Relatorio - Tecnica de coloração de GRAM

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RELATÓRIO: Técnica de Coloração de GRAM
 
A técnica de coloração de Gram diferencia bactérias Gram-positivas de Gram-negativas a partir da composição e organização da parede celular desses microrganismos, corando em tom roxo as bactérias Gram-positivas e em tom rosa avermelhado as Gram-negativas. No dia 20 de março de 2023 ocorreu a aula prática da disciplina de microbiologia e imunologia, com o intuito de demonstrar de forma prática a técnica, que consiste na aplicação sequencial de cristal violeta, lugol, álcool e por fim, no caso da aula, fucsina, com lavagens entre determinados passos usando água destilada. 
Antes da coloração propriamente dita foi a confecção das lâminas a serem observadas, utilizando como material para análise as colônias de bactérias existentes nos meios de culturas confeccionados na aula do dia 13 de março de 2023. Para as lâminas o procedimento é abrir placa de Petri na qual foi feito o meio de cultura, próximo às chamas do bico de Bunsen para evitar contaminações e utilizar a alça, no caso descartável, para retirar superficialmente fragmentos de colônias e então espalha-los pela lâmina já com certa distância das chamas, se necessário pode-se colocar uma gota de água destilada para melhorar o espalho pela lâmina, sendo que nesse caso foi necessário secar a água próximo às chamas novamente.
 Inserir imagem de duas fotos lado a lado da preparação da placa de petri
 O primeiro passo foi retirar uma amostra de colônia de bactérias presente na placa de petri para lâmina de vidro, deixamos secar por alguns minutos, para fazer a coloração de Gram foi aplicar por toda a extensão coberta de bactérias da lâmina o corante principal, que nesse caso é o cristal violeta ou violeta de cristal, e esse produto ficou agindo por 1 minuto, tendo o objetivo de penetrar pela parede celular de todas as bactérias que estavam presentes na lâmina (ainda sem diferenciá-las) e cora-las inicialmente de roxo, o corante foi fixado somente com o passo dois, no qual ocorreu a formação de cristais com a reação entre o lugol e o cristal violeta.
 
Retirando amostra de bactérias Aplicando o corante cristal violeta
 O segundo passo é retirado o corante cristal violeta com agua destilada e em seguida aplicado o corante lugol, que vai ajudar o cristal violeta a permanecer no interior das bactérias pelo formão de cristais iodo-violeta, após aplicação dele aguardou- se mais 1 minuto, para posteriormente ser removido o excesso com água destilada.
 
Aplicando água destrilada Aplicando o corante lugol 
 Terceiro passo aplicou- se nessa mesma lâmina o terceiro reagente, o álcool acetona vai agir como um descolorante, sua finalidade é secar a parede celular de bactérias Gram positivas (por conta da camada mais espessa de peptideoglicanos compondo a parede celular destas) impossibilitando a saída dos cristais formados no interior dessas bactérias, ao passo que esse álcool dissolveu a parede celular das bactérias Gram- negativas (por conta de sua parede celular menos espessa) possibilitando que os cristais formadas saíssem durante a lavagem, assim iniciou-se o processo de diferenciação das bactérias, tornando as Gram- positivas roxas e deixando as Gram- negativas descoloridas. Por ser uma etapa crítica não pôde ter excesso de lavagem, tendo uma lavagem rápida de apenas 30 segundos após a aplicação do lugol. Essa lavagem foi feita com água destilada, tendo o intuito de retirar o excesso de lugol.
 Aplicando o descorante 
 Quarto passo aplicou- se o último reagente, que foi a fucsina, ela é considerada um corante secundário, porque nessa etapa as células Gram-negativas estavam descoloridas, logo elas receberam essa coloração vermelha da fucsina, nesse processo o reagente foi mantido por 30 segundos, após esse tempo o produto foi apenas escorrido da lâmina, ou seja, essa lâmina não foi mais lavada.
 Depois de todas essas aplicações a lâmina é levada para secagem em ar ambiente, para depois ser analisada em microscópio.
 
 Aplicando o corante fucsina Aplicando agua destilada
 
Quinto passo do processo de coloração de gram, esperamos a lâmina secar por alguns minutos e em seguida analisamos a lâmina no microscópio. Nas imagens abaixo podemos observa bastante presença de bactérias Gram-negativas (sofreu descoloração), mas uma pequena quantidade de bactérias Gram-positivas (não sofreu descoloração). Nas bactérias Gram-positivas observamos que a maioria presenta forma morfológica de cocos (diplocodos, estreptococos e estafilococos) e nas Gram-negativas cocos (sarcinas e estafilococos).
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 Visão da lâmina no microscópio (imagem 1) Visão da lâmina no microscópio (imagem 2)
Essa técnica de coloração diferente ocorre porque o peptidoglicano que é um carboidrato presente na parede celular da bactéria sobre desidatração ou não, no caso da parede celular das bactérias gram-positivas há camadas grande de peptidoglicano, por isso as bactérias absorvem bastante corante e não sofrem descoloração e criam cristais que forma uma barreira o qual não permiti a entrada de outro corante e não deixa o corante que já está dentro sair. Já na parede celular das bactérias gram-negativas por ser formada por uma membrana externa mais uma pequena camada de peptidoglicado, acabam desidratando essa primeira membrana externa e permite que o corante que estava dentro saía facilmente e permitindo a entrada de outro corante.
Essa técnica de coloração gram é muito importante pois através deste método descobrimos o tipo de bactéria, o qual vai auxiliar no tratamento desta doença de forma correta. Se a bactéria for gram-positiva é mais fácil de ser destruída, já a bactéria gram-negativa e mais resiste ao tratamento devido a sua membrana externa possui uma camada de lipopolissacarideo que impede a penetração do antibiótico. Entretanto, o método de coloração de gram não se aplica em todas as bactérias e são mais eficientes em bactéria jovem ou em crescimento.