CE-AULA1 Principios_Marina

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- QFL 2242 -
ELETROFORESE CAPILAR
PRINCÍPIOS
ELETROFORESE CAPILAR
TÉCNICA DE SEPARAÇÃO BASEADA NA MIGRAÇÃO DIFERENCIADA DE COMPOSTOS IÔNICOS OU IONIZÁVEIS EM UM CAMPO ELÉTRICO
MEIOS: PAPEL, AMIDO, AGAROSE, ACETATO DE CELULOSE, GEL DE POLIACRILAMIDA, etc
FSCE
NACE
MEEKC
MEKC
CEC
CSE
CIEF
CITP
REVESTIMENTO DE POLIIMIDA
CENTRO
PAREDE
TEMPERATURA
0 25 175 190
DIÂMETRO,m
r1
r2
r3
PERFIL DE TEMPERATURA
NO INTERIOR DE UM CAPILAR
1930	FRONTEIRA MÓVEL	 A. TISELIUS
1948	PRÊMIO NOBEL		 Uppsala University, Suécia
	Colunas de 300 m	 S. HJERTÉN
				 Uppsala University, Suécia
1979	Capilares de 100 m	 F. M. EVERAERTS
	Separação de 16 ânions	 Eindhoven University of Technology, Holanda
1981	Capilares de 75 m	 J. JORGENSON
	FSCE – teoria simplificada	 University of North Carolina, EUA
	LIF – detector de 		 R. ZARE
	fluorescência 		 Stanford University, EUA
	induzida por laser		 E. YEUNG
				 Iowa State University, EUA
	Detectores		 E. EWING
	Eletroquímicos 		 Pennsylvania State University, EUA
1984	MEKC			 S. TERABE
				 Kyoto University, Japão
1986		INSTRUMENTOS COMERCIAIS
1987	CGE			 B. KARGER
				 Northeastern University, EUA
1991	CEC			 KNOX e GRANT
	separação de HPA´s	 University of Edinburg, Escócia
1997		MICROCHIP TECHNOLOGY
SISTEMA PARA ELETROFORESE CAPILAR
FONTE DE ALTA TENSÃO
DETECTOR
ELETRODO
CAPILAR
RESERVATÓRIO PARA O ELETRÓLITO
DISPOSITIVO PARA CONTROLE DE TEMPERATURA
CAIXA DE ACRÍLICO
P
h
vácuo
MODOS
DE
INJEÇÃO
+
HIDROSTÁTICA
ELETROCINÉTICA
INJEÇÃO HIDRODINÂMICA
INJEÇÃO ELETROCINÉTICA
MODOS DE DETECÇÃO	LIMITES DE DETECÇÃO
				TÍPICOS, mol/L
	ABSORBÂNCIA
	direta				 10-5  10-6 
	indireta				 10-4  10-5
	FLUORESCÊNCIA
	direta (lâmpada)			 10-7  10-8 
	direta (laser)			 10-9  10-12 
	indireta				 10-6  10-7 
	RAMAN				 10-6  10-7
	ÍNDICE DE REFRAÇÃO
	direto (laser)			 10-5  10-6
	CONDUTIVIDADE		 10-5  10-6
	AMPEROMETRIA		 10-8  10-9
	ESPECTROMETRIA DE		 10-4  10-9 
	MASSAS 
	RADIOMETRIA			 10-9  10-11
	
I0
I
LEI DE BEER
SOLUTO
 = 103 L mol-1 cm–1
C = 1 mmol L-1 =
CUBETA DE 1 cm
 A = 1
CAPILAR DE 50 m
 A = 0,005
FATOR DE 200
 I0
log = A =  b C
 I
F1 = q E
F2 = f v
F3
F4
ESTADO ESTACIONÁRIO:
F1 + F2 + F3 + F4 = 0
MIGRAÇÃO ELETROFORÉTICA
v
E
	q E
v = =  E
	 f 
O
H
O
P
O
P
O
C
H
2
O
O
O 
H
O
 H
O
 H
H
 O
N
N
N
H
N
N
H
N
H
O
O
N
H
N
N
H
N
O
N
H
2
N
N
H
H
2
N
O
NUCLEOTÍDEO
URACILA
CITOSINA
ADENINA
GUANINA
BASE
N
H
2
ADENOSINA
GUANOSINA
N
H
N
N
R
N
O
N
H
2
H
N
N
R
H
2
N
O
CITIDINA
N
N
R
H
2
N
O
H
N
N
R
O
O
URIDINA
N
H
N
O
O
R
N
H
2
NH
N
N
R
N
N
H
2
N
N
N
R
N
N
H
N
N
R
N
O
N
H
2
N
N
N
R
N
O
N
H
2
 
 		[H+]n
0 =	 ───────────────────────────────────────────
	 [H+]n + K1 [H+]n-1 + K1 K2 [H+]n-2 + ... + K1 K2...Kn
 
 
	 	K1 [H+]n-1
1 =	 ───────────────────────────────────────────
	 [H+]n + K1 [H+]n-1 + K1 K2 [H+]n-2 + ... + K1 K2...Kn
 
 	
		K1 K2 [H+]n-2
2 =	 ───────────────────────────────────────────
 	[H+]n + K1 [H+]n-1 + K1 K2 [H+]n-2 + ... + K1 K2...Kn
 
 
		K1 K2...Kn
n =	 ───────────────────────────────────────────
	 [H+]n + K1 [H+]n-1 + K1 K2 [H+]n-2 + ... + K1 K2...Kn
 
 
 
MOBILIDADE EFETIVA
eff)i =  j j
H3A
H2A-
A3-
HA2-
H3A
H2A-
HA2-
A3-
pKa1
pKa2
pKa3

MOBILIDADE EFETIVA DE UM ÁCIDO TRIPRÓTICO
EXERCÍCIO:
Calcule a mobilidade efetiva dos ácidos fórmico e acético nos pH 2, 5 e 9.
Qual o melhor pH para a separação dos dois solutos?
Dados: ác. fórmico: pKa = 3,752; formiato = 56,6 x 10-5 cm2 V-1 s-1; ác. acético: pKa = 4,756; acetato = 42,4 x 10-5 cm2 V-1 s-1
eff)i =  j j
HA + H2O = A- + H3O+
A- + HA = 1 
 [A-]
A- = 
 [A-] + [HA]
 [HA]
HA = 
 [A-] + [HA]
 [A-][H3O+]
Ka = 
 [HA]
EXERCÍCIO:
Calcule a mobilidade efetiva dos ácidos fórmico e acético nos pH 2, 5 e 9.
Qual o melhor pH para a separação dos dois solutos?
Dados: ác. fórmico: pKa = 3,752; formiato = 56,6 x 10-5 cm2 V-1 s-1; ác. acético: pKa = 4,756; acetato = 42,4 x 10-5 cm2 V-1 s-1
eff)ácido = A- A- + HA HA 
HA = 0, espécie neutra 
eff)ácido = A- A-
 [A-]
A- = 
 [A-] + [HA]
 [A-][H3O+]
Ka = 
 [HA]
 [A-] 1 Ka
A- = = =
 [A-] + ([A-][H3O+]/Ka) 1 + [H3O+]/Ka Ka + [H3O+]
EXERCÍCIO:
Calcule a mobilidade efetiva dos ácidos fórmico e acético nos pH 2, 5 e 9.
Qual o melhor pH para a separação dos dois solutos?
Dados: ác. fórmico: pKa = 3,752; formiato = 56,6 x 10-5 cm2 V-1 s-1; ác. acético: pKa = 4,756; acetato = 42,4 x 10-5 cm2 V-1 s-1
pH 2:
(eff)ác. acético = 10-4,756/ (10-4,756 + 10-2) x -42,4 x 10-5
 = -7,42 x 10-7 cm2V-1s-1
(eff)ác. fórmico = 10-3,752/ (10-3,752 + 10-2) x -56,6 x 10-5 
 = -9,84 x 10-6 cm2V-1s-1
 Ka
eff)ácido = A- A- = A- 
 Ka + [H3O+]
EXERCÍCIO:
Calcule a mobilidade efetiva dos ácidos fórmico e acético nos pH 2, 5 e 9.
Qual o melhor pH para a separação dos dois solutos?
Dados: ác. fórmico: pKa = 3,752; formiato = 56,6 x 10-5 cm2 V-1 s-1; ác. acético: pKa = 4,756; acetato = 42,4 x 10-5 cm2 V-1 s-1
pH 9:
(eff)ác. acético = 10-4,756/ (10-4,756 + 10-9) x -42,4 x 10-5
 = -4,24 x 10-4 cm2V-1s-1
(eff)ác. fórmico = 10-3,752/ (10-3,752 + 10-9) x -56,6 x 10-5 
 = -5,66 x 10-4 cm2V-1s-1
pH 5:
(eff)ác. acético = 10-4,756/ (10-4,756 + 10-5) x -42,4 x 10-5
 = -2,70 x 10-4 cm2V-1s-1
(eff)ác. fórmico = 10-3,752/ (10-3,752 + 10-5) x -56,6 x 10-5 
 = -5,36 x 10-4 cm2V-1s-1
EXERCÍCIO:
Calcule a mobilidade efetiva dos ácidos fórmico e acético nos pH 2, 5 e 9.
Qual o melhor pH para a separação dos dois solutos?
Dados: ác. fórmico: pKa = 3,752; formiato = 56,6 x 10-5 cm2 V-1 s-1; ác. acético: pKa = 4,756; acetato = 42,4 x 10-5 cm2 V-1 s-1
mobilidade efetiva versus pH
ác. acético
ác. fórmico
SILANOL
silanóis vicinais
(ponte de hidrogênio)
SILOXANO
silanóis geminais
silanol isolado
silanol dissociado
SUPERFÍCIE
SOLUÇÃO
SÍLICA FUNDIDA
Si OH + H2O
 pKa = 5,9
 Si O- + H+
 Si OH
 O
Si O Si O
 O H
Si O Si O
 O H
Si O Si O
 O
Si O Si
 O O:
Si O Si
 O
Si O Si OH
 O OH
 Si
 OH 
SUPERFÍCIE
CAMADA
COMPACTA
CAMADA
DIFUSA
SOLUÇÃO
PLANO DE
CISALHAMENTO
IHP
OHP
DUPLA CAMADA ELÉTRICA
SUPERFÍCIE
dx
x
F2
F1
F3
E
v
CAMADA DIFUSA
MIGRAÇÃO ELETROOSMÓTICA
F1 = E  dx
F2 =  (dv/dx)x+dx
F3 =  (dv/dx)x
*exercício: obter a equação de osm
  0 
osm = 
 
PERFIL DO POTENCIAL COM A DISTÂNCIA SEGUNDO A TEORIA DE DEBYE-HÜCKEL
10 mM
1 mM
POTENCIAL, mV
3:3
100 mM
1:1
2:2
DISTÂNCIA, nm
1.0
0.5
0.0
*exercício: gerar os perfis de potencial com a distância
FLUXO
ELETROOSMÓTICO
FLUXO
LAMINAR
PERFIL RADIAL DA VELOCIDADE
PYREX
SÍLICA
TEFLON
pH
MOBILIDADE ELETROOSMÓTICA
(104 cm2 V-1 s-1)
FLUXO ELETROOSMÓTICOEM DIFERENTES MATERIAIS
 3 4 5 6 7 8
4
3
2
1
 Si OH
 O
Si O Si O
 O H
Si O Si O
 O H
Si O Si OH
 O
Si O Si
 O O:
Si O Si
 O
Si O Si OH
 O OH
 Si
 OH 
 Si OH
 O
Si O Si O
 O H
Si O Si O
 O H
Si O Si O
 O
Si O Si
 O O:
Si O Si
 O
Si O Si OH
 O OH
 Si
 OH 
Si C18H37
CH3
CH3
+ HCl
SILANIZAÇÃO
Cl Si C18H37
CH3
CH3
 Si OH
 O
Si O Si O
 O
Si O Si O
 O 
Si O Si OH
 O
Si O Si O
 O
Si O Si OH
 O
Si O Si O
 O OH
 Si
 OH 
- Si – CH2 – CH2 – CH2 – NH2
- Si – CH2 – CH – CH2 – OH
- Si – CH2 – CH2 – CH2 – CN
- Si – CH2 – CH2 – CH2 – SO3H
OH
CAPILARES REVESTIDOS
controle do eof
v´osm
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
FLUXO NORMAL
vosm
monômero
semi-micela
mono-camada
FLUXO INVERTIDO
DESATIVAÇÃO DINÂMICA
dupla-camada
I0
I
Ia
Ib
II
-
-
Ia
Ib
I
II
Csuperfície
Csolução
força iônica
ISOTERMAS
CTAB
DDAB
Characterization of Surfactant Coatings in Capillary Electrophoresis by Atomic Force Microscopy
Nicole E. Baryla, Jeremy E. Melanson, Mark T. McDermott, and Charles A. Lucy*
Department of Chemistry, University of Alberta, Edmonton, Alberta T6G 2G2, Canada
Anal. Chem. 2001, 73, 4558-4565
+
INJEÇÃO
DETECÇÃO
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
vosm
vi
vef
CE, (antigo CZE ou FSCE)
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
  ELETROFORESE CAPILAR EM SOLUÇÃO LIVRE
 Ldet Ldet Ldet Ltot
ti = = =
 vi vosm + vef (osm + ef) V
 
+
+
-
-
EXERCÍCIO
Calcule as velocidades e mobilidades de um soluto catiônico sabendo-se que seu tempo de migração até o detector foi de 5 min, e que o tempo de migração de um soluto neutro no mesmo eletrólito foi de 7 min. Outras condições: comprimento total do capilar = 72 cm, comprimento do capilar até o detector = 50 cm, tensão aplicada = +30 kV.
osm = 2,86 x 10-4 cm2 V-1 s-1
vosm = 0,119 cm/s
 Ldet V 50 cm 30000 V 
vosm = = osm = = osm 
 tosm Ltot 7x60 s 72 cm
+
DETECÇÃO
EXERCÍCIO
Calcule as velocidades e mobilidades de um soluto catiônico sabendo-se que seu tempo de migração até o detector foi de 5 min, e que o tempo de migração de um soluto neutro no mesmo eletrólito foi de 7 min. Outras condições: comprimento total do capilar = 72 cm, comprimento do capilar até o detector = 50 cm, tensão aplicada = +30 kV.
 Ldet 50 cm
vi = = = 0,166 cm/s
 ti 5x60 s
vi = vosm + vef
vef = vi - vosm = 0,166 - 0,119
vef = 0,0476 cm/s
ef = vef x 72 cm/ 30000 V = 1,14 x 10-4 cm2 V-1 s-1
+
DETECÇÃO
EXERCÍCIO
Calcule as velocidades e mobilidades de um soluto catiônico sabendo-se que seu tempo de migração até o detector foi de 5 min, e que o tempo de migração de um soluto neutro no mesmo eletrólito foi de 7 min. Outras condições: comprimento total do capilar = 72 cm, comprimento do capilar até o detector = 50 cm, tensão aplicada = +30 kV.
 Ldet Ltot
ti = 
 (osm+ ef) V
 50 x 72 cm2
5x60 s = 
 (2,86x10-4 + ef) cm2V-1s-1 30000 V
ef = 1,14 x 10-4 cm2 V-1 s-1
ou
+
DETECÇÃO
RESOLUÇÃO
w1
w2
t1
t2
definição:
 (t2 – t1)
Rs = 2
 wb1 + wb2 
 (t2 – t1)
= 1,18
 wh1 + wh2 
EFICIÊNCIA DA COLUNA
largura da banda
1,000
0,882
0,607
0,500
0,324
0,134
0,044
tangentes ao ponto de inflexão
wi = 2 
wb = 4 

wh = 2,354 



GAUSSIANA
NÚMERO DE PRATOS
ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO
N = L/H
 t 2 t 2
N = 16 = 5,54
 wb wh 
2
H = 
 L
DISPERSÃO
injeção
detecção
2 =  2n
PROCESSOS
INDEPENDENTES
VARIÂNCIAS
ADITIVAS
DIFUSÃO 2dif = 2 Di ti
  2inj
INJEÇÃO 2inj = 
 12
  2det
DETECÇÃO 2det = 
 12
 r16 E6 e2 T2 i2
TEMPERATURA 2 = ti
 1536 Di b2
 Cm r12 vosm2
ADSORÇÃO 2ads = ti
 Di
 i2 E2 ti2 2
CONDUTIVIDADE 2 =
 16 2
REVESTIMENTO DE POLIIMIDA
CENTRO
PAREDE
TEMPERATURA
0 25 175 190
DIÂMETRO,m
r1
r2
r3
PERFIL DE TEMPERATURA
NO INTERIOR DE UM CAPILAR
 Q r12 1 1 r2 1 r3 1
T = + ln + ln +
 2 2 b a r1 p r2 r3 q
EFEITO JOULE
TENSÃO, kV
CORRENTE, A
5 10 15 20 25 30
300
250
200
150
100
 50
líquido
ar (10 m/s)
não termostatizado
+
+
+
eletrólito < amostra
eletrólito > amostra
eletrólito = amostra
tempo
DETECÇÃO
pico
simétrico
cauda
frontal
cauda
< CONCENTRAÇÃO
< MOBILIDADE
< CONDUTIVIDADE
> CONCENTRAÇÃO
> MOBILIDADE
> CONDUTIVIDADE
RESOLUÇÃO e EFICIÊNCIA
 1/2 
 1 V
Rsi,i+1 = 
 4  2 Di ( média + osm )
 i V 
N =
 2 Di
0
25
50
75
100
02468101214
pH
0
0,25
0,5
0,75
1
1,25

- 
m
ef
 x10
5
 cm
2
/Vs
-6.0E-04
-5.0E-04
-4.0E-04
-3.0E-04
-2.0E-04
-1.0E-04
0.0E+00
0246810
0.0
0.5
1.0
POTENCIAL, mV
1 mM
100 mM
10 mM
0.0
0.5
1.0
0.0
5.0
10.0
15.0
DISTÂNCIA, nm
0.0
0.5
1.0
2:2
3:3
1:1