Relatório prática_ Biologia Molecular_02

Prévia do material em texto

RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS: Biologia Molecular 
DADOS DO(A) ALUNO(A):
NOME:
MATRÍCULA:
CURSO: 
POLO: 
PROFESSOR(A) ORIENTADOR(A):
ORIENTAÇÕES GERAIS: 
·	O relatório deve ser elaborado individualmente e deve ser escrito de forma clara e
·	concisa;
·	O relatório deve conter apenas 01 (uma) lauda por tema;
·	Fonte: Arial ou Times New Roman (Normal e Justificado);
·	Tamanho: 12;
Margens: Superior 3 cm; Inferior: 2 cm; Esquerda: 3 cm; Direita: 2 cm;
·	Espaçamento entre linhas: simples;
·	Título: Arial ou Times New Roman (Negrito e Centralizado). 
TEMA DE AULA: ELETROFORESE
RELATÓRIO:
·	Identificar todos os equipamentos e reagentes necessários para a realização da eletroforese
Cuba de eletroforese
 Gel Agarose
Tampão
 Amostra
 Sonda (Corante Fluorescente)
 Transluminador
 Fotodocumentador
Magnésio
Taq Polimerase
 Primers
 Nucleotídeos
 Tubos de PCR
Termociclador
·	Descrever cada etapa dessa metodologia
Eletroforese ocorre dentro de uma matriz ou gel que possibilita a corrida da amostra. O gel
é introduzido dentro de uma solução tampão específica para eletroforese que fornece as
condições ideais para a passagem da corrente e a manutenção do valor do pH.
Em seguida, as amostras são pipetadas em pequenos poços feitos com um pente no gel.
Para ocorrer a migração, a cuba e fonte de eletroforese exercem uma voltagem, corrente e
potência constantes, esses fatores irão determinar o sucesso da técnica.
E por fim, as bandas são visualizadas sob luz ultravioleta ou LED, através do equipamento
chamado de transiluminador.
A agarose é um polissacarídeo composto por agar e pectina.
Para preparar este gel, simplesmente faz-se a mistura entre o pó de agarose e solução
tampão. Após fundir, coloca-se brometo de etidium, que tem ampla afinidade pelo DNA, e
revela sobre presença de UV(ultra violeta) os
Ácidos nucléicos.
Quando a mistura esfriar o gel estará duro. Esse endurecimento é feito em um local
apropriado, o mesmo local onde será feita a corrida da amostra. Um detalhe importante é a
colocação do pente no gel durante o endurecimento. O pente cria poços que serão utilizados
para a colocação das amostras. Podemos ver este processo como uma corrida. Cada um é
colocado numa pista e na presença de uma corrente elétrica vai deixando o seu rasto. São
estes rastos que serão comparados no método.
O gel de agarose e usado pois tem uma maior extensão de separação para
fragmentos longos de DNA( identifica os ácidos nucléicos presente neste). O tamanho e a
conformação da molécula de DNA, a concentração do gel de agarose, a corrente elétrica
aplicada e tipo de tampão usado influenciam a velocidade da partícula no gel.
·	Justificar a aplicação das diferentes concentrações dos géis. 
A agarose é utilizada como gel para a eletroforese. A agarose é um polissacarídeo forma
uma rede que prende as moléculas durante a migração. Dependendo da concentração de
agarose, há uma diferença no gradiente de separação, isto é, quanto maior a concentração
de agarose, menor o tamanho dos poros e maior a dificuldade da migração dos fragmentos
de DNA e de RNA, aumentando o tempo de migração.
Para preparar um gel de agarose, faz-se a mistura entre o pó de agarose e a solução tampão
TBE ou TAE. Após a polimerização do gel, coloca-se brometo de etídio, que fará o DNA e o
RNA quando exposto ao UV. A menores temperaturas o gel ganha consistência. Um
detalhe fundamental é a colocação do pente no gel durante o endurecimento. O pente cria
poços que serão utilizados para a colocação das amostras de DNA e RNA.
Podemos ver este processo como uma corrida. Cada um é colocado numa pista e na
presença de uma corrente elétrica vai deixando o seu rastro. São estes rastros que vamos
comparar.
TEMA DE AULA: REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE 
RELATÓRIO:
·	Descrever cada uma das etapas da PCR, explicando detalhadamente cada uma. 
DESNATURAÇÃO O DNA
 genomico contendo a sequência a ser amplificada é desnaturado por aquecimento a cerca de 95°C por cerca de 30 segundos. A dupla fita é aberta (desnaturada), tornando- se uma fita única. 
 ANELAMENTO OU HIBRIDIZAÇÃO Após a separação das fitas, um par de iniciadores ou primeirs (uma fita de DNA específica para o gene que se quer estudar) complementam a fita oposta da sequência de DNA a ser amplificada. Ou seja, um deles complementar sequência em uma fita da dupla - helice de DNA e o outro complementar sequência na outra fita. O molde é determinado pela posição dos iniciadores que se anelam a fita. Essa etapa ocorre a uma temperatura de 60°C. 
 EXTENSÃO OU POLIMERIZAÇÃO Com o molde já identificado, a enzima DNA -polimerase adiciona as bases complementares, formando uma nova fita e então tem-se novamente a duplicação da fita de DNA. Esse processo acontece a uma temperatura de 72°C. 
 O ciclo inteiro então reiniciado, os produtos do primeiro ciclo de replicação são então desnaturados, hibridizados e novamente replicados com DNA-polimerase. O procedimento repetido muitas vezes até que o nível desejado de amplificação seja obtido. Na prática, a amplificação efetiva do DNA re quer de 20 a 30 ciclos de reação, com os produtos de cada ciclo servindo como DNA -molde para o próximo – dando origem ao termo “reação em cadeia” da polimerase. Como cada etapa da reação ocorre em uma temperatura especifica, a reação pode ser controlada. É utilizado um termociclador para determinar a temperatura e o tempo de cad a etapa, bem como o número de ciclos de replicação. A detecção do produto de amplificação normalmente é feita em eletroforese em gel de agarose, que é corado com brometo de etídio, permitindo a visualização direta do DNA pesquisado. Hoje, existe m termocicladores que, além d e amplificar o DNA, permitem a sua detecção – chamada PCR em tempo real (qPCR)
·	Realizar o cálculo para 10 reações da PCR
Quantidade para 1 reação
 
Amostra de DNA 5uL
dNTPs 2,5 uL
MgCl2 1,25 uL
Primers 2 uL (1+1)
Taq Polimerase 1uL
Tampão 4uL
H2O ultrapura (q.s.p) 9,5 uL
TOTAL PREPARADO 25 uL
Quantidade para 10 reações 
Amostra de DNA 50 uL
dNTPs 25 uL
MgCl2 12,5 uL
Primers 20 uL (10+10)
Taq Polimerase 10 uL
Tampão 40 uL
H2O ultrapura (q.s.p) 95 uL
TOTAL PREPARADO 250 uL