MATERIAL AULA DNA

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17/01/2023
1
GAG 109 – BIOTECNOLOGIA 
NA AGRICULTURA
Profa. Heloisa Oliveira dos Santos
SEMENTE
Principal insumo da Agricultura
Material 
para 
pesquisa
Perpetuação 
das 
espécies
Fonte de 
alimento
Veículo de 
tecnologia 
gerada
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MERCADO MUNDIAL DE SEMENTES
Ornamentais
23%
Soja
14%
Olerícolas
16%
Milho
37%
Outros
10%
US$ 71 
bilhões
TAXA DE UTILIZAÇÃO DE SEMENTES
47 50 49 51 55 57 56 56 57 58 58
25 29 36
41 45
46 47 46 56 54 5511 11
14
16
18 19 19 19
20 20 1984
86
86
87
91 90 91 91
92 92 93
56
58
60
64
67 64 62 61
71 70 71
88
88
88
86
83 93 94 94
93 94 9472
71
72
69
71
68 69 67
75 74 75
2007/08 2008/09 2009/10 2010/11 2011/12 2012/13 2013/14 2014/15 2015/16 2016/17 2017/18*
Algodão Arroz Feijão Milho Soja Sorgo Trigo
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3
AS 19 MAIORES EMPRESAS DE
SEMENTES DO MUNDO EM 2018
- TRANSGÊNICOS -
BRASIL/MUNDO
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4
ONDE ESTÃO OS TRANSGÊNICOS NO MUNDO??
21
PAÍSES EM 
DESENVOLVIMENTO
5
 PAÍSES 
DESENVOLVIDOS
Estados Unidos 75.0
Brasil 51.3
Argentina 23.9
Canadá 12.7
Índia 11.6
191.7 milhões de hectares
(Clive James, 2019)
BRASIL – 51,3 MILHÕES DE HECTARES EM 2018
Soja – 34,86 milhões de hectares – 96%
Milho -15,38 milhões de hectares – 89%
Algodão – 1 milhão de hectares – 74%
(Clive James, 2019)
Cana de Açucar – 400 hectares – 0,1%
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A CADA NOVA SAFRA, A SEMENTE DEMONSTRA SER MAIS
DECISIVA COMO VEÍCULO PARA QUE O AGRONEGÓCIO
BRASILEIRO CRESÇA EM PRODUTIVIDADE E QUALIDADE
Não existe agricultura 
competitiva sem a 
utilização de sementes 
de alta qualidade
Sistema organizado 
envolvendo todas as etapas, 
da produção ao 
processamento e à 
comercialização
Sementes certificadas 
ou amparadas pela 
legislação é garantia de 
sucesso 
ATRIBUTOS DA QUALIDADE DE SEMENTES
FÍSICA PUREZA FÍSICA, TAMANHO, DANO MECÂNICO
FISIOLÓGICA GERMINAÇÃO, VIGOR, LONGEVIDADE
Sanitária PRAGAS, DOENÇAS
Genética PUREZA VARIETAL, PUREZA GENÉTICA
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CULTIVARES COM 
NOVAS 
CARACTERÍSTICAS
CONTROLE 
DE 
QUALIDADE
Aspectos legais
Patente de genes
Proteção de 
cultivares
Propriedade 
intelectual
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PUREZA GENÉTICA
SEMENTES ADVENTÍCIAS - CRUZAMENTOS NATURAIS
ENTRE AS PLANTAS DE MESMA ESPÉCIE E MISTURAS
INDESEJÁVEIS NO MOMENTO DA COLHEITA,
TRANSPORTE E BENEFICIAMENTO.
Definição da cultivar
Coloração da flor Forma da folha Hábito de crescimento
Marcadores morfológicos
Identificação de cultivares e a certificação da pureza genética
Melhoristas, empresas produtoras de sementes
e órgãos de certificação 
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Dogma central da Biologia Molecular
Transcrição
Tradução
Transcrição
reversa
DNA
RNA
Proteína
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CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS DE UM BOM 
MARCADOR MOLECULAR???
•Polimórfico
•Herança codominante
•Amplamente distribuido no genoma
•Reproduzível
•Fácil detecção, rápido e barato
•Seletivamente neutro
•Viável de uso com grande número de amostras
ALGUNS CONCEITOS BÁSICOS
Diplóide: Constituído por duas cópias (homólogos) de cada cromossomo.
Alelo: As formas alternativas de um caráter genético encontrado em um
determinado locus de um cromossomo.
Homozigotos: Um organismo diplóide com alelos idênticos de um determinado
gene em ambos os cromossomos homólogos.
Heterozigotos: Um organismo diplóide com alelos diferentes de um
determinado gene em ambos os cromossomos homólogos.
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Homozigoze
Heterozigoze
REPRESENTAÇÃO DIDÁTICA
Alelos
Diplóide
Haplóide
ORIGEM DO POLIMORFISMO MOLECULAR
Mutações pontuais - SNPs
A. ATCTCGTGATTCCTAGTCGTA
TAGAGCACTAAGGGATCAGCAT 
B. ATCTCGT GATTA TAGTCGTA
TAGAGCA CTAATATCAGCAT
Pequenas deleções e/ou inserções - InDels
A. ATCTCGTCTAGTCGTA
TAGAGCAGATCAGCAT
B. ATCTCGT---GTCGTA
TAGAGCA---CAGCAT
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QUANTO A HERANÇA
MARCADORES DOMINANTES MARCADORES CODOMINANTES
MARCADORES 
MOLECULARES DE 
DNA
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MARCADOR MOLECULAR – DNA
Amplificação
Hibridização
Sequenciamento
O QUE É DNA?
Qual a sua composição química?
Qual a sua estrutura?
Como o DNA se replica?
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Composição química/Estrutura
Par de bases
Esqueleto
fosfoglicídico
REPLICAÇÃO DO DNA
O mecanismo de replicação 
está baseado no pareamento 
das bases da dupla hélice do 
DNA.
A estrutura do DNA 
contém a informação 
necessária para perpetuar 
sua sequência de bases
O pareamento especifico entre bases permite que cada 
cadeia simples sirva de molde para a síntese da cadeia 
complementar, logo a nova molécula tem uma cadeia nova e 
uma velha - SEMICONSERVATIVA 
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REPLICAÇÃO DO DNA - Semiconservativa
DNA original
15N 15N
Após uma replicação
14N 15N
Após duas replicações
14N 15N
e
14N 14N
Cultivo em meio
14NH4Cl
Cultivo em meio
15NH4ClExperimento 
realizado por 
Meselson e Stahl
em 1958
REPLICAÇÃO DO DNA - Semiconservativa
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IDENTIFICAÇÃO E 
CARACTERIZAÇÃO DE 
CULTIVARES POR MEIO DE 
MARCADORES MOLECULARES 
DE DNA
AVALIAÇÃO DO POLIMORFISMO DIRETAMENTE DO DNA
PCR
• 1985
Reação de 
polimerase 
em cadeia
SSR
• 1985
Sequências 
adjacentes 
que se 
repetem em 
número 
variado
RAPD
• 1990
Polimorfismo 
de DNA 
amplificado 
ao acaso
AFLP
• 1994
Polimorfismo 
no 
comprimento 
de 
fragmentos 
amplificados
SNP
• 1998
Polimorfismos 
de 
Nucleotídeos 
Únicos 
RFLP
• 1980
Fragmentos 
de DNA de 
comprimento 
polimórfico
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RFLP
Fragmentos de DNA de 
comprimento polimórfico
Polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição 
RFLP
RFLP examina 
diferença em 
tamanho de 
fragmentos de 
restrição de DNA 
específicos
Polimorfismo 
deriva de 
mutação pontual, 
inserção, deleção 
Utiliza-se DNA 
celular total
Requer DNA 
puro de alto 
peso molecular
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Metodologia de RFLP
1.Digerir DNA em fragmentos
pequenos;
2.Separação dos fragmentos por gel
eletroforese;
3.Transferência de fragmentos de DNA
para filtro;
4.Visualização dos fragmentos de
DNA;
*Sondas marcadas (32P) ou a frio
5.Análise dos resultados;
*Bandas analisadas para alelos
e/ou presença/ausência
*Diferenças em padrão de
bandas reflete diferenças genéticas
*A escolha de sonda/enzima de
restrição é crucial
Enzimas de 
restrição
Fragmentos 
separados por 
eletroforese
Transferência 
de fragmentos 
de DNA para 
filtro
Fragmentos 
pós 
transferência 
Hibridização
Visualização 
dos 
fragmentos de 
DNA
Vantagens e Desvantagens do RFLP
• Reprodutível
• Marcadores co-dominantes
• Simples
• Trabalhoso
• Caro
• Uso de sondas radioativas*
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PCR
Reação em cadeia da polimerase
PCR – Reação em cadeia da polimerase
Técnica que permite a amplificação da quantidade de
DNA específico utilizando a enzima Taq DNA
polimerase, sequências iniciadoras específicas
(primers) e variações de temperatura controladas.
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História da PCR – Kary Mullis
• Químico, 1966
• Doutor em bioquímica, 1972
• 2 anos de pós-doutorado numa indústria farmacêutica
• Deixou a academia para escrever ficção científica, foi dono de padaria por dois anos; voltou à indústria.
• 1983 → Teve a idéia de utilizar um par de primers para amplificação enquanto voltava para a casa à noite
ao lado da namorada
• Avisou na empresa e deixou-se que ele ficasse trabalhando na PCR, demorou um ano para padronizar a
técnica
• Perdeu a namorada logo depois, mas ganhou o Nobel de química (1993)
• Controvérsias: Surfista, já foi divorciado 3 vezes, é um dos que
acredita que o HIV não causa a AIDS, e diz ter tomado bastante LSD
na década de 60/70 e que isso o ajudou a descobrir a afamada técnica!
Recepção de amostras
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Homogeneização das Amostras
Preparo das Amostras
17/01/2023
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Pesagem das Amostras
Extração do DNA
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Limpeza do DNA
Componentes da Reação
Iniciadores pequenas 
sequencias complementares 
ao DNA alvo
DNA polimerase 
termoestável, isolada de 
Thermus aquaticus
Mg2+
Cofator da 
Taq
dCTP
dGTP
dATP
dTTP
Nucleotídeos 
utilizados para 
a confecção danova fita
Tampão mantem o pH ótimo para atividade da enzima
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Ciclos da PCR
95°C
50°C
72°C
95°C
50°C
72°C
Etapa 1: 
DESNATURAÇÃO
94-96°C por 30’
Etapa 2: 
ANELAMENTO
50-65°C por 1min
Etapa 3: 
EXTENSÃO
72°C por 1min
Preparação da PCR
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Eletroforese em gel de Agarose
Revelação
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Eletroforese em gel de poliacrilamida
Utilização na área de sementes
PCR de primers 
específicos PCR 
multiplex
Detecção de 
OGM
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PCR qualitativo
Mr – Marcador de peso molecular
1 – Controle sem DNA
2 – Milho Convencional
3 – GA 21
4 – MON810
5- NK603
6- Soja Convencional
7 Soja RR
508pb Zeina
223pb MON810
113pb NK603
Detecção de soja RR por PCR 
A) Control reaction/Lectin gene
118 bp 
Le
ng
th
 s
ta
nd
ar
d
C
on
ve
nt
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oy
a
R
R
 s
oy
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ak
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C
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R
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l
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th
 s
ta
nd
ar
d
128 bp 
B) Specific reaction
Le
ng
th
 s
ta
nd
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d
C
on
ve
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oy
a
R
R
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Be
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il
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C
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PC
R
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l
Le
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th
 s
ta
nd
ar
d
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PCR multiplex
1 – Marcador de peso molecular
2 – Controle sem DNA
3 – Milho Convencional
4 – MON810
5 – Bt11
6- Herculex
508pb Zeina
223pb MON810
103pb Bt11
Mon810 e Bt11 – mesmo gene Cry 1ab
(primers específicos)
Nascimento et al., (2013)
RAPD
Polimorfismo do DNA amplificado 
ao acaso 
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Polimorfismo do DNA amplificado ao acaso 
RAPD
Amplifica 
sequências 
anônimas de 
DNA usando 
primers 
arbitrários
PCR com um 
único primer.
Baixa 
reprodutibilidade
Método rápido 
para detecção de 
polimorfismos
Marcador 
dominante
RAPD
A
B
C
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FIGURA 1. Produtos de amplificação de DNA obtidos com os iniciadores OP-B04, OP-B07, OP-B08, OP-B11 e OP- C14. As
colunas de 1 a 6 correspondem aos produtos de amplificação das cultivares Carioca, Carioca MG, Aporé, Pérola, IAPAR
57 e IAPAR 81. As setas indicam as bandas consideradas robustas.
Aplicabilidade - RAPD
Aplicabilidade - RAPD
Padrões de amplificações, característicos obtidos com DNA extraído de 3 isolados de 
C. gossypii var. cephalosporioides, UFLA-MG- 1995,1998
Nas linhas tem-se a sequência dos isolados 1,2 e 3 (C. gossypii) e isolado 4 (C. gossypii var. 
cephalosporioides), 1° grupo de 4 foram amplificados pelo primer A4 e o 2° grupo pelo primer A7
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Aplicabilidade - RAPD
Variedades de Alho:
Mossoró 
Quitéria
Chonan
Caçador
Amarante
Amarante L
Chonan L
Aplicabilidade - RAPD
Variabilidade entre grupos de cultivares de Melão
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Vantagens e Desvantagens do RAPD
• Rápido
• Simples
• Baixo custo
• Sem uso de radio-isótopos
• Marcador dominante
• Problemas de reprodutibilidade
• Problemas de interpretação
Criticado
• Baixa reprodutibilidade;
• Pareamento a baixas 
temperaturas;
• Vulnerável a qualidade e 
quantidade do DNA molde.
Logo, não deve ser 
utilizado como critério 
único na identificação de 
cultivares.
SSR - Microsatélite
Sequências simples repetidas
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Sequencias simples repetidas
SSR - Microssatélite
Identifica um 
numero maior 
de alelos por 
loco 
(multi-alélico)
PCR com um par 
de primers.
Alta 
reprodutibilidade
Sequências 
curtas (1 a 6 
bases) repetidas 
em tandem 
Extremamente 
úteis para 
identificação de 
cultivares e 
certificação de 
pureza genética
MARCADOR MULTI ALÉLICO
AT
AT
AT
AT
AT
CCG
CCG
CCG
CCG
CA CA CA CA
CA CA
CA
CA CA CA CA CA
CA CA CA CA CA CA
CAAlelo 3
Alelo 5
Alelo 7
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MARCADOR MULTI ALÉLICO
AA AB AC BB BC CC
Alelo A
Alelo B
Alelo C
Aplicabilidade - SSR
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Aplicabilidade - SSR
K. C. P. C. Salgado (2001)
Aplicabilidade - SSR
Salgado et al (2006)
17/01/2023
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Aplicabilidade - SSR
(Rabel et al, 2010)
Aplicabilidade - SSR
(Rabel et al, 2010)
17/01/2023
36
Aplicabilidade - SSR
(Rabel et al, 2010)
Aplicabilidade - SSR
M – Marcador de peso molecular
T1 – 100% L1
T2 – 99% L1 + 1% L2
T3 – 98% L1 + 2% L2
T4 – 95% L1 + 5% L2
T5 – 90% L1 + 10% L2
T6 – 100% L2
Br – Controle (Branco)
(Ramos et al, 2014)
17/01/2023
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AFLP
Polimorfismo de fragmentos do 
DNA amplificado
Polimorfismo de fragmentos do DNA amplificado
AFLP
Combinação de 
RFLP e PCR
Resulta em 
padrões muito 
informativos
Maior 
polimorfismo em 
regiões não 
codificantes
Maior numero 
de marcas 
associadas a 
fenótipos de 
interesse
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AFLP
Aplicabilidade - AFLP
Análise do marcador AFLP da população de mapeamento F2. o esquerda duas pistas denotadas por Mi e Mo
foram gerados a partir do os pais, Misuzudaizu e Moshidou Gong 503, respectivamente, com um combinação
de primers AFLP, E35 (GAG) e M7 (CTG). Lanes 3 –21 foram gerados a partir da população F2 com o mesmo
primer combinação. Setas no lado esquerdo do gel indicam mapeadas Marcadores AFLP. Marcador de peso
molecular FX174 HaeIII é mostrado na faixa denotada por M com o tamanho (em pb) no lado direito da o gel.
17/01/2023
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Como escolher o marcador?
Característica RFLP RAPD SSR AFLP
Polimorfismo Pontual/InDel Pontual/InDel # Rep. Pontual/InDel
Nível de polimorfismo Médio Médio Alto Médio
Abundancia Alta Média-alta Média Média-alta
Dominância Codominante Dominante Codominante Dominante
[DNA] 10µg 25ng 50ng 500ng
Marcação Sim Não Não Sim/não
Repetibilidade Alta Baixa Alta Média
SNP
Polimorfismo de 
nucleotídeo único
17/01/2023
40
Detecção de polimorfismo resultante de alteração em um 
único nucleotídeo - SNP
Polimorfismo –
Substituição/del
eção/adição –
única base.
Maior 
abundancia no 
genoma
Maior 
polimorfismo em 
regiões não 
codificantes
Maior numero 
de marcas 
associadas a 
fenótipos de 
interesse
Polimorfismos de nucleotídeo único - SNPs
• Variações no DNA em único nucleotídeo que 
ocorrem em mais de 1% de uma população.
• Podem ou não estar em regiões codificantes.
Transversões (Purinas Purimidinas)
A por C ou T ; G por C ou T
Transições (purina purina)
(pirimidina Pirimidina)
A por G ou C por T
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Projeto Genoma humano
1990 – Chefiado inicialmente por 
James Watson
5000 cientistas e 250 laboratórios
15/02/2001
Collins et al.
Venter et al.
Genômica
• Após o sequenciamento completo foi possível avaliar melhor as 
variações no genoma e utilizá-las na agricultura
• Essas alterações poderiam ser responsáveis pelas diferenças 
fenotípicas (associação Genótipo x Fenótipo)
• Identificação de vias metabólicas e genes
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42
Genômica na agricultura
2009
2005 2010
2016
2018
2018
2011
2014
2000
2014
2014
Espécie N. Científico Ano N° SNPs
Milho Zea mays 2009 Aproximadamente 800.000
Soja Glycine max 2010 Aproximadamente 84.000
Arroz Oryza sativa 2005 Aproximadamente 52.000
Batata Solanum tuberosum 2011 Aproximadamente 15.200
Trigo Triticum 2018 Aproximadamente 117.000
Genômica na agricultura
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SNPs
Não condificantes
(ncSNPs)
Codificantes
(cSNPS)
SNPs
exônicos
SNPs candidatos ou 
não sinônimos
SNPs
sinônimos
SNPs
intrônicos
SNPs
promotores
SNPs
regulatórios
Pode afetar a 
função da 
proteína
Não afeta a 
função da 
proteína
Localizado nos
íntrons
Localizados em regiões 
regulatórias
Localizado em 
promotores
Aplicabilidade - SNPs
Espécie Aplicação N° de SNPs identificados Referência
Zea mays L. Diversidade genética e estrutura populacional 56,110 Zhang et al., 2016
Phaseolus vulgaris Estrutura populacional 384 Valdisser et al., 2016
Helianthus annuus L. Construção de mapa de ligação 46,278 Celik et al., 2016
Oryza sativa Diversidade genética e associação genótipo/fenótipo 22,682 Tang et al., 2016
Triticum aestivum L Melhoramento genético - seleção genômica 41,371 Poland et al., 2012
Capsicum spp. Diversidade genética e mapeamento±15,000 Cheng et al., 2016
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Heloisa Oliveira dos Santos
heloisa.osantos@ufla.br