticas com as não-
fóticas necessárias para modificar a função do marca-passo. Já os estudos de atividade 
celular, mapeando a expressão da proteína do gene c-fos, mostram que o FIG responde 
tanto a estímulos fóticos quanto não-fóticos, mas quando se verifica a neuroquímica 
das células envolvidas torna-se claramente evidente a participação dos neurônios 
imunorreativos a NPY nos eventos não-fóticos em detrimento dos fóticos (Janik et al. 
1995). 
1.2.3 – O Núcleo Pré-geniculado 
A organização do complexo geniculado lateral do tálamo de primatas é 
substancialmente diferente do de roedores. O GLD é um extenso aglomerado celular 
que apresenta uma morfologia laminada. Este núcleo é circundado por um grupo 
celular que é reconhecido como núcleo pré-geniculado (NPG) (Jones, 1985). O NPG 
tem sido descrito compreendendo duas porções distintas: a primeira localizada numa 
região látero-dorsal ao GLD, que é continua com o núcleo reticular do tálamo; e a 
26
outra situada numa região dorsomedial ao mesmo, a qual continua-se com a zona 
incerta medialmente (Moore, 1993). 
Em relação a sua citoarquitetura, três tipos neuronais tem sido descritos 
empregando-se a técnica de Nissl. O primeiro tipo se caracteriza por apresentar 
pericário fusiforme com citoplasma escasso e pouco marcado; o segundo possui um 
corpo bem desenvolvido repleto de grânulos de Nissl, o que torna seu citoplasma 
intensamente marcado; o terceiro tipo apresenta pericário de tamanho médio com 
poucos grânulos de Nissl e encontra-se espalhado entre os neurônios fusiformes. O 
primeiro e o terceiro tipos de neurônios estão localizados na região mais interna do 
NPG e o segundo tipo na porção mais externa (Polyak, 1957). Um estudo realizado por 
Babb (1980), em Macaca mulatta, empregando as técnicas de impregnação de Klüver-
Barrera e de Golgi, também identificou 3 populações neuronais distintas. Para isso, os 
critérios utilizados foram: a forma e o tamanho do pericário, a configuração dendrítica, 
o tipo de protrusão e a impregnação do axônio. Analisando tais características, ele 
propôs que o NPG possuía uma estrutura bilaminar, com uma lâmina interna (NPGli) e 
outra externa (NPGle) (Fig.1). O primeiro tipo de neurônio foi identificado ocupando a 
lâmina interna, caracterizando-se por apresentar pericário esférico (12-14 μm) com 
dendritos exibindo longas espinhas ou protrusões. O segundo tipo foi observado 
somente na lâmina externa, mostrando pericário poligonal (26-37 μm) e com poucas 
espinhas dendríticas. O terceiro tipo foi localizado ocupando ambas as lâminas, 
possuindo esses neurônios um pericário ovóide (19-40 μm) com dendritos curtos e 
largos e espinhas usualmente presentes. 
Avaliando a organização do complexo geniculado lateral de primatas, Moore 
(1989), identificou um grupo de células imunorreativas a NPY em uma região em 
forma de cunha, situada medialmente ao GLD, a qual tinha sido previamente 
caracterizada como NPG. Moore (1993), num estudo comparativo entre macacos e 
humanos, sugeriu que o NPG é o homólogo do FIG e do GLV de roedores, baseando-
se no padrão de distribuição das aferências retinianas e de algumas características 
neuroquímicas. Assim, ele sugeriu que o FIG dos primatas estaria localizado no NPG 
em uma vasta região imediatamente medial ao GLD e que o GLV ficaria mais 
dorsalmente. Em sagüi, verificou-se que NPG recebe projeção bilateral da retina e 
apresenta imunorreatividade para NPY (neurônios), 5-HT e SP (fibras) e proteínas 
27
ligantes de cálcio (PV e CB), fornecendo indícios dessa estrutura ser homóloga ao FIG 
e GLV dos roedores (Costa et al. 1998). Chevassus-au-Louis e Cooper (1998) 
discutem a evolução do FIG em roedores ao NPG dos primatas. Esses autores 
acreditam que o aumento do volume do GLD concomitante com a expansão do 
pedúnculo cerebral definiram as modificações observadas no complexo geniculado 
lateral dos primatas em comparação aos roedores. Muitos aspectos anatomofuncionais 
do NPG ainda não foram descritos, como sua conectividade (traçadores neurais), efeito 
comportamental após lesão e a atividade celular (genes de expressão imediata), por 
exemplo. Esses experimentos são indispensáveis para definir o papel do NPG dentro 
do STC. 
Figura 1 – Esquemas de secções coronais. Sentido antero-posterior (A-G). PGNil (Lâmina 
interna do núcleo pré-geniculado). PGNol (Lâmina externa do Núcleo pré-geniculado). 
LGN (Núcleo geniculado lateral dorsal). OT (Tracto óptico). IC (Cápsula interna). RN 
(Núcleo reticular do tálamo). OR (Radiação óptica). Retirado de Babb et al. (1980). 
28
1.3 – Estímulos Fóticos e Não-fóticos. 
Os estímulos ambientais sejam eles fóticos ou não-fóticos atuam direta ou 
indiretamente sobre o oscilador circadiano modificando sua atividade e, assim, podem 
ajustar os ritmos biológicos do indivíduo à dinâmica do ecossistema no qual está 
inserido (Janik et al. 1995; Mikkelsen et al. 1998). 
Experimentalmente, podemos manipular diversas características do ciclo claro-
escuro como intensidade luminosa, duração das fases, manter em condições 
constantes, entre outras. Essas manipulações são utilizadas para compreender algumas 
propriedades dos ritmos biológicos, bem como seu efeito em diversos ritmos dos 
animais. Uma técnica muito comum é a aplicação de pulsos de curta duração (15 a 60 
min), de luz ou de escuro, em animais previamente deixados sob condições constantes 
(seguro de que estão expressando seu ritmo endógeno), e a observação do que ocorre 
com o ciclo de atividade-repouso nos dias subseqüentes. Para os pulsos de luz os 
animais são mantidos em escuro constante, sendo o inverso para os pulsos de escuro. 
Estes pulsos podem agir modificando a fase de um determinado ritmo do animal, caso 
ele o inicie mais cedo que o previsto dizemos que ocorreu avanço de fase (AvF) e do 
outro modo chamamos de atraso de fase (AtF). Esse efeito observado depende da fase 
circadiana nas quais os pulsos são aplicados e pode ser representado graficamente, tal 
representação é conhecida como curva de resposta dependente de fase (CRF). A CRF 
para luz (Fig. 2A) é caracterizada por AtF no inicio da noite subjetiva e AvF a partir 
do meio da noite subjetiva e uma relativa insensibilidade durante o dia subjetivo. 
(Daan e Pittendrigh, 1976; Takahashi, 1984). A CRF para escuro (Fig. 2B) é 
caracterizada por AvF no início da noite subjetiva e AtF no final da noite subjetiva. 
Essa curva foi originalmente interpretada como sendo a imagem especular da CRF 
para luz. Entretanto, durante o meio do dia subjetivo verificam-se significativos 
avanços de fase (Boulos e Rusak, 1982a; 1982b; Ellis et al. 1982; Dwyer e 
Rosenwasser, 2000; 2002). 
Rosenwasser e Dwyer (2001), discutindo resultados de estudos anteriores, 
relataram que outros estímulos de natureza não-fótica, como por exemplo, interações 
sociais, mudança de ambiente, exposição à roda de atividade ou a administração de 
triazolam (benzodiazepínico) também podem agir alterando a fase do ritmo em livre-
curso. A CRF para estímulos não-fóticos (Fig. 2C-D) (neste caso as condições podem 
29
ser de claro ou escuro constante) efetivamente reflete uma resposta oposta à CRF para 
luz e não a obtida com os pulsos de escuro. 
Evidentemente, não há o que se debater quanto à luz ser um estímulo fótico, por 
outro lado, o escuro parece apresentar características mistas, pois sua CRF pode ser 
obtida pela soma da equação polinomial da CRF não-fótica com o inverso da equação 
polinomial da CRF para luz. Em estudos feitos com roedores, esses autores sugerem 
que o pulso de escuro atue por um mecanismo fótico quando aplicado no início da 
noite subjetiva, onde não há incremento de atividade locomotora, e por um mecanismo 
não-fótico durante o dia subjetivo e no final da noite subjetiva, onde é possível 
verificar o aumento dessa atividade (Rosenwasser e Dwyer,2001). Janik e Mrosovsky 
(1994), mostraram que a lesão bilateral do folheto intergeniculado do tálamo reduz a 
atividade locomotora e bloqueia as mudanças de fase provocadas por pulsos de escuro 
e outros estímulos devidamente caracterizados como não-fóticos. Particularmente, 
comparando as respostas comportamentais de estímulos não-fóticos com as de pulso 
de escuro, acreditamos que o último se trata de um evento não-fótico. 
DS NS
Figura 2 – (A) 15 min de pulso luz. (B) 6-h de pulso de escuro. (C) 3-h de roda 
de atividade em CC. (D) Triazolam em CC. DS (dia subjetivo) e NS (noite 
subjetiva). Adaptado de Rosenwasser e Dwyer, 2001. 
30
Vale salientar que todos os resultados supracitados foram realizados em animais 
de hábitos noturnos. Estudos recentes em mamíferos diurnos revelam que há um alto 
grau de conservação filogenética das respostas aos estímulos ambientais. As CRF, em 
última análise, parecem seguir um padrão semelhante entre animais diurnos e noturnos 
(Lee e Labyak, 1997; Hut et al. 1999; Glass et al. 2001). Em princípio, duas 
estratégias temporais podem estar envolvidas, quer seja pela alteração da relação de 
fase entre os ciclos ambientais e o relógio circadiano ou deste último com os ciclos de 
atividades comportamentais (Rosenwasser e Dwyer, 2001). Pormenorizando, isso 
significa dizer que um mesmo tipo de estímulo pode ter significado diametralmente 
oposto entre as diferentes espécies e, sobretudo, fundamentado em especificidades de 
seus mecanismos fisiológicos. 
1.4 – Marcando a Atividade Celular. 
Em 1985, a descoberta dos genes de expressão imediata (IEGs) e suas 
respectivas proteínas trouxeram uma nova perspectiva para o estudo funcional do 
sistema nervoso, no qual poder-se-ia mapear a atividade neuronal após um 
determinado tipo de estímulo e, através de técnicas imunohistoquímicas 
convencionais, analisar tal efeito levando em conta aspectos qualitativos e 
quantitativos da marcação da proteína expressa. Um dos IEGs mais estudados foi o c-
fos e sua proteína específica, FOS (Morgan e Curran, 1995). Sem dúvida a sua 
característica mais notável é a expressão rápida e transitória, onde os IEGs codificam 
fatores transcricionais (FT) que irão regular diversos genes. Dependendo do FT e do 
gene teremos uma modificação plástica e adaptativa específica na célula. Por exemplo, 
os FT podem ativar genes responsáveis por formar receptores de membrana, canais 
iônicos, estruturas do citoesqueleto, neurotransmissores, entre outros. Entre os fatores 
transcricionais encontramos os constitutivos (FTC) e os induzidos (FTI). O mecanismo 
que controla a produção dos FTC não está muito bem elucidado, no entanto, os FTI 
estão envolvidos numa complexa cascata molecular, com a participação de segundos 
mensageiros e dos próprios FTC atuando em regiões promotoras específicas do DNA. 
Nem todos os IEGs codificam FT, alguns podem produzir diretamente outras 
substâncias, como por exemplo, enzimas citoplasmáticas (fosfatases e cicloxigenases) 
(Herdegen e Leah, 1998). 
31
Muito já se sabe sobre as funções dos FT no sistema nervoso, entre elas 
podemos citar: memória (Bourtchuladze et al. 1994), apoptose (Smeyne et al. 1993), 
regeneração axonal (Schaden et al. 1994) e até mesmo a sincronização dos ritmos 
biológicos (Wollnick et al. 1995). Em relação a esta última, os principais IEGs 
envolvidos são c-fos e JunB. Eles formam heterodímeros e se ligam a uma região 
promotora do DNA conhecida como sítio AP-1(Herdegen e Leah, 1998). 
1.5 – Genes de Expressão Imediata e o Sistema de Temporização 
Circadiana. 
A expressão dos IEGs apresentam variação circadiana e está regulada por 
mecanismos diferentes, comparando-se distintas regiões envolvidas nos ritmos 
biológicos, como o NSQ, o FIG e o PVT e entre as variadas situações experimentais, 
seja ela de claro ou escuro constante, claro-escuro ou fotoperíodo esqueleto. Ainda, 
reforçando a afirmação inicial, verificou-se que a expressão de FOS no NSQ pode ser 
bloqueada injetando-se um antagonista glutamatérgico (MK801), e que o mesmo 
procedimento não surte efeito sobre o FIG (Edelstein et al. 2000). 
Vale ressaltar que a maneira como esses genes se expressam nos traduzem 
informações interessantes acerca das propriedades dos ritmos biológicos e até mesmo 
de características individuais. Beaulé e Amir (1998) demonstram que a expressão de 
FOS e JunB no NSQ e FIG mantêm uma forte correlação com as mudanças de fase 
após estímulos fóticos e que a intensidade da expressão dessas proteínas apresenta 
forte ligação com a diferença entre as 24 horas do ciclo claro-escuro ambiental e o 
período endógeno do animal. 
Experimentos envolvendo pulsos de luz mostram que esta induz a expressão de 
FOS no NSQ e a quantidade da proteína expressa depende da hora circadiana em que o 
estímulo é aplicado (Peters et al. 1996; Schumann et al. 2006). Embora haja 
controvérsias, a expressão de FOS parece ser essencial nas mudanças de fase 
provocada pela luz, visto que sua expressão é bastante pronunciada no NSQ e 
coincidente com os momentos onde tais mudanças são mais propícias (Aronin et al. 
1990; Kornhauser et al. 1990; Abe e Rusak, 1994). Edelstein et al. (2000), mostraram 
que a expressão de FOS e JunB no NSQ é maior durante a noite subjetiva, após um 
32
pulso de luz, já no FIG o pulso de luz também foi capaz de induzir essa expressão, mas 
a mesma é indiferente à fase circadiana. 
Edelstein a Amir (1995), mostraram que diversos estímulos não-fóticos 
respondem diferentemente a fase circadiana e, ao contrário dos pulsos de luz, a 
expressão de FOS é bem mais pronunciada durante o dia subjetivo. Além disso, os 
estímulos não-fóticos não são capazes de induzir FOS no NSQ a ponto de ser 
estatisticamente significante quando comparado ao grupo controle (Mikkelsen et al. 
1998). Entretanto, as células do FIG respondem de forma satisfatória a esses estímulos 
e em especial as que contêm NPY. Este grupo celular parece estar mais envolvido na 
transmissão da informação desses estímulos do que propriamente aos pulsos de luz 
(Janik et al. 1995). Ainda, a injeção de NPY dentro do NSQ reproduz o efeito dos 
estímulos não-fóticos, reduzindo a expressão de FOS e inibindo as mudanças de fase 
provocadas pela luz (Janik et al. 1995; Eldestein e Amir, 1995; 1996). Até o momento, 
não existem trabalhos relacionando a expressão desses IEGs com as mudanças de fase 
após pulsos de escuro nos centros moduladores do STC. 
1.6 – Estudos Eletrofisiológicos 
A conexão do FIG com o SCN, via TGH, e estudos de lesão, indicam que o FIG 
contribui na modulação dos ritmos circadianos. No entanto, estudos eletrofisiológicos 
mostram que o FIG também participa de funções visuomotoras (Szkudlarek e Raastad, 
2007). Registros de células mostram que neurônios do FIG codificam o nível de 
iluminação ambiental e outros neurônios apresentam uma freqüência de disparo 
espontânea (Szkudlarek e Raastad, 2007). Estudos eletrofisiológicos realizados em 
macacos rhesus demonstram que neurônios do NPG, localizados imediatamente dorsal 
ao GLD, respondem à iluminação do campo visual e que esse efeito é independente de 
movimentos oculares. Ainda, alguns efeitos visuais tônicos, observados no NPG após 
iluminação do campo visual, podem agir via sistema inibitório possivelmente a partir 
de células gabaérgicas presentes na camada retinorecipiente (Livingston e Fedder, 
2003). Comparando-se as respostas à iluminação ambiental de neurônios do FIG com 
os da camada retinorecipiente do NPG, podemos levantar a hipótese de tratarem-se de 
estruturas homólogas. No sagüi, a região descrita por esse estudo coincide com a 
NPGli, entretanto, essas células somente foram identificadas ocupando a NPGle. 
33
Sabemos que essa região recebe uma pequena quantidade de fibras retinianas com 
predominância contralateral. Assim, estudos eletrofisiológicos com essa espécie são 
necessários para se averiguarpossíveis diferenças na organização funcional do NPG. 
34
2. JUSTIFICATIVA. 
Os componentes do STC nos mamíferos tem sido alvo de muitos estudos 
realizados nas últimas quatro décadas. Esses estudos tem contribuído de forma 
relevante para o entendimento da hodologia e da função das regiões envolvidas na 
geração e modulação dos ritmos biológicos. O STC dos primatas ainda apresenta 
muitas incógnitas a serem desvendadas no que diz respeito a esses estudos, uma vez 
que grande parte dos trabalhos foram realizados em roedores. O NSQ de primatas se 
apresenta como um núcleo muito bem definido nos aspectos anatômicos e funcionais, 
mostrando na maioria das vezes resultados muito semelhantes aos encontrados em 
outros grupos de mamíferos. Um problema que ainda persiste é quanto à existência de 
uma estrutura homóloga ao FIG de roedores no tálamo desses animais, tendo em vista 
uma grande diferença morfológica no complexo geniculado lateral entre primatas e 
roedores. Alguns estudos sugerem que o NPG é o equivalente ao FIG e ao GLV, mas 
os dados levantados são insuficientes para qualquer conclusão. Estudos 
neuroquímicos, hodológicos (traçadores neurais), de lesão e mapeamento da atividade 
celular (IEGs) certamente ajudariam a elucidar essa questão. Portanto, usando como 
modelo um primata do Novo Mundo, o sagüi (Callithrix jacchus), esperamos 
encontrar a resposta para uma questão central, se o NPG dos primatas, ou parte dele, 
corresponde ao FIG dos roedores. Nossa atenção estará particularmente voltada para 
observação do NPG, com o pressuposto de que as células marcadas devam representar 
o equivalente do FIG de roedores em primatas. Nosso estudo deverá trazer 
contribuições sobre o funcionamento do STC de um animal filogeneticamente mais 
recente na escala evolutiva, sendo possível estabelecer elos comparativos com a 
espécie humana. O NPG se coloca como um elemento chave no entendimento do STC 
dessas espécies. Por fim, as características desse sistema serão analisadas 
comparativamente e os resultados obtidos poderão nos levar a entender como o STC se 
organizou durante o processo evolutivo. 
35
3. OBJETIVO. 
1) Caracterizar o núcleo pré-geniculado (NPG) de um primata do Novo Mundo, 
o sagüi (Callithrix jacchus), através da caracterização neuroquímica, projeção 
retiniana (traçadores neurais) e expressão protéica do proto-oncogene c-fos (após pulso 
de escuro), a fim de definir o papel deste dentro do sistema de temporização 
circadiana. 
36
4. MATERIAL E MÉTODOS. 
4.1 – Animais. 
Para realização deste projeto foram requeridos 09 (nove) animais, sem 
parentesco, nascidos em cativeiro no Núcleo de Primatologia da Universidade Federal 
do Rio Grande do Norte (NP-UFRN), da espécie Callithrix jacchus, conhecido 
popularmente como sagüi. Todos os sagüis utilizados eram machos adultos jovens e 
pesavam entre 300 e 400 gramas. O estado de saúde geral dos animais foi 
acompanhado através de medidas dos pesos corporais (343,3g + 34,8), temperatura 
interna (39,3°C + 0,5), exame parasitológico de fezes (técnica de Blagg), do registro 
da ingestão alimentar e da observação dos padrões da atividade motora e 
comportamento dos mesmos. Somente foram utilizados os animais que apresentaram 
bom estado de saúde e peso regular durante todo o experimento. Durante a pesquisa os 
mantivemos em viveiros lotados no ambiente externo do NP-UFRN ou em gaiolas 
localizadas dentro de salas isoladas desse meio externo. Os sagüis eram alimentados 2 
vezes ao dia em horários aleatórios (1 vez entre 06:00 h – 11:00 h e outra entre 13:00 h 
– 17:00 h) e com água ad libitum. 
Os animais foram cedidos pelo NP-UFRN com autorização do IBAMA, n° 
1/24/92/0039-00, sendo submetidos a procedimentos experimentais de acordo com as 
normas estabelecidas pelo National Research Council of National Academy publicadas 
no livro “Guidelines for the Care and Use of Mammals in Neuroscience and 
Behavioral Research”. Uma versão em formato pdf está disponível gratuitamente no 
site da Sociedade Brasileira de Neurociências e Comportamento (SBNeC) – 
http://www.sbnec.gov.br/links 
4.2 – Viveiros e Gaiolas. 
Os viveiros, medindo 2,0 x 1,0 x 2,0 metros, com paredes em alvenaria e porta 
gradeada de ferro, equipados com comedouro, bebedouro, poleiro e toca de PVC (com 
interior em cor preta), encontravam-se localizados em ambiente exposto às condições 
naturais, permitindo aos sagüis interagirem com as principais pistas ambientais, como 
por exemplo: ciclo claro-escuro e pistas sociais (contato visual, olfativo e auditivo com 
outros co-específicos). 
37
As gaiolas, medindo 76 cm de altura x 40 cm de largura x 60 cm de 
comprimento, equipadas com comedouro, bebedouro, poleiro e toca de PVC (com 
interior em cor preta), foram postas dentro de uma sala com isolamento acústico 
parcial e luminosidade (250 lx), temperatura (26,7 ± 0,3°C) e umidade controladas 
(78,2 ± 6%). Um exaustor era ligado sempre que necessário para renovação do ar da 
sala. Cada gaiola foi equipada com um sensor infravermelho sensível ao movimento 
que, por sua vez, estava conectado a uma placa de aquisição de dados em uma sala 
vizinha de onde se obtinha os registros do ciclo de atividade-repouso do animal. Cada 
gaiola continha apenas um animal e estavam separadas umas das outras por anteparos 
de madeira impedindo que os sagüis tivessem contato visual com os demais, 
entretanto, a relação auditiva e olfativa entre os mesmos provavelmente manteve-se 
inalterada. 
4.3 – Alimentação. 
Pela manhã os sagüis recebiam papa (composta por leite, água, pão, ovo, 
açúcar, banana e vitaminas), frutas da época, como banana, melancia, mamão, manga, 
entre outras. À tarde, a alimentação colocada de manhã era trocada por frutas da época 
ou batata-doce cozida. Como complemento alimentar, no turno vespertino, recebiam 
leite fermentado com lactobacilos vivos ou goma arábica ou ovo ou larva de tenébrio 
em dias específicos da semana. 
4.4 – Projeção Retiniana e Neuroquímica. 
A fim de investigar a projeção retiniana ao NPG usamos um traçador neural 
com propriedade anterógrada, a subunidade b da toxina colérica (CTb). Esse traçador é 
captado pelo corpo neuronal e transportado via fluxo axoplasmático aos terminais, não 
possuindo propriedade transináptica. 
Os sagüis (1, 2, 3 e 4) mantidos nos viveiros foram capturados, receberam 
anestesia intra-peritoneal de uma mistura contendo ketamina (200 mg/Kg) e xilasina 
(20 mg/Kg), em seguida foram colocados na mesa cirúrgica, onde efetuou-se uma 
injeção intra-ocular (olho esquerdo) de aproximadamente 80μl de uma solução aquosa 
de CTb a 1% em tampão fosfato 0,1 M contendo também dimetil-sulfóxido a 10%. A 
injeção foi realizada através de uma agulha calibre 30 introduzida na junção esclero-
38
corneal a um ângulo de aproximadamente 45°, atingindo o corpo vítreo. A velocidade 
de injeção foi de 1μl por minuto, sob pressão, com o auxílio de uma micro-bomba. Ao 
término da injeção, a agulha permaneceu no local durante cerca de 15 minutos para 
evitar refluxo da solução. Após a cirurgia, esses animais foram devolvidos ao seu local 
de origem dando-os sobrevida de 7 (sete) dias, com recuperação pós-cirúrgica 
acompanhada por um médico veterinário. Em seguida, foram novamente capturados, 
anestesiados, perfunidos (via transcardíaca), removidos os encéfalos e obtidos cortes 
deste tecido (microtomia). Para cada animal, pelo menos um compartimento do 
encéfalo foi utilizado para realização de imunohistoquímica contra CTb e os outros 
para os demais neurotransmissores (ver tabela 1). Um compartimento do animal 4 foi 
separado para a realização do método de Nissl e outro para dupla marcação contra 
CTb e NPY. Este grupo serviu para analisarmos as características neuroquímicas, as 
aferências retinianas e os aspectos citoarquitetônicos do NPG, a fim de compará-las 
com as descritas para o FIG dos roedores. A avaliação dos resultadosimunohistoquímicos foi feita com o auxílio de um microscópio óptico (Olympus, BX-
41) utilizando campo claro ou escuro conforme a necessidade. As imagens foram 
digitalizadas utilizando uma câmera (Nikon, DXM-1200) acoplada ao microscópio e 
conectada a um computador, sendo subseqüentemente operacionalizadas para ajuste de 
brilho e contraste com o programa Adobe Photoshop 7.0. Posteriormente, analisamos 
os resultados baseando-se na intensidade da marcação, número de células marcadas e 
disposição e arranjo destas no NPG. 
4.5 Processamento do tecido. 
4.5.1 - Perfusão e Microtomia: 
Os animais foram anestesiados previamente com uma injeção intraperitonial de 
uma mistura contendo ketamina (200 mg/Kg) e xilasina (20 mg/Kg), depois 
perfundidos em uma capela de perfusão, introduzindo-se uma agulha de 20 x 1,5 mm 
no ápice do coração atingindo o ventrículo esquerdo, e logo após o átrio direito foi 
seccionado para o escoamento do liquido vascular. Esta agulha estava conectada a uma 
bomba peristáltica (Masterflex, Cole-Parmer, Niles, IL). Inicialmente, 400 ml de 
solução salina a 0,9%, pH de 7,4, com heparina (Hipolabor, 5000 UI/ml) na 
39
concentração de 2 ml/L, à temperatura ambiente, foram impulsionados pelo leito 
vascular durante 4 minutos (100 ml/min), seguindo-se 700 ml de solução fixadora 
(paraformaldeído a 4%, Vetec Química Fina) em tampão fosfato (PB) 0,1 M, a um pH 
de 7,4, também em temperatura ambiente. Metade da solução fixadora foi infundida 
em fluxo rápido (35 ml/min), e a outra metade em fluxo lento (17,5 ml/min), 
totalizando 30 min. Os encéfalos foram removidos da cavidade craniana e pós-fixados 
por 4 horas na mesma solução fixadora e em seguida transferidos para uma solução de 
sacarose a 30% (Nuclear-CAQ) em PB 0,1 M, até serem submetidos à microtomia. 
Dessa maneira, os encéfalos foram seccionados por microtomia de congelação (gelo 
seco), em um micrótomo manual. Obtivemos secções coronais de 30 μm, as quais 
foram distribuídas seqüencialmente em 6 compartimentos, cada compartimento 
contendo sempre uma de seis secções, de maneira que a distância entre uma secção e a 
seguinte de um mesmo compartimento era de aproximadamente 180 μm. As secções 
de todos os compartimentos foram armazenadas em uma solução anti-congelante 
contendo PB 0,1 M, pH 7,4. 
4.5.2 – Imunohistoquímica: 
As técnicas imunohistoquímicas foram baseadas num protocolo para marcação 
simples ou dupla* com imunoperoxidase e as concentrações dos anticorpos utilizados, 
na maioria dos casos, seguiram as especificações técnicas de cada fabricante (ver 
tabela 1). Analisamos qualitativamente a expressão dessas substâncias no NPG do 
sagüi. 
*Não obtivemos sucesso na realização desta etapa (protocolo não descrito). 
4.5.2.1 - Imunoperoxidase simples:
A reação foi feita pelo método ABC (protocolo avidina-biotina complexo 
peroxidase; ABC, kit Elite, Vector labs, Burlingame, CA, USA). 
As secções de um compartimento de cada vez foram lavadas (4 vezes de 10 
minutos) com tampão fosfato (PB) 0,1 M, pH 7,4, sob agitação automática, e pré-
tratadas com peróxido de hidrogênio a 0,3% em PB por 20 minutos para inativação da 
peroxidase endógena. Os cortes foram colocados em contato com um anticorpo 
específico (primário) diluído em PB contendo Triton-X 100 a (ICN Biomedicals) 0,4% 
40
e de soro normal (Sigma Chemical Company) a 2% do animal em que foi obtido o 
anticorpo secundário durante 18 a 24 horas (25ºC). Em seguida, as secções foram 
colocadas em contato com o anticorpo secundário biotinilado, na concentração de 
1:200 (Vector) ou 1:1000 (Jackson), diluído em Triton-X 100 a 0,4%, por 90 minutos. 
Após esta etapa, os cortes foram incubados numa solução contendo avidina e biotina 
(2%) previamente diluído (30 minutos antes) em Triton-X 100, por 90 minutos. Para 
visualizar a reação, os cortes foram colocados num recipiente em contato com um 
cromógeno, uma solução de diaminobenzidina (DABtetra) (Sigma, St Louis, MO, USA) 
a 2,5% diluída em PB (0,1M / pH 7,4). Seguiu-se a reação final adicionando-se uma 
solução contendo peróxido de hidrogênio (H2O2) a 0,003% como substrato, obtendo-se 
da região marcada uma cor marrom resultante da oxidação da DAB. Realizaram-se 
quatro últimas lavagens, de dez minutos cada, com PB (0,1 M, pH 7,4). Sempre, entre 
cada uma das etapas descritas anteriormente, foram feitas quatro lavagens do tecido, 
de dez minutos cada, com PB a 0,1 M e pH 7,4. Os cortes foram montados em lâminas 
de vidro (Specimen) previamente gelatinizadas com gelatina-alúmem-cromo (Vetec 
Química Fina) que, após secarem a temperatura ambiente, foram mergulhadas em uma 
solução de tetróxido de ósmio a 0,05%, por 30 segundos, para intensificação da 
reação. Posteriormente, as lâminas passaram pelo processo de desidratação em álcoois 
(Cromato Produtos Químicos) de concentrações gradativamente maiores (70, 90 e 
100%), 5 minutos cada, e deslipidificados com xilol (Cromato Produtos Químicos), 
mergulhados em dois recipientes por 5 minutos cada, em seguida foram cobertas com 
lamínulas usando-se DPX (Aldrich Milwaukee, WI). Na imunohistoquímica contra a 
proteína FOS, adicionamos a solução da DAB 2 ml de uma solução contendo 400 mg 
de sulfato de amônio e níquel diluído em 5 ml de água destilada. As etapas 
antecedentes e subseqüentes à reação com a DAB foram idênticas ao descrito acima. A 
coloração obtida com essa técnica varia entre o cinza e o preto. 
41
Tabela 1: Especificações técnicas das substâncias utilizadas na 
imunohistoquímica. Natal, RN. 2008. 
Antígeno Anticorpo 
Primário 
(AP) 
Anticorpo 
Secundário 
(AS) 
Soro 
Normal 
Fabricante 
(AP) 
Fabricante 
(AS) 
CTb 
Subunidade B da 
toxina colérica
Cabra 
[1:9000] 
Asno 
[1:200] 
Asno 
[1:200] 
List 
Biological 
Laboratories, 
INC. 
Sigma 
Chemical 
Company 
NPY 
Neuropeptídeo-Y
Coelho 
[1:1000] 
Cabra 
[1:1000] 
Cabra 
[1:50] 
Sigma Jackson 
Immuno-
research 
Laboratories
GAD
Descarboxilase 
do ácido 
glutâmico
Camundongo 
[1:500] 
Coelho 
[1:200] 
Coelho 
[1:50] 
Protos Biotech Sigma 
ENK
Encefalina
Camundongo 
[1:1000] 
Coelho 
[1:200] 
Coelho 
[1:50] 
Chemicon Sigma 
SP 
Substância P
Rato 
[1:1000] 
Cabra 
[1:1000] 
Cabra 
[1:50] 
Chemicon Jackson 
Fos Coelho 
[1:10000] 
Cabra 
[1:1000] 
Cabra 
[1:50] 
Oncogene 
Research 
Products 
Jackson 
5-HT
Serotonina
Coelho 
[1:5000] 
Cabra 
[1:1000] 
Cabra 
[1:50] 
Protos Biotech Jackson 
CB 
Calbindina
Camundongo 
[1:1000] 
Coelho 
[1:200] 
Coelho 
[1:50] 
Sigma Sigma 
PV
Parvalbumina
Camundongo 
[1:5000] 
Coelho 
[1:200] 
Coelho 
[1:50] 
Sigma Sigma 
CR 
Calretinina
Coelho 
[1:1000] 
Cabra 
[1:1000] 
Cabra 
[1:50] 
Chemicon Jackson 
NeuN 
Proteína 
neuronal nuclear 
específica
Camundongo 
[1:1000] 
Coelho 
[1:200] 
Coelho 
[1:50] 
Chemicon Sigma 
GFAP
Proteína acídica 
fibrilar glial
Camundongo 
[1:2000] 
Coelho 
[1:200] 
Coelho 
[1:50] 
Sigma Sigma 
4.5.3 – Técnica de Nissl (Tionina): 
Realizamos a técnica de Nissl para o estudo da citoarquitetura, usando a tionina 
como corante. Na nossa rotina, os cortes foram lavados em tampão fosfato 0,1 M, pH 
7,4, em seguida montados em lamínulas previamente gelatinizadas e deixados secar a 
temperatura ambiente (25°C) por 48 horas. A partir de então os cortes foram 
42
submetidos à coloração de Nissl, que consiste na desidratação do tecido passando-o 
em concentrações crescentes de álcoois etílicos (70% - 1 vez, por 1 h, 95% - 2 vezes, 3 
minutos cada, 100% - 2 vezes, 3 minutos cada), sendo posteriormente deslipidificados 
em dois recipientes com xilol, por 3 e 30 minutos, nessa ordem. Na seqüência, o tecido 
é reidratado em concentrações decrescentes de álcoois (mesmo processo anterior, mas 
no sentido inverso), submergido em água destilada por 2 minutos, posteriormente 
colocado 30 a 40 segundos na solução de tionina a 0,25%. Para desfecho do processo, 
os cortes foram rapidamente submergidose emergidos 10 vezes em água destilada e 
novamente desidratados e deslipidificados como descrito anteriormente, sendo 
acrescentado apenas uma etapa (antes da desidratação em álcool 100%) de imersão do 
tecido numa solução contendo álcool a 95% e ácido acético a 1%, por 3 segundos. Os 
cortes foram deslipidificados em xilol em dois recipientes (2 e 4 minutos, 
respectivamente) e finalmente cobertos com lamínula utilizando como meio de 
montagem o DPX. 
4.7 Expressão da Proteína FOS. 
4.7.1 – Grupo Experimental
Os sagüis (5 e 6) foram transferidos do viveiros para as nas gaiolas e mantidos 
em regime de claro-escuro, sendo 12 h de claro (250 lx) e 12 h de escuro total. Esta 
condição foi mantida até que todos os animais estivessem devidamente sincronizados 
por pelo menos 7 dias. Após esse período, os animais foram submetidos à condição de 
claro constante com iluminação de intensidade fixa de 250 lux até expressarem seu 
ritmo sem referências de pistas ambientais (livre-curso). Após duas semanas em livre-
curso foi aplicado um pulso de escuro com duração de 45’ (quarenta e cinco minutos), 
atingindo horas circadianas (HC) específicas dos sagüis previstas com auxílio do 
software El Temps (Antoni Diez-Noguera, Barcelona, 1999). Para fazer tal previsão 
calculamos o período endógeno do animal (τ) em décadas (dez dias, imediatamente 
antecedentes ao pulso) pelo teste Lomb-Scargle, obtendo um valor em minutos, o qual 
subtraído de 1440 min (equivalente à 24h) nos forneceu uma referência para a 
mudança de fase diária (MF). Em seguida, dividimos o τ por 24 para encontrarmos as 
43
HCs (Fig.3). Assim, ajustamos o “timer” para interromper a passagem de corrente 
elétrica para as luzes da sala na hora prevista e com a duração desejada. 
Um software (Aschoff) desenvolvido na base de pesquisa LabCrono/UFRN foi 
usado para registrar o ciclo de atividade/repouso de cada animal, utilizando para isto 
um sensor infravermelho (JFL-Equipamentos Eletrônicos, IDX-1000) adaptado à 
gaiola, que detecta cada movimento do animal gerando um sinal elétrico. O sinal 
elétrico gerado pelo sensor é enviado para uma placa de aquisição de dados, National 
Instruments (NI PCI – 6025E), que armazena informações de 05 minutos, totalizando 
288 pontos de registro de atividade ao longo de 24 horas. Estas informações são 
usadas para se obter o perfil do ciclo atividade/repouso dos animais mantidos sob 
diversas circunstâncias experimentais. Estudos comparativos entre dados captados por 
softwares com dados obtidos através de registros de observação comportamental 
demonstram que 97% das vezes em que este tipo de sensor é ativado, o sinal 
corresponde ao deslocamento do animal, embora ele seja capaz de detectar qualquer 
tipo de movimento (Santos, 2000). 
A determinação dos horários do início da atividade foi feito através da 
totalização dos dados em intervalos de 15 minutos e calculada a freqüência média 
diária de atividade. Como início da atividade (HC 0) foi considerado o primeiro 
intervalo de 15 minutos com valor superior ou igual a 10% da média de atividade 
diária, que se manteve por um mínimo de 30 minutos dentro de 1 hora. Como fim da 
atividade foi considerado o último intervalo de 15 minutos com valor superior ou igual 
a 10% da média diária, antecedido por no mínimo 30 minutos de atividade dentro de 1 
hora (critério adaptado a partir de Glass et al, 2001). O critério de definição da HC 
atingida pelo pulso de escuro foi determinado pelo início do pulso, mesmo que o 
término deste se extinguisse na HC subseqüente. 
Os pulsos foram aplicados visando atingir as HCs 4, 10, 16 e 22. Esses pontos 
foram escolhidos por estarem com respostas bem caracterizadas na CRFs para pulso de 
escuro em outros trabalhos. Deu-se um intervalo de duas semanas entre um estímulo e 
o outro. O último pulso foi aplicado no dia subjetivo e na HC em que houve a maior 
mudança de fase com os pulsos anteriores, devido à predição de uma correlação 
positiva com expressão da proteína FOS no NPG. Trinta minutos após o último pulso, 
os sagüis (5 e 6) foram capturados, vendados, anestesiados, perfundidos, removido os 
44
encéfalos, obtido cortes deste tecido (microtomia), servindo assim como nosso grupo 
experimental. Posteriormente foi realizada imunohistoquímica contra a proteína FOS, 
utilizada como indicador de atividade neuronal, assim como uma marcação com dupla 
peroxidase contra FOS e NPY. Para mensurar a expressão de FOS, o grupo 
experimental foi comparado ao do grupo controle utilizando como parâmetro o 
número de células FOS-positivas por campo (coincidente com os limites do NPG), em 
três níveis (rostral, médio e caudal) do NPG. Quatro indivíduos leigos no assunto 
foram instruídos a contar essas células, apenas com a informação das características 
que deveriam levar em consideração para computar essas células no ato da contagem. 
Para confirmar se há diferença entre os grupos seria necessário aplicar o teste T 
(Student), no entanto, devido ao baixo tamanho da amostra, não foi possível avaliar 
essa condição. Apenas utilizamos a estatística descritiva para apresentação dos dados. 
As ferramentas para análise da imunohistoquímica e digitalização das imagens foram 
semelhantes a do grupo anterior. 
O objetivo deste experimento foi tentar responder as hipóteses iniciais sobre a 
natureza do pulso de escuro (baseando-se na resposta da expressão de FOS e 
comportamento da CRF), averiguar a existência de uma relação entre as mudanças de 
fase e a expressão de FOS no NPG e o papel do NPG dentro desse contexto como 
possível estrutura análoga ao FIG. 
45
ح
ح MF = ح - 1440*
1440 -1370 = 70
 HC = 24 / ح *
1370 / 24 ≈ 57 
Figura 3 – Demonstração dos cálculos utilizados na previsão da 
HC para aplicação do pulso de escuro e sua respectiva resposta 
de fase. ح (período endógeno), (pulso de escuro, HC4), 
(linha de regressão linear), (resposta de fase), MF (mudança de 
fase diária) e HC (hora circadiana). 
46
4.7.2 – Grupo Controle 
O sagüi 7 foi submetido a mesma condição inicial do grupo anterior, mas não se 
aplicou o pulso de escuro, onde, partindo-se de uma HC equivalente ao dos animais do 
grupo anterior, fizemos a captura, vendamento, perfusão, remoção dos encéfalos, 
microtomia e imunohistoquímica contra a proteína FOS, servindo assim como nosso 
grupo controle. 
4.7.3 – Curva de Resposta Dependente de Fase (CRF). 
Durante todo o experimento, os animais 5, 6, 7, 8 e 9 receberam pulsos de 
escuro em HC’s distintas de acordo com as especificações descritas acima. As 
respostas comportamentais de cada um deles serviram para construção da CRF. Os 
animais 8 e 9 serviram apenas como fonte de dados para as respostas de fase e logo 
foram devolvidos aos viveiros ao término do desenho experimental. 
As mudanças de fase foram calculadas pela diferença entre os horários 
estimados para o início da atividade, 1 dia após a aplicação do pulso, determinados 
pela regressão linear (GraphPad InStat) a partir do início da atividade 1-7 dias 
imediatamente antes ao pulso. 
4.7.4 – Registro de Atividade Locomotora. 
Os registros de atividade locomotora dos animais 5, 6, 7, 8 e 9 foram utilizados 
como parâmetro para avaliar quantitativamente quaisquer mudanças significativas no 
comportamento locomotor nos dias ou momentos em que esses animais foram 
estimulados. Aplicamos o teste ANOVA (Tukey-Kramer, pós-teste) para medidas 
repetidas a fim de averiguar diferenças na atividade locomotora no dia do pulso em 
relação ao dia imediatamente antecedente e subseqüente. Nesse caso, o tempo de 
atividade foi quantificado em segundos por intervalo de 5 min. O teste ANOVA (one-
way, Tukey-Kramer, pós-teste ) foi utilizado para identificar se há diferenças na 
distribuição da atividade locomotora entre as HC’s e a acrofase desse comportamento. 
Não foi possível comparar o nível de atividade locomotora das HC’s atingidas pelo 
pulso com as