Prévia do material em texto
Estudos Disciplinares Biotecnologia: Avanços e inovações no desenvolvimento de medicamentos e alimentos Prof. Luiz Carlos UNIDADE II Fermentação submersa (FS). Vantagem: facilidade no controle dos parâmetros fermentativos, volume, esterilização, absorção dos nutrientes. Fermentação em substrato sólido (FES). Ausência ou mínima quantidade de água. Vantagem: utilização de meios residuais ou com baixo valor agregado, menor risco de contaminação, maior facilidade de aeração. Desvantagem: restrição ao tipo de micro-organismo, dificuldade em manter temperatura e outros parâmetros fermentativos. Downstream: remoção de impurezas e concentração do produto. Cromatografia, secagem, centrifugação, etc. Obtenção de enzimas Tipos de Fermentadores Fonte: www.china-bioreactor.com Fonte: ATCJB - Microcervejarias - Webnode Obtidas por micro-organismos recombinantes. Hidrolases: amilases (a-amilase, glicoamilase), pectinases e proteases (papaína, bromelina, pepsina). Isomerases: glicose-isomerase. Amilases: panificação, cervejarias, etc. quebra de amido em açúcares Proteases: laticínios, sucos, polpas, etc. clarificação Lipase: sabor ao queijo Invertase: açúcar invertido Pectinase: clarificação do vinho Enzimas na indústria de alimentos Branqueamento da polpa de celulose xilanases. Reduz o consumo de cloretos. Lipases reduz o problema do excesso de resina na madeira. Atualmente: Enzimas oxidativas (lacases e peroxidases) sendo utilizadas no branqueamento. Gerenciamento de resíduos nanomateriais, pectinases. Enzimas na indústria de papel e celulose Fonte: Hydrothermal Lacases: alvejamento do algodão. Lipases: remoção de lubrificantes e melhorias no poliéster. Limpeza de efluentes. Proteases: impedir o encolhimento do tecido, diminuição da feltragem, melhoria no tingimento e brilho do tecido. Amilases: desengomar o tecido. Celulases: envelhecimento do tecido (jeans) Enzimas na indústria têxtil Fonte: Grupo SRC Tecnologia Segundo produto mais explorado na área biotecnológica. Utilização: Produção de medicamentos e desenvolvimento de novos produtos. Produtos de higiene pessoal, esfoliação da pele e antissinais (enzimocosméticos). Digestão, debridamento e cicatrização de feridas. Terapia anticâncer. Problemas: baixa potência, seletividade, regulação inadequada da atividade, imunogenicidade, custo, etc. Enzimas na indústria farmacêutica Plasmina cicatrizante L-asparaginase anticancerígeno Bromelima processos inflamatórios Lisozima antibiótico Tripsina tratamento de úlceras Colagenase debridamento de feridas úlceras dérmicas Enzimas na indústria farmacêutica: medicamentos Fonte: Drogaria Araújo Fonte: IndiaMart Proteases peeling, tratamento de estrias, combate à oleosidade. Catalase antissinais, combate aos radicais livres. Glicose-oxidade enxaguante bucal. Lactase tinturas. Glicoamilase remoção da placa dentária. Enzimas na indústria farmacêutica: cosméticos Fonte: site lojas Americanas Brasil: representa 60% do mercado de consumo de enzimas na América Latina. Cerca de 85% importação Cerca de 15% exportação Mercado Fonte: Estudos da Freedonia Group Incorporated Importação Exportação Dentre os itens expostos abaixo qual não deve ser visto como uma desvantagem em relação ao uso de enzimas na área farmacêutica? a) Baixa potência. b) Dificuldade na regulação da atividade. c) Imunogenicidade. d) Baixo custo de produção. e) Seletividade inadequada. Interatividade Dentre os itens expostos abaixo qual não deve ser visto como uma desvantagem em relação ao uso de enzimas na área farmacêutica? a) Baixa potência. b) Dificuldade na regulação da atividade. c) Imunogenicidade. d) Baixo custo de produção. e) Seletividade inadequada. Resposta Teve início na década de 1960. Orientou a pesquisa e o desenvolvimento dos modernos sistemas de produção agrícola para a incorporação de pacotes tecnológicos de suposta aplicação universal, que visavam a maximização dos rendimentos dos cultivos em distintas situações ecológicas. Elevar ao máximo a capacidade potencial dos cultivos, a fim de gerar as condições ecológicas ideais afastando predadores naturais via utilização de agrotóxicos, contribuindo, por outro lado, com a nutrição das culturas através da fertilização sintética. Utilização intensiva de agrotóxicos e fertilizantes, aliado ao desenvolvimento genético de sementes. Revolução Verde Grande importância na agricultura mundial, tendo grande parte da área cultivada com espécies de interesse agronômico ocupada por variedades transgênicas. A área de cultivo de transgênicos no mundo cresce desde as primeiras autorizações comerciais em 1996. Mais de 13 milhões de agricultores e mais de 125 milhões de hectares em 25 países. Brasil: segundo o relatório do Serviço Internacional para a Aquisição de Soluções em Agrobiotecnologia (ISAAA), plantou mais de 21 milhões de hectares com culturas geneticamente modificadas (segundo produtor mundial). Estados Unidos e Argentina, respectivamente, primeiros e terceiro maiores produtores mundiais. Plantas Transgênicas Segurança Alimentar: funcionamento das toxinas ou substâncias alergênicas presentes nas plantas transgênicas. Controle da transferência de genes e perda da biodiversidade. Poder das empresas produtoras de sementes e insumos derivados da aplicação de transgenia em produtos agrícolas. Preocupações Fonte: portal Uberaba 73% espécies tolerantes a herbicidas. 18% espécies resistentes a insetos. 9% espécies com as duas funções. Taxa de crescimento: 46,42%/ano. Argentina: 80% ao ano. Quatro grupos de commodities: Soja (60% da área plantada por GM) Milho Algodão Canola Cultivos Geneticamente Modificados Fonte: Site Poder360 55% da produção mundial é de transgênicos. Taxa atinge entre 85% nos EUA e 99% na Argentina. Soja Fonte: James (2005) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Em % área plantada 0,06 0,47 0,8 0,29 0,46 0,29 0,13 0,11 0,09 0,09 0,30 0,28 0,09 0,09 0,52 0,54 0,58 0,23 0,13 0,06 0,05 0,05 0,12 0,19 0,63 0,62 0,21 0,13 0,05 0,11 0,23 0,61 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 Anos Soja Milho Algodão Canola 2017: Embrapa desenvolveu a primeira espécie transgênica de algodão (BRS 433 FL B2RF) Alta produtividade, estabilidade de produção, fibra de elevada qualidade, além da resistência às principais lagartas que atacam o algodoeiro e ao herbicida glifosato. Todas possuem a tecnologia Bollgard II Roundup Ready Flex (B2RF, da Bayer), que conferem resistência ao herbicida glifosato e a lagartas. Recomendado para produção no Cerrado e estados do MATOPIBA. Participação Mundial Participação Mundial Produtos / Países Participação na Produção Mundial (%) Adoção de Cultivos GM Soja (em grãos) Total 93,0 Estados Unidos 35,0 Sim (85%) Brasil 27,0 Sim (10-20%) Argentina 18,0 Sim (99%) China 9,0 Não Índia 4,0 Não Milho Total 71,0 Estados Unidos 40,0 Sim (30%) China 18,0 Não Brasil 7,0 Não México 3,0 Sim (1) Argentina 2,0 Sim (1) Algodão (em plumas) Total 71,0 China 26,0 Sim (58%) Estados Unidos 20,0 Sim (37%) Índia 12,0 Sim (1) Paquistão 9,0 Sim (1) Brasil 4,0 Não Fonte: FNP-Agrianual (2004) e James (2004). (1) Sam informação exata sobre ataxa de adoção (adaptado) Grande potencial – diversidade biológica (20% do total mundial). Forte sistema nacional de pesquisa agrícola. Vantagem ambiental: climas tropical e subtropical, ocorrência de vasta região de Cerrado (rápida expansão de área cultivável e produtividade) e germoplasma selecionado (adaptado às condições ambientais do país). Exemplos de sucesso da pesquisa na diversificação e melhoramento de espécies: soja no Cerrado e frutas no Nordeste. Pesquisas genômicas apoiadas pelo setor privado em colaboração com institutos públicos de pesquisa. 2000: Quase 7000 pesquisadores e 1718 grupos de pesquisa (85% no setor agrícola). Brasil e a Biotecnologia Agrícola Sementes melhoradas com apoio das multinacionais (Bayer, Du Pont). Mudas e matrizes. Inoculantes e controle biológico. Embrapa Fonte: EMBRAPA e CIB (2004) (adaptado) Produtos Instituição • Plantas que produzem hormônios Embrapa/Unicamp • Mamão resistente ao vírus da manda anelar Embrapa • Feijão tolerante ao vírus do mosaico dourado Embrapa • Soja tolerante a herbicida Embrapa • Milho com alto teor de metionina Embrapa • Milho e Sorgo resistente a alumínio Embrapa • Batata resistente a vírus Embrapa • Arroz resistente a insetos Universidade Federal do Rio de Janeiro • Laranja resistente a vírus Allelyx • Maracujá resistente a doenças Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz - Esalq • Eucalipto com maior produção de celulose Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz - Esalq Redução do gasto com inseticidas. Maior incidência de pragas acaba favorecendo a substituição por OGM. Dois principais: algodão Bt e milho Bt. Inserção do gene do Bacillus thuringiensis, resistente a pragas de insetos. Produção de algodão consome 25% dos defensivos agrícolas (praguicidas). China: maior produtor mundial. Gasto de 20% do custo total de produção é com defensivos agrícolas. Redução de 80% nos custos com defensivos agrícolas a partir da adoção do OGM. Cultivos resistentes a insetos Fonte: CIB Herbicida líder na agricultura mundial. Tecnologia Round up Ready (RR): soja, milho e algodão. Considerado de baixa toxicidade a humanos e animais. Uso excessivo e indiscriminado permitiu a seleção natural de espécies invasoras resistentes. Nova tecnologia da Bayer: Intacta 2 Xtend, a qual, além de resistência ao glifosato e a algumas lagartas, também incorpora resistência ao Dicamba, herbicida desenvolvido há décadas para o controle de invasoras de folhas largas. EUA: 10 milhões de hectares de sementes de soja com a tecnologia Intacta 2 Xtend. 2019: 60% da área de cultivo de soja nos EUA utilizando a nova tecnologia. Glifosato Herbicida de amplo espectro (ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzoico). Primeiro registro: 1967. Marcas: Dianat, Banvel, Diablo, Oracle e Vanquish. Algumas espécies de ervas daninhas desenvolveram resistência. Problemas de volatilização levam o produto a se espalhar para culturas vizinhas. Bayer (Monsanto) oferece culturas resistentes ao Dicamba. Formulação de menor volatilidade foi aprovada pela EPA em 2016. Moderadamente tóxico por ingestão e ligeiramente tóxico por inalação ou exposição cutânea. Estudos sugerem que ele afeta peixes (disruptor endócrino). Dicamba Dentre os países abaixo, qual não apresenta aprovação regulamentada em relação a produtos agrícolas geneticamente modificados? a) EUA. b) China. c) Brasil. d) Argentina. e) Alemanha. Interatividade Dentre os países abaixo, qual não apresenta aprovação regulamentada em relação a produtos agrícolas geneticamente modificados? a) EUA. b) China. c) Brasil. d) Argentina. e) Alemanha. Resposta Setor Econômico 1996 2001 2006 Taxa de Crescimento Anual Terapêuticos 7555 13935 25545 13 Diagnósticos 1760 2705 4050 9 Agricultura 285 740 1740 20 Especialidades 275 690 1600 19 Diagnósticos Não Médicos 225 330 465 8 Total 10100 18400 33400 12 Comercialização de produtos biotecnológicos nos EUA Fonte: Genetic Engineering News. O instituto de pesquisa indiano TEI anunciou um projeto de desenvolvimento da chamada mostarda dourada, cujo óleo tem alto teor betacaroteno, precursor da vitamina A, que ajuda a combater diversas doenças, como a cegueira noturna, a xeroftalmia (ressecamento da córnea), diarreias e sarampo. A pesquisa é conjunta com a Universidade de Michigan e a Monsanto. A deficiência em vitamina A atinge cerca de 250 milhões de pessoas no mundo. Mostarda com alto teor de betacaroteno Fonte: Mundo Saudável Desenvolvido pelo Prof. Ingo Potrykos – Instituto de Tecnologia em Zurique. Objetivo: adequar a ingestão de vitamina A. Arroz apresenta o menor código genético entre os cereais. Objetivo de promover a modificação em milho (base de alimentação em alguns países africanos). Também tem havido pouca pesquisa sobre quão bem o betacaroteno se manterá quando armazenado por longos períodos entre as safras, ou quando cozido usando métodos tradicionais. Golden Rice foi um dos sete vencedores do Patents for Humanity Awards de 2015 pelo Patent and Trademarke Office dos EUA. Em 2018 vieram as primeiras aprovações como alimento na Austrália, Nova Zelândia, Canadá e EUA. Arroz Dourado Segundo a revista “Nature Biotechnology”, graças à injeção de um único gene capaz de absorver um excedente de sal em plantações de tomate, cientistas conseguiram fazer crescer e desenvolver em água contendo forte teor de sódio, tomates perfeitamente comestíveis. O gene introduzido atua sobre uma proteína como um filtro capaz de captar e isolar o sódio excedente. Embrapa: desenvolveu um novo tipo de tomate com até três vezes mais licopeno e que também se mostra mais resistente a pragas (reduzindo o uso de defensivos agrícolas). (não se trata de OGM). Outros casos: milho, laticínios e soja com melhora na qualidade nutricional. Tomates resistentes ao excesso de sal Gene de interesse. Técnica de transformação das células vegetais através da introdução do gene de interesse. Técnica para gerar a planta inteira a partir de uma só célula transformada. Procedimento para obtenção do OGM Planta Transgênica contendo tanto os genes naturais quanto o gene adicional inserido e proveniente de algum outro organismo. Construção de bibliotecas genômicas. DNA do organismo contendo o gene de interesse é extraído. DNA é cortado em fragmentos menores utilizando as enzimas de restrição. Estes fragmentos são, então, ligados a outros fragmentos de DNA, mas que podem se replicar em bactérias, onde este material é inserido e replicado por várias vezes. Depois, seleciona-se a colônia de bactérias que contém o fragmento de DNA correspondente ao gene de interesse. Isolamento do gene Isolamento do gene Fonte: https://midia.atp.usp.br DNA genômico DNA recombinantes Fragmentos de DNA Construção dos vetores Clivagem com endonucleases Introdução dos vetores em bactérias Gene que codifica uma proteína capaz de modificar herbicidas, inativando-os. Os herbicidas são muito usados no controle de ervas daninhas, entretanto, algumas culturas não sobrevivem à aplicação deste produto. Deste modo, culturas contendo este gene poderiam tornar-se resistentes ao herbicida, facilitando assim o controle das ervas. Gene que codifica uma proteína de alto valor nutricional. Genes bacterianos que codificam proteínas com propriedades tóxicas para insetos. Os insetos que se alimentassem de plantas expressando este gene morreriam ou se desenvolveriam com menor eficiência, levandoao seu controle na cultura. Genes de interesse agronômico Eletroporação: Protoplastos são células vegetais desprovidas de parede celular. Serão incubados em meio contendo os genes a serem inseridos e será aplicada uma corrente elétrica em alta voltagem para modificar a estrutura da membrana celular e permitir a penetração dos genes e inserção ao genoma. Biobalístico: Microprojéteis de ouro ou tungstênio cobertos com os genes a serem inseridos serão acelerados na direção das células vegetais. Ocorrerá a dissociação do DNA no interior da célula e a integração do gene exógeno no genoma. Transferência dos genes de interesse Regeneração a partir das células transformadas Fonte: site EMBRAPA Explantes oriundos de folhas imaturas. Calos embriogênicos obtidos após quatro subcultivos em meio de cultivo. Bombardeamento do gene de interesse (biobalística). Regeneração dos calos embriogênicos. Alongamento e enraizamento das plantas transgênicas. Aclimatização. Multiplicação e avaliação dos eventos transgênicos (áreas credenciadas pela CNTBio). Fase final de comercialização e incorporação dos cultivares OGM. Etapas de regeneração e transformação do OGM Dentre as diferentes etapas de obtenção de um OGM, qual deve ser vista como a última a ser desenvolvida? a) Isolamento do gene. b) Incorporação dos cultivares. c) Bombardeamento dos genes. d) Construção dos vetores. e) Seleção das bactérias de interesse. Interatividade Dentre as diferentes etapas de obtenção de um OGM, qual deve ser vista como a última a ser desenvolvida? a) Isolamento do gene. b) Incorporação dos cultivares. c) Bombardeamento dos genes. d) Construção dos vetores. e) Seleção das bactérias de interesse. Resposta Fármacos obtidos por rota biotecnológica. Proteínas obtidas por tecnologia do DNA recombinante. Envolve o cultivo de células ou micro-organismos e sua modificação para a produção de substâncias em condições controladas. Primeira Geração: biofármacos que são constituídos de sequências de aminoácidos semelhantes às das proteínas naturais. Segunda Geração: proteínas modificadas para apresentar propriedades terapêuticas diferenciadas em relação às naturais. Exemplo: alteração do efeito terapêutico. Biofármacos Fonte: Ciência Informativa Produzidos por células artificiais chamadas hibridomas. Hibridoma: célula construída a partir da fusão de um linfócito clonado com uma célula tumoral. Produzem anticorpos sempre idênticos em especificidade, estrutura e afinidade. Classificam-se em murinos, quiméricos, humanizados e humanos segundo o tipo de cadeias que compõem a estrutura do anticorpo. Primeiros: fusão de uma linha celular de mieloma murino com células imunitárias, constituindo os chamados murinos. Surgiram problemas de compatibilidade pois havia produção de anticorpos humanos antimurinos. Anticorpos Monoclonais Quiméricos: substituição de algumas regiões das cadeias dos anticorpos por cadeias humanas. Local de reconhecimento do antígeno não é humano. Humanizados: somente as partes das cadeias variáveis se constituem em porção murina. Animais Transgênicos: ao transportarem genes humanos, podem produzir anticorpos humanos específicos a determinado antígeno para estimular a expansão clonal e obterem-se então os anticorpos monoclonais humanos pretendidos. Anticorpos Monoclonais Fonte: FCAV - UNESP Cadeia leve Cadeia pesada Ligações dissulfídricas Anti-AGO2 humana: testes de imunoprecipitação, imunoeletroforese (Western Blot) e imuno-histoquímica. Investigações relacionadas ao HIV. Brentuximabe vedotin. É um anticorpo que tem como alvo o antígeno CD30, ligado à quimioterapia MMAE. Esse medicamento é usado no tratamento do linfoma de Hodgkin e do linfoma anaplásico de grandes células. Ado-trastuzumabe emtansina. É um anticorpo que tem como alvo a proteína HER2, ligado à quimioterapia DM1. É usado no tratamento de alguns pacientes com câncer de mama HER2+. Exemplos Fonte: empr.com Fonte: OncLive Bevacizumabe: É um anticorpo monoclonal que tem como alvo a proteína VEGF, que afeta o crescimento dos vasos sanguíneos tumorais. Pode provocar efeitos colaterais, como aumento da pressão arterial, hemorragia, problemas de cicatrização, coágulos sanguíneos e problemas renais. Cetuximabe: É um anticorpo que tem como alvo a proteína EGFR, que é encontrada em células normais da pele, bem como em alguns tipos de células cancerígenas. Este medicamento pode provocar erupções importantes em alguns pacientes. Ocrelizumabe: tratamento de esclerose múltipla. Tocilizumab: tratamento de artrite reumatoide. Potencial: transplantes Exemplos Fonte: OncLive Possibilidade de realizar diversos testes a partir de uma única amostra de sangue. Testes portáteis, colorimétricos, podem ser realizados no próprio consultório e alguns em casa. A indústria de reagentes para diagnóstico ainda é pequena, em relação ao tamanho do mercado farmacêutico, mas espera-se um forte crescimento nos próximos anos, motivado pela evolução da chamada medicina personalizada. Medicina Personalizada: intervenções de base genética. Testes passam a ser parte de um pacote terapêutico: Testes de diagnóstico: predição de doenças pela genética e seu estágio evolutivo. Drogas desenhadas para atacar genes específicos (Farmacogenômica). Diagnóstico Primeira Geração: são oriundas de vírus ou bactérias inativados (mortos) ou atenuados. Segunda geração: utilizam a tecnologia do DNA recombinante. Estas vacinas recombinantes geralmente são voltadas para a prevenção do mesmo tipo de enfermidades das vacinas convencionais. Salto qualitativo: são mais seguras, menos passíveis de contaminação no processo produtivo e podem ser também mais eficazes. Vacinas Vacinas Fonte: Site Invenções Brasileiras (adaptado) Desenvolvida pela Faculdade de Medicina da USP – Ribeirão Preto CLONAGEM DNA M.Tuberculosis GÊNES QUE EXPRESSAM ANTIGENOS MICROBACTERIANOS HSP65, HSP70, ESAT6, MPT, ML36, MT38 PLASMÍDEO CLONAGEM TRANSFORMAÇÃO ISOLAMENTO DOS PLASMÍDEOS VACINA DE DNA CRESCIMENTO DAS BACTÉRIAS VACINAÇÃO BACTÉRIA F. coli Forte interesse da indústria farmacêutica. São chamadas de vacinas gênicas. Os genes para o antígeno de interesse são localizados e clonados. DNA será injetado diretamente no músculo (pistola de ar comprimido). Células musculares absorvem o material genético e passam a expressá-lo desencadeando a resposta imunológica. Vantagens: custo reduzido, CQ simplificado, condições de conservação menos restritas (sem refrigeração). Possibilidade de uso como vacina terapêutica (controlar doenças já existentes). Exemplos: vacinas para HIV e câncer. Terceira Geração Vendas Globais Setor Farmacêutico Mercado Fonte: Evaluate Pharma 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 336 383 422 452 486 524 560 569 577 606 615 631 655 675 702 38 46 56 66 79 96 110 119 130 140 151 163 175 184 192 Empresas Setor Farmacêutico Biotecnologia Mercado Fonte: Evaluate Pharma Ranking Empresa Vendas globais em US$ Bilhões Market share (%) 2011 2018 %CAGR 11-18 2011 2018 Var 1 Roche 25,7 32,6 +3% 18,1 15,2 -2,9% 2 Novo Nordisk 11,4 19,6 +8% 8,0 9,1 +1,1% 3 Sanofi 11,5 17,8 +6% 8,1 8,3 +0,2% 4 Pfizer 10,1 14,3 +5% 7,1 6,7 -0,4% 5 Amgen 14,4 13,6 -1% 10,1 6,3 -3,8% 6 GlaxoSmithk line 4,712,5 +15% 3,3 5,8 +2,5% 7 Johnson & Johnson 6,8 8,5 +3% 4,8 4,0 -0,8% 8 Merck & Co 7,7 8,4 +1% 5,4 3,9 -1,5% 9 Eli Lilly 5,3 8,3 +7% 3,7 3,8 +0,2% 10 Abbott Laboratories 8,1 7,6 -1% 5,7 3,5 -2,2% Empresa Segmento Gilead Sciences Inc. HIV / AIDS, doença hepática e problemas metabólicos Amgen Inc. Câncer, hematologia, doenças inflamatórias, nefrologia, saúde óssea Celgene Corp. Doenças do câncer e doenças imunes e inflamatórias Biogen Inc. Doenças neurodegenerativas, hemofilia, doenças autoimunes Regeneron Pharmaceuticals Inc. Proteínas e terapias de anticorpos Alexion Pharmaceuticals Inc. Transtornos graves e ultra raros Vertex Pharmaceuticals Inc. Drogas de moléculas pequenas Mercado Fonte: Site Infomoney Trata-se de uma geração de vacinas onde o DNA deverá ser inserido diretamente no músculo da pessoa e passará a expressar a proteína relacionada gerando a resposta imunológica. A qual(is) geração(ões) de vacinas o texto se refere? a) Primeira. b) Segunda. c) Terceira. d) Segunda e Terceira. e) Primeira e Segunda. Interatividade Trata-se de uma geração de vacinas onde o DNA deverá ser inserido diretamente no músculo da pessoa e passará a expressar a proteína relacionada gerando a resposta imunológica. A qual(is) geração(ões) de vacinas o texto se refere? a) Primeira. b) Segunda. c) Terceira. d) Segunda e Terceira. e) Primeira e Segunda. Resposta ATÉ A PRÓXIMA!