eletroforese protocolo simples e questoes

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ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE (analítica e preparativa)
PREPARO DO GEL DE AGAROSE (0,8%):
1. Para 100mL de gel, pesar 0,8g de agarose.
2. Adicionar 100mL de TAE 1X.
3. Fundir a solução no microondas até homogeneizar (aproximadamente 1 min e 10 seg na 
potência máxima – evitar fervura).
4. Enquanto a solução de gel esfria (morno), preparar o suporte de gel, selando as laterais com 
fita crepe ou na própria cuba.
5. Acrescentar 40μL de Brometo de Etídeo (10mg/mL) e misturar com agitação leve. Obs.: 
Brometo de Etídio é mutagênico e deve ser manuseado com luvas. 
6. Despejar a solução de gel no suporte sem fazer bolhas.
7. Colocar o pente da espessura desejada no suporte. Obs.: Verificar o número e o volume das
amostras para escolher o pente mais adequado.
8. Esperar a solução solidificar.
9. Colocar o suporte com o gel na cuba de eletroforese. Adicionar tampão TAE 1X até cobrir a
superfície do gel.
ANALÍTICA:
1. Extrair 3μL da amostra de DNA.
2. Homogeinizar com 1μL de tampão de corrida 5X (Loading Buffer).
3. Aplicar as amostras nos poços.
4. Reservar 2 poços para utilização de um padrão de corrida (Ladder-1Kb).
5. Ajustar a voltagem de acordo com o tempo de corrida desejado (média utilizada 80V).
6. Analisar o gel sob radiação ultravioleta (Alpha Imager).
7. Tirar foto dos resultados obtidos.
PREPARATIVA:
1. Adicionar tampão de corrida ao material a ser purificado (diluição de 5X).
2. Aplicar as amostras nos poços, pulando um poço entre cada amostra para evitar contaminação. 
Para volumes maiores, montar o gel com o pente de dentes largos ou unir os dentes do pente com 
fita adesiva antes de colocar o pente no gel ainda líquido (morno).
3. Aplicar em outro poço o padrão de tamanho molecular (Ladder-1kb).
4. Ajustar a voltagem de acordo com o tempo de corrida desejado (média utilizada 80V).
5. Vizualizar as bandas no gel utilizando a luz ultravioleta manual no comprimento de onda longo.
6. Cortar a banda desejada utilizando bisturi limpo e colocá-la em um tubo de microcentrífuga
previamente pesado.
7. Seguir protocolo de Purificação de DNA a partir de Gel.
QUESTÕES PARA DISCUSSÃO NO RELATÓRIO:
1 - O resultado da corrida foi satisfatório? Em caso negativo, explique as possíveis causas do erro.
2 - Diferencie as seguintes técnicas: Western blot, Southern blot e Northern blot.
3 -(UFES/2013)   A impressão digital do DNA é rotineiramente usada na determinação de 
paternidade. A técnica consiste em extrair o DNA dos glóbulos brancos do sangue coletado da 
mãe, da criança e do(s) suposto(s) pai(s). O DNA de cada indivíduo é tratado com a mesma 
enzima de restrição, e os fragmentos obtidos são separados, formando-se, assim, o padrão de 
banda de cada indivíduo.
Legenda: M – mãe; F – filho; SP1 – suposto pai 1; SP2 – suposto pai 2
a) No esquema de um gel mostrado acima, indique o pai biológico da criança. Justifique a 
sua indicação.
b) Cite uma aplicação da investigação do DNA na análise forense e uma na prática 
clínica.
c) A maioria das células eucarióticas é diploide; seus dois conjuntos de cromossomos 
podem ser dispostos em pares de homólogos. Por outro lado, as células eucarióticas 
haploides contêm um único conjunto de cromossomos. Na espécie humana, é possível 
encontrar tanto células diploides, como células haploides. Indique os tipos celulares que 
exemplificam o genoma haploide e diploide, respectivamente, na espécie humana.