CROMATOGRAFIA LIQUIDA

Prévia do material em texto

CROMATOGRAFIA LIQUIDA - CLAE
Cromatografia é um processo de separação e identificação de componentes de uma mistura.
Essa técnica é baseada na migração dos compostos da mistura, os quais apresentam diferentes interações através de duas fases.
Fase móvel: fase em que os componentes a serem isolados "correm" por um solvente fluido, que pode ser líquido ou gasoso.
Fase estacionária: fase fixa em que o componente que está sendo separado ou identificado irá se fixar na superfície de outro material líquido ou sólido.
Para compreender a cromatografia, você precisa saber dois conceitos básicos:
Eluição: é a corrida cromatográfica.
Eluente: é a fase móvel, um tipo de solvente que vai interagir com as amostras e promover a separação dos componentes.
O processo cromatográfico consiste na passagem da fase móvel sobre a fase estacionária, dentro de uma coluna ou sobre uma placa. Assim, os componentes da mistura são separados pela diferença de afinidade através das duas fases.
Cada um dos componentes da mistura é seletivamente retido pela fase estacionária, resultando em migrações diferenciais destes componentes.
A cromatografia serve para identificação de substâncias, purificação de compostos e separação de componentes de misturas.
Cromatografia líquida
Na cromatografia líquida, a fase estacionária é constituída de partículas sólidas organizadas em uma coluna, a qual é atravessada pela fase móvel. A cromatografia líquida compreende a cromatografia líquida clássica e a cromatografia líquida de alta eficiência:
Cromatografia líquida clássica: a coluna é preenchida, geralmente, uma só vez, pois parte da amostra usualmente se adsorve de forma irreversível.
Cromatografia líquida de alta eficiência: é uma técnica que utiliza bombas de alta pressão para a eluição da fase móvel. Isso faz com que a fase móvel possa migrar a uma velocidade razoável através da coluna. Assim, pode realizar a análise de várias amostras em pouco tempo. Porém, necessita de equipamentos específicos.
Fase estacionária empregada:
De acordo com a fase estacionária empregada, a cromatografia pode ser líquida ou gasosa: Fase estacionária líquida: o líquido é adsorvido sobre um suporte sólido ou imobilizado sobre ele. Fase estacionária sólida: quando a fase fixa é um sólido.
As biomoléculas são grandes compostos químicos poliméricos produzidos por células vivas que servem como blocos de construção fundamentais dos organismos vivos e realizam muitos processos biológicos essenciais à vida. Os principais tipos de biomoléculas incluem proteínas, peptídeos, polinucleotídeos, carboidratos, lipídios, vitaminas e coenzimas. A natureza da molécula grande e da estrutura da biomolécula, sua diversidade química, a necessidade de considerar a atividade biológica e as matrizes complexas, exigem uma técnica de caracterização eficiente. Embora existam muitas técnicas de separação e análise disponíveis, a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é a mais comumente usada. Devido a seus muitos grupos funcionais e múltiplas conformações, a análise de biomoléculas por HPLC é baseada em diferentes modos, como fase reversa, exclusão por tamanho ou troca iônica. Independentemente dos modos de separação aplicados, o empacotamento eficiente da coluna e as características químicas consistentes das partículas na fase estacionária são essenciais para uma separação precisa e confiável de biomoléculas.
HPLC DE BIOMOLÉCULAS EM FASE REVERSA
HPLC em fase reversa (do inglês, RP-HPLC) é uma técnica sensível e versátil, usada para separar e analisar proteínas, fragmentos de proteínas e peptídeos. A RP-HPLC usa uma fase estacionária não polar e uma fase móvel polar. A retenção de proteínas e peptídeos na fase estacionária segue princípios de adsorção e fracionamento. Regiões hidrofóbicas das proteínas se ligam de forma reversível à fase estacionária. Proteínas são eluidas pelo aumento da natureza não polar da fase móvel. A resolução pode ser afetada pelo tamanho do poro, tamanho da partícula, comprimento da coluna e a cadeia de hidrocarboneto ligada à fase estacionária.
CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO POR TAMANHO (SEC)
A cromatografia de exclusão por tamanho (do inglês, SEC) é um modo de cromatografia não desnaturante que separa moléculas por seu tamanho (ou seja, raio hidrodinâmico). Esse modo não depende da interação do analito com a fase estacionária e sim do fluxo de analitos aleatórios através das partículas da fase estacionária. Analitos de alto peso molecular eluem antes, pois são totais ou parcialmente excluídos dos poros de partículas da fase estacionária, ao passo que analitos com menor peso molecular eluem depois, já que passam mais tempo navegando pelo caminho tortuoso através da partícula. A SEC foi usada para caracterizar agregados e fragmentos de anticorpos monoclonais (mAbs), estimar pesos moleculares de proteínas desconhecidas e determinar a estabilidade de formulações proteicas.
CROMATOGRAFIA DE INTERAÇÃO HIDROFÓBICA (HIC)
A cromatografia de interação hidrofóbica (do inglês, HIC) é um modo cromatográfico que separa analitos com base no grau de interação entre porções de analitos hidrofóbicos e ligantes hidrofóbicos de fase estacionária. Devido a seu menor peso molecular e menor propensão a dobramento, a HIC, em geral, não é usada na separação de peptídeos. Em altas concentrações de sal, camadas de hidratação de proteínas podem ser suficientemente perturbadas, de modo que regiões da superfície hidrofóbica entrem em contato com a fase estacionária não polar. A escolha do sal é determinada pela série de Hofmeister, que classifica cátions e ânions com base em sua capacidade de romper as camadas de hidratação de proteínas (caotrópicos) ou promover a formação de camadas de hidratação de proteínas (cosmotrópicos). Sais típicos incluem sulfato de amônio, sulfato de potássio e sulfato de sódio. Atualmente, a cromatografia de interação hidrofóbica é usada para determinar o perfil da proporção de medicamento/anticorpo (do inglês, DAR) em conjugados da anticorpo-droga (do inglês, ADC).
CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA (IEX)
A cromatografia de troca iônica (IEX) é um modo de cromatografia que separa analitos por carga. Proteínas e peptídeos são anfotéricos, o que significa que exibem tanto funcionalidades ácidas quanto básicas. Funcionalidades de proteínas ácidas incluem ácido aspártico, ácido glutâmico, cisteína, tirosina e α-carboxilato da terminação C. Funcionalidades de proteínas básicas incluem arginina, histidina, lisina e a α-amina da terminação N. Variantes de carga bioterapêutica podem ser detectadas e separadas por IEX. Variantes de carga podem surgir de um erro de tradução de transcrição do RNA mensageiro (RNAm) e/ou modificações pós-tradução, como desaminação, oxidação ou glicosilação.
Uma coluna de IEX deve ser selecionada com base no ponto isoelétrico (pI) do analito. Se o pH da fase móvel for menor que o pI, o analito terá carga positiva e se ligará a uma coluna de troca catiônica. Se o pH da fase móvel for maior que o pI, o analito terá carga negativa e se ligará a uma coluna de troca aniônica.
CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE
A cromatografia de afinidade depende de uma interação específica entre um analito e um ligante de fase estacionária. Idealmente, apenas o analito de interesse entra em contato com a fase estacionária, permitindo que todos os outros componentes da amostra passem pela coluna. Em seguida, uma segunda fase móvel é passada através da coluna para eluir o analito.
A cromatografia de proteína A é a forma mais comum de cromatografia de afinidade empregada no setor biofarmacêutico. A proteína A é uma proteína de superfície de 42 kDa, encontrada na parede celular do S. aureus. Esta proteína se liga de modo específico à cadeia pesada na região Fc de IgGs, o que a torna um mecanismo ideal para separar IgGs de outros componentes da amostra. A maioria das colunas de proteína A é fabricada imobilizando-se a proteína em uma partícula orgânica porosa. Entretanto, foi desenvolvido um formato monolítico para a cromatografia de proteína A, o qual permite alto rendimentode amostra em várias taxas de vazão, renunciar da eficiência.
Questões de concurso
A cromatografia líquida é uma técnica analítica na qual a fase móvel é um líquido. 
A cromatografia de exclusão por tamanho é uma técnica cromatográfica na qual os solutos são separados com base em sua partição entre uma fase móvel líquida e uma fase estacionária revestida em um suporte sólido. 
A sílica (SiO2) é o suporte mais popular em cromatografia de adsorção.
Em cromatografia líquida, a cromatografia de adsorção é método também conhecido como cromatografia líquido-sólido (CLS).
A cromatografia de adsorção utiliza o mesmo material tanto na fase estacionária quanto no suporte.
Em cromatografia líquida, a retenção entre os analitos pode ser alterada mudando a fase móvel.
A retenção de um soluto em cromatografia líquida depende da interação dos componentes da amostra tanto com a fase móvel quanto com a estacionária.
O tipo de cromatografia de líquidos de alta eficiência, no qual a fase estacionária é um líquido imiscível com o líquido que compõe a fase móvel, é denominado cromatografia por partição.
maior vantagem do desenvolvimento de um método para um estudo de bioequivalência por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas ao invés da cromatografia líquida acoplada ao detector de ultravioleta é que os analitos não necessitam possuir cromóforo.
A cromatografia baseia-se no método de diferenças na velocidade de movimentação de solutos passando por uma fase estacionária. Os métodos cromatográficos são de dois tipos básicos: cromatografia em coluna e planar.
A eluição isocrática é feita com um único solvente ou com uma mistura de solventes de composição constante.
Também há a eluição por gradiente, na qual a força do solvente é aumentada gradativamente ao longo da cromatografia. Isso ocorre quando dois ou mais solventes que diferem significativamente são empregados.
A cromatografia em fase líquida é uma técnica de separação baseada nas diferenças de interação das espécies químicas com as fases estacionária e móvel, fornecendo informações quantitativas e qualitativas importantes sobre os componentes de uma mistura. Uma das características da cromatografia em fase líquida é que o tempo de retenção é um parâmetro que pode ser usado para identificar uma espécie química específica.
Detectores de CLAE
1.Detector de UV-visível (espectrofotométrico)
2.Detector de Fluorescência (fluorimétrico)
3.Detector de índice de refração (RI - Refrative index)
4.Detector eletroquímico (amperométrico)
5.Detector condutimétrico
6.Espectrômetro de massas
Caso tenhamos Fase estacionária sólidas, o mecanismo de separação será baseado na adsorção do soluto sobre a superfície da FE. Por outro lado, caso a FE seja líquida, a separação será baseada na absorção do soluto pela FE, processo que também recebe o nome de partição.
Na cromatografia líquida podemos utilizar tanto uma fase móvel de características mais polar quanto de maior caráter apolar, a depender da aplicação desejada. Além disso, a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) pode se basear em 5 diferentes mecanismos de interação entre os componentes da amostra (solutos) e a fase estacionária, são eles: adsorção, partição, troca iônica, exclusão molecular e afinidade.
A cromatografia líquida com fase reversa faz uso de uma fase estacionária apolar e de uma fase móvel polar. Esse tipo de cromatografia pode ser usado para separar substâncias orgânicas que formam diferentes coeficientes de partição entre fase móvel e fase estacionária.
A cromatografia tem como princípio básico a separação de determinadas misturas, utilizando dessa forma duas fases, uma móvel e outra estacionária. A fase móvel pode ser constituída por uma substância líquida ou um gás, já a fase estacionária é composta por um líquido ou um sólido.
O presente artigo irá descrever a cromatografia líquida de alta eficiência, um tipo de cromatografia pertencente a classificação colunar.
High Performance Liquid Cromatography (HPLC)
A cromatografia pode ser classificada como planar e colunar, existindo dessa forma vários tipos de cromatografia por exemplo, cromatografia gasosa, líquida, de camada delgada, etc.
A cromatografia líquida de alta eficiência – CLEA ou também conhecida com a sigla HPLC (High Performance Liquid Cromatography) faz parte do grupo de classificação da cromatografia colunar. Essa técnica cromatográfica normalmente é empregada em amostras de alimentos, água, solo, sangue, urina, etc.
Esse tipo de cromatografia obteve um avanço significativo a partir dos anos 70, e desde então vem apresentando novas sofisticações tecnológicas, dentre elas a utilização de colunas preenchidas por partículas de pequenos tamanhos, desenvolvimento e aperfeiçoamento de vários detectores por exemplo fluorescência, espectrofotômetros de massa acoplados ao HPLC, e dentre outros avanços que ocorreram desde a descoberta do equipamento.
Ela tem a capacidade de realizar separações e análises quantitativas de uma grande quantidade de compostos presentes em vários tipos de amostras, em escala de tempo de poucos minutos, com alta resolução, eficiência e sensibilidade.
Equipamento de HPLC
O equipamento para a realização desse tipo de cromatografia é denominado de cromatógrafo líquido que é constituído por vários sistemas, sendo eles:
·  Sistema de reservatório de fase móvel;
· Sistema de bombeamento de fase móvel;
· Sistema de injeção;
· Sistema analítico que é constituído pela coluna cromatográfica;
· Sistema de detecção (existe detecção por UV, fluorescência, espectrofotometria de massas);
· Sistema de aquisição e registro de dados.
Fases da Cromatografia Líquida
Na cromatografia líquida existe um sistema composto por duas fases, uma fase móvel e outra fase denominada de estacionária.
Na fase estacionária podem ser utilizados compostos sólidos ou líquidos. Os sólidos normalmente são substâncias absorventes, tais como, sílica, carvão ativo, etc., que se encontram “empacotadas” em uma coluna, a qual é atravessada pela fase móvel. Nesse caso a base para a separação de misturas é chamada de absorção.
Já o composto líquido da fase estacionárias é denominado de película delgada, sendo que nesse caso a base de separação de misturas é denominado de partição.
Na fase móvel emprega-se uma mistura de alguns solventes, por exemplo, metanol, acetonitrila e água, sendo que essa mistura é denominada de Eluente. Normalmente para a fase móvel existem alguns critérios quanto aos solventes, tais como:
· O grau de pureza dos solventes,
· Baixa viscosidade;
· Dissolução da amostra sem perda dos compostos;
· Polaridade adequada para a realização da separação dos componentes da amostra.
Quanto a eluição de compostos é importante ressaltar que existem dois tipos de eluições:
· Isocrática: a composição da fase móvel (%B) se apresenta constante durante todo o processo de análise. Normalmente se utiliza um tipo de solvente.
· Gradiente: a composição da fase móvel (%B) pode ser alternada durante a realização da análise.
Nota: Em relação a porcentagem das eluições, essa denominação é definida de acordo com o tipo de bomba do cromatógrafo líquido, podendo ser uma bomba binária, quaternária, etc.
No caso da bomba binária, existem dois pistões e canais (estes denominados de canal A e canal B), os quais são responsáveis por todas as funções essenciais que fazem parte do sistema de fluxo dos solventes.
Portanto, quando se diz %B, estará indicando a porcentagem de solvente que irá passar pelo canal B.
Aquisição de dados e resultados
Para a cromatografia normalmente se utiliza sistemas de computação ou automação. Esses sistemas têm o intuito de aumentar a capacidade de utilização dos aparelhos, por meio de injeção de amostra, inserção de dados das amostras e métodos, aquisição e tratamento de dados.
A aquisição e tratamento de dados irá definir a precisão de um pico gerado no cromatograma, além de permitir a determinação de tempos e intensidades (áreas e alturas dos picos), lembrando que normalmente os gráficos gerados apresentam uma relaçãode tempo e sinal do detector para os analitos como pode ser verificado abaixo:
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Espectrofotometria de Massa
Com o desenvolvimento das tecnologias a cromatografia pode ser relacionada com diferentes sistemas de detecção, sendo um deles a espectrofotometria de massas. Essa junção garante alta sensibilidade e eficiência na separação das fases, além de obter informações referentes aos compostos analisados, por exemplo, a massa molar, estrutura química, seletividade, dentre outros.
De acordo com a IUPAC, a espectrofotometria de massas pode ser definida como a análise da matéria através da formação de íons em fase gasosa e consequentemente caracterizados de acordo com sua massa, carga, estrutura e propriedades físico-químicas.
Em suma, a cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrofotometria de massas pode ser utilizada em aplicações forenses, ambientais, substâncias químicas, farmacêuticas, alimentícias e dentre outras áreas.