Atividade Avaliativa n.1 - Biologia Molecular

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Atividade Avaliativa n. 1 – Biologia Molecular
1. Descreva sucintamente os passos da tecnologia do DNA recombinante.
Primeiramente é necessário um organismo, do qual um fragmento do DNA de interesse será extraído e um DNA de rápida replicação (vetor); ambos os DNA’s serão “cortados” por enzimas de restrição (produzidas naturalmente por bactérias para o corte do genoma) e ligados em uma molécula chamada DNA recombinante; os vetores com incorporação do DNA de interesse serão incorporados em outra bactéria que se replicará rapidamente, já com o vetor dentro, num processo chamado de transformação; uma vez que o vetor possui um marcador selecionável para selecionar apenas as células de interesse, ele permite a identificação de moléculas recombinantes; isolando as bactérias que carregam o vetor recombinante, pode-se multiplicar o DNA de interesse, tendo assim, depois de um certo tempo, vários clones de DNA de interesse; uma vez clonado, pode-se caracterizar o DNA, modificar e re-inserir num organismo.
2. Quais as ferramentas moleculares utilizadas nessa tecnologia? Explique-as.
As principais ferramentas são: enzimas de restrição e vetores.
Enzimas de restrição: são enzimas produzidas por bactérias para proteção contra infecções virais. As enzimas de restrição cortam sequências através do reconhecimento das sequências palindrômicas do DNA, com cortes feitos assimetricamente e gerando extremidades coesivas, que vão facilmente se aderir novamente por complementariedade a outra fita do DNA vetor ou com cortes gerando extremidades rombas, que não podem ser utilizadas na tecnologia do DNA recombinante, pois não geram uma ponta fita simples 
Vetores de clonagem: são moléculas de DNA capazes de se replicarem como veículos para transportar fragmentos de DNA de interesse, obtidos por ação das enzimas de restrição. Os vetores precisam apresentar algumas características que o definem como boas moléculas de rapida replica, como: conter marcadores genéticos de seleção, que conferem resistência a antibióticos; habilidade de promover replicação autônoma rápida; conter sítios únicos de restrição para facilitar a clonagem do inserto de DNA; apresentar uma quantidade mínima de DNA não-essencial para otimizar a clonagem.
3. O que se tornou possível com a tecnologia do DNA recombinante?
Foi possível: isolar um gene específico, parte de um gene ou uma região do genoma; produzir a molécula de proteína de interesse em larga escala; aumentar a eficiência da producão de enzimas e drogas para comercialização; modificar organismos existentes para que eles expressem uma característica de interesse que não seja codificada pelo genoma; corrigir defeitos genéticosem organismos complexos, inclusive humanos. 
4. Respondendo a uma questão sobre a possibilidade de se clonarem animais para livrá-los de extinção, um cientista apresenta duas técnicas, I e II, que poderiam ser usados e que estão descritas nos quadros.
TÉCNICA I – 1 - Uma fêmea (animal X) é estimulada com hormônios a produzir vários óvulos. 2 - Essa fêmea é então inseminada artificialmente. 3 - Após alguns dias, os zigotos são retirados da fêmea e divididos em dois. 4 - Cada metade é reimplantada no útero de outra fêmea (receptora), da mesma espécie, gerando um novo animal. 
TÉCNICA II – 1 - Células somáticas são retiradas do corpo de um animal (animal Y), das quais são retirados os núcleos. 2 - Óvulos não fecundados são retirados de um segundo animal (animal Z). O núcleo de cada um desses óvulos é retirado. 3 - O núcleo retirado da célula somática do animal Y é implantado no óvulo sem núcleo do animal Z. A nova célula assim formada começa a se dividir formando um embrião. 4 - O embrião é reimplantado no útero de um terceiro animal (animal W) dando origem a um novo animal. 
Pergunta-se: 
a) Todos os animais produzidos pela técnica I são genotipicamente iguais ao animal X? Justifique. 
Não, pois foram resultados de óvulos diferentes e fecundados por espermatozóides diferentes.
b) O novo animal formado pela técnica II pode ser chamado "clone" do animal Y, Z ou W? Justifique. 
São clones do animal Y, pois ele foi o doador do núcleo retirado da célula somática.
5. Dois cientistas realizaram uma experiência com o objetivo de estudar a transmissão das informações contidas nos genes do núcleo de células de diferentes tecidos. Núcleos de óvulos de rã não fertilizados foram substituídos por núcleos de células somáticas, retiradas de uma mesma rã. Os cientistas observaram que a grande maioria destas células, com seus novos núcleos, resultaram na formação de embriões normais. Explique por que: 
a) esses núcleos transplantados de células somáticas de diferentes tecidos deram origem a indivíduos normais e idênticos; 
O DNA de uma célula somática, além de ser idêntico ao DNA de qualquer outra célula somática do mesmo indivíduo, possui todos os genes necessários para a formação de um indivíduo normal. Por isso foram originados indivíudos normais e idênticos. 
b) o resultado da experiência seria diferente se tivessem sido usados núcleos de células germinativas. 
Células germinativas são haploides e ocorre crossing-over e segregação independente dos pares de cromossomos homólogos durante sua formação, por isso os indivíduos não seriam idênticos.
6. A biotecnologia consiste no uso de sistemas celulares para o desenvolvimento de processos e produtos de interesse econômico ou social. Analise as alternativas abaixo e assinale as corretas:
a. Um clone significa qualquer grupo de células ou organismos produzidos assexuadamente de um único ancestral sexuadamente produzido. 
b. Wilmut e outros pesquisadores (1997) produziram proles vivas via transferência nuclear de células somáticas adultas em ovelhas.
c. A insulina humana e cultivares, como o milho, a batata e a soja, ainda não têm sido possíveis de serem produzidos por técnicas de engenharia genética.
d. O melhoramento de plantas agrícolas é obtido por meio do acúmulo de genes que conferem maior tolerância a doenças e melhor qualidade aos produtos.
e. Entre os métodos biológicos para a introdução de genes em células de mamíferos, vírus e plasmídios podem ser utilizados como vetores.
f. Plantas transgênicas são plantas que contêm um ou mais genes introduzidos pela técnica de transformação genética (DNA recombinante).
7. Quais são as etapas da PCR convencional? Explique o que ocorre em cada fase. Quais os reagentes utilizados e para que servem?
Inicialmente ocorre a desnaturação do DNA de interesse pelo calor, a uma temperatura que varia entre 94 e 95ºC, permitindo a abertura da dupla fita, que é separada em duas fitas simples; após essa separação, ocorre o anelamento, onde um par de primers vai complementar a fita oposta da sequência de DNA de interesse, se ligando a uma região específica, a uma temperatura de 60°C; posteriormente a enzima DNA-polimerase vai adicionar as bases complementares, formando uma nova fita e, com isso, novamente a duplicação da fita de DNA. Essa etapa ocorre a uma temperatura de 72ºC.
Para a realização da PCR, são utilizados: o DNA de interesse; um par de primers sintéticos, que são os iniciadores de cadeia, de uma região específica; a enzima DNA polimerase termoestável, que vai otimizar a reação; os dinucleotídeos trifosfato, que serão inseridos na nova fita de DNA; o tampão, que fornece pH e salinidade ideal para o funcionamento da enzima polimerase e para que as ligações do primer na região de interesse seja específica e um cátion metal divalente (Mg2+) que confere a especificidade de ligação do primer no longo genoma.
8. Para que é realizado a PCR, quais os objetivos?
Para amplificações de regiões específicas do DNA alvo; identificar mutações; análise de polimorfismos de DNA; diagnósticos de doenças genéticas e infecciosas; diagnóstico pré-natal; medicina forense; estudo de animais e plantas fósseis; clonagem de genes; teste de paternidade, dentre outras utilizações.
O objetivo é a produção do DNA in vitro, para que esse possa ser analisado e utilizado de alguma outra maneira
9. Diferencieo PCR convencional do PCR em tempo real? Quais são as vantagens do segundo?
10. Quais são os sistemas de detecção (química da reação) do PCR em tempo real?
11. Quais os tipos de quantificação para o PCR em tempo real?
12. Um fragmento de DNA clonado foi sequenciado usando-se o método químico. Uma parte do auto-radiograma do gel de sequenciamento é representada abaixo. Escreva a seqüência de nucleotídeos da dupla hélice de DNA.
	
	A
	
	G
	
	T
	
	C