VArusZikaEstado-Alves-2018

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE 
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS 
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA 
 
 
 
 
Brenda Elen Bizerra Alves 
 
 
 
VÍRUS ZIKA NO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE: ASPECTOS 
EPIDEMIOLÓGICOS E FILOGENÉTICOS. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Natal 
2018. 
 
 
 
BRENDA ELEN BIZERRA ALVES 
 
 
VÍRUS ZIKA NO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE: ASPECTOS 
EPIDEMIOLÓGICOS E FILOGENÉTICOS. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Orientador: Prof. Dr. Josélio Maria Galvão de Araújo 
 
 
 
 
 
 
 
Natal 
2018. 
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Biologia Parasitária da 
Universidade Federal do Rio Grande do Norte 
para obtenção do Título de Mestre em Biologia 
Parasitária na área de Microbiologia. 
 
 
 
 
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN 
Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - Centro de Biociências - CB 
Alves, Brenda Elen Bizerra. 
 Vírus Zika no Estado do Rio Grande do Norte: aspectos 
epidemiológicos e filogenéticos / Brenda Elen Bizerra Alves. - Natal, 
2018. 
 100 f.: il. 
 
 Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do 
Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Biologia 
Parasitária. 
 Orientador: Prof. Dr. Josélio Maria Galvão de Araújo. 
 
 
 1. Vírus Zika - Dissertação. 2. Rio Grande do Norte - Dissertação. 3. 
Epidemiologia - Dissertação. 4. Filogenia - Dissertação. I. Araújo, 
Josélio Maria Galvão de. II. Universidade Federal do Rio Grande do 
Norte. III. Título. 
 
RN/UF/BSE-CB CDU 578.89 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
BRENDA ELEN BIZERRA ALVES 
 
 
 
Vírus Zika no Estado do Rio Grande do Norte: Aspectos epidemiológicos e 
filogenéticos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Aprovada em: 28/02/2018. 
 
Examinadores 
Prof. Dr. Josélio Maria Galvão de Araújo (Presidente) – Universidade Federal do Rio 
Rio Grande do Norte (UFRN) 
Prof. Dr. José Veríssimo Fernandes (1º Examinador) – Universidade Federal do Rio 
Grande do Norte 
Prof. Dr. Daniel Carlos Ferreira Lanza (2º Examinador) – Universidade Federal do 
Rio Grande do Norte (UFRN) 
Prof. Dr. João Felipe Bezerra (3º Examinador) – Faculdade Natalense de Ensino e 
Cultura (FANEC) 
 
 
 
 
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Biologia Parasitária da 
Universidade Federal do Rio Grande do Norte 
para obtenção do Título de Mestre em Biologia 
Parasitária. 
Área de concentração: Biologia Parasitária 
 
 
 
AGRADECIMENTOS 
 
Inicialmente, agradeço a Deus por toda paz, luz, bênçãos e força que são 
combustíveis para a luta diária dos meus sonhos; 
Agradeço a minha família por todo suporte, ajuda, torcida e amor; 
Agradeço a todos os meus amigos por todo carinho, cuidado, atenção, 
companheirismo e momentos felizes que me proporcionam; 
Agradeço ao meu Orientador, Professor Josélio, por todo acolhimento, paciência, 
ensinamentos e incentivos. E por ser um grande exemplo de Professor, Orientador, 
Líder e Ser Humano inspirador. 
Agradeço de todo coração a toda Equipe do LADIC pela ajuda, paciência e 
colaboração. Sem dúvidas, a ajuda de todos foi essencial para a conclusão desse 
trabalho. Aproveito também para fazer um agradecimento especial a Hannaly por toda 
a cumplicidade desde o início do mestrado até essa etapa final de conclusão, 
agradeço a Deus por ter você presente em minha, tanto na vida acadêmica, quanto 
fora. 
Agradeço imensamente a Matheus, Alex e Gustavo por todo auxílio e ajuda com a 
Bioinformática. Aproveito também para agradecer ao meu Amigo Allan pela ajuda na 
elaboração dos mapas. A contribuição de vocês foi indispensável para a realização 
desse trabalho, agradeço de coração. 
Agradeço aos demais professores por aceitarem participar da minha banca 
examinadora, contribuindo desse modo para o enriquecimento desse trabalho. 
 
 
 
RESUMO 
 
O Rio Grande do Norte (RN) foi um dos primeiros Estados onde o vírus Zika foi 
incialmente detectado no Brasil, provavelmente devido ao fluxo de turistas, ao alto 
grau de infestação do Aedes aegypti e a precariedade do saneamento ambiental. A 
presença desse arbovírus no RN, a notificação de casos graves, a escassez de 
trabalhos disponíveis sobre esse tema e sua possível introdução do vírus no Brasil 
durante a Copa das Confederações de 2013, serviram de motivação para a realização 
desse estudo que buscou investigar a circulação do vírus Zika no Estado do Rio 
Grande do Norte e realizar a caracterização molecular dos vírus isolados durante o 
período de junho de 2013 a dezembro de 2016. Durante esse período, amostras de 
pacientes foram analisadas através da técnica de transcrição reversa seguida da 
reação em cadeia da polimerase em tempo real (qRT-PCR) para a detecção do 
genoma viral. A infecção pelo ZIKV foi confirmada em 8,97% (73/814) dos casos 
estudados. A análise da distribuição espacial do vírus pelas diferentes microrregiões 
do Estado, mostrou sua circulação em 16 municípios. Os municípios com maior 
número de casos confirmados foram Natal e Parnamirim. O período com maior 
incidência da infecção ocorreu nos meses de março, abril e maio de 2015, entretanto, 
as maiores proporções de casos positivos ocorreram nos meses de novembro e 
dezembro de 2014 e fevereiro de 2015. A maioria dos casos de infecção por Zika 
ocorreu em pacientes do sexo feminino, mas sem diferença significativa em relação 
ao sexo masculino. A infecção pelo vírus Zika atingiu todas as faixas etárias com 
praticamente as mesmas taxas de incidência da infecção. Nenhuma correlação entre 
a estimativa de viremia e o tempo de doença nos pacientes foi encontrada, assim 
como, não foram encontradas diferenças significativas na viremia de acordo com o 
tipo de amostra analisada (soro/sangue total), mas houve uma diferença significativa 
na viremia entre o quarto e quinto dia de sintomas analisados. A análise filogenética 
indicou que a linhagem do ZIKV circulante no estado do Rio Grande do Norte pertence 
ao genótipo Asiático. Ao comparar os vírus isolados nesse estudo com as cepas 
ascestrais isoladas na Malásia foram identificadas três mutações que geraram 
mudanças de aminoácidos: D393E, V473M e T487M. Essas mutações foram 
encontradas no domínio III da proteína (E) e provavelmente, influenciam na 
patogenicidade das cepas dos vírus Zika circulantes no Estado do RN. Esse estudo 
fornece subsídios necessários para compreender a distribuição e a dinâmica da 
doença no estado do Rio Grande do Norte e a caracterização genética é fundamental 
para a compreensão dos aspectos biológicos do vírus. 
Palavras-chave: Vírus Zika. Rio Grande do Norte. Epidemiologia. Filogenia. 
 
 
 
 
ABSTRACT 
 
Rio Grande do Norte (RN) was one of the first states where the virus was initially 
detected in Brazil, probably due to the tourists flow, the high degree of Aedes aegypti 
infestation and the precariousness of environmental sanitation.The presence of this 
arbovirus in RN, the notification of severe cases, the scarcity of available works on this 
subject and its possible introduction of the virus in Brazil during the Confederations 
Cup 2013, served as motivation for the accomplishment of this study that sought to 
investigate the circulation of the Zika virus in the State of Rio Grande do Norte and to 
perform the molecular characterization of the isolated viruses during the period from 
June 2013 to December 2016. In this period, patient samples were analyzed using the 
reverse transcription technique followed by real-time polymerase chain reaction (qRT-
PCR) for the detection of the viral genome. ZIKV infection was confirmed in 8.97% 
(73/814) of the cases studied. The analysis of the spatial distribution of the virus by the 
different micro regions of the State showed its circulation in 16 municipalities. The 
municipalities with the highest number of confirmed caseswere Natal and Parnamirim. 
The period with the highest incidence of infection occurred in the months of March, 
April and May of 2015 however, the highest proportions of positive cases occurred in 
the months of November and December of 2014 and February of 2015. The majority 
of cases of Zika infection occurred in female patients, but without significant difference 
in relation to males. Zika virus infection reached all age groups with practically the 
same infection incidence rates. No correlation between viremia estimation and disease 
time in patients was found, as well as, no significant differences in viremia according 
to the type of sample analyzed (serum/whole blood), but there was a significant 
difference in viremia between the fourth and fifth day of symptoms analyzed. 
Phylogenetic analysis indicated that the circulating ZIKV in the state belong to the 
Asian genotype.The amino acid comparison between ZIKV identified in this study and 
the ancestral strains isolated in Malaysia showed three mutations with amino acid 
changes: D393E, V473M and T487M. These mutations were found in domain III of the 
protein (E), and probably influence the pathogenicity of Zika virus strains circulating in 
Rio Grande do Norte. This study provides the necessary inputs to understand the 
distribution and dynamics of the disease in the State of Rio Grande do Norte and the 
genetic analyses are fundamental for understanding the biological aspects of the virus. 
 
Keywords: Zika virus. Rio Grande do Norte. Epidemiology. Phylogeny. 
 
 
 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
Figura 1. Partícula viral e organização do genoma do vírus Zika. O vírus Zika 
apresenta em sua estrutura um envelope contendo as proteínas E e M, além de um 
capsídeo com simetria icosaédrica e um genoma de RNA. O genoma apresenta duas 
porções não codificantes (5’ÚTR e 3´UTR) e uma porção codificante que origina três 
proteínas estruturais e sete proteínas não estruturais. ............................................. 21 
Figura 2. Representação esquemática e estrutural da Proteína (E) do vírus Zika. A 
proteína (E) possui cerca de 505 aminoácidos, apresenta-se sob a forma de dímero e 
possui três domínios: Domínio I (vermelho), domínio II (amarelo) e domínio III (azul).
 .................................................................................................................................. 22 
Figura 3. Ciclo replicativo do vírus Zika. A infecção pelo ZIKV inicia-se com a fixação 
do vírus aos receptores celulares (1). Em seguida, ocorre o processo de endocitose, 
com a formação do endossomo (2). A acidificação do endossomo promove a fusão 
entre o envelope viral e a membrana do endossomo, resultando na liberação do 
nucleocapsídeo (3) e logo após, ocorre a liberação do genoma viral (4) no citoplasma 
da célula. O RNA genômico é traduzido em uma única poliproteína que dá origem às 
proteínas estruturais e não estruturais. As proteínas não estruturais irão auxiliar na 
formação de novos RNAs virais genômicos, enquanto as proteínas estruturais irão 
compor a estrutura das novas partículas virais. A montagem dessas partículas ocorre 
no RE (5) e o processo de maturação ocorre no complexo de Golgi (6). Os virions 
maduros (7) são liberados da célula por exocitose (8). ............................................. 25 
Figura 4. Mosquitos Aedes aegypti e Aedes albopictus. a) Mosquito Aedes aegypti 
apresentando em seu escudo escamas branco-prateadas dispostas em formato de 
lira. b) Mosquito Aedes albopictus com escamas prateadas organizadas em uma faixa 
longitudinal. ............................................................................................................... 26 
Figura 5. Perímetro cefálico (PC) de um recém-nascido sem microcefalia (PC ≥ 32), 
com microcefalia (PC com dois desvios-padrão abaixo da média) e microcefalia 
severa (PC com três desvios-padrão abaixo da média). ........................................... 32 
Figura 6. Mapa do mundo demonstrando circulação do ZIKV até março de 2017. ... 38 
Figura 7. Árvore filogenética demonstrando que o vírus Zika possui duas linhagens, 
uma Asiática e outra Africana. ................................................................................... 43 
Figura 8. Localização do Estado do Rio Grande do Norte. ....................................... 48 
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Figura 9. Mapa do Rio grande do Norte demonstrando a distribuição dos casos 
estudados e com infecção confirmada pelo vírus Zika. ............................................. 63 
Figura 10. Mapa do Rio Grande do Norte indicando a distribuição dos casos 
confirmados de ZIKV por mesorregião potiguar. ....................................................... 65 
Figura 11. Fluxograma mostrando a distribuição espaço-temporal da infecção pelo 
vírus Zika no Estado do Rio Grande do Norte. .......................................................... 66 
Figura 12. Distribuição mensal por ano dos casos confirmados de infecção pelo vírus 
Zika no Estado do Rio Grande do Norte. .................................................................. 67 
Figura 13. Casos confirmados de infecção pelo vírus Zika de acordo com o gênero.
 .................................................................................................................................. 69 
Figura 14. A) Distribuição dos casos positivos para o vírus Zika de acordo com a faixa 
etária. B) Frequência de casos positivos para o vírus Zika de acordo com a faixa etária.
 .................................................................................................................................. 70 
Figura 15. Análise dos valores do Ct (Cycle Threshold) em relação ao tempo de 
doença nos pacientes. .............................................................................................. 70 
Figura 16. Análise dos valores do Ct (Cycle Threshold) por dia de sintomas (primeiro, 
segundo, terceiro, quarto, quinto e sexto dia de sintomas). ...................................... 71 
Figura 17. Análise dos valores do Ct (Cycle Threshold) em relação ao tipo de amostra 
(soro/sangue total). ................................................................................................... 71 
Figura 18. Árvore filogenética dos vírus Zika circulantes no Rio Grande do Norte. As 
cepas sequenciadas nesse estudo, marcadas em vermelho, pertencem a Linhagem 
Asiática. Árvore construída através do método estatístico de Máxima Verossimilhança, 
utilizando o modelo de substituição de Kimura - 2 parâmetros. Os valores de bootstrap, 
localizam-se próximos aos ramos da árvore. ............................................................ 74 
Figura 19. Alinhamento das sequências de aminoácidos da proteína (E) mostrando as 
substituições (D393E, V473M e T487M) detectadas nas cepas dos vírus Zika isolados 
nesse estudo. ............................................................................................................ 75 
Figura 20. Substituições D393E, V473M e T487M detectadas no domínio III da 
proteína (E) do envelope do vírus Zika. .................................................................... 75 
Figura 21. Estrutura Tridimensional da proteína (E) dos vírus Zika isolados nesse 
estudo. As substituições D393E, V474M e T487M estão marcadas em vermelho. .. 76 
Figura 22. Comparação da estrutura da proteína (E) dos vírus isolados nesse estudo, 
representada com a cor azul, com a estrutura da proteína (E) da cepa da Malásia 
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(KX694533), representada com a cor amarela. As substituições D393E, V474M e 
T487M estão marcadas em vermelho. ...................................................................... 77 
 
 
 
 
 
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LISTA DE TABELAS 
 
Tabela 1. Relação dos oligonucleotíodeos utilizados na transcrição reversa seguida 
da reação em cadeia pela polimerase em tempo real (qRT-PCR) para detecção do 
vírus Zika (Y = T ou C, R = A ou G). ......................................................................... 50 
Tabela 2. Relação dos reagentes utilizados na transcrição reversa seguida pela 
reação em cadeia pela polimerase em tempo real (qRT-PCR) para pesquisa do vírus 
Zika. .......................................................................................................................... 51 
Tabela 3. Oligonucleotídeos iniciadores desenhados para o sequenciamento do gene 
do envelope (E) do virus Zika. ................................................................................... 53 
Tabela 4. Reagentes utilizados na reação de síntese de cDNA................................ 55 
Tabela 5. Percentual de detecção do ZIKV por ano de estudo. ................................ 62 
Tabela 6. Percentual de detecção do vírus Zika por Mesorregião Potiguar. ............. 64 
Tabela 7. Análise mensal quantitativa por ano dos casos de infecção pelo vírus Zika 
no Estado do Rio Grande do Norte. .......................................................................... 67 
Tabela 8. Informações sobre as amostras utilizadas no sequenciamento. ............... 72 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 
 
A. aegypti: Aedes aegypti 
A. albopictus: Aedes albopictus 
CHIKV: Vírus chikungunya 
CIEVS: Centro de Informações Estratégicas em Vigilância em Saúde 
Ct: Cycle threshold 
DENV: Vírus dengue 
ECP: Efeito citopático 
ELISA: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay 
EMPARN: Empresa de Pesquisa Agropecuária 
IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística 
IFN: Interferon 
ISO: Organização Internacional de Normalização 
kDa: Kilodaltons 
LADIC: Laboratório de Biologia Molecular de Doenças Infecciosas e do Câncer 
LACEN: Laboratório Central Doutor Almino Fernandes 
LBMG: Laboratório de Biologia Molecular e Genômica 
µ: Microlitro 
ORF: Open Reading Frame 
PAHO: Pan American Health Organization 
PDB: The Protein Data Bank 
qRT-PCR: Transcrição reversa seguida da reação em cadeia pela polimerase em 
tempo real 
RE: Retículo Endoplasmático 
 
 
RN: Rio Grande do Norte 
RNA: Ácido ribonucleico 
RNAv: RNA viral 
RT-PCR: Transcrição reversa seguida da reação em cadeia pela polimerase 
SCZ: Síndrome Congênita do Zika 
SGB: Síndrome de Guillain-barré 
SEPLAM Secretaria de Estado do planejamento e das finanças 
SESAP: Secretaria de Estado e de Saúde Pública 
SLEV: Vírus da encefalite Saint Louis 
SVS: Secretária de Vigilância em Saúde 
VNO: Vírus do Nilo Ocidental 
WHO: World Health Organization 
ZIKV: Vírus Zika 
 
 
 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 17 
1.1 Breve histórico ................................................................................................. 18 
1.2 O Vírus ......................................................................................................... 19 
1.3 Transmissão vetorial .................................................................................... 25 
1.4 Transmissão não vetorial ............................................................................. 28 
1.5 Manifestações clínicas ................................................................................. 29 
1.5.1 Complicações graves ................................................................................ 30 
1.5.1.2 Síndrome Congênita do Zika (SCZ) .................................................... 31 
1.6 Patogênese ...................................................................................................... 33 
1.7 Diagnóstico ...................................................................................................... 34 
1.8 Tratamento atual e perspectivas ...................................................................... 35 
1.9 Epidemiologia .................................................................................................. 37 
1.9.1 Epidemiologia no Mundo ........................................................................... 37 
1.9.2 Epidemiologia nas Américas .................................................................... 38 
1.9.3 Epidemiologia no Brasil ............................................................................. 39 
1.9.4 Epidemiologia no Rio Grande do Norte ..................................................... 40 
1.9.5 Epidemiologia associada a distúrbios neurológicos .................................. 41 
1.10 Diversidade genética ..................................................................................... 42 
2 JUSTIFICATIVA ..................................................................................................... 45 
3 OBJETIVOS ........................................................................................................... 46 
3.1 Objetivo geral ................................................................................................... 46 
3.2 Objetivos específicos ...................................................................................... 46 
4 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................... 47 
4.1 Tipo de estudo ................................................................................................. 47 
4.2 Local do estudo ............................................................................................... 47 
 
 
4.3 Amostras Clínicas ............................................................................................ 48 
4.4 Extração do RNA total ..................................................................................... 49 
4.5 Transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase em tempo 
real (qRT-PCR) para pesquisa do Vírus Zika ........................................................ 49 
4.6 Isolamento Viral ............................................................................................... 51 
4.7 Sequenciamento e Análise Filogenética .......................................................... 52 
4.7.1 Sequenciamento do gene do envelope ................................................. 52 
4.7.1.1 Oligonucleotídeos iniciadores ............................................................. 52 
4.7.1.2 Gradiente de temperatura ................................................................... 54 
4.7.1.3 Síntese de cDNA ................................................................................54 
4.7.1.4 PCR para Sequenciamento ................................................................ 55 
4.7.1.5 Purificação do produto de PCR por extração de gel de agarose ....... 56 
4.7.1.6 Purificação direta do produto de PCR ................................................ 57 
4.7.1.7 Quantificação de DNA ........................................................................ 57 
4.7.1.8 Reação de Sequenciamento .............................................................. 58 
4.7.1.9 Purificação e precipitação de DNA para remoção de Dye terminators
 ....................................................................................................................... 58 
4.7.2 Caracterização genética ............................................................................ 59 
4.7.2.1. Elaboração do banco de sequências nucleotídicas ........................... 59 
4.7.2.2 Análises de Sequências ..................................................................... 59 
4.8 Construção da estrutura tridimensional da Proteína (E) .................................. 60 
4.9 Análises epidemiológicas e estatísticas ........................................................... 60 
4.10 Considerações éticas..................................................................................... 61 
5 RESULTADOS ....................................................................................................... 62 
5.1 Monitoramento do vírus Zika no Estado Rio Grande do Norte durante o 
período de junho de 2013 a dezembro de 2016. ................................................... 62 
5.2 Distribuição geográfica dos casos de infecção por Zika no Rio grande do 
Norte, de junho de 2013 a dezembro de 2016....................................................... 63 
 
 
5.3 Distribuição espaço - temporal dos casos de infecção por Zika no Rio grande 
do Norte, de junho de 2013 a dezembro de 2016. ................................................. 65 
5.4 Distribuição dos casos de infecção por Zika no Rio Grande do Norte, de 
acordo com o gênero ............................................................................................. 69 
5.5 Distribuição dos casos de infecção por Zika no Rio Grande do Norte, de 
acordo com a faixa etária....................................................................................... 69 
5.6 Avaliação dos valores do Ct (Cycle Threshold) na infecção ocasionada pelo 
vírus Zika. .............................................................................................................. 70 
5.7 Caracterização genética dos vírus Zika isolados no Rio Grande do Norte. ..... 72 
5.8 Análise estrutural da Proteína (E) .................................................................... 74 
6 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 78 
6. 1 Análise Epidemiológica ................................................................................... 78 
6.2 Análise Filogenética ......................................................................................... 81 
6.3 Modelagem proteica ........................................................................................ 82 
7 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 83 
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 84 
ANEXOS ................................................................................................................... 98 
 
 
 
 
 
 
17 
 
 
 
1 INTRODUÇÃO 
 
O termo ecológico arbovírus refere-se aos vírus que realizam ciclos complexos 
que envolvem vetores artrópodes hematófagos, como hospedeiros intermediários, e 
vertebrados susceptíveis (FIGUEIREDO, 2007). Nos últimos anos, as arboviroses 
tornaram-se ameaças constantes em regiões tropicais (LOPES et al., 2014). Os 
arbovírus são altamente capazes de emergir e distribuir-se para novas regiões 
geográficas (BALM et al., 2012). Inúmeros são os fatores qube contribuem para a 
emergência desses arbovírus, dentre eles: alterações genéticas que aumentam a 
adaptação viral, mudanças climáticas, crescimento populacional, urbanização 
desordenada e a globalização que aumentou o número de viagens, intensificando o 
fluxo de pessoas por diferentes regiões do mundo (MUSSO & GUBLER, 2016). Alguns 
arbovírus importantes tais como Dengue (DENV), Chikungunya (CHIKV), Zika (ZIKV) 
e Febre amarela (YFV) cocirculam atualmente no Brasil (SVS, 2017; MINISTÉRIO DA 
SAÚDE, 2018). 
 Os vírus Chikungunya e Zika se dispersaram e ocasionaram epidemias globais, 
porém o ZIKV provocou um maior impacto na saúde pública devido à sua associação 
com casos de microcefalia e malformações congênitas em recém-nascidos e sua 
associação com síndrome neurológica de Guillain-Barré em adultos (WHITE et al., 
2017). 
O Rio Grande do Norte (RN) foi um dos primeiros estados onde o vírus Zika foi 
inicialmente detectado no Brasil (ZANLUCA et al., 2015), circulando intensamente nos 
municípios desse Estado durante os anos de 2015 e 2016 e ocasionando casos 
graves de microcefalia e outras malformações congênitas (SESAP, 2016; SESAP, 
2017b). Isso se deu, provavelmente, em consequência da precariedade no sistema 
de saneamento ambiental e condições climáticas favoráveis que possibilitam o 
desenvolvimento dos vetores e o intenso fluxo de pessoas (em virtude do turismo) que 
pode ter favorecido a transmissão e manutenção dos casos de infecção pelo vírus 
Zika no Estado (LOPES et al., 2014). 
Diante disso, espera-se que a vigilância virológica realizada nesse estudo, com 
o auxílio de técnicas moleculares, promova a compreensão da origem e dispersão 
18 
 
 
dessa doença no Rio Grande do Norte e que através das análises filogenéticas 
identifiquemos a linhagem das cepas circulantes no RN, que permite correlacionar 
com os casos graves (a partir das análises de mutações presentes nos vírus) e que 
possamos também avaliar a história evolutiva desses vírus. 
 
1.1 Breve histórico 
 
O vírus Zika, assim chamado, porque foi isolado pela primeira vez na Floresta 
Zika (situada em Uganda no continente Africano) em abril de 1947. Esse vírus foi 
isolado a partir de um macaco Rhesus sentinela, utilizado para avaliar a circulação do 
vírus da Febre Amarela naquela região. No ano seguinte (1948), o vírus foi isolado de 
um pool de 86 mosquitos Aedes Africanus capturados também na Floresta Zika, 
caracterizando-os portanto, como vetor de transmissão do ciclo silvestre nos macacos 
(DICK et al., 1952). 
 O primeiro relato de infecção em humanos ocorreu em 1952, quando Smithburn 
(1952) realizou um estudo com soros humanos provenientes da Uganda e da 
Tanzânia e detectou a presença de anticorpos neutralizantes contra o vírus. Nesse 
mesmo ano, o vírus foi isolado de uma paciente do sexo feminino de 10 anos de idade, 
durante uma epidemia de icterícia ocorrida na Nigéria (MACNAMARA, 1954). 
 Em 1956, o estudo realizado por Bearcroft (1956) avaliou a infecção pelo ZIKV 
em um voluntário humano. Nesse estudo, o vírus foi inoculado por via subcutânea e a 
infecção foi demonstrada pelo aumento dos títulos de anticorpos e através do 
isolamento viral a partir do sangue desse voluntário. Ainda nesse ano, Boorman e 
Porterfield (1956) evidenciaram experimentalmente a capacidade de infecção, 
replicação e transmissão viral pelos mosquitos Aedes aegypti. 
Nos anos seguintes (1961 a 1963), estudos realizados com vetores na Floresta 
Zika, obtiveram 12 isolados do vírus a partir de pools de Aedes africanus, sugerindo 
essa espécie como principal vetor do ciclo silvestre naquela localidade (HADDOW et 
al., 1964). 
O primeiro relato clínico completo da doença foi descrito por Simpson, em 1964, 
que descreveu sua própria infecção. Em seu segundo dia de doença apresentou19 
 
 
erupção cutânea maculopapular no rosto, pescoço, tronco e braços com propagação 
para as palmas das mãos e plantas dos pés, febre passageira, mal estar e dor nas 
costas. No terceiro dia, apresentou uma melhora do quadro clínico, com persistência 
apenas da erupção cutânea que desapareceu no quinto dia de doença (HAYES, 
2009). 
Durante 30 anos (1951 a 1981), o vírus se disseminou por outros países do 
continente Africano e também por alguns países da Ásia, sendo isolado de mosquitos 
Aedes aegypti, em 1966, na Malásia (HAYES, 2009; SHEN et al., 2016). Os primeiros 
casos de infecção no continente Asiático foram relatados na Indonésia, no ano de 
1977 (MUSSO & GUBLER, 2016). Com a disseminação, para outros países, o vírus 
tornou- se endêmico na África e Sudeste da Ásia (IOOS et al., 2014). 
 
1.2 O Vírus 
 
O vírus Zika é um arbovírus do grupo B, pertencente à família Flaviviridae e ao 
gênero Flavivirus, assim como outros arbovírus de importância epidemiológica como 
os vírus dengue, o da febre amarela e o do Nilo Ocidental (PLOURDE & BLOCH, 
2016). A família Flaviviridae é composta por três gêneros: Flavivirus, Pestivirus e 
Hepacivirus e dois grupos de vírus (GBV-A e GBV-C) que aguardam a classificação 
formal. Os membros dessa família apresentam similaridades quanto ao ciclo 
replicativo, organização do genoma e morfologia viral (LINDENBACH et al., 2007). 
O gênero Flavivirus inclui um número elevado de espécies taxonomicamente 
reconhecidas, com mais de 70 vírus. As inúmeras espécies pertencentes a esse 
gênero caracterizam-se por serem vírus pequenos com diâmetro entre 40 a 60 nm, 
envelopados, capsídeo com simetria icosaédrica e genoma constituído por uma única 
fita de ácido ribonucleico (RNA) de sentido positivo contendo cerca de 10.794 
nucleotídeos, flanqueado pelas regiões 5’ e 3’ não codificantes (KUNO & CHANG, 
2007; LINDENBACH et al., 2007). A única fase aberta de leitura (open reading frame, 
ORF) do genoma é responsável por codificar uma única poliproteína que após ser 
processada por proteases do vírus e da célula, origina as proteínas estruturais e não 
estruturais dos vírus (BALEOTTI et al., 2003; CHAMBERS et al., 1990; LINDENBACH 
20 
 
 
et al., 2007; FAYE et al., 2014). As regiões não codificantes 5’ e 3’ dos flavivírus 
possuem cerca de 100 nucleotídeos (nt) e de 400 a 700 nt, respectivamente 
(LINDENBACH et al., 2007). A região 5’ possui CAP tipo I (m7GpppAmpN2) e 
caracteriza-se por não ser bem conservada dentre as diferentes espécies de flavivírus 
(LINDENBACH et al., 2007; LINDENBACH & RICE, 2003). A região 3’ não possui 
cauda poliadenilada (LINDENBACH & RICE, 2003) e apresenta grande variabilidade, 
contudo, algumas regiões conservadas (conserved sequence, CS) são encontradas e 
estão envolvidas na estrutura secundária dos flavivírus (LINDENBACH, 2007; KUNO 
& CHANG, 2007). 
Estruturalmente, o ZIKV é semelhante aos outros flavivírus, como o vírus do 
Nilo Ocidental (VNO), vírus da encefalite japonesa (JEV), vírus da dengue (DENV) e 
vírus da febre amarela (YFV) (KOSTYUCHENKO et al., 2016), porém, apresenta em 
seu envelope uma região altamente variável, situada próximo a um importante sítio de 
glicosilação que contém o aminoácido asparagina na posição 154 (Asn154) e está 
associado a virulência nos flavivírus. Essas diferenças estruturais podem ser 
importantes para o entendimento da patogênese da doença (SIROHI et al., 2016). 
Assim como os demais flavivírus, sua única ORF codifica uma poliproteína 
contendo aproximadamente 3.419 aminoácidos cuja clivagem origina as proteínas 
estruturais e não estruturais do vírus. As proteínas estruturais são três: capsídeo (C), 
envelope (E) e pré-membrana (prM) que após a clivagem torna-se (M). Além das 
proteínas estruturais, a poliproteína também origina sete proteínas não estruturais: 
NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5 (CHAMBERS et al., 1990; KUNO & 
CHANG, 2007) (Figura 1). 
21 
 
 
 
 
Fonte: Adaptado RATHER et al. (2017b). 
O envelope viral é constituído por uma bicamada lipídica e contém 180 cópias 
de cada uma das glicoproteínas estruturais (E) e (M) (LINDENBACH et al., 2007; 
ZHANG et al., 2014). A glicoproteína (E) possui aproximadamente 500 aminoácidos 
(MUKHOPADHYAY et al., 2005), peso molecular de 53 kilodaltons (kDa) 
(LINDENBACH & RICE, 2003) e apresenta-se sob a forma de dímero, contendo em 
cada monômero 3 domínios: DI, DII e DIII (KOSTYUCHENKO et al., 2016). O domínio 
I localiza-se no centro do monômero, unindo os domínios II e III, portanto, atua na 
organização estrutural do envelope. O domínio II é essencial para a fusão do vírus 
com a membrana da célula hospedeira (DAI et al., 2016; YE et al., 2016). O domínio 
III permite a ligação do vírus ao receptor celular (ZHANG et al., 2014), contém também 
um sítio de ligação para a Imunoglobulina G (IgG) e ainda, desempenha um importante 
papel na etapa de fusão (KOSTYUCHENKO et al., 2016) (Figura 2). 
Figura 1. Partícula viral e organização do genoma do vírus Zika. O vírus Zika apresenta em sua estrutura 
um envelope contendo as proteínas E e M, além de um capsídeo com simetria icosaédrica e um genoma 
de RNA. O genoma apresenta duas porções não codificantes (5’ÚTR e 3´UTR) e uma porção codificante 
que origina três proteínas estruturais e sete proteínas não estruturais. 
22 
 
 
Fonte: Adaptado DAI et al. (2016). 
 
A proteína (M) possui cerca de 75 aminoácidos e origina-se a partir da clivagem 
da proteína precursora prM (~ 165 aminoácidos) (MUKHOPADHYAY et al., 2005) que 
ocorre durante a passagem do vírus pelo complexo de Golgi da célula hospedeira, 
sendo essencial para a maturação dos virions (STIASNY & HEINZ, 2006). Nesse 
processo, o fragmento “pr” é removido, a proteína torna-se (M) e por fim, os novos 
virions maduros são liberados por exocitose (LINDENBACH & RICE, 2003). Acredita-
se que a função da prM, em virions imaturos, seja de evitar alterações estruturais na 
glicoproteína (E) induzidas pelo pH ácido durante sua passagem pelo complexo de 
Golgi (STIASNY & HEINZ, 2006). 
A proteína (C), que forma o capsídeo, possui aproximadamente 120 
aminoácidos, apresenta peso molecular de aproximadamente 11 kDa e é altamente 
básica por conter em sua estrutura inúmeros aminoácidos com cargas positivas 
(CHAMBERS et al., 1990; LINDENBACH et al., 2007; MUKHOPADHYAY et al., 2005). 
Figura 2. Representação esquemática e estrutural da Proteína (E) do vírus Zika. A proteína (E) possui 
cerca de 500 aminoácidos, apresenta-se sob a forma de dímero e possui três domínios: Domínio I 
(vermelho), domínio II (amarelo) e domínio III (azul). 
23 
 
 
 Dentre as proteínas não estruturais, a NS1 possui aproximamente 46 
kilodaltons (LINDENBACH et al., 2007) é dimérica, glicosilada e possivelmente atua 
no processo de replicação viral (JACOBS et al., 2000; LINDENBACH et al., 2007). 
Acredita-se que a perda de um códon da porção gênica da NS1, possibilitou a 
adaptação do ZIKV aos humanos (ABUSHOUK, NEGIDA & AHMED, 2016). 
A NS2A é relativamente pequena (22 kDa), hidrofóbica e atua nas mudanças 
entre a replicação do RNA viral e o seu empacotamento (LINDENBACH et al., 2007). 
A NS2B também é uma pequena proteína (14 kDa) (LINDENBACH et al., 2007) e 
quando associada a NS3 forma um complexo proteico estável que atua como cofator 
da serino protease (NS3-NS2B) (FALGOUT et al., 1991). Sabe-se que a protease do 
vírus Zika NS2B-NS3 é essencial para a clivagem da poliproteína viral e 
consequentemente para o ciclo replicativo do vírus, por isso atualmente é bastante 
estudada para o desenvolvimento de possíveis antivirais (ROY et al., 2017). 
Conforme observado também em outros flavivírus, o domínio NS3 do vírus Zika 
também necessita da proteína NS2B para o seu correto dobramento, sendo 
consequentemente essencial para a correta atividade da protease (ROY et al., 2017). 
A NS3 é uma proteína multifuncional (70 kDa) por apresentar atividadede nucleotídeo 
trifosfatase, de RNA helicase e apresenta em seu terço N-terminal atividade de 
protease (NS2B-NS3) que promove a clivagem da poliproteína e atua também na 
replicação do RNA viral (LI et al., 1999; LINDENBACH et al., 2007). 
A NS4A e NS4B são pequenas proteínas hidrofóbicas de 16 kDa e 27 kDa, 
respectivamente, e estão envolvidas no processo de replicação viral (LINDENBACH 
et al., 2007). A proteína NS4A do ZIKV mostrou-se determinante para a patogênese 
do vírus (JAVED et al., 2017). 
Por fim, a NS5 é a maior (103 kDa) proteína do gênero Flavivirus. Essa proteína 
apresenta em seu domínio N-Terminal atividade de metiltransferase e também um 
outro domínio com atividade de RNA polimerase dependente de RNA. Dessa forma, 
esses domínios atuam em conjunto permitindo a síntese e extensão dos RNAs 
nascentes (CHAMBERS et al., 1990; LINDENBACH et al., 2007; WANG et al., 2017). 
O estudo realizado por Wang et al. (2017) verificou que a proteína NS5 do vírus Zika 
apresenta ~ 68% de identidade com a NS5 do vírus da encefalite japonesa (VEJ) e ~ 
66% com a do DENV-3. Esses percentuais correspondem as diferenças estruturais 
24 
 
 
identificadas no ZIKV no domínio com atividade de metiltransferase e também no 
domínio com atividade de RNA polimerase dependente de RNA. 
 A infecção pelo ZIKV inicia-se com a fixação do vírus aos receptores celulares 
presentes na membrana plasmática da célula hospedeira (CHU & NG, 2004), em 
seguida, ocorre o processo de endocitose mediado por proteínas do tipo clatrinas, que 
permite a entrada do vírus na célula através de uma vesícula formada a partir da 
membrana celular (LINDENBACH & RICE, 2003). No interior do endossomo, o pH 
torna-se ácido e promove uma alteração conformacional na glicoproteína (E) na qual 
expõe os peptídeos de fusão, que promovem a fusão entre o envelope viral e a 
membrana do endossomo, com a consequente liberação do nucleocapsídeo viral no 
citoplasma da célula hospedeira (LINDENBACH & RICE, 2003; MUKHOPADHYAY et 
al., 2005). Em seguida, o nucleocapsídeo libera o genoma viral no citoplasma da célula 
(LINDENBACH et al., 2007; VAN DER SCHAAR et al., 2007) (Figura 3). 
Após a liberação do genoma viral no citosol da célula, o ciclo replicativo irá 
ocorrer em quatro fases: tradução do RNA genômico na poliproteína que dá origem 
às proteínas estruturais e não estruturais, síntese de uma fita de RNA de polaridade 
negativa que serve como molde para a replicação do RNA viral, mobilização das 
proteínas estruturais para a montagem de partícula viral no Retículo Endoplasmático 
(RE) e liberação do virions maduros (SHANKAR, PATIL & SKARIYACHAN, 2017). A 
replicação viral inicia-se quando o RNA genômico do vírus que funciona como RNA 
mensageiro, é traduzido em uma única poliproteína que após ser processada por 
proteases do vírus e da célula hospedeira, dá origem às proteínas estruturais e não 
estruturais do vírus. As proteínas não estruturais atuam em conjunto para promover a 
transcrição do RNA genômico em uma fita complementar de RNA de polaridade 
negativa que serve como molde para a replicação do RNA viral genômico 
(LINDENBACH & RICE, 2003; SCHAAR et al., 2007; ZHANG et al., 2014). As 
proteínas estruturais prM e E juntas, formam o complexo prM-E que se insere na 
membrana do Retículo Endoplasmático (RE). Ao mesmo tempo, as unidades da 
proteína C se reúnem para formar os nucleocapsídeos que contém as réplicas do RNA 
viral genômico recém-sintetizados. Esses nucleocapsídeos ancoram na membrana do 
RE, onde o complexo prM-E está inserido, sendo este o local de onde brotam as 
partículas virais imaturas (SCHAAR et al., 2007; ZHANG et al., 2014). Essas partículas 
são transportadas através do complexo de Golgi e durante esse trajeto, ocorrem 
25 
 
 
mudanças conformacionais que permitem a clivagem da proteína (prM) pela proteína 
furina dando origem a proteína (M) (STIASNY & HEINZ, 2006). Essa alteração 
promove a exposição da proteína (E) ao baixo pH, bem como sua glicosilação. O 
ambiente ácido provoca um rearranjo da proteína (E) de dímeros para trímeros 
(STIASNY & HEINZ, 2006). Essa mudança para o estado trimérico é irreversível e 
torna a proteína (E) fusogênica. Após essas alterações estruturais, os virions tornam-
se maduros e são liberados da célula por exocitose (SCHAAR et al., 2007; ZHANG et 
al., 2014) (Figura 3). 
Fonte: Adaptado SAXENA et al. (2016). 
 
1.3 Transmissão vetorial 
 
O ZIKV é transmitido principalmente por mosquitos pertencentes ao gênero Aedes, 
sendo os mosquitos da espécie Aedes aegypti os principais vetores de transmissão 
Figura 3. Ciclo replicativo do vírus Zika. A infecção pelo ZIKV inicia-se com a fixação do vírus aos 
receptores celulares (1). Em seguida, ocorre o processo de endocitose, com a formação do endossomo 
(2). A acidificação do endossomo promove a fusão entre o envelope viral e a membrana do endossomo, 
resultando na liberação do nucleocapsídeo (3) e logo após, ocorre a liberação do genoma viral (4) no 
citoplasma da célula. O RNA genômico é traduzido em uma única poliproteína que dá origem às 
proteínas estruturais e não estruturais. As proteínas não estruturais irão auxiliar na formação de novos 
RNAs virais genômicos, enquanto as proteínas estruturais irão compor a estrutura das novas partículas 
virais. A montagem dessas partículas ocorre no RE (5) e o processo de maturação ocorre no complexo 
de Golgi (6). Os virions maduros (7) são liberados da célula por exocitose (8). 
 
26 
 
 
embora, os mosquitos Aedes albopictus também motivem grande preocupação na 
saúde pública devido a sua competência vetorial (IOOS et al., 2014; ZAMMARCHI et 
al., 2014; PINTO JUNIOR, 2015). O ciclo evolutivo desses mosquitos ocorre em duas 
fases, uma aquática na qual permite o desenvolvimento do ovo, larva e pupa e a outra 
fase, a alada, que permite a formação do mosquito adulto e ocorre no ambiente 
terrestre (TAVEIRA et al., 2001). Quando adulto, a diferenciação dessas espécies 
ocorre através da observação da distribuição das escamas (existentes na porção do 
escudo) desses vetores. Os mosquitos Aedes aegypti possuem escamas branco-
prateadas dispostas em formato de lira, já os Aedes albopictus apresentam escamas 
prateadas dispostas em uma faixa longitudinal (CONSOLI & OLIVEIRA, 1994) (Figura 
4). 
 
Fonte: Adaptado TORESDAHL & ASIF (2016). 
 
Esses vetores estão envolvidos em ciclos de transmissão silvestres e urbanos 
(IOOS et al., 2014). Tanto no Brasil quanto em outros países do continente Americano, 
a transmissão do vírus Zika ocorre através do ciclo urbano. 
Os mosquitos Aedes aegypti possuem alta capacidade vetorial devido aos seus 
hábitos diurnos; alimentação hematofágica, realizada pelas fêmeas, com múltiplos 
repastos que aumenta o risco de infecção do vetor e de transmissão de doenças 
(TAVEIRA et al., 2001; NATAL, 2002; HALSTEAD, 2008; JANSEN & BEEBE, 2010) e 
seu comportamento estritamente antropofílico (NATAL, 2002). Por isso, é 
frequentemente encontrado no peridomicílio e domicílio humano (CONSOLI & 
OLIVEIRA, 1994; MONATH, 1994). Essa espécie é cosmopolita e está presente nas 
faixas tropicais e subtropicais do mundo (CONSOLI & OLIVEIRA, 1994). Sua ampla 
distribuição está associada à fatores climáticos, os quais influenciam diretamente na 
biologia do vetor (WHO, 2009). O estudo realizado por Viana & Ignotti (2013) mostrou 
Figura 4. Mosquitos Aedes aegypti e Aedes albopictus. a) Mosquito Aedes aegypti apresentando em 
seu escudo escamas branco-prateadas dispostas em formato de lira. b) Mosquito Aedes albopictus 
com escamas prateadas organizadas em uma faixa longitudinal. 
27 
 
 
que elevações na temperatura, umidade e pluviosidade contribuíam para a 
sobrevivência, desenvolvimento e proliferação do vetor. Além dos fatores climáticos, 
o grau de infraestrutura da saúde pública também influencia na distribuição do inseto. 
Precárias condições de saneamento,crescimento desordenado de cidades e 
necessidade de armazenamento de água para uso doméstico favorecem a 
proliferação desse mosquito (JANSEN & BEEBE, 2010; MONATH, 1994). 
O Aedes albopictus atua como vetor secundário de transmissão do vírus Zika 
(CIOTA et al., 2017). É encontrado em áreas que apresentam climas tropicais, mas 
devido a sua alta capacidade de adaptação também é encontrado em locais com 
climas temperados, o que aumenta a distribuição geográfica do vírus, contribuindo 
para a sua globalização e consequentemente para a sua capacidade de ocasionar 
surtos (WONG et al., 2013; GREGORY et al., 2017). Diferentemente do A. aegypti que 
é um vetor domiciliado, o Aedes albopictus pode ser encontrado em diversos tipos de 
ambientes: urbanos e suburbanos, áreas peri-rurais, parques e zonas florestais. E 
ainda, pode atuar como um potencial vetor de patógenos zoonóticos (LAMBRECHTS, 
SCOTT & GUBLER, 2010), já que é capaz de alimentar-se em diversos mamíferos, 
aves e répteis. A susceptibilidade à infecção por ZIKV e sua capacidade de 
transmissão foi demonstrada experimentalmente por estudos realizados por Wong et 
al. (2013), Liu et al. (2017a) e por Ciota et al. (2017). Além disso, o A. albopictus foi 
detectado como o principal vetor do ZIKV, DENV e CHIVK, durante a epidemia que 
ocorreu no Gabão (África Central) em 2007 (GRARD et al., 2014). 
O vírus Zika também foi detectado em outras espécies de Aedes. Em vários países 
do continente Africano esse vírus foi detectado no A. africanus; na Ilha de Yap, o ZIKV 
foi constatado no A. hensilli e na Polinésia Francesa no A. polinesesesis (GUO et al., 
2016; MUSSO & GUBLER, 2016). Experimentalmente, as espécies de A. vittatus e A. 
luteocefalia foram capazes de transmitir o vírus, porém, a capacidade vetorial depende 
tanto da cepa quanto da espécie de mosquito (GUO et al., 2016; LIU et al., 2017a). 
Além do gênero Aedes, O ZIKV foi detectado em mosquitos pertencentes a outros 
gêneros como o Anopheles e o Culex, o que pode amplificar a capacidade de 
transmissão do vírus (LIU et al., 2017a). Uma maior proximidade filogenética do vírus 
Zika com outros arbovírus transmitidos por mosquitos do gênero, como são os casos 
do: vírus do Nilo Ocidental (VNO), vírus da Encefalite Japonesa e vírus da encefalite 
28 
 
 
Saint Louis (SLEV) foi constatada (YE et al., 2016). Para demonstrar a capacidade 
vetorial dos mosquitos do gênero Culex, amplamente distribuídos em áreas de 
circulação do vírus Zika, diversos estudos foram realizados, mas os resultados ainda 
são controversos (YE et al., 2016). Guo e colaboradores (2016) demonstraram que a 
espécie Culex quinquefasciatus era capaz de se infectar e transmitir o vírus, porém, o 
estudo realizado por Liu et al. (2017a) verificou que essa espécie não era competente 
para realizar a transmissão do vírus. Além disso, outros estudos com Culex pipiens e 
Culex tarsalis também não conseguiram verificar a transmissibilidade do vírus através 
desses vetores (GREGORY et al., 2017). 
 
1.4 Transmissão não vetorial 
 
O principal modo de transmissão do ZIKV é vetorial, contudo, há relatos de 
transmissão sexual, perinatal, pós-transfusional e exposição ocupacional (GREGORY 
et al., 2017). 
A transmissão sexual tornou-se preocupante para a saúde pública por 
promover a transmissão do ZIKV em áreas onde não há infestação de vetores e por 
possibilitar a transmissão a longo prazo, já que o vírus persiste no sêmen em até dois 
meses após o início dos sintomas (MANSUUY et al., 2016; SPENCER et al., 2017). 
Desde sua introdução nas Américas, vários casos de transmissão sexual foram 
relatados. Foy e colaboradores (2011), descreveram um caso de transmissão sexual 
em um casal heterossexual nos Estados Unidos, em 2008. O vírus também foi isolado 
a partir do sêmen de um paciente, em 2013, durante a epidemia ocorrida na Polinésia 
Francesa (MUSSO et al., 2015). No ano de 2016, diversos relatos de transmissão 
sexual de viajantes que retornaram para América do Norte e Europa foram 
documentados. Atualmente, ainda não há relatos sobre a carga viral necessária para 
transmissão sexual do ZIKV (GREGORY et al., 2017). A maioria dos casos notificados 
ocorreram a partir de transmissão masculina para feminina, porém, um caso de 
transmissão sexual entre homens e de uma mulher para um homem, foram também 
descritos. Além disso, o vírus foi recentemente detectado em secreções vaginais 
(HAMER et al., 2017; PENOT et al., 2017). 
29 
 
 
A transmissão intrauterina foi associada à infecção pelo Zika devido aos casos 
de microcefalia e outras malformações cerebrais detectados em recém-nascidos de 
mães que apresentaram sintomas compatíveis com a infecção pelo vírus Zika. O 
mecanismo de transmissão vertical intra-uterina ainda é desconhecido. É provável que 
o vírus se replique em sinciotrofoblastos ou em trofoblastos extravilosos, ambos 
localizados na placenta, e que dessa forma alcancem o feto. Outras hipóteses 
envolvem a reposta imune como: danos placentários e transmigração de células 
imunes infectadas para o feto (COYNE & LAZEAR, 2016). 
A transmissão via transfusão sanguínea foi confirmada, no Brasil, pelo isolamento 
viral e ocorreu a partir de um doador de sangue que se encontrava no período de 
incubação da doença (VASCONCELOS, 2015). Na Polinésia Francesa, a infecção 
pelo vírus foi confirmada em aproximadamente 3% de doadores assintomáticos 
(SHARMA & LAL, 2017). Por fim, desde a década de 60, casos de transmissão por 
exposição ocupacional vem sendo relatados (GREGORY et al., 2017). 
 
1.5 Manifestações clínicas 
 
O período de incubação do vírus Zika varia de 3 a 12 dias. Esse período vai desde 
a sua inoculação na pele, durante o repasto sanguíneo pelo vetor infectado, até o 
início dos sintomas (PLOURDE & BLOCH, 2016). A sintomatologia ocasionada pela 
infecção ocorre em cerca de 20% dos casos e apresenta-se de forma inespecífica 
devido à similaridade com os sintomas ocasionados por outras arboviroses, 
especialmente Chikungunya e Dengue (GRARD et al., 2014; MOULIN et al., 2016; 
MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2017b). 
A infecção por esse vírus geralmente ocasiona uma doença autolimitada de 
evolução branda e atinge todas as faixas etárias de ambos os sexos (DUFFY et al., 
2009; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015a). Os sintomas comumente relatados incluem 
erupção cutânea maculopapular (pescoço, rosto, tronco e braço que se espalha para 
as extremidades, atingindo mãos e pés), febre baixa (37,4 ° C - 38,0 ° C), hiperemia 
conjuntival sem prurido, artralgia (intensidade leve a moderada), mialgia, fadiga e 
cefaleia (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015b; PLOURDE & BLOCH, 2016; JAVED et al., 
2017). Quando comparada a outras doenças exantemáticas como dengue, 
30 
 
 
chikungunya e sarampo, a sintomatologia ocasionada pelo vírus Zika provoca um 
exantema maculopapular mais acentuado e hiperemia conjuntival na maioria dos 
casos (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015a). Os pacientes podem também apresentar, 
com menos frequência, dor retro-orbital, anorexia, vômitos, diarreia, dor abdominal e 
aftas (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2016). 
 
1.5.1 Complicações graves 
 
Foram relatados casos de paciente que apresentaram complicações 
neurológicas tais como: encefalite, meningoencefalite, parestesia, paralisia facial e 
mielite, casos de púrpura trombocitopênica, danos oftalmológicos, cardíacos e 
genitouninários e casos de hematoespermia (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2016; 
PLOURDE & BLOCH, 2016). Além desses casos, a infecção pelo vírus Zika também 
está relacionada com casos de Síndrome de Guillain-barré (SGB) e microcefalia. 
 
1.5.1.1 Síndrome de Guillain-barré (SGB) 
 
Um aumento do número de casos de Síndrome de Guillain-barré (SGB) foi 
relatado tanto na Polinésia Francesa quanto no Brasil após surtos de infecção pelo 
vírus Zika. Essa síndrome, de etiologia auto-imune, provoca inflamação e 
desmielinização dos nervos periféricos de modo ascendente,progressivo e simétrico. 
Ocorre geralmente entre duas e três semanas após infecções por microrganismos, 
tanto vírus quanto bactérias (BOLAN et al., 2007; KRAUER et al., 2017). Clinicamente, 
o paciente apresenta incialmente formigamentos nos membros inferiores, fraqueza 
muscular que pode levar a paresia (perda dos movimentos), em seguida, a doença 
progride para a porção superior, atingindo os músculos respiratórios e provocando 
consequentemente falência respiratória (BOLAN et al., 2007; CIEVS, 2016). 
Casos de Síndrome de Guillain-Barré foram relatados em associação com 
outros flavivírus, tais como dengue, vírus do Nilo Ocidental, Vírus da Encefalite 
Japonesa e após a vacinação para a prevenção da febre amarela. Além dos relatos 
associados à alfavírus, como o vírus Chikungunya (CIEVS, 2016; KRAUER et al., 
2017). 
31 
 
 
 Atualmente, sabe-se da existência de mimetismo molecular entre epítopos 
presentes na poliproteína do ZIKV e proteínas humanas que explica a ocorrência 
dessa Síndrome após a infecção por esse vírus (LUCCHESE & KANDUC, 2016; 
KRAUER et al., 2017). 
 
1.5.1.2 Síndrome Congênita do Zika (SCZ) 
 
A síndrome congênita do Zika é caracterizada pela presença da microcefalia, 
juntamente com outras anomalias no sistema nervoso central, alterações oculares e 
auditivas, calcificações cerebrais e insuficiência placentária com restrição do 
crescimento fetal (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2017b; COYNE & LAZEAR, 2016). 
A microcefalia é definida como a medida do perímetro cefálico (PC) com um valor 
de dois desvios-padrão abaixo da média para idade gestacional e sexo do recém-
nascido. Em casos de microcefalia severa considera-se três desvios-padrão abaixo 
da média. Atualmente, o Ministério da Saúde, adotou a medida estabelecida pela 
Organização Mundial de Saúde (OMS) que considera 32 cm (percentil 2.6 para 
meninos e 5.6 para meninas) a medida padrão mínima para o PC do recém-nascido 
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2016; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015b) (Figura 5). Apesar 
da microcefalia constituir o principal sinal clínico da Síndrome, alguns distúrbios 
neurológicos e oculares congênitos podem ocorrer sem a presença da microcefalia 
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2017b; COYNE & LAZEAR, 2016). 
Sabe-se que o primeiro trimestre gestacional está mais associado aos casos de 
microcefalia e outros distúrbios congênitos devido a embriogênese cerebral, porém, o 
ZIKV também é capaz de ocasionar malformações em fases mais tardias da gestação 
(segundo e terceiro trimestre), mas com riscos menores (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 
2017b; COYNE & LAZEAR, 2016). 
 
 
 
 
32 
 
 
 
Fonte: Adaptado DE SILVA et al. (2017). 
 
1.5.1. 2. 1 Associação Zika e microcefalia 
 
 O estudo realizado por Rasmussen et al. (2016) analisou os critérios 
elaborados pelo teratologista Thomas Shepard a fim de avaliar a associação do vírus 
com distúrbios neurológicos. Desse modo, foi visto que essa associação é explicada 
pelos três critérios necessários para identificar um agente teratogênico, são eles: 
a) A exposição ao agente deve ocorrer em um momento fundamental do 
desenvolvimento fetal. As anomalias congênitas e a microcefalia ocorrem após 
a infecção materna no primeiro trimestre de gravidez, que corresponde ao 
período de desenvolvimento cerebral; 
b) A sintomatologia clínica deve ser padrão, ou seja, deve ocasionar anomalias 
específicas ou uma síndrome estabelecida. É observada a ocorrência da 
Síndrome congênita do Zika que possui padrões clínicos bem definidos; 
c) A exposição é um evento raro que ocasiona anomalias raras. Assim como a 
microcefalia é um evento raro, a infecção em viajantes também é considerada 
um evento raro. 
Essa associação também foi comprovada por meio de diversos estudos realizados 
no Brasil. Foi detectada a presença do RNA viral no líquido amniótico de mulheres 
Figura 5. Perímetro cefálico (PC) de um recém-nascido sem microcefalia (PC ≥ 32 cm), com 
microcefalia (PC com dois desvios-padrão abaixo da média) e microcefalia severa (PC com três 
desvios-padrão abaixo da média). 
33 
 
 
grávidas cujos fetos apresentavam microcefalia e calcificações cerebrais, e que 
relataram sintomas compatíveis com uma doença exantemática durante a gravidez. A 
infecção pelo vírus Zika também foi confirmada após óbitos ocorridos logo após o 
nascimento em três neonatos com microcefalia e em outros dois que apresentavam 
malformações congênitas (OLIVEIRA et al., 2016; RASMUSSEN, et al., 2016). 
 
1.6 Patogênese 
 
Poucas informações sobre a patogênese estão disponíveis, porém, estudos 
mostraram a importância da imunidade inata e celular no desfecho da infecção pelo 
vírus Zika. 
Hamel e colaboradores (2015) constataram que a replicação do vírus Zika 
estimula a produção de interferon (IFN) que é uma importante citocina da resposta 
imune inata e um importante inibidor da replicação viral. Além disso, ensaios in vivo 
realizados em camundongos knockout para IFN mostraram uma maior 
susceptibilidade à infecção pelo ZIKV (MCARTHUR, 2017). Em relação as barreiras 
físicas que também compõe a resposta imune inata, foi observado que o vírus Zika é 
capaz de se replicar em fibroblastos dérmicos, queratinócitos epidérmicos e em 
células dendríticas humanas, isso porque o vetor ao realizar o repasto sanguíneo 
inocula o vírus na derme e epiderme. A formação de autofagossomos, importante 
mecanismo imune, foi observada na infecção ocasionada pelo ZIKV. Porém, assim 
como outros flavivírus, inclusive como o DENV, a produção de autofagossomos 
aumentou a replicação do vírus Zika (HAMEL et al., 2015). 
Em relação a resposta imune adquirida, as informações atuais mostram a 
importância das células T e células B na infecção pelo ZIKV. Tanto diferentes perfis 
de células TCD4+ (Th1, Th2, Th9 e Th17) quanto as células TCD8+ participam da 
resposta imune induzida pelo vírus (TAPPE et al., 2016; MCARTHUR, 2017). 
A produção de anticorpos, pelos plasmócitos que derivam das células B, auxilia 
tanto na resolução da infecção pois neutralizam fortemente epítopos presentes na 
proteína do envelope viral (E) (SAPPARAPU et al., 2016) quanto pode aumentar a 
gravidade da infecção ocasionada pelo ZIKV devido a presença de anticorpos 
34 
 
 
heterólogos. Estudos in vitro demonstraram uma maior carga viral na infecção pelo 
ZIKV, ocasionada pela endocitose mediada via receptor Fc, em indivíduos com 
infecção precendente por DENV (MCARTHUR, 2017). Esse mecanismo pode ser 
explicado pela teoria da infecção sequencial proposta por Halstead (1988). Essa teoria 
sugere que anticorpos heterólogos reconhecem epítopos virais similares, formam 
imunocomplexos e estes, são reconhecidos por receptores Fc presentes em 
monócitos e macrófagos, o que provoca a amplificação da infecção nessas células 
imunes. Além disso, existe a suspeita da associação da produção de autoanticorpos 
para gangliosídeos, com a patogenia ocasionada pela Síndrome de Guillain-barré 
(SGB), microcefalia e lesões oculares em recém-nascidos (HOMAN et al., 2016). 
 
1.7 Diagnóstico 
 
 Em razão do diagnóstico clínico da doença não ser específico (FAYE et al., 
2008), devido ao amplo espectro de manifestações clínicas e a sobreposição clínica 
com outros arbovírus circulantes, como Dengue e Chikungunya, as técnicas de 
diagnóstico molecular são necessárias e são as mais comumente utilizadas para 
confirmar a infecção pelo ZIKV (GOURINAT et al., 2015; PLOURDE & BLOCH, 2016) 
 As técnicas moleculares de transcrição reversa seguida da reação em cadeia 
pela polimerase (RT-PCR) e/ou de transcrição reversa seguida da reação em cadeia 
pela polimerase em tempo real (qRT-PCR) permitem o diagnóstico confirmatório, 
através da detecção do RNA viral durante a fase aguda da doença (FAYE et al., 2013; 
GOURINAT et al., 2015). A RT-PCR é específica, rápida e sensível (FAYE et al., 
2008), já a qRT-PCR possui maior precisão, sensibilidade, rapidez (ARAÚJOet al., 
2009) e possibilita a quantificação viral, tornando possível a correlação com a 
sintomatologia clínica apresentada pelo paciente (WHO, 2009). O material genético 
viral pode ser detectado em uma ampla variedade de materiais como: soro, plasma, 
urina, saliva, líquido, amniótico, sêmen e líquor (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015c; 
MANSUUY et al., 2016; WAGGONER & PINSKY, 2016). A saliva mostrou-se útil para 
aumentar a taxa de detecção viral durante a fase aguda (PLOURDE & BLOCH, 2016). 
A urina, possibilita o diagnóstico em até 20 dias após a viremia, até mesmo quando o 
vírus não é mais detectável na saliva (WAGGONER & PINSKY, 2016). O sêmen 
35 
 
 
permite a detecção do RNA viral por um maior período de tempo, em cerca de 60 dias. 
Além disso, o vírus mostrou-se capaz de se replicar em células prostáticas o que pode 
permitir a presença do vírus por um período ainda maior no sêmen (MANSUUY et al., 
2016; SPENCER et al., 2017). 
 O diagnóstico confirmatório a partir do isolamento do vírus em cultura é mais 
comumente realizado em laboratórios de pesquisa porque é um processo demorado 
e necessita de maior experiência profissional, não sendo utilizado na rotina clínica 
(LELAND & GINOCCHIO, 2007; WAGGONER & PINSKY, 2016). Para o isolamento, 
o vírus Zika pode ser inoculado em cérebros de camundongos, assim como, pode ser 
cultivado em várias linhagens celulares: células de rim de macaco (Vero), rim de 
macaco Rhesus (LLC-MK2), Aedes pseudoscutellaris (MOS61 ou AP-61) e de Aedes 
albopictus (C6 / 36) (WAGGONER & PINSKY, 2016). 
 Os imunoesaios utilizando conjugados tais como o ELISA (do inglês: Enzyme 
Linked Immuno Sorbent Assay) ou a imunofluorescência possibilitam a detecção dos 
anticorpos IgM ou IgG específicos para o vírus, a partir de 5 a 6 dias após o 
aparecimento dos sintomas (PAHO, 2015a). Concluir o diagnóstico por meio desses 
imunoensaios, em areás de co-circulação com outros flavivírus (especialmente 
DENV), é difícil devido à reatividade cruzada que dificulta a especificidade desses 
testes e que ocasiona também resultados falsos-positivos (MUSSO & GUBLER, 2016; 
PLOURDE & BLOCH, 2016). 
Os achados em exames laboratoriais de rotina, encontrados em pacientes com 
a infecção pelo vírus zika, são inespecíficos o que torna o diagnóstico difícil e 
inconclusivo. O paciente pode apresentar linfopenia e neutropenia leves e uma 
trombocitopenia de leve a moderada. Elevações leves na proteína C reativa, 
fibrinogênio, ferritina, lactato desidrogenase sérica e enzimas hepáticas também 
podem ser detectadas (PLOURDE & BLOCH, 2016). 
 
1.8 Tratamento atual e perspectivas 
 
 Não há medicamentos disponíveis para o tratamento da infecção pelo ZIKV, os 
medicamentos utilizados apenas auxiliam na redução dos sintomas. Para controlar a 
36 
 
 
febre e as dores, o acetaminofeno (paracetamol) ou dipirona são utilizados. Os anti-
histamínicos são utilizados para minimizar o exantema maculopapular. O ácido 
acetilsalicílico e outras drogas anti-inflamatórias são contra-indicados devido a 
dificuldade do diagnóstico clínco diferencial em relação a dengue o que poderia 
aumentar o risco de complicações hemorrágicas (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2016). 
Estudos testaram compostos antivirais já existentes como o sofosbuvir que é 
utilizado para o tratamento da hepatite. Os resultados dos testes mostraram que esse 
medicamento inibiu a replicação do vírus Zika. Outros compostos com propriedades 
antivirais como a cloroquina (antipalúdico) e a azitromicina (antibacteriano) também 
foram testados. Foi visto que a cloroquina atuou nos estágios iniciais da infecção viral 
e a azitromicina inibiu a replicação viral e evitou os efeitos citopáticos ocasionados 
pelo vírus em células da glia (HAMER et al., 2017; MCARTHUR, 2017). O 
medicamento ideal teria que promover a redução da carga viral, reduzir os sintomas 
e assim, proteger o feto em desenvolvimento de complicações neurológicas 
(MCARTHUR, 2017). 
 Atualmente, não há vacina disponível para a prevenção contra a infecção 
ocasionada pelo vírus Zika. Um total de 45 vacinas encontram-se em várias fases de 
desenvolvimento e estão sendo avaliadas, desse total seis já estão na fase I de testes 
clínicos em humanos. Essas seis vacinas estão sendo desenvolvidas com diferentes 
tecnologias: vírus inativado, peptídeo sintético, uma de RNA, duas de DNA e uma 
recombinante. Após a fase I, restam mais duas fases de avalição até sua 
disponibilidade à população, o que demonstra o rápido avanço no desenvolvimento 
desses ensaios (FERNANDEZ & DIAMOND, 2017; MCARTHUR, 2017). 
 
37 
 
 
1.9 Epidemiologia 
 
1.9.1 Epidemiologia no Mundo 
 
 Até 2006, o vírus Zika era endêmico apenas na África e Sudeste Ásia, com 
menos de 40 casos de infecção descritos na literatura desde seu primeiro isolamento 
em 1947 (IOOS et al., 2014; BARBOZA et al., 2008). 
A emergência desse vírus foi evidenciada a partir de 2007 (GRARD et al., 2014) 
quando ocorreu a primeira epidemia fora da área endêmica (África e Ásia) (DUFFY et 
al., 2009; CIEVS, 2015). Inúmeros casos de infecção pelo vírus foram notificados na 
ilha de Yap, localizada nos Estados Federados da Micronésia (Oceano Pacífico) 
(DUFFY et al., 2009). Durante o surto, foram relatados 185 casos suspeitos, destes, 
49 foram classificados como laboratorialmente confirmados e 59 como prováveis 
devido a presença de anticorpos neutralizantes (DUFFY et al., 2009). A presença do 
ZIKV nessa ilha isolada demonstrou que o comércio e viagens possibilitam a 
expansão do vírus para longas distâncias (HAYES, 2009). 
 Em 2013, o ZIKV ocasionou uma grande epidemia na Polinésia Francesa que 
é um território pertencente a França localizado no Oceano Pacífico. A Polinésia 
Francesa possui 118 ilhas e uma população estimada em 268.270 habitantes. Todos 
os arquipélagos da Polinésia francesa foram atingidos pela epidemia (ECDC, 2014; 
MUSSO & GUBLER, 2016). Estima-se que durante o surto, 32.000 habitantes (11,5% 
da população) adquiriram a infecção. Esse grande surto ocorreu, provavelmente, 
devido a presença de uma população imunologicamente susceptível e a alta 
densidade de vetores competentes presentes nesse território (MALLET, VIAL & 
MUSSO, 2015; MUSSO & GUBLER, 2016). 
 A partir da Polinésia Francesa, o vírus atingiu inúmeras ilhas do pacífico: Nova 
Caledônia, Ilhas Cook, Ilhas Salomão, Vanuatu, Fiji, Samoa e Ilha de Páscoa nos anos 
de 2014 e 2015 (MALLET, VIAL & MUSSO, 2015; MUSSO & GUBLER, 2016). Após 
a introdução no Brasil, no ano de 2015, o vírus se disseminou, atingindo vários países 
do continente Americano (SAIZ et al., 2017). Na Europa, até o início de 2017, apenas 
38 
 
 
casos importados foram constatados na França, Espanha, Reino Unido e Bélgica 
(SPITERI et al., 2017) (Figura 6). 
 
Fonte: Adaptado HILLS, FISCHER & PETERSEN (2017). 
 
1.9.2 Epidemiologia nas Américas 
 
 O primeiro relato do ZIKV no continente Americano ocorreu no início de 2014, 
na Ilha de Páscoa (território Chileno localizado no Oceano Pacífico) no qual 89 casos 
suspeitos foram notificados, destes, 51 casos foram confirmados por RT-PCR. 
(ECDC, 2014b; TOGNARELLI et al., 2016). Supõem-se que sua introdução ocorreu, 
provavelmente, durante o Festival de Tapati que ocorre anualmente nessa ilha e atraiu 
visitantes provenientes de locais onde o vírus circulava como a Polinésia Francesa e 
Ilhas do Pacífico (MUSSO & GUBLER, 2016). 
 Em maio de 2015, a circulação do vírus Zika foi confirmada no Brasil (IKEJEZIE, 
et al., 2017). No mês de outubro de 2015, o vírus foi detectado em outro país da 
América do Sul, a Colômbia e em seguida, foi detectado em outros 12 países e 
territórios pertencentes a América e Caribe: Suriname, Venezuela, Guatemala, 
Honduras, México, Paraguai, Panamá, Guiana Francesa, El Salvador, Haiti, Porto 
Rico e Martinica (MUSSO & GUBLER, 2016). A rápida disseminação do vírus no 
Figura 6. Mapa do mundo demonstrandocirculação do ZIKV até março de 2017. 
39 
 
 
continente Americano pode ser explicada pelo elevado fluxo de viagens, presença de 
um vetor competente associado ao clima que permite sua manutenção e proliferação 
e uma população imunologicamente susceptível (IKEJEZIE et al., 2017) 
Desde sua introdução em 2015, a maioria dos casos no continente Americano 
foram notificados na América do Sul, com 70% dos casos relatados, seguido do Caribe 
com 21% dos casos. Um menor número de notificações foi observado na América 
Central e do Norte, com um percentual de 9% e 1%, respectivamente (MUSSO & 
GUBLER, 2016; HILLS, FISCHER & PETERSEN, 2017). 
 
1.9.3 Epidemiologia no Brasil 
 
 A ocorrência do vírus Zika no Brasil, foi relatada em maio de 2015 
(HENNESSEY et al., 2016). Existem três hipóteses para a introdução do vírus no país. 
A primeira hipótese sugere que o vírus Zika teria sido introduzido durante a Copa do 
Mundo FIFA Brasil 2014TM, realizada durante os meses de junho e julho; já que esse 
evento esportivo intensificou o fluxo de pessoas vindas de diversos países com 
diferentes contextos epidemiológicos e teria possibilitado a introdução de agentes 
etiológicos de doenças transmissíveis (SVS, 2014). A segunda hipótese sugere que a 
introdução do vírus teria ocorrido, em agosto de 2014, durante Campeonato Mundial 
de VA’A Sprint de canoagem sediado no Rio de Janeiro, onde recebeu competidores 
de várias partes do mundo, inclusive de quatro países do Pacífico (Polinésia Francesa, 
Nova Caledônia, Ilhas Cook e Ilha de Páscoa) que apresentaram circulação do vírus 
em 2014 (MUSSO, 2015). A hipótese mais recente sugere que o vírus teria sido 
introduzido durante a Copa das Confederações, em junho de 2013. Está hipótese é 
reforçada pelo estudo realizado por Faria e colaboradores (2016) que através de 
análises filogenéticas estimaram que o ancestral dos sete isolados brasileiros do 
ZIKV, avaliados nesse estudo, teria sido introduzido no país no período compreendido 
entre agosto de 2013 e abril de 2014 (FARIA et al., 2016). 
 A circulação do ZIKV foi confirmada no Brasil, através da detecção do genoma 
viral por meio de métodos moleculares, em maio de 2015 nos municípios de Natal (Rio 
Grande do Norte) e Sumaré (São Paulo) (CIEVS, 2015; ZANLUCA et al., 2015). Nesse 
40 
 
 
mesmo ano, o vírus foi detectado na Bahia, onde um total de 24 amostras foram 
analisadas e sete foram positivas para o vírus (CAMPOS, BANDEIRA & SARDI, 2015). 
Casos de infecção pelo vírus Zika também foram confirmados, logo em seguida, nos 
estados da Paraíba, Alagoas, Maranhão, Rio de Janeiro, Pará e Pernambuco, sendo 
neste último observado um aumento de casos de microcefalia (VASCONCELOS, 
2015; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2017a). 
 Em 2016, um total de 216.207 casos suspeitos foram notificados no Brasil. No 
ano seguinte, uma grande redução do número de casos prováveis foi observada, no 
qual foram constatados 17.321 casos, destes, 8.703 (50,2%) foram confirmados. As 
maiores incidências no ano de 2017, foram constatadas nas regiões Norte e Centro-
Oeste do País (SVS, 2017). 
 
1.9.4 Epidemiologia no Rio Grande do Norte 
 
 No final do ano de 2014, a Secretaria de Estado e de Saúde Pública 
(SESAP/RN) constatou no Estado casos de uma síndrome exantemática em alguns 
municípios do RN. Para o esclarecimento dessa síndrome, foram realizados exames 
para a investigação de outras doenças exantemáticas tais como: dengue, rubéola, 
sarampo, Parvovírus b19 e Chikungunya, porém, nada foi constatado (SESAP, 
2015a). 
A circulação do vírus no Brasil foi primariamente detectada em maio de 2015, 
no Rio Grande do Norte no munícipio de Natal e logo em seguida, no município de 
São Gonçalo do Amarante (SESAP, 2015b; ZANLUCA et al., 2015). No final desse 
ano, 8.743 casos suspeitos foram notificados, desses, 113 casos foram confirmados 
(SESAP, 2016). Em 2016 (janeiro a novembro), 5.971 casos suspeitos foram 
notificados e 205 casos confirmados. Durante o mesmo período em 2017, apenas 460 
casos foram notificados e 12 confirmados, caracterizando o ano de 2017 como não 
epidêmico no Estado (SESAP, 2017). 
 
41 
 
 
 
1.9.5 Epidemiologia associada a distúrbios neurológicos 
 
Em outubro de 2015 foi observado um aumento do número de casos de 
microcefalia no Estado do Pernambuco, e posteriormente em vários outros Estados 
do Nordeste do Brasil. Em virtude do aparecimento dessa condição neurológica 
coincidir com o mesmo período do surto de infecção por Zika vírus, a associação da 
infecção com o aumento de casos de microcefalia congênita, foi postulada. No mês 
seguinte, o Ministério da Saúde decretou situação de emergência e confirmou a 
relação causal entre o aumento da ocorrência de microcefalia e a infecção materna 
pelo ZIKV durante a gestação (PAHO, 2015b; MINISTÉRIO DA SÁUDE, 2017; CDN, 
2016). No início do ano de 2016, a Organização Mundial de saúde (OMS), declarou 
que foi firmado um consenso científico associando a infecção ocasionada pelo vírus 
Zika com a microcefalia, Síndrome de Guilain Barré (SGB) e outras malformações 
congênitas cerebrais (KRAUER et al., 2017). 
Na Polinésia Francesa, um estudo retrospectivo relatou o aumento do número 
de casos de recém-nascidos com malformações congênitas após o surto ocorrido em 
2013, no qual foi constatado um aumento de até 20 vezes no número de casos de 
microcefalia (PANCHAUD et al., 2016; SAIZ et al., 2017). Outro estudo realizado 
nessa mesma localidade, estimou um risco 53,4 vezes maior da ocorrência de 
microcefalia em fetos de mães que tiveram infecção pelo vírus Zika, durante o primeiro 
trimestre de gestação (KRAUER et al., 2017). 
O aumento do número de casos da Síndrome de Guillain-Barré (SGB) foi 
relatada em diversos países cuja circulação vírus Zika foi confirmada, mas não em 
todos. Além do Brasil e da Polinésia Francesa, a Síndrome foi evidenciada em 
diversos países da América do Sul (Colômbia, Guiana Francesa, Venezuela e 
Suriname), América Central (Panamá, El Salvador, Haiti, Honduras, República 
Dominicana e Jamaica) e em territórios da América do Norte (Martinica e Porto Rico) 
(KRAUER et al., 2017). 
No ano de 2017, um total de 2.767 casos de microcefalia ou malformações no 
sistema nervoso central foram confirmados em 24 países e territórios do continente 
Americano (HILLS, FISCHER & PETERSEN, 2017). 
42 
 
 
No Brasil, o estudo realizado por Oliveira e colaboradores (2016) detectou um 
total de 574 casos de microcefalia e malformações congênitas, durante o período de 
1 de janeiro de 2015 a 7 de janeiro de 2016, logo após o surto de infecção pelo ZIKV. 
Esse estudo constatou um aumento do número de casos de microcefalia nos Estados 
da Bahia, Paraíba e Pernambuco onde as gestantes apresentavam histórico de 
doença exantemática precedente durante o primeiro trimestre de gravidez (OLIVEIRA 
et al., 2016). 
 No Rio Grande do Norte, área do presente estudo, desde 2014 casos suspeitos 
de microcefalia e/ou outras malformações relacionadas ao vírus Zika e outras 
infecções congênitas foram notificadas. O ano com maior número de nascimentos de 
crianças com microcefalia foi 2015, com 336 casos, seguido do ano de 2016, com 151 
casos e 2017, com 15 casos notificados (SESAP, 2017b). 
 
1.10 Diversidade genética 
 
 O vírus Zika se diversificou em duas principais linhagens circulantes, uma 
originária da África e a outra, proveniente do continente Asiático (HADDOW et al., 
2012), tendo apenas um único sorotipo viral (SAIZ et al., 2017) (Figura 7). 
43 
 
 
 
Fonte: Adaptado Haddow et al. (2012) 
O vírus Zika, provavelmente, surgiu em Uganda, na África, entre 1892 e 1943, 
se disseminou para a Malásia em 1945 e em seguida, atingiu as várias ilhas dos 
Estados Federados da Micronésia, localizada no Oceano Pacífico (FAYE et al., 2014). 
A partir dessa disseminação, a linhagem Africana sofreu alterações genéticas e 
originou a linhagem Asiática(FARIA et al., 2016; GONG, XU & HAN, 2017). No 
entanto, a divergência genética entre os clados africanos e asiáticos é baixa, cerca de 
11,7% (SLAVOV et al., 2016). A linhagem Asiática sofreu eventos evolutivos, 
provocando grandes surtos no Oceano Pacífico e nas Américas e ainda continua se 
expandindo geograficamente (MUSSO & GUBLER, 2016; GONG, XU & HAN, 2017). 
Uma das mutações que explicam a emergência dessa linhagem no continente 
Americano é a substituição do aminoácido Alanina por Valina na proteína não 
estrutural NS1 que aumentou a eficiência de transmissão do vírus dos humanos para 
os mosquitos, promovendo uma maior prevalência do vírus no vetor, o que aumentou 
as chances de transmissão (LIU et al., 2017b). 
Figura 7. Árvore filogenética demonstrando que o vírus Zika possui duas linhagens, uma Asiática e 
outra Africana. 
44 
 
 
Nas Américas, supõe-se que o vírus foi introduzido entre os meses de maio e 
dezembro do ano de 2013, a partir de uma única introdução de uma cepa de linhagem 
Asiática (FARIA et al., 2016), coincidindo com o período da Copa das Confederações. 
 
45 
 
 
2 JUSTIFICATIVA 
 
O Rio grande do Norte foi um dos primeiros Estados onde o vírus Zika foi 
detectado no Brasil (ZANLUCA et al., 2015). Desde sua detecção, em maio de 2015 
(SESAP, 2015b), o RN ainda notifica casos de doença exantemática branda (SESAP, 
2017) e casos graves de microcefalia e/ou outras malformações relacionadas ao vírus 
Zika (SESAP, 2017b). Esses fatores, juntamente com a hipótese de sua possível 
introdução no Brasil durante a Copa das Confederações (2013) e a escassez de 
trabalhos disponíveis sobre esse tema no Estado serviram de motivação para a 
realização desse estudo. 
Realizar a vigilância virológica no Estado é importante porque permite 
compreender a dinâmica da doença e assim, prevenir surtos futuros. Já o estudo 
filogenético permite associar as cepas circulantes no Estado com sua patogenicidade 
o que é importante para o entendimento dos casos graves. 
 
 
46 
 
 
3 OBJETIVOS 
 
3.1 Objetivo geral 
 
 Avaliar os aspectos epidemiológicos e filogenéticos do vírus Zika circulante no 
Estado do Rio Grande do Norte, durante o período de junho de 2013 a dezembro de 
2016. 
 
3.2 Objetivos específicos 
 
 Investigar a presença do vírus Zika em amostras de pacientes com sintomas 
compatíveis com infecção por esse patógeno; 
 Verificar a distribuição espaço-temporal dos casos de infecção por Zika no 
estado do Rio Grande do Norte; 
 Identificar o período do ano com maior incidência da infecção pelo vírus, 
durante todo o período do estudo; 
 Analisar a distribuição dos casos de Zika, em relação ao gênero e faixa etária; 
 Estimar a carga viral por tempo de doença nos pacientes, por dia de doença e 
por tipo da amostra analisada (soro/sangue total); 
 Caracterizar filogeneticamente os isolados do vírus Zika detectados no estado 
do Rio Grande do Norte; 
 Realizar a caracterização estrutural in silico da proteína do envelope (E) dos 
vírus isolados no Rio Grande do Norte durante o período desse estudo. 
 
47 
 
 
4 MATERIAL E MÉTODOS 
 
4.1 Tipo de estudo 
 
Trata-se de um estudo epidemiológico observacional transversal, 
predominantemente descritivo. 
 
4.2 Local do estudo 
 
O Rio Grande do Norte (RN) situa-se na Região Nordeste do Brasil, 
apresentando como limites geográficos, o Oceano Atlântico ao Norte e ao Leste, o 
Ceará ao Oeste e o Estado da Paraíba ao Sul (Figura 8). O Estado apresenta uma 
área total de 52.811,107 Km2 e uma população estimada em 3.507.003 habitantes 
(IBGE, 2017). O RN possui 167 municípios, distribuídos em quatro mesorregiões 
geográficas (Agreste Potiguar, Central Potiguar, Leste Potiguar e Oeste Potiguar) que 
estão subdivididas em 19 microrregiões, essas subdivisões apresentam similaridades 
em relação a aspectos humanos e físicos (SEPLAN, 2014). Apresenta quatro tipos de 
clima. Os climas árido e semiárido prevalecem na maior parte do território estadual e 
são responsáveis por baixos índices pluviométricos, já os climas sub-úmido e úmido 
promovem precipitações nas faixas litorâneas e nas áreas serranas do Estado 
(SEPLAN, 2014). Conhecer sobre as condições climáticas da região a ser estudada é 
essencial para o entendimento da dinâmica de transmissão das arboviroses porque 
fatores como temperatura, umidade e pluviosidade contribuem para a sobrevivência, 
desenvolvimento e proliferação do vetor (VIANA & IGNOTTI, 2013). 
 
48 
 
 
 
Figura 8. Localização do Estado do Rio Grande do Norte. 
Fonte: Autoria própria. 
 
4.3 Amostras Clínicas 
 
Foram analisadas 814 amostras, incluindo soro, sangue total, urina e/ou líquor 
de pacientes com sintomas de doença exantemática atendidos nos diversos Centros 
de Saúde e Hospitais da Rede pública e privada do Rio Grande do Norte. As amostras 
foram coletadas em até cinco dias após o início dos sintomas, correspondente ao 
período virêmico. Essas amostras foram enviadas ao Laboratório Central Doutor 
Almino Fernandes (LACEN/RN), juntamente com suas respectivas fichas de 
notificação compulsória que contém informações e dados clínicos dos pacientes. 
Posteriormente, foram encaminhadas ao Laboratório de Biologia Molecular de 
Doenças Infecciosas e do Câncer (LADIC-UFRN) onde foram processadas para 
análise molecular visando a detecção do genoma do vírus Zika. 
 
 
49 
 
 
4.4 Extração do RNA total 
 
A extração do RNA total das amostras clínicas foi realizada através do kit de 
extração QIAmp® Viral Mini Kit (QIAGEN, Inc., Valencia, EUA), de acordo com o 
protocolo descrito pelo fabricante. Resumidamente, a técnica foi executada da 
seguinte forma: 140 μL de cada amostra (soro ou sangue) foram incubados por 10 
min à temperatura ambiente juntamente com 560 μL do tampão de lise AVL e 5,6 μL 
do carreador de RNA. Ao término do tempo, 560 μL de etanol absoluto foram 
adicionados. A solução obtida foi homogeneizada, aplicada à coluna de sílica 
fornecida pelo kit (em duas vezes de 630 μL) e centrifugada. Posteriormente, as 
amostras foram lavadas com os tampões AW1 e AW2. O RNA retido na coluna de 
sílica foi eluído com 60 μL de tampão AVE e armazenado à -70ºC. 
 
4.5 Transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase em tempo 
real (qRT-PCR) para pesquisa do Vírus Zika 
 
 A técnica de transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase 
em tempo real (qRT-PCR) (sistema TaqMan®) foi utilizada para a detecção rápida e 
quantificação do vírus Zika. A qRT-PCR foi realizada em uma única etapa, esse 
procedimento evita a ocorrência de resultados falsos-positivos devido a contaminação 
das amostras, e utiliza oligonucleotídeos iniciadores e sondas marcadas com 
fluoróforos (POERSCH et al., 2005; WHO, 2009). As sondas utilizadas são 
complementares a uma sequência alvo e são marcadas com fluoróforos que emitem 
fluorescência no momento da amplificação e proporcionalmente a quantidade de 
produtos amplificados, permitindo a quantificação viral (STORCH, 2007). Essa técnica 
confirmatória é mais rápida, sensível e específica que a técnica de transcrição reversa 
seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) convencional e é ideal em 
áreas onde co-circulam diferentes arbovírus (TIEN et al., 2017) 
Para a detecção do ZIKV nas amostras, foi utilizado o protocolo de qRT-PCR 
descrito por Faye et al. (2013) no qual utiliza dois iniciadores consensuais forward e 
reverse (Zika_qRT_F e Zika_qRT_R) a 200 nM, complementares as sequências dos 
genes que codificam a proteína NS5 que é a mais conservada do gênero Flavivirus e 
50 
 
 
a sonda (Zika_qRT_P) a 125 nM complementar aos nucleotídeos conservados 
existentes nas cepas de ZIKV da Malásia, África e Micronésia (Tabela 1). 
 
Tabela 1. Relação dos oligonucleotíodeos utilizados na transcrição reversa seguida da reação em 
cadeia pela polimerase em tempo real (qRT-PCR) para detecção do vírusZika (Y = T ou C, R = A ou 
G). 
Tipo de oligonucleotídeo 
(sentido) 
Sentido da sequência (5’ – 3’) Posição no 
genoma 
Primer Zika_qRT_F (+) AARTACACATACCARAACAAAGTG GT 9271–9297 
Primer Zika_qRT_R (-) TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG 9352–9373 
Sonda Zika_qRT_P FAM-CTYAGACCAGCTGAAR-BBQ 9304–9320 
Fonte: FAYE et al., 2013. 
 
A mistura de reagentes para a reação da qRT-PCR foi realizada para cada 
amostra estudada da seguinte forma: em uma placa de 96 poços 
(AppliedBiosystems®) foram adicionados 2,5 μL do TaqMan FAST 1-Step Master Mix 
(2x) (AppliedBiosystems, Foster City, Usa), 0,2 μL do primer Zika_qRT_F (Invitrogen, 
USA), 0,2μL do primer Zika_qRT_R (Invitrogen, USA), 0,2 μL da sonda Zika_qRT_P 
(AppliedBiosystems®) e 1,9 μL de água livre de nucleases (Promega, Madison, USA). 
Após a preparação desses 5 µL de mistura para a reação, foram alíquotados 5 µL do 
RNA previamente extraído (Tabela 2). 
A Placa de 96 poços foi levada ao equipamento ABI Prism 7500 Fast 
(AppliedBiosystems®) e a reação ocorreu de acordo com os seguintes parâmetros de 
termociclagem: 1 ciclo para ativação enzimática da transcriptase reversa (50ºC por 5 
minutos), 1 ciclo para a inativação enzimática e desnaturação inicial (95ºC por 20 
segundos), 40 ciclos de desnaturação (95ºC por 15 segundos), anelamento (60ºC por 
1 minuto), extensão (60ºC por 1 minuto) e um período de extensão final (60ºC por 1 
minuto). 
 
 
 
 
51 
 
 
Tabela 2. Relação dos reagentes utilizados na transcrição reversa seguida pela reação em cadeia pela 
polimerase em tempo real (qRT-PCR) para pesquisa do vírus Zika. 
 
Fonte: Autoria própria. 
Os valores de Ct (Cycle Threshold), fornecidos pela qRT-PCR, foram utilizados 
para selecionar as amostras que foram submetidas ao sequenciamento. Sabendo que 
o valor de Ct é inversamente proporcional a carga viral, 18 amostras com baixos 
valores de Ct e provenientes de diferentes municípios, foram selecionadas para a 
realização do sequenciamento. 
Devido à dificuldade na realização do sequenciamento utilizando a amostra do 
paciente, a estratégia de isolamento viral em cultura de células C6/36 de Aedes 
albopictus foi utilizada para promover o aumento da carga viral e assim, facilitar o 
sequenciamento. Para isso, cinco amostras foram selecionadas para o isolamento 
viral. 
 
4.6 Isolamento Viral 
 
 Para o isolamento viral, foram utilizadas células de Aedes albopictus clone 
C6/36 (Igarashi, 1978). Inicialmente, cinco amostras com baixo valor de Ct (Cycle 
Threshold) foram selecionadas e 15 µL, de cada uma dessas amostras, foram 
inoculados em cada garrafa de células C6/36 correspondente. Após a inoculação, 
todas as garrafas de células foram homogeneizadas para que as amostras atingissem 
todo o conteúdo celular. Em seguida, as garrafas foram incubadas por 1 hora à 
temperatura de 28 °C e homogeneizadas a cada 15 minutos. Após o término da 
incubação, o soro fetal bovino a 2% foi adicionado e as garrafas foram novamente 
incubadas à temperatura de 28 °C e observadas diariamente por um período de 10 a 
Reagentes 
Mistura para qRT-PCR 
(volume utilizado por reação) 
TaqMan FAST 1-Step Master Mix (2x) 2,5 µL 
Primer Zika_qRT_F 0,2 µL 
Primer Zika_qRT_R 0,2 µL 
Sonda Zika_qRT_P 0,2 µL 
Água livre de nucleases 1,9 µL 
52 
 
 
14 dias. As culturas positivas pela técnica de isolamento viral, ou seja, que 
apresentaram efeito citopático (ECP) foram posteriormente submetidas à qRT-PCR. 
 
4.7 Sequenciamento e Análise Filogenética 
 
4.7.1 Sequenciamento do gene do envelope 
 
A caracterização genética dos vírus Zika foi realizada a partir do 
sequenciamento do gene do envelope (E), através do método de Sanger et al. (1997) 
no qual utiliza dideoxinucleotídeos [ddA, ddC, ddG,ddT, (ddNTPs)] marcados com 
fluorescência que se incorporam a cadeia nascente de DNA e interrompem sua 
síntese. Após a reação de sequenciamento, vários fragmentos de DNA estarão com 
sua extremidade 3´ marcada com diferentes dideoxinucleotídeos que serão lidos no 
sequenciador automático e determinarão a sequência de interesse. 
 
4.7.1.1 Oligonucleotídeos iniciadores 
 
Utilizando a estratégia de primer walking, oligonucleotídeos iniciadores foram 
utilizados para amplificar cerca de 700 pb por região da proteína do envelope (E), 
sendo 300 pb de sobreposição entre as regiões. Nesse estudo, foram desenhados um 
total de cinco pares de oligonucleotídeos iniciadores, a fim de se obter o completo 
sequenciamento desse gene que fornece bons resultados filogenéticos (Faye et al., 
2014). 
Para o desenho desses primers foram coletadas no GenBank sete sequências 
do genoma completo do vírus Zika do Camboja, Filipinas, Colômbia, Pernambuco, 
Natal, Paraíba e Bahia e uma sequência referência da Uganda. Todas as sequências 
foram alinhadas no software Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 
(MEGA). Após a análise das sequências pelo software, o genoma completo da cepa 
de Natal (código de acesso GenBank: KU527068) foi selecionado e a região do 
envelope dessa cepa, contendo 1512nt, foi utilizada como alvo para o desenho dos 
primers. Todos os primers foram desenhados com um percentual de 45-50% de 
53 
 
 
Guanina/Citosina (G/C) e a uma temperatura de melting (TM) de 58 ºC. Após o 
desenho manual dos primers, as sequências foram colocadas no site RNA fold 
(Institute for Theoretical Chemistry | University of Vienna) que tem a finalidade de 
prever a formação de estruturas secundárias. Em seguida, cada um dos pares foi 
analisado separadamente no software AutoDimer desenvolvido por Vallone & Butler 
(2004) que calcula a formação de dímeros. Os primers ainda foram avaliados pelo 
Primer Blast (National Center for Biotechnology Information, US) que verifica a 
especificidade de anelamento dos primers com o ZIKV in silico, os resultados 
mostraram que os primers não anelaram com outros flavívirus e nem com regiões do 
genoma humano (Tabela 3). 
 
 
Tabela 3. Oligonucleotídeos iniciadores desenhados para o sequenciamento do gene do envelope (E) 
do virus Zika. 
 
Fonte: Autoria própria. 
Região 
 
Primer sense A ( 5’ - 
3’) 
 
Primer sense B (5’- 
3’) 
Posição no 
genoma 
(KU527068.1) 
Produto 
(pb) 
TM 
(ºC) 
A/B 
 
1 
 
GTG GGA GTG CAT 
ACT ATA TG 
 
TCC GAA GCC ATG 
TCT GAT AT 
 
490- 1189 
 
699 
 
58 
2 
 
AGA TCT AGA AGA 
GCT GTG AC 
 
 
AAG GTA ATG GAA 
TGT 
CGT GG 
 
 
741-1650 
 
909 
 
 
58 
 
3 
AAA ATG ACC GGG 
AAG AGC AT 
 
ATT ACG GGG TTA 
GCG 
GTT AT 
 
1347-2071 724 
 
58 
 
4 
AGT CAA GAA GGA 
GCA GTT CA 
 
GGC TGT GGA TAA 
GAA 
GAT CA 
 
1755-2480 725 
 
58 
5 
TAC ATT GTC ATA 
GGA GTC GG 
 
CGT CAG TTG AAC 
TCC 
ATT CT 
 
2133-2750 
 
617 
 
58 
54 
 
 
4.7.1.2 Gradiente de temperatura 
 
 Para otimizar a reação de transcrição reversa seguida da reação em cadeia da 
polimerase (RT-PCR) para sequenciamento, um gradiente de temperatura foi 
realizado no termociclador modelo 22331 (Eppendorf AG, Hamburg, GER) a fim de se 
obter a melhor temperatura de anelamento para os primers desenhados. Para essa 
padronização foram utilizados microtubos de 200 µL correspondente a cada uma das 
regiões do envelope (1, 2, 3, 4 e 5), em seguida, foram adicionados 5 µL do primer 
sense e 5 µL do primer antisense a uma concentração de 10 µM, 1 μL da enzima 
AMV-RT (Promega, Madison, EUA), 25 µL de PCR Master Mix 2X (Promega Co, 
Madison, WI) e 9 µL de água livre de nucleases. Por fim, 5 μL do RNA extraído de um 
controle positivo de ZIKV foi aliquotado nessa mistura. O microtubo foi levado ao 
vórtex e logo após, ao termociclador onde as seguintes temperaturas foram ajustadas: 
51, 3 ºC; 53, 4 ºC; 55, 6 ºC; 57, 8 ºC; 59, 8 ºC; 61, 6 ºC; 62, 8 ºC e 63, 5 ºC. Os 
resultados do gradiente foram visualizados através de eletroforeses em gel de 
agarose a 1% em TBE 0,5X, por 60 minutos a 100v. Os resultados do gradiente 
visualizados através das eletroforesesem gel de agarose a 1%, mostraram que a 
melhor temperatura de amplificação foi 61,6 ºC. 
 
4.7.1.3 Síntese de cDNA 
 
 A síntese de cDNA foi realizada com o objetivo de promover uma maior 
economia e estabilidade do RNA das amostras selecionadas para o sequenciamento. 
O kit utilizado foi o High-Capacity cDNA Reverse Transcription kits 
(AppliedBiosystems®) e essa reação foi executada de acordo com as instruções do 
fabricante. O RNA total da amostra é convertido em cDNA através do uso de primers 
randômicos e da enzima transcriptase reversa. 
 O ensaio para a obtenção do cDNA foi realizado da seguinte forma: Em 
microtubos de 200 µL foram adicionados 2,0 µL de 10X RT Buffer (Applied 
Biosystems, Foster City, CA, USA), 0,8 µL de 25X dNTP Mix a 100 Mm (Applied 
Biosystems, Foster City, CA, USA), 2,0 µL de 10X RT Randon Primers (Applied 
Biosystems, Foster City, CA, USA), 1,0 µL da MultiScribeTM Reverse Transcriptase 
55 
 
 
(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) e 4,2 µL de água livre de nucleases. Em 
seguida, 10 µL do RNA extraído, foram adicionados aos 10 µL dessa mistura (Tabela 
4). Os microtubos foram levados ao termociclador modelo 22331 (Eppendorf AG, 
Hamburg, GER) e as amostras foram submetidas aos seguintes parâmetros de 
termociclagem: um ciclo a 25°C por 10 minutos, um ciclo a 37°C por 120 minutos e 
por fim, um ciclo a 85°C por 5 minutos. 
 
Tabela 4. Reagentes utilizados na reação de síntese de cDNA. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fonte: Autoria própria. 
 
4.7.1.4 PCR para Sequenciamento 
 
 Em um microtubo de 200 µL foram adicionados 5 µL do cDNA sintetizado, 5 µL 
do primer sense e 5 µL do primer antisense a uma concentração de 10 µM, 25 µL de 
PCR Master Mix 2X (Promega Co, Madison, WI) e 10 µL de água livre de nucleases. 
Para cada par de primer específico (sense e antisense), foi utilizado um microtubo de 
200 µL correspondente. Os microtubos foram submetidos à agitação no vórtex e 
levados ao termociclador modelo 22331 (Eppendorf AG, Hamburg, GER). 
 Inicialmente, o cDNA foi submetido a 30 ciclos de desnaturação a 94°C por 35 
segundos, hibridização a 61,6 °C por 1 minuto e extensão a 72°C por 2 minutos. Em 
seguida, foi submetido a um ciclo de 72 °C por 2 minutos para a extensão final. Após 
o término da PCR para sequenciamento, os produtos amplificados foram visualizados 
através de eletroforese em gel de agarose a 1% em TBE 0,5X, por 60 minutos a 100v. 
Reagentes Volume 
10X RT Buffer 2,0 µL 
25X dNTPs Mix (100Mm) 0,8 µL 
10X RT Randon Primers 2,0 µL 
MultiScribeTM Reverse Transcriptase 1,0 µL 
Água livre de nucleases 4,2 µL 
RNA 10 µL 
56 
 
 
4.7.1.5 Purificação do produto de PCR por extração de gel de agarose 
 
Quando mais de um amplicon (além do amplicon de interesse) foi visualizado 
no gel de agarose, realizou-se uma purificação do produto de PCR através da extração 
do amplicon específico a partir do gel de agarose. 
Primeiramente, uma eletroforose em gel de agarose a 0,7% a 100V foi 
preparada e 5 µL de GelRed™0,1% (Biotium), 5 µL de Blue/Orange Loading Dye, 6x 
(Promega, Madison, USA) e todo o volume da reação de PCR foi aplicado no gel de 
agarose. Após o término da corrida, o gel foi levado ao transiluminador de luz UV, os 
amplicons de interesse foram analisados e cortados com o auxílio de lâminas de bisturi 
estéreis. Cada região amplificada foi cortada com uma lâmina de bisturi nova. Os 
fragmentos cortados foram transferidos para tubos de 1,5 mL e a purificação do 
produto amplificado foi realizada a partir do kit comercial Gel Extraction (Qiagen, Inc., 
Valencia, CA) conforme protocolo estabelecido pelo fabricante. 
Para a purificação do produto amplificado, foram adicionados 300 µL do Buffer 
QG para cada 100 mg de gel no microtubo de 1,5 mL contendo o amplicon de 
interesse, em seguida, o microtubo foi levado ao termobloco para a incubação durante 
10 minutos a 50ºC, sendo submetido a homogeneização a cada 2-3 minutos com o 
auxílio do vórtex. Após o período de incubação, a dissolução do gel foi verificada, 
assim como a cor da mistura que deveria estar amarela, semelhante a cor do tampão 
QG. Em seguida, 100 µL de isopropanol foram adicionados a amostra e o microtubo 
foi levado ao vórtex, toda a mistura foi aplicada na coluna fornecida pelo kit. A coluna 
foi submetida à centrifugação a 13.000 rpm por 1 minuto, o filtrado foi desprezado e 
500 µL do Buffer QG foi adicionado na coluna que foi centrifugada por mais 1 minuto. 
O filtrado foi novamente desprezado, foram adicionados 750 µL de Buffer PE e a 
coluna foi submetida a centrifugação por 1 minuto. O filtrado resultante foi desprezado 
e a amostra foi incubada durante 2-5 minutos e em seguida, centrifugada por mais 
duas vezes, durante 1 minuto. O liquído contido no tubo de coleta foi novamente 
desprezado e a coluna foi colocada em um microtubo de 1,5 mL. No centro da coluna 
foram aplicados 30 µL de Buffer EB e a mesma foi centrifugada por mais 1 minuto. O 
cDNA contido no microtubo após a centrifugação foi armazenado a - 20 ºC, até o 
momento de sua utilização. 
57 
 
 
Após essa purificação, esse produto purificado foi levado Laboratório de 
Biologia Molecular e Genômica (LBMG/UFRN), onde as etapas descritas a seguir 
foram realizadas. 
 
4.7.1.6 Purificação direta do produto de PCR 
 
O produto de PCR contendo amplicons únicos (após a visualização em 
eletroforese em gel de agarose) e o produto de PCR purificado a partir do gel de 
agarose foram levados ao Laboratório de Biologia Molecular e Genômica 
(LBMG/UFRN) onde foram purificados pelo kit ExoSAP-IT™ (ThermoFischer), de 
acordo com o protocolo descrito pelo fabricante. 
Esse ensaio de purificação enzimática possibilita a remoção de primers e 
nucleotídeos não utilizados na reação de PCR para sequenciamento. Essa purificação 
foi realizada da seguinte forma: Em banho de gelo, 5 μL do produto de PCR foram 
adicionados com 2 μL do reagente ExoSAP-IT™ (ThermoFischer), em seguida, essa 
mistura foi incubada por 15 minutos a 37 °C para que os primers e os nucleotídeos 
não utilizados na reação de PCR fossem degradados. Para inativar o reagente 
ExoSAP-IT ™ (ThermoFischer), a mistura foi novamente incubada a 80°C durante 15 
minutos. Após essas incubações o produto de PCR ficou pronto para uso e foi 
armazenado a - 20 ºC, até o momento de sua utilização. 
 
4.7.1.7 Quantificação de DNA 
 
 O DNA purificado foi quantificado por fluorescência através do kit Qubit® 
dsDNA HS (High Sensitivity). Seguindo as instruções do fabricante, todo o ensaio de 
quantificação foi realizado a temperatura ambiente (22-28 °C). Essa etapa de 
quantificação é essencial para determinar o volume de DNA que será utilizado na 
reação de sequenciamento. 
Para a quantificação, inicialmente, uma solução de trabalho foi preparada a 
partir da diluição 1:200 do dsDNA HS Reagente Qubit® no dsDNA HS Buffer Qubit®. 
Após o preparo, essa solução de trabalho foi aliquotada tanto nas amostras quanto 
58 
 
 
nos dois padrões disponibilizados no kit, totalizando um volume final de mistura de 
200 μL em cada um dos microtubos. Estes, foram homogeneizados no vórtex e 
incubados durante 2 minutos a temperatura ambiente (22-28 °C), para a posterior 
quantificação no Qubit® 2.0 Fluorometer (Carlsbad, CA). 
 
4.7.1.8 Reação de Sequenciamento 
 
 Essa reação foi realizada utilizando o kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing 
Ready Reaction” (Applied Biosystems, Foster City, CA) que possibilita o 
sequenciamento dos fragmentos amplificados em ambos os sentidos. Em um 
microtubo de 0,2 mL, foi adicionado 2 μL de Terminator Ready Reaction Mix, em 
seguida, 1,5 μL de Sequencig Buffer 5x, 2 μL de primer (sense ou antisense) a uma 
concentração de 5 Μm, a quantidade de cDNA colocada nessa reação foi determinada 
pelo processo de quantificação e o volume de água livre de nucleases foi adicionado 
até que a mistura atingisse um volume final de 10μL. 
 Os microtubos foram levados ao termociclador Mastercycler® epgradient 
(Eppendorf AG, Hamburg) e a solução foi submetida aos seguintes parâmetros de 
termociclagem: 1 ciclo de incubação a 96 ºC durante 1 minuto, 35 ciclos de 
desnaturação (96 ºC durante 15 minutos), hibridização (50 ºC durante 15 minutos) e 
de extensão (60 ºC durante 4 minutos). 
 
4.7.1.9 Purificação e precipitação de DNA para remoção de Dye terminators 
 
Todos os reagentes não utilizados na reação de sequenciamento tais como: 
íons, desoxinucleotídeos e dye terminators, devem ser removidos para que não 
interfiram na leitura realizada pelo sequenciador. Para isso, com base nas instruções 
fornecidas pelo fabricante, o kit BigDye® XTerminator™ Purification foi utilizado. 
Para a realização dessa técnica, inicialmente a Solução SAM™ que tem por 
finalidade otimizar o BigDye® XTerminator e estabilizar a amostra após o processo de 
purificação, foi adicionada no produto da reação de sequenciamento e essa mistura 
foi levada ao vórtex. Logo em seguida, a solução XTerminator, essencial para capturar 
59 
 
 
os dye terminators e os íons não utilizados na reação, foi adicionada e toda a mistura 
foi novamente levada ao vórtex. O processo homogeneização nessa técnica é 
fundamental para que as soluções realizem a purificação do produto da reação de 
sequenciamento. Após essa etapa, os microtubos foram levados à centrífuga e 10 μL 
do sobrenadante, foram aplicados em uma placa de 96 poços, na qual foi levada ao 
sequenciador Applied Biosystems ABI-3500 (Applied Biosystems, Foster City, CA). 
 
4.7.2 Caracterização genética 
 
4.7.2.1. Elaboração do banco de sequências nucleotídicas 
 
 As sequências completas do gene do envelope (E) do vírus Zika foram 
coletadas a partir do acesso ao Virus Variation, disponibilizado pelo NCBI 
(www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/viruses/variation/). Os critérios de exclusão, tais 
como, sequências sem autor, data e local foram aplicados porque impossibilitam a 
realização de uma análise filogeográfica plausível. Sequências recombinantes 
também foram excluídas porque nesses casos, inúmeras hipóteses evolutivas podem 
ser formuladas, o que torna difícil a fundamentação através dos modelos evolutivos 
utilizados (TWIDDY et al., 2003; WOROBEY et al., 1999). Após a coleta, as 
sequências foram renomeadas com siglas de duas letras do seu respectivo país de 
origem (definida pela Organização Internacional de Normalização (ISO) 3166-1 alfa-
2, disponível em: https://www.iso.org/obp/ui/#search), seguida do ano de isolamento 
e número de acesso ao GenBank. 
 
4.7.2.2 Análises de Sequências 
 
 A qualidade das amostras resultantes do sequenciamento foi analisada através 
do software Chromas 2.6.4 (Copyright © 1998-2017 Technelysium Pty Ltd). Todas as 
sequências foram alinhadas no site Clustal Omega (Copyright © EMBL-EBI 2017) e 
editadas manualmente, utilizando duas sequências referência coletadas no GenBank. 
60 
 
 
 Para realizar as análises filogenéticas, inicialmente, as sequências obtidas 
foram alinhadas com as sequências do Banco previamente elaborado (descrito no 
tópico 4.7.2.1) no Clustal Omega (Copyright © EMBL-EBI 2017), após o alinhamento, 
as árvores filogenéticas foram construídas no software MEGA 7 (disponível em: 
http://www.megasoftware.net/download_form), através do método estatístico de 
Máxima Verossimilhança, utilizando o modelo de substituição de Kimura-2 parâmetros 
e um valor de 1000 para o bootstrap. 
 
4.8 Construção da estrutura tridimensional da Proteína (E) 
 
 Com o auxílio do site do NCBI, um Blastp foi realizado com a sequência da 
proteína (E) da amostra 19 (Natal/RN) cujo gene foi completamente sequenciado. As 
sequências de aminoácidos da proteína (E) disponíveis no The Protein Data Bank 
(PDB), tanto de outros vírus Zika isolados quanto de outros flavivírus (Dengue, Vírus 
da Encefalite Japonesa e Vírus do Oeste do Nilo), que apresentaram maior identidade 
com a amostra 19 (Natal/RN), foram coletadas em formato FASTA. Em seguida, essas 
sequências foram inseridas no software Molecular Evolutionary Genetics Analysis 
version 7.0 (MEGA) que realizou o alinhamento dessas sequências. Após esses 
procedimentos, o programa Chimera 1. 12 (California, USA) foi utilizado para a 
predição da Proteína do envelope viral (E) dos vírus Zika circulantes no Estado. 
 
4.9 Análises epidemiológicas e estatísticas 
 
 Os dados contidos nas fichas de notificação compulsória foram analisados a 
partir do programa Microsoft Office 2017®. Para a construção dos gráficos e tabelas 
foram utilizados o Microsoft Office Excel® 2017 e o Microsoft Office Word® 2017, 
respectivamente. Os Mapas foram elaborados no Adobe illustrator (Copyright © 2017 
Adobe Systems Incorporated) para visualizar a dispersão geográfica do vírus no 
Estado. 
 As análises estatísticas foram realizadas através do software GraphPad Prism 
7 ©. Para as análises, valores de p<0,05 foram considerados como significativos e os 
61 
 
 
de p>0,05 foram considerados como não significativos estatisticamente. O teste exato 
de Fisher foi aplicado para a avaliação da infecção de acordo com o gênero. Para 
estimar a viremia ocasionada pela infecção do vírus Zika, os valores do Ct (Cycle 
Threshold) foram utilizados. Para analisar a correlação entre o Ct (Cycle Threshold) e 
o tempo de doença nos pacientes, o coeficiente de correlação de Spearman (R) foi 
utilizado. Já o teste de Mann Whitney, foi aplicado para avaliar os valores de Ct por 
dia de sintomas avaliados e por tipo de amostras analisadas (soro/sangue total). 
 
4.10 Considerações éticas 
 
 Este estudo foi submetido à apreciação e aprovado pelo Comitê de Ética em 
Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CAAE: 
51057015.5.0000.5537). 
 
 
 
62 
 
 
 
5 RESULTADOS 
 
5.1 Monitoramento do vírus Zika no Estado Rio Grande do Norte durante o 
período de junho de 2013 a dezembro de 2016. 
 
 Durante o período de junho de 2013 a dezembro de 2016, um total de 814 
amostras de pacientes foram analisadas. O vírus zika foi detectado em 73 amostras, 
evidenciando um percentual de detecção de 8,97% (73/814) do total de casos 
estudados. Ao analisarmos a incidência do vírus por ano, nenhum caso foi detectado 
de junho a dezembro de 2013 (0/101). Em 2014, o percentual de detecção foi de 
10,08% (12/119). No ano de 2015, observou-se uma maior incidência do vírus no 
Estado, no qual foi constatado um percentual de 21,48% (61/284), porém, nenhum 
caso foi detectado em 2016 (0/310) (Tabela 5). 
 
 
Tabela 5. Percentual de detecção do ZIKV por ano de estudo. 
Fonte: Autoria própria. 
 
 
 
 
 
 
 
Detecção do ZIKV por 
qRT-PCR /Ano 
junho a 
dezembro 
de 2013 
 
 
2014 
 
 
2015 
 
 
2016 
junho de 2013 a 
dezembro de 
2016 
Percentual de detecção 
(casos positivos/estudados) 
 
0% 
(0/101) 
 
 
10,08% 
(12/119) 
 
 
21,48% 
(61/284) 
 
 
0% 
(0/310) 
 
8,97% 
(73/814) 
63 
 
 
5.2 Distribuição geográfica dos casos de infecção por Zika no Rio grande do 
Norte, de junho de 2013 a dezembro de 2016. 
 
Com o auxílio das fichas de notificação compulsória, foi possível analisar a 
distribuição dos casos positivos nos municípios do Rio Grande do Norte. O Estado é 
dividido em 167 municípios, dos quais 69 foram estudados e a circulação do vírus foi 
detectada em 16 municípios (Figura 9). 
Fonte: Autoria própria. 
Dentre as quatro mesorregiões que dividem o Estado, a mesorregião que 
apresentou o maior número de casos confirmados foi a do Leste Potiguar com um 
percentual de 56,16% (41/73) do total de casos detectados. Os municípios com maior 
número de casos detectados foram Natal e Parnamirim, com 30,14% (22/73) e 19,18% 
(14/73), respectivamente. O percentual de detecção na mesorregião Central Potiguar 
foi de 22,91% (16/73) dos casos confirmados, sendo Guamaré o município com maior 
incidência, com umpercentual de 13,70% (10/73). A mesorregião Agreste Potiguar 
obteve um percentual de detecção de 19,18% (14/73) e o município de Nova Cruz, 
localizado nessa mesorregião, apresentou 9,59% (7/73) dos casos positivos. Nenhum 
Figura 9. Mapa do Rio grande do Norte demonstrando a distribuição dos casos estudados e com 
infecção confirmada pelo vírus Zika. 
64 
 
 
caso de infecção pelo vírus Zika foi detectado na Mesorregião do Oeste Potiguar 
(Tabela 6, Figura 10). 
 
Tabela 6. Percentual de detecção do vírus Zika por Mesorregião Potiguar. 
 
Fonte: Autoria própria. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Mesorregiões 
 
 
Municípios 
 
Casos 
positivos 
 
% de casos 
positivos 
% de detecção 
por Mesorregião 
(positivos/total de 
casos positivos) 
 Guamaré 
Caiçara do Rio do Vento 
10 
2 
10/73 (13,70%) 
2/73 (2,74%) 
 
Central Potiguar Galinhos 2 2/73 (2,74%) 22,91% (16/73) 
 Parelhas 1 1/73 (1,37%) 
 Acari 1 1/73 (1,37%) 
 Nova Cruz 7 7/73 (9,59%) 
 Passa e Fica 2 2/73 (2,74%) 
Agreste Potiguar Jandaíra 3 3/73 (4,11%) 19,18% (14/73) 
 São Pedro 1 1/73 (1,37%) 
 São Paulo do Potengi 1 1/73 (1,37%) 
 Natal 22 22/73 (30,14%) 
 
 
Leste Potiguar 
Parnamirim 
Ceará-Mirim 
Extremoz 
São Gonçalo do Amarante 
Macaíba 
14 
2 
1 
1 
1 
14/73 (19,18%) 
2/73 (2,74%) 
1/73 (1,37%) 
1/73 (1,37%) 
1/73 (1,37%) 
 
 
56,16% (41/73) 
Oeste Potiguar - 0 0% 0% 
Não Informados - 2 2/73 (2,74%) 2,73% (2/73) 
TOTAL 16 73 100% 100% 
65 
 
 
Fonte: Autoria própria. 
 
5.3 Distribuição espaço - temporal dos casos de infecção por Zika no Rio 
grande do Norte, de junho de 2013 a dezembro de 2016. 
 
O primeiro caso confirmado do ZIKV no Rio Grande do Norte ocorreu em julho 
de 2014 no município de Caiçara do Rio do Vento, nesse mesmo mês, o vírus foi 
também detectado no município de Galinhos. Nenhum caso de infecção pelo vírus foi 
detectado nos meses de agosto a outubro de 2014. Já nos meses de novembro e 
dezembro de 2014 o vírus foi detectado em Jandaíra, Guamaré e Macaíba. 
No ano de 2015, no período de janeiro a março o vírus foi detectado em: Natal, 
Acari, Guamaré, Passa e Fica, São Pedro, Parnamirim, Extremoz, Parelhas e São 
Paulo do Potengi. Durante os meses de abril a junho desse mesmo ano, a circulação 
do vírus foi constatada também nos municípios de Natal e Parnamirim, além dos 
municípios de Galinhos, Nova Cruz e São Gonçalo do Amarante. Amostras positivas, 
com dados incompletos da ficha de notificação compulsória, foram provenientes de 
Passa e Fica, Natal, Ceará-Mirim e Caiçara do Rio dos Vento (Figura 11). 
Figura 10. Mapa do Rio Grande do Norte indicando a distribuição dos casos confirmados de ZIKV por 
mesorregião potiguar. 
66 
 
 
 
Fonte: Autoria própria. 
 A análise mensal detalhada dos casos estudados e confirmados durante o 
período do estudo, permitiu constatar que o período de maior incidência da infecção 
pelo vírus Zika ocorreu de março a maio de 2015, com 23,29% (17/73), 8,22% (6/73) 
e 19,18% (14/73) dos casos positivos, respectivamente. Sendo março de 2015, o mês 
com maior número de casos confirmados, apresentando um percentual de 23,29% 
(17/73) (Figura 12, Tabela 7). A análise de proporção dos casos positivos e estudados 
por mês, informa que os meses de novembro e dezembro de 2014 e fevereiro de 2015, 
obtiveram os maiores valores de proporção (Tabela 7). 
 
 
 
 
Figura 11. Fluxograma mostrando a distribuição espaço-temporal da infecção pelo vírus Zika no Estado 
do Rio Grande do Norte. 
67 
 
 
 
Fonte: Autoria própria. 
 
Tabela 7. Análise mensal quantitativa por ano dos casos de infecção pelo vírus Zika no Estado do Rio 
Grande do Norte. 
Ano 
 
Meses 
 
Casos 
estudados 
Casos 
positivos 
 
Proporção dos 
casos 
positivos/ 
estudados por 
mês 
 
 
% Percentual de 
casos positivos 
 Junho 22 0 0 (0/22) 0% (0/73) 
 Julho 38 0 0 (0/38) 0% (0/73) 
 Agosto 12 0 0 (0/12) 0% (0/73) 
2013 Setembro 13 0 0 (0/13) 0% (0/73) 
 Outubro 8 0 0 (0/8) 0% (0/73) 
 Novembro 4 0 0 (0/4) 0% (0/73) 
 Dezembro 3 0 0 (0/3) 0% (0/73) 
 Janeiro 7 0 0 (0/7) 0% (0/73) 
 Fevereiro 14 0 0 (0/14) 0% (0/73) 
 Março 8 0 0 (0/8) 0% (0/73) 
 Abril 6 0 0 (0/6) 0% (0/73) 
 Maio 16 0 0 (0/16) 0% (0/73) 
2014 Junho 9 0 0 (0/9) 0% (0/73) 
 Julho 14 2 0,14 (2/14) 2,74% (2/73) 
 Agosto 2 0 0 (0/2) 0% (0/73) 
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
J J A S O N D J F M A M J J A S O N D J F M A M J J A S O N D J F M A M J J A S O N DN
º 
D
E 
C
A
SO
S 
C
O
N
FI
R
M
A
D
O
S 
MESES
Casos confirmados
2013 2014 2015 2016 
Figura 12. Distribuição mensal por ano dos casos confirmados de infecção pelo vírus Zika no Estado 
do Rio Grande do Norte. 
68 
 
 
 
 
 
 
 
 Setembro 9 0 0 (0/9) 0% (0/73) 
 Outubro 5 0 0 (0/5) 0% (0/73) 
 Novembro 16 5 0,31 (5/16) 6,85% (5/73) 
 Dezembro 9 5 0,55 (5/9) 6,85% (5/73) 
 Janeiro 21 5 0,24 (5/21) 6,85% (5/73) 
 Fevereiro 17 7 0,41 (7/17) 9,59% (7/73) 
 Março 64 17 0,26 (17/64) 23,29% (17/73) 
 Abril 64 6 0,09 (6/64) 8,22% (6/73) 
 Maio 65 14 0,21 (14/60) 19,18% (14/73) 
2015 Junho 7 1 0,14 (1/7) 1,37% (1/73) 
 Julho 0 0 0 (0/0) 0% (0/73) 
 Agosto 0 0 0 (0/0) 0% (0/73) 
 Setembro 0 0 0 (0/0) 0% (0/73) 
 Outubro 0 0 0 (0/0) 0% (0/73) 
 Novembro 0 0 0 (0/0) 0% (0/73) 
 Dezembro 0 0 0 (0/0) 0% (0/73) 
 Janeiro 13 0 0 (0/13) 0% (0/73) 
 Fevereiro 26 0 0 (0/26) 0% (0/73) 
 Março 99 0 0 (0/99) 0% (0/73) 
 Abril 48 0 0 (0/48) 0% (0/73) 
 Maio 41 0 0 (0/41) 0% (0/73) 
2016 Junho 21 0 0 (0/21) 0% (0/73) 
 Julho 15 0 0 (0/15) 0% (0/73) 
 Agosto 7 0 0 (0/7) 0% (0/73) 
 Setembro 8 0 0 (0/8) 0% (0/73) 
 Outubro 4 0 0 (0/4) 0% (0/73) 
 Novembro 0 0 0 (0/0) 0% (0/73) 
 Dezembro 2 0 0 (0/2) 0% (0/73) 
Não 
informados 
- 
77 11 
 
0,14 (11/77) 
 
15,07% (11/73) 
TOTAL - 814 73 - 100% 
69 
 
 
5.4 Distribuição dos casos de infecção por Zika no Rio Grande do Norte, de 
acordo com o gênero 
 
 Em relação ao gênero, os resultados obtidos mostram que, durante o período 
de junho de 2013 a dezembro de 2016, a maior incidência da infecção pelo vírus Zika 
foi observada em pacientes do sexo feminino, com um percentual de 57,53% (42/73) 
dos casos positivos (Figura 13), porém, as análises estatísticas realizadas não 
evidenciaram nenhuma diferença significativa da infecção ocasionada pelo vírus Zika 
em homens e mulheres (p>0,05). 
Fonte: Autoria própria. 
 
5.5 Distribuição dos casos de infecção por Zika no Rio Grande do Norte, de 
acordo com a faixa etária 
 
As análises do número de casos positivos e da frequência de casos positivos 
evidenciaram que praticamente todas as faixas etárias apresentaram as mesmas 
taxas de incidência da infecção (Figura 14 A e B). A frequência dos casos positivos foi 
calculada durante os anos de 2014 e 2015, através do número de casos positivos por 
número de casos analisados de cada uma das faixas etárias. Em relação ao 
percentual de casos positivos, observou-se um maior percentual na faixa etária de 0-
42
31
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Feminino Masculino
N
º 
d
e 
ca
so
s 
co
n
fi
rm
ad
o
s
Figura 13. Casos confirmados de infecção pelo vírus Zika de acordo com o gênero. 
70 
 
 
10 anos com 19,18% (14/73) dos casos positivos, seguidas das faixas etárias de 31-
40 e 41-50, ambas com um percentual de detecção de 16,44% (12/73). 
 
Fonte: Autoria própria. 
 
5.6 Avaliação dos valores do Ct (Cycle Threshold) na infecção ocasionada pelo 
vírus Zika. 
 
 A viremia nos pacientes foi estimada através dos valores de Ct (Cycle 
Threshold), porém, nenhuma correlação foi encontrada entre o tempo de doença nos 
pacientes e os valores de Ct que representam a carga viral (p= 0,694 e R= 0,065) 
(Figura 15). 
Fonte: Autoria própria. 
Figura 14. A) Distribuição dos casos positivos para o vírus Zika de acordo com a faixa etária. B) 
Frequência de casospositivos para o vírus Zika de acordo com a faixa etária. 
Figura 15. Análise dos valores do Ct (Cycle Threshold) em relação ao tempo de doença nos pacientes. 
71 
 
 
 A estimativa da viremia foi analisada por dia de sintomas (primeiro, segundo, 
terceiro, quarto, quinto e sexto dia de sintomas). Os resultados mostraram que não 
foram encontradas diferenças significativas na viremia no terceiro e quarto dia de 
sintomas (p=0,929), assim como, do terceiro ao quinto dia (p=0,929). No entanto, 
houve uma diferença significativa na viremia no quarto e quinto dia de sintomas (p= 
0,238), em que foi observada uma tendência de viremia maior no quarto dia de 
sintomas dos pacientes (Figura 16). 
Fonte: Autoria própria. 
A carga viral também foi avaliada em função do tipo de amostra, de modo que 
não foram encontradas diferenças significativas de carga viral nas amostras de soro 
e sangue total analisadas (p=0.812), porém pode-se obervar um maior número de 
amostras de sangue total com maior viremia (por apresentar baixos valores de Ct) 
(Figura 17). 
Fonte: Autoria própria. 
 
Figura 16. Análise dos valores do Ct (Cycle Threshold) por dia de sintomas (primeiro, segundo, terceiro, 
quarto, quinto e sexto dia de sintomas). 
Figura 17. Análise dos valores do Ct (Cycle Threshold) em relação ao tipo de amostra (soro/sangue 
total). 
72 
 
 
 
5.7 Caracterização genética dos vírus Zika isolados no Rio Grande do Norte. 
 
 Do total de 18 amostras, com baixos valores de Ct (Cycle Threshold), 
selecionadas para realizar as etapas de sequenciamento, duas amostras 
apresentaram bons resultados no sequenciamento do gene que codifica a proteína do 
envelope (E) viral. Dessas 18 amostras, cinco foram inoculadas em cultura de células 
C6/36 de Aedes albopictus, mas em apenas uma delas o vírus foi isolado. O 
sobrenadante da primeira passagem do vírus na cultura, obtido a partir dessa amostra 
foi utilizado para o sequenciamento. Portanto, nesse estudo, três amostras foram 
utilizadas para a caracterização genética do vírus Zika (Tabela 8). 
 
Tabela 8. Informações sobre as amostras utilizadas no sequenciamento. 
Fonte: Autoria própria. 
Número de 
identificação das 
amostras 
Município 
detectado 
Ano 
Isolamento em 
cultura de 
células C6/36 
Porcentagem de 
sequenciamento do 
gene completo da 
proteína do 
envelope (E) do 
vírus Zika 
19 Natal 2015 Sim 100% 
278 Natal 2015 Não 55,68% 
139 Natal 2015 Não 70,17% 
73 
 
 
As análises filogenéticas das sequências estudadas mostraram que as cepas 
circulantes no Estado pertencem a linhagem Asiática (Figura 18). 
 TW 2016 KY126348
 TH 2015 KX051562
 CA 2013 KF993678
 KH 2010 KU955593
 ID 2014 KU179098
 PH 2016 KY003152
 KR 2016 KY553111
 PH 2012 KU681082
 SR 2015 KU312313
 PR 2015 KX087101
 PR 2015 KX601168
 CN 2016 KY328290
 CN 2016 KU761560
 WS 2016 KX216636
 WS 2016 KX216639
 BR AL 2015 KY559001
 JM 2016 KY785424
 DO 2016 KY785475
 BR RJ 2016 KY014296
 BR TO 2016 KY559021
 BR BA 2015 KX520666
 JP 2016 LC219720
 BR PE 2016 KY558990
 CK 2014 KX216640
 CK 2014 KJ634273
 BR TO 2016 KY559022
 BR RN NATAL 2015 19 C636
 BR RN NATAL 2015 278
 BR PB 2015 KX280026
 BR CE 2016 KX811222
 BR RN 2015 KY558989
 BR RN 2015 KU527068
 BR PE 2015 KY558996
 BR SP 2016 KY559008
 BR AL 2015 KY559003
 BR RN NATAL 2015 139
 JP 2016 LC171327
 JP 2016 LC191864
 MX 2016 MF801417
 SG 2016 KY241697
 SG 2016 KY241777
 SG 2016 KY241689
 TW 2016 KY126349
 SG 2016 KY241716
 MY 1966 KX601167
 MY 1966 HQ234499
 MY 1966 KX694533
 MY 1966 KX377336
Linhagem Asiática
 UG 1962 KY288905
 CF 1976 KF268948
 CF 1976 KF268950
 CF 1980 KF268949
 CF 1968 KF383115
 UG 1947 KU720415
 UG 1947 KX421193
 UG 1947 LC002520
 UG 1947 HQ234498
 SN 2001 KF383119
 SN 2001 KF383118
 SN 1997 KF383117
 NG 1968 HQ234500
 NG 1968 KU963574
 SN 2013 MF629798
 SN 1968 KF383116
 SN 1984 KU955595
 SN 1984 KY348860
 SN 1984 HQ234501
 SN 1984 KX601166
Linhagem Africana
99
97
98
99
86
84
52
38
41
37
31
80
19
91
99
96
46
51
79
84
69
98
29
30
7
67
28
36
50
53
18
74 
 
 
Fonte: Autoria própria. 
 
5.8 Análise estrutural da Proteína (E) 
 
 As sequências de aminoácidos da proteína (E) das três amostras utilizadas 
nesse estudo, foram comparadas com as sequências de aminoácidos de quatro cepas 
ancestrais originárias da Malásia, país do Sudeste Asiático. Essa comparação foi 
realizada porque a linhagem Asiática sofreu eventos evolutivos, originando cepas que 
provocaram grandes surtos nas ilhas localizadas no Oceano Pacífico e também no 
continente Americano. Um total de três substituições de aminoácidos foram 
encontradas no domínio III da proteína (E) dos vírus Zika circulantes no Rio Grande 
do Norte (Figura 19 e 20). A primeira substituição foi encontrada na posição 393 onde 
ocorreu a troca do aminoácido Aspartato (D) por Ácido glutâmico (E) (D393E). Essa 
mutação foi constatada nas três amostras. A segunda substituição ocorreu entre dois 
aminoácidos apolares: Valina (V) por Metionina (M) na posição 473 (V473M) e a última 
mutação foi do aminoácido polar Treonina (T) pelo aminoácido apolar Metionina (M) 
na posição 487 (T487M). Essas duas últimas mutações foram constatadas nas 
amostras: 19 (Natal/RN) e 139 (Natal/RN). 
 
 
Figura 18. Árvore filogenética dos vírus Zika circulantes no Rio Grande do Norte. As cepas 
sequenciadas nesse estudo, marcadas em vermelho, pertencem a Linhagem Asiática. Árvore 
construída através do método estatístico de Máxima Verossimilhança, utilizando o modelo de 
substituição de Kimura - 2 parâmetros. Os valores de bootstrap, localizam-se próximos aos ramos da 
árvore. 
 
75 
 
 
Fonte: Autoria própria. 
 
Fonte: Adaptado Dai et al. (2016). 
 
 
Figura 19. Alinhamento das sequências de aminoácidos da proteína (E) mostrando as substituições 
(D393E, V473M e T487M) detectadas nas cepas dos vírus Zika isolados nesse estudo. 
Figura 20. Substituições D393E, V473M e T487M detectadas no domínio III da proteína (E) do envelope 
do vírus Zika. 
76 
 
 
Através da construção da estrutura tridimensional da proteína (E) dos vírus Zika 
circulantes no Estado foi possível verificar os locais onde ocorreram as substituições 
(Figura 21). A substituição do Aspartato (D) por Ácido glutâmico (E) (D393E) encontra-
se em uma região de alça. Enquanto que as outras duas substituições, da Valina (V) 
por Metionina (M) na posição 473 (V473M) e da Treonina (T) pela Metionina (M) na 
posição 487 (T487M), encontram-se localizadas em alfa-hélices na região 
transmembrana da proteína (E) (KOSTYUCHENKO et al., 2016) 
Fonte: Autoria própria. 
 
A estrutura tridimensional da proteína (E) dos vírus Zika isolados nesse estudo 
foi comparada com a estrutura da proteína (E) de uma cepa ancestral da Malásia (ID: 
KX694533), porém, não foram encontradas alterações na estrutura secundária nos 
locais onde ocorreram as substituições (Figura 22). 
 
 
Figura 21. Estrutura Tridimensional da proteína (E) dos vírus Zika isolados nesse estudo. As 
substituições D393E, V474M e T487M estão marcadas em vermelho. 
 
77 
 
 
 
Fonte: Autoria própria. 
 
 
 
 
 
Figura 22. Comparação da estrutura da proteína (E) dos vírus isolados nesse estudo, representada 
com a cor azul, com a estrutura da proteína (E) da cepa da Malásia (KX694533), representada com a 
cor amarela. As substituições D393E, V474M e T487M estão marcadas em vermelho. 
 
78 
 
 
6 DISCUSSÃO 
 
6. 1 Análise Epidemiológica 
 
Desde a introdução do vírus Zika no Estado do Rio Grande do Norte, em maio 
de 2015, o Estado monitora a circulação deste vírus, bem como, os casos graves de 
microcefalia e/ou outras malformações relacionadas à Zika (ZANLUCA et al., 2015; 
SESAP, 2017b). Apesar do grande impacto ocasionado pelo vírus Zika na saúde 
pública do Rio Grande do Norte, pouco se conhece sobre a dinâmica dessa doença 
devido a escassez de trabalhosdisponíveis. Através desse estudo foi possível 
constatar um percentual de detecção do vírus de 8,97% (73/814) do total de casos 
estudados. Ao analisarmos a incidência do vírus em cada ano estudado, nenhum caso 
de infecção foi detectado no período de junho a dezembro de 2013 (0/101). Esse 
resultado sugere que o vírus não circulou no RN durante a Copa das Confederações 
(FARIA et al., 2016). O presente estudo, detectou a circulação do vírus Zika a partir 
do ano de 2014, no entanto, os primeiros relatos de circulação do vírus no Estado, só 
foram confirmados no início de 2015 (SESAP, 2015b), o que demonstra a importância 
dos estudos retrospectivos. No ano de 2015, uma maior incidência do vírus no RN foi 
constatada, com um percentual de detecção de 21,48% (61/284), esse resultado 
corrobora com os registros do Ministério da Saúde que considera o ano de 2015 como 
o ano epidêmico do vírus Zika no Brasil (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2017a). Em 2016, 
nenhum caso foi detectado (0/310), possivelmente devido a introdução do vírus 
Chikungunya no Estado. Nesse ano, em todo o RN, 8.268 casos de CHIKV foram 
confirmados enquanto a confirmação de ZIKV ocorreu em apenas 205 casos (SESAP, 
2017). Acredita-se que o vírus Chikungunya tenha deslocado a transmissão do ZIKV 
na área de estudo, possivelmente devido a competição entre esses dois vírus, tanto 
por hospedeiros vertebrados quanto por vetores e também devido à alta eficiência de 
transmissão do CHIKV. Outro fator importante que pode explicar esse resultado 
baseia-se na imunidade pregressa adquirida contra o ZIKV por uma grande parcela 
da população do Estado reduzindo, portanto, o número de indivíduos susceptíveis ao 
ZIKV (MAGALHAES et al., 2017). 
79 
 
 
No que diz respeito à distribuição espacial do vírus Zika no Estado, esse estudo 
constatou que três das quatro mesorregiões apresentaram casos confirmados de 
infecção pelo vírus Zika. A mesorregião Leste Potiguar concentrou um maior número 
de casos, sendo Natal e Parnamirim, os municípios com maior número de casos 
positivos. A grande incidência, do vírus no município de Natal, pode ser explicada por 
inúmeros fatores: elevada densidade populacional desse município (IBGE, 2018); por 
atrair constantemente um grande número de turistas em virtude de suas belezas 
naturais, o que favorece a disseminação do vírus e por apresentar também condições 
climáticas favoráveis e um sistema de saneamento ambiental precário que favorecem 
a proliferação do vetor (SEPLAN, 2014). O elevado número de casos em Parnamirim 
provavelmente ocorreu por sua proximidade territorial com Natal que favorece o fluxo 
de pessoas entre esses dois municípios acarretando, consequentemente, a 
disseminação do vírus. Nenhum caso de infecção pelo vírus Zika foi detectado na 
Mesorregião do Oeste Potiguar, esse resultado pode ser explicado porque poucos 
municípios foram estudados durante todo o período do estudo (Figura 10). 
Provavelmente, a maioria desses municípios não possui um sistema de vigilância 
epidemiológica adequado, resultando em subnotificações da doença; a baixa 
pluviosidade em alguns municípios dessa Mesorregião (SEPLAN, 2014) não 
favoreceu a proliferação do vetor reduzindo, desse modo, o número de casos; e ainda, 
a distância geográfica pode ter dificultado o transporte das amostras coletadas nesses 
municípios até o Laboratório Central Doutor Almino Fernandes (LACEN/RN). 
O primeiro caso de ZIKV no Rio Grande do Norte, detectado nesse estudo, 
ocorreu em julho de 2014 no município de Caiçara do Rio do Vento (localizado no 
interior do Estado), seguido da detecção no município de Galinhos (situado no litoral 
do RN) (Figura 11). A circulação inicial do vírus Zika nesses dois municípios 
provavelmente ocorreu porque essas cidades atraem turistas. A detecção no 
município de Caiçara do Rio do Vento pode ser explicada porque esse município fica 
próximo da Serra das Gameleiras que é um local que atrai turistas. Provavelmente, o 
evento esportivo da Copa do mundo de 2014 que ocorreu durante os meses de junho 
e julho de 2014, impulsionou o turismo nesses municípios. Portanto, esse estudo 
detectou a introdução do vírus Zika no Estado já que, até o final do ano de 2014, 
apenas o monitoramento do vírus Dengue era realizado no Rio Grande do Norte 
80 
 
 
(SOUSA, 2015). Já era esperado que o vírus fosse detectado em um maior número 
de municípios em 2015, já que foi o ano de maior incidência, detectado nesse estudo. 
Os meses de março, abril e maio de 2015 apresentaram um maior percentual 
de detecção do vírus, sendo março, o mês com maior incidência detectada. 
Possivelmente, essa elevada incidência foi ocasionada devido a maior ocorrência de 
chuvas durante todo esse mês, na maioria dos municípios do Estado, o que pode ter 
resultado no aumento da densidade populacional do vetor (EMPARN, 2015). Sabe-se 
que a pluviosidade aumenta o número de potenciais criadouros, e portanto, de 
infestação do vetor, o que predispõe ao aumento dos casos de infecção (DE SOUZA, 
SILVA & SILVA, 2010). As maiores proporções de casos positivos ocorreram no final 
do ano de 2014 e no início do ano de 2015, provavelmente, porque esse período 
corresponde ao início do período epidêmico do vírus Zika no Estado devido à 
introdução de um novo vírus em uma região com uma população imunologicamente 
susceptível. 
Em relação ao gênero, este trabalho verificou uma maior incidência da infecção 
pelo vírus Zika no sexo feminino, representando um percentual de 57,53% dos casos 
confirmados, apesar de não ter havido diferença significativa, esse resultado 
corrobora com os de outros estudos realizados no Nordeste, como o de Zanluca et al. 
(2015), Campos, Bandeira e Sardi (2015) e Pessôa et al. (2016) que também 
detectaram um maior número de casos nesse gênero. Esse resultado pode ser 
explicado porque as mulheres procuram com mais frequência os serviços de saúde 
do que os homens (RIBEIRO, SOUSA & ARAUJO, 2008). 
Praticamente todas as faixas etárias apresentaram infecção pelo ZIKV isso se 
deve provavelmente ao fato de que o vírus foi introduzido pela primeira vez no Estado, 
de maneira que toda a população se apresentava susceptível independentemente da 
idade. 
No que diz respeito à estimativa da viremia, esperava-se uma maior carga viral 
no início da infecção, porém, nenhuma correlação foi encontrada entre o tempo de 
doença nos pacientes e a carga viral (Figura 15). A viremia também foi analisada por 
dia de sintomas em que foi observada uma maior viremia no quarto dia de sintomas. 
Esse resultado pode ser explicado porque um maior número de amostras foram 
coletadas nesse dia, se comparada aos demais dias (Figura 16). 
81 
 
 
Em relação a carga viral por tipo de amostra analisada (soro/sangue total), 
nenhuma diferença significativa foi detectada, porém as amostras de sangue total 
apresentaram maior viremia, de modo que esse resultado nos informa que as 
amostras de sangue total são mais eficazes para a detecção do vírus Zika. 
Atualmente, sabe-se que altas cargas virais são detectadas na saliva e urina e que 
essas amostras podem ser utilizadas alternativamente, quando a coleta de sangue é 
difícil, como por exemplo em crianças (PLOURDE & BLOCH, 2016; WAGGONER & 
PINSKY, 2016). 
 
6.2 Análise Filogenética 
 
 Na análise filogenética realizada, consta que as cepas circulantes no Estado 
do Rio Grande do Norte pertencem a Linhagem Asiática, assim como os vírus Zika 
circulantes em Países da Ásia, Américas e no Brasil, conforme demonstrado na Figura 
18. Esse resultado corrobora com o estudo realizado por Zanluca e colaboradores 
(2015) onde essa linhagem foi também identificada no Rio Grande do Norte. Além 
disso, outros estudos constataram que essa linhagem circula em outros Estados do 
Nordeste tais como Bahia (CAMPOS, BANDEIRA & SARDI, 2015), Ceará, Maranhão 
(FARIA et al., 2016) e Pernambuco (PESSÔA et al., 2016). 
Assimcomo o estudo realizado por Faria et al. (2016), que utilizou amostras 
provenientes do Nordeste, nosso estudo também detectou que as sequências de 
isolados brasileiros encontram-se intercaladas com sequências de outros países 
pertencentes ao continente Americano. Esse resultado reflete a dinâmica de 
circulação do vírus nas Américas (FARIA et al. 2016). 
Em relação ao clado Asiático, os valores de bootstrap dos nós ancestrais estão 
bem suportados, apesar de que alguns valores de bootstrap foram baixos. Esse último 
resultado pode ser explicado pela baixa variabilidade genética identificada e pelo curto 
espaço de tempo estudado. Então, conforme demonstrado em nossa árvore 
filogenética, a maioria das sequências de Linhagem Asiática são de 2015 e 2016 que 
corresponde ao período epidêmico no continente Americano (IKEJEZIE et al., 2017). 
82 
 
 
6.3 Modelagem proteica 
 
As substituições D393E, V473M e T487M, detectadas nesse estudo, 
encontram-se no domínio III da proteína (E) (Figura 20). Para avaliar essas 
substituições de aminoácidos, foram verificadas as pontuações na Matriz Blossum 80 
desenvolvida por Henikoff e Henikoff (1992). A Matriz Blossum é utilizada para 
comparar proteínas com alto grau de identidade, já que se baseia no alinhamento local 
das sequências de proteínas. A Matriz Blossum 80 compara sequências menos 
divergentes, como é o caso das sequências de aminoácidos da proteína (E) dos vírus 
Zika isolados nesse estudo com as cepas ancestrais. Um score positivo indica uma 
substituição mais provável enquanto um score negativo determina substituição menos 
provável. As substituições do Aspartato (D) pelo Ácido glutâmico (E) na posição 393 
(D393E) e da Valina (V) pela Metionina (M) na posição 473 na posição (V473M) 
obtiveram um score positivo no valor de 1. Essa pontuação indica que essas 
substituições apresentam maior probabilidade de ocorrer, se comparada a 
substituição da Treonina (T) por Metionina (M) na posição 487 (T487M) que 
apresentou um score negativo de -1 (ANEXO A, B e C). 
Essas mutações possivelmente ocorreram porque o domínio III sofre maiores 
pressões evolutivas por interagir com o meio extracelular, com receptores celulares e 
com as IgGs (ZHANG et al., 2014; KOSTYUCHENKO et al., 2016). A substituição 
D393E pode ter ocorrido, por estar localizada em uma região de alça que se 
caracteriza por sua elevada variabilidade (Figura 21) (XIANG, 2006). Além disso, esse 
sítio está próximo do sítio 373 que contém o aminoácido lisina (K373), onde as regiões 
hipervariáveis (CDRs) das IgGs interagem (BARBA-SPAETH et al., 2016). 
É provável que essas mutações encontradas no domínio III também possam 
influenciar na patogenicidade das cepas dos vírus Zika circulantes no Estado do RN, 
possivelmente, aumentando a capacidade de adsorção do vírus à inúmeros 
receptores celulares o que aumenta o espectro de tecidos afetados pelo vírus, 
contribuindo desse modo, para o aumento da infeciosidade viral. 
 
 
83 
 
 
7 CONCLUSÕES 
 
 Este estudo forneceu informações importantes sobre a dinâmica da disseminação 
do vírus no RN e avaliou o impacto na saúde pública da população Norte-
Riograndense, de modo que os resultados desse trabalho, permitem nortear ações 
visando à prevenção da população contra futuros surtos; 
 Este foi o primeiro estudo de detecção do vírus Zika no Estado do Rio Grande do 
Norte realizado durante o maior período de tempo (2013-2016), evidenciando um 
percentual de detecção de 8,97% (73/814) do total de casos estudados; 
 O vírus Zika foi detectado em 16 municípios e em três das quatro mesorregiões 
que dividem o Estado. As mesorregiões mais afetadas foram a do Leste Potiguar, 
seguida da Central Potiguar e Agreste Potiguar, respectivamente. Nenhum caso 
de infecção pelo vírus Zika foi detectado na Mesorregião do Oeste Potiguar. Os 
municípios de Natal e Parnamirim apresentaram o maior número de casos 
confirmados; 
 Esse estudo detectou a introdução do vírus Zika no Estado em julho de 2014, onde 
foi constatado no município de Caiçara do Rio do Vento; 
 O ano que apresentou maior incidência do vírus no Estado foi 2015, sendo março 
o mês com maior número de casos confirmados; 
 A maioria dos casos de infecção por Zika ocorreu em pacientes do sexo feminino 
e atingiu todas as faixas etárias com praticamente as mesmas taxas de incidência 
da infecção; 
 Nenhuma correlação entre a estimativa de viremia e o tempo de doença nos 
pacientes foi encontrada, assim como, não foram encontradas diferenças 
significativas na viremia de acordo com o tipo de amostra analisada (soro/sangue 
total), mas houve uma diferença significativa na viremia entre o quarto e quinto dia 
de sintomas analisados; 
 As cepas circulantes do vírus no RN pertecem a linhagem Asiática, essa mesma 
linhagem predomina nas Américas; 
 A análise estrutural in silico da proteína (E) detectou a existência de três mutações 
que podem explicar a patogenicidade dos vírus Zika circulantes no Rio Grande do 
Norte. 
84 
 
 
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98 
 
 
 
ANEXOS 
 
ANEXO A – Pontuação da substituição (D393E), detectada nesse estudo, na Matriz 
Blossum 80. 
Fonte: NCBI - National Center for Biotechnology Information 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
99 
 
 
ANEXO B - Pontuação da substituição (V473M), detectada nesse estudo, na Matriz 
Blossum 80. 
 
Fonte: NCBI - National Center for Biotechnology Information 
 
 
100 
 
 
ANEXO C - Pontuação da substituição T487M, detectada nesse estudo, na Matriz 
Blossum 80. 
 
 
Fonte: NCBI - National Center for Biotechnology Information 
 
101 
 
 
ANEXO D – Número de acesso ao GenBank das sequências da proteína (E) utilizadas 
para a construção da árvore filogenética: KX280026; KX811222; KY558989; 
KU527068; KY014296; KY558996; KY559022; KY559008; KX520666; KY559003; 
KY558990; KY559021; KY559001; KY241697; KY241716; KY241689; KY241777; 
MF801417; KY126349; KY126348; KY785424; LC219720; LC171327; LC191864; 
KY785475; KX216640; KJ634273; KU761560; KY328290; KF993678; KU312313; 
KX216636; KX216639; KU955593; KY553111; KX051562; KU681082; KY003152; 
KU179098; KX087101; KX601168; KX694533; KX377336; HQ234499; KX601167; 
KY288905; KF383115; KF268948; KF268949; KF268950; KU720415; KX421193; 
KF383119; LC002520; HQ234498; HQ234500; KU963574; KF383116; KF383118; 
KF383117; MF629798; HQ234501; KX601166; KY348860; KU955595; 
Fonte: NCBI - National Center for Biotechnology Information