Determinação de Clorofila e Carotenóides

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Metodologia para projetos e 
execução 
 
 
 
Determinação de Pigmentos Fotossintéticos por DMSO saturado 
CLOROFILA E CAROTENÓIDES 
 
1. Reagentes 
✓ DMSO e CaCO3 
 
2. Solução de extração 
✓ Preparar 200 mL para um total de 50 amostras. Em um Becker, adicionar 7,0 g de CaCO3 e 200 mL de 
DMSO; 
✓ Submeter a agitação constante em agitador magnético por aproximadamente 30 min; 
✓ Filtrar o reagente com papel de filtro em funil de Buchner com auxílio de bomba de vácuo; 
✓ Acondicionar em frasco âmbar devidamente identificado até o uso; 
 
3. Procedimento experimental 
a) Cortar 3 discos foliares de aproximadamente 1 cm cada e pesar eles (aproximadamente 0,050 g). 
b) Colocar aproximadamente 3 discos foliares em tubos de ensaio cobertos com papel alumínio e adicionar 2,0 
mL da solução de extração (DMSO saturado com CaCO3). 
c) Fechar os tubos e mantê-los sob escuro ou luz difusa por 24 h; (pode ficar até 1 semana) 
d) Incubar em banho-maria a 65°C por 30-45 min; 
e) Proceder as leituras em espectrofotômetro à 665, 649 e 480nm, tendo como “branco” um tubo de ensaio 
contendo 1,0 mL da solução de extração; 
f) Expressar o conteúdo de clorofila a, b e total e de carotenoides em μg/g de acordo com as seguintes 
fórmulas: 
 
Obs.: Determine a umidade foliar para cada tratamento para converter valores de massa fresca (MF) para massa 
seca (MS). Extração reduz a MS em 6%. Assim, não disco extraídos para determinar MS. 
Formula: PIGMENTOS FOTOSSINTÉTICOS = μg/mL x VOLUME EXTRATO x (1/MS) x fator de diluição = μg/g MS 
Wellburn AR (1994) The spectral determination of chlorophylls a and b, as well as total carotenoids, using various solvents with 
spectrophotometers of different resolution. J. Plant Physiol 144(3):307-313. 
Barnes, JD, Balaguer L, Manrique E, Elvira S, Davison AW (1992) A reappraisal of the use of DMSO for the extraction and 
determination of chlorophylls a and b in lichens and higher plants. Environ. & Exp. Bot. 32,85-100. 
Clorofila - mg/L ou μg/mL 
Clfa = 12,47A665 – 3,62A649 
Clfb = 25,06A649 – 6,50A665 
Clftotal(a+b) = 7,15A665 + 18,71A649 
Carotenoides - mg/L ou μg/mL 
Carotenoides = (1000A480 – 1,29 Clfa – 53,78 Clfb)/220