Relatório - Extração de DNA, PCR e Eletroforese

Prévia do material em texto

UNESP - UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS E BIOTECNOLOGIA
Gabriela Andrade, Isabela Baptista Leal dos Santos, Isadora Passos Frigero, Juan
Oliveira, Lara Salomão Resende e Mariana Sayuri Utsumi
LABORATÓRIOS - GENÔMICA
Extração de DNA, Preparação PCR e Eletroforese.
BOTUCATU
2022
UNESP - UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 0
Extração de DNA 2
Introdução: 2
Materiais, métodos e discussão: 2
Resultados: 4
Preparação de PCR 5
Introdução: 5
Materiais, métodos e discussão: 6
Resultados: 7
Eletroforese 8
Introdução: 8
Materiais, métodos e discussão: 11
Resultados: 12
Conclusão: 14
Referências: 15
1
Extração de DNA
Introdução:
A extração de DNA ocorre em basicamente duas etapas: A lise celular (quebra das
células das amostras) e purificação. Precisamos “abrir” a célula para retirar seu DNA e
separá-lo de outros compostos como proteínas e restos celulares que não são moléculas-alvo
da técnica em questão.
A extração permite que estudemos as causas de doenças genéticas, entender o
material genético de cada espécie e diferenciá-las, verificar a paternidade de indivíduos e
produzir organismos geneticamente modificados para que produzam produtos de nosso
interesse como: Insulina, antibiótico e hormônios. por apresentar aplicações diversas e muito
importantes, esta técnica é muito empregada e seu entendimento, tão necessário. Vamos
verificar a seguir os passos a serem feitos e o porquê da utilização de cada material usado
durante o processo.
Materiais, métodos e discussão:
1) Adicionar 200μL de Tampão de Lise (R1) em um tubo contendo previamente 5,6μL
de carreador R5 e 5μL de Proteinase K (R6).
● O Tampão de Lise é adicionado para que ocorra a quebra da membrana da
célula para que haja a exposição do DNA e assim possa ser realizado o
procedimento desejado, além do mais, ele contribui com a manutenção do pH
para que ele não fique ácido ou básico demais. O carreador é utilizado para
melhorar a ligação e consequentemente a extração do DNA, e por fim, a
Proteinase K é uma enzima que tem a finalidade de fazer a digestão de
proteínas e até mesmo a inativação de nucleases para que não haja
interferência ou degradação do DNA por meio destas. Tais processos
contribuem para um nível mais elevado de pureza na extração.
2) Adicionar 200μL de amostra, homogeneizar vigorosamente e incubar a 56ºC por 10
minutos.
● A alta temperatura utilizada durante este processo serve para que haja a
desnaturação das proteínas e assim a quebra das suas pontes de sulfeto.
3) Centrifugar rapidamente (spin) para remover as gotículas da tampa do tubo.
● A centrifugação serve para, basicamente, manter todo o conteúdo concentrado
e homogeneizado sem perder a amostra.
4) Adicionar 200μL de etanol PA e homogeneizar por inversão.
● O etanol, somado com o cloreto de sódio que está presente na solução
adicionada anteriormente do tampão, é adicionado para diminuir a
2
solubilidade da água para que o DNA, que é uma molécula polar, não acabe se
ligando. Além do mais, contribui para a emulsificação deste DNA, o que
reforça a ideia central de exposição e deixá-lo isolado para que não haja
interferências e um resultado puro.
5) Transferir todo o volume para uma coluna (R7), centrifugar 5000g x 1min., transferir
a coluna para um novo tubo coletor e descartar o tubo coletor anterior.
● A coluna R7 é feita com uma sílica utilizada para a ligação do DNA exposto
durante todo o processo anterior, e a centrifugação é realizada para que ocorra
a separação do conteúdo em duas fases, havendo a decantação das moléculas
requeridas, dessa forma, há a fixação do DNA na coluna de sílica. Esta ligação
é feita para facilitar a visualização posteriormente.
6) Adicionar 400μL do reagente Lavagem 1 (R2), centrifugar 11000 x 1min., transferir a
coluna para um novo tubo coletor e descartar o tubo coletor anterior.
● O reagente de lavagem é composto por cianato de guanidina e
β-mercaptoetanol que realiza a limpeza do conteúdo presente no eppendorf, ou
seja, ele retira as proteínas que não interessam no processo, como por exemplo
as nucleases. Durante este procedimento é possível verificar a formação de
uma bolha no tubo, isto ocorre por conta do oxigênio que é liberado pela água
e acaba ficando preso por conta do tamanho longo que o DNA possui, o que
acaba formando uma bolha no centro do tubo.
7) Adicionar 200μL do reagente Lavagem 2 (R3), centrifugar 11.000g x 1 min.,
transferir a coluna para um novo tubo coletor e descartar o tubo coletor anterior.
● O R3 é uma pequena solução de etanol. O etanol serve para diminuir a
constante dielétrica (solubilidade) da água e impedir que o DNA se dissolva e
seja perdido, além de ser usado para purificação da amostra. A centrifugação
serve para separar o conteúdo para podermos retirar o reagente de lavagem.
8) Adicionar novamente 200μL do reagente Lavagem 2 (R3), centrifugar 14.000g x 3
min.
● Essa etapa é igual a anterior, porém seu tempo de centrifugação e rpm são
maiores para separar mais a mistura de R3 e moléculas de DNA.
9) Transferir a coluna para um tubo de 1.5 mL devidamente identificado
e manter a coluna com a tampa aberta para evaporar qualquer resíduo de
álcool.
● Transferimos a coluna para o tubo maior para ter mais espaço para trabalhar
dentro do eppendorf, sem que os líquidos caiam e os volumes fiquem errados.
10) Adicionar no centro da coluna 60μL de água livre de DNAse/RNAse e incubar por 2
minutos a temperatura ambiente.
3
● A água adicionada precisa ser ultra pura e livre de DNAse/RNAse para não
prejudicar a amostra e quebrar a molécula-alvo.
11) Por fim, centrifugar a 5.000g x 1 min. e descartar a coluna.
● Nessa etapa temos o mesmo objetivo das centrifugações anteriores.
12) O DNA pode ser utilizado imediatamente ou estocado a -20ºC.
● A estocagem em baixas temperaturas permite que não ocorra a degradação do
DNA e que ele possa ser utilizado posteriormente.
Resultados:
Depois dos passos realizados em materiais e métodos, pingamos uma gota do produto,
obtido durante a extração, no espectrofotômetro NanoDrop one para medir a eficiência da
extração. Obtivemos os seguintes resultados (amostra nº 2):
Figura 1: Foto do NanoDrop (autoria própria)
ng/μL: 104.5 ; A260/A280: 1.96 ; A260/A230: 1.99
A primeira razão, 104.5, nos dá a quantidade de DNA presente na amostra.
Já as razões A260/A280 e A260/A230 nos dão uma ideia do que pode ter ocorrido
durante o processo e se há proteínas ou solventes orgânicos, respectivamente, presentes na
amostra. Quanto mais próximas, tanto para mais ou menos, de 2, melhor foi a extração e
purificação.
Com os dados obtidos pelo equipamento, podemos observar que nossa extração se
deu de forma satisfatória, com uma quantidade considerável de DNA por μL e sem
quantidades significativas de proteínas e solventes orgânicos para contaminar a amostra.
4
Preparação de PCR
Introdução:
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica biomolecular que permite
que uma certa região do DNA seja identificada e multiplicada (ampliada) diversas vezes, o
que torna muito mais viável o estudo dessa específica região do genoma. Essa técnica
baseia-se no processo de replicação do DNA que acontece in vivo.
Para o procedimento, é preparado um master mix (solução com todos os componentes
necessários para a reação). Quando preparada, a solução é submetida a variações de
temperatura em tempos específicos , o que permite os 3 passos base da PCR: desnaturação,
anelamento e extensão. Esse processo é repetido diversas vezes, até que se tenha uma
quantidade satisfatória de DNA. Como a cada ciclo a quantidade de DNA é duplicada, ao
final temos um crescimento exponencial do fragmento do genoma em questão.
A técnica de PCR não é antiga, tendo o começo do seu desenvolvimento no início dos
anos 1980. Em 1983, o cientista Ph.D. Kary Mullis criou a técnica e, no decorrer dos anos,
vários aperfeiçoamentos e otimizações foram sendo desenvolvidos. Um exemplo de
aperfeiçoamento é a descoberta das Taq polimerases, enzimas isoladas de Thermus aquaticus,
quesão bactérias encontradas em condições de extremas temperaturas. As polimerases são
capazes, então, de resistir às altas temperaturas necessárias durante o processo da PCR, e as
antigas polimerases de E. Coli, menos resistentes e que tornavam o processo mais demorado,
foram substituídas. No final da década, a PCR começou a ser utilizada em aplicações
diagnósticas e em exames de DNA. Após 10 anos de sua criação, Kary B. Mullis é premiado
com o Nobel de Química por sua invenção. Anos depois, em 2003, a empresa Roche lança o
primeiro instrumento de PCR em tempo real para amplificação e detecção do DNA
amplificado. Nos próximos anos, temos o desenvolvimento de novos aparelhos e materiais
destinados à técnica, o que a torna, hoje, rápida, relativamente acessível e de descomplicada
manipulação.
Hoje, a reação em cadeia da polimerase é utilizada para diversos fins. É possível
identificar novas espécies, realizar diagnósticos moleculares, auxiliar na medicina forense (já
que a quantidade de DNA disponível é relativamente pequena, e a técnica permite a
multiplicação desse genoma milhares de vezes), promover testes de paternidade, entre outras
aplicações. Podemos dizer que atualmente, a técnica anda em direção à medicina
personalizada, uma vez que muitas doenças podem ser diagnosticadas e tratadas
precocemente e é possível melhorar a qualidade de vida das pessoas que escolhem entender
melhor o próprio genoma.
Materiais, métodos e discussão:
Foi preparado um eppendorf de 500 µL com quantidade total para 7 reações de PCR,
pois a quantidade necessária para somente 1 reação era muito pequena. As quantidades de
5
cada componente foram determinadas a partir de cálculos usando a fórmula
, sendo o volume de 25µL, as concentrações finais requeridas, a𝐶
1
* 𝑉
1
= 𝐶
2
* 𝑉
2
𝑉
2
𝐶
2
𝐶
1
concentração inicial também pré-determinada e o volume inicial que deveria ser pipetado.𝑉
1
Encontrando os volumes iniciais, estes foram multiplicados por 7 e tivemos como
resultado as seguintes quantidades para as 7 reações:
● 99,4 µL de água ultrapura - a água ultrapura apresenta baixa condutividade
elétrica e propicia que não ocorra mudanças estruturais nas proteínas.
● 17,5 µL de Buffer 10x - tampão de pH com sais que cria um meio ideal para a
enzima trabalhar.
● 7 µL de (50mM) - cofator da polimerase: contribui ativando o sítio𝑀𝑔𝐶𝑙
2
catalítico da enzima a partir do enovelamento.
● 14 µL de DNTP(10mM) - nucleotídeos que se ligarão à polimerase.
● 7 µL de primer F (10µM) - fornece uma extremidade 5’ livre para o início da
polimerização pela Taq polimerase na região alvo (iniciador 5’ ou forward).
● 7 µL de primer R (10µM) - fornece uma extremidade 3’ livre para o início da
polimerização pela Taq polimerase na região alvo (iniciador 3’ ou reverse).
● 2,1 µL de Taq invitrogen (5U/µL) - responsável pela síntese de novas fitas de
DNA em solução tampão.
● 21 µL de amostra de DNA extraído.
Foi obtido um volume total de 175µL. Destes, foram pipetados 25µL em outro
eppendorf de 200µL para a rodagem de somente uma reação de PCR. O volume foi
encaminhado para o termociclador.
No termociclador, primeiramente, as amostras foram deixadas por 5 minutos na
temperatura de 94ºC, que é o tempo de climatização do aparelho. Logo após, foram regulados
temperatura e tempo de cada etapa da PCR: desnaturação, anelamento e extensão.
● Desnaturação: Temperatura em 94ºC por 30 segundos. Etapa responsável pela
perda da estrutura de dupla hélice do DNA. Além disso, a desnaturação
permite que os primers se liguem à região complementar à sua sequência na
amostra de DNA.
→
Figura 2 (fonte: Unilago)
● Anelamento: Temperatura em 58ºC por 30 segundos, sendo que a temperatura
de anelamento é específica de cada primer. Assim, cada primer se encaixa nas
respectivas sequências complementares à região-alvo da amplificação.
→
Figura 2 (fonte: Unilago)
6
● Extensão: Temperatura em 72ºC por 1 minuto. A temperatura é elevada para
que a Taq polimerase se posicione junto aos primers que se anelaram
anteriormente e, a partir do cofator magnésio, a síntese da nova fita pode ser
iniciada.
→
Figura 4 (fonte: Unilago)
O ciclo foi repetido 35 vezes, até se obter uma quantidade satisfatória de DNA.
Depois, as amostras foram mantidas por 7 minutos a 72ºC no termociclador, sendo este tempo
uma segurança para que a enzima cumpriu com seu trabalho. Até que as amostras fossem
tiradas do termociclador, foram mantidas a 4ºC no aparelho.
Resultados:
A termociclagem durou por volta de 1 hora e 45 minutos. A amostra foi retirada do
termociclador e mantida em geladeira. 1 semana depois, foi realizada a eletroforese em gel de
agarose do material, a fim de identificar se o PCR foi feito corretamente. Os resultados
diretos, então, do PCR, são evidenciados no tópico Resultados, em Eletroforese.
7
Eletroforese
Introdução:
Depois de ter executado a extração do DNA e feito a PCR que seria várias cópias de
uma região de interesse do DNA, o próximo passo seria a execução da eletroforese, para
verificar se essa PCR funcionou. A eletroforese (forese que significa “migração/movimento”
e eletro indica o uso da eletricidade que faz com que a ocorra migração/movimento da
molécula para o polo) é utilizada para separar fragmentos de DNA e outras macromoléculas,
a partir de seu tamanho ou tipo de carga (aquilo que é atraído).
O funcionamento base da eletroforese em gel é basicamente uma passagem de
corrente através de um gel, que por sua vez, “empurra” a molécula consigo, e em função do
seu tamanho e carga as velocidades vão sendo alteradas permitindo que sejam separadas
umas das outras. Entretanto, as moléculas de DNA têm a mesma carga e a separação só irá
ocorrer baseada apenas no seu tamanho, e assim é possível dizer quantos fragmentos
(diferentes) de DNA estão presentes em uma amostra e o tamanho que eles possuem em
relação aos outros. Esse gel citado anteriormente, é uma placa gelatinosa que a maioria das
vezes, para separação de DNA, são feitos de polissacarídeos denominados de agarose
(comprado em forma de flocos secos em pó), quando essa agarose e submetida a um tampão
(água contendo sais) e uma temperatura mais elevada e subsequentemente esfriada, cria-se
um gel com características sólidos/mole, ou seja, quase como se fosse uma gelatina. Tendo
em vista molecular, o gel de agarose é uma matriz que é unida por ligações de hidrogênio
formando microporos. Em uma das extremidades desse gel, é feito alguns poços (furos) onde
são inseridas as moléculas de interesse, que no caso e o DNA, o esquema a seguir, figura X
descreve mais detalhadamente esse processo.
A figura X, mostra o gel já inserido no equipamento, e as amostras devem ser
colocadas dentro dos poços, logo em seguida, em uma das extremidades da caixa é ligado um
eletrodo positivo e no outro extremo é ligado um negativo, para que haja uma corrente
elétrica. Nessa caixa é inserida a solução tampão que ajuda a criar uma corrente elétrica nesse
gel de agarose, levando em consideração que essa solução tampão deve preencher toda a
caixa.
Figura 5: Esquema de um equipamento de eletroforese (fonte: Khan Academy)
8
Depois de criar a corrente, os poços que estão na extremidade do pólo negativo irão
fazer com que o DNA migre para o polo positivo da caixa, através da corrente elétrica, onde
que por sua vez contém uma voltagem na faixa de 80 - 120 V, caso essa voltagem seja
elevada, vai fazer com que a molécula migre mais rapida, porem o gel pode derreter, caso a
voltagem seja menor que essa, a molécula irá demorar mais para ir para o outro polo.
Portanto, cada uma das amostras de DNA é inserida nos poços e um poço e reservado para
uma escada de DNA (um ponto de referência, que por sua vez contém fragmentos de DNA já
conhecidos para se ter uma certa base), essas escadas de DNA vem com determinadas escalas
de tamanho, assim é mais fácil saber a faixa do tamanho esperado dos fragmentos em
questão.
Quando a caixa é ligada, a corrente começa a fluir pelo gel de agarose e como as
moléculas de DNA possuemcargas negativas devido ao grupo fosfato em seus esqueletos de
açúcar-fosfato, faz com que elas se movem na matriz do gel para o outro canto da caixa (pólo
positivo). O esquema representa na figura 6, descreve o funcionamento citado anteriormente,
entretanto vale ressaltar que os pedaços mais curtos irão correr mais rapidamente do que os
que forem maiores e após algum tempo, esses fragmentos mais curtos irão ficar mais
próximos do pólo positivo e os mais longos irão permanecer no polo negativo.
Figura 6 - Esquema de corrida em gel (Fonte própria autoria)
Entretanto, uma vez que os fragmentos tenham sido separados basta examinar o gel e
ver quais as faixas estão marcadas em seus respectivos tamanhos, para poder fazer isso,
algumas técnicas devem ser levadas em consideração, pois é muito difícil ver somente com
esse processo descrito anteriormente, para isso o gel é pigmentado com um corante que fica
preso ao DNA, depois de corado é colocado a uma luz Ultra violeta (UV), e o DNA fica
brilhante que torna possível a visualização do DNA em diferentes locais da ao longo do
tamanho do gel, como mostrado na figura 7. Salientado que a numeração escrita do lado
9
esquerdo desse exemplo, ou seja, bp é referente a quantos pares de base tem no comprimento
do fragmentos de DNA que no caso é visto na escada e referenciando as amostras.
Figura 7 - Exemplo de um resultado de eletroforese (fonte: Khan Academy)
Por fim, as linhas que estão marcadas no gel é chamada de bandas, essas bandas tem
determinados números de fragmentos de DNA, ao comparar essas bandas com a escada,
determinamos os tamanhos aproximadamente do DNA, pegando a imagem anterior (figura 7)
como exemplo, nota-se que a banda que está brilhando no gel de agarose tem o tamanho de
aproximadamente 600 a 700 pares de base (bp)
Materiais, métodos e discussão:
Materiais:
● Agarose
● Cuba e fonte de eletroforese
● Tampão de eletroforese - TBE
● Marcador de peso molecular (ladder)
● Corante fluorescente Nitrato de prata
● Corante azul de bromofenol
● Transiluminador UV
Métodos:
Para a realização da eletroforese em gel de agarose, foram utilizadas as amostras
coletadas nas aulas anteriores e uma amostra de RNA fornecida pela professora.
Na preparação do gel de agarose, inicialmente são seguidos os seguintes passos:
● Preparar a solução de agarose TBE 0,5X (ou TAE 1X), à concentração apropriada
segundo o tamanho da amostra de DNA. Para isso, pesar a quantidade correta de
10
agarose (a concentração depende do tamanho das amostras) e misture com o volume
de tampão necessário para fazer o gel.
● Esquentar no micro-ondas até dissolver a agarose, mexendo continuamente para evitar
ferver. Checar se o volume de agarose diminuiu (principalmente quando são géis
reutilizados), no caso de que seja assim completar com água.
● Deixar esfriar até aproximadamente <60°C, e adicionar 1,5µL de nitrato de prata
(1µg/µL) por cada 30 mL de agarose e misturar agitando cuidadosamente. O nitrato
de prata é um corante que se liga ao DNA, permitindo que os fragmentos de DNA
possam ser vistos como bandas. Apresenta alta sensibilidade, e é um ótimo substituto
do brometo de etídio, bastante utilizado antigamente, mas altamente tóxico.
● Colocar a agarose na bandeja, eliminar bolhas com uma ponteira e rapidamente
colocar os pentes.
● Esperar que gelifica (aprox. 30 min).
Depois de preparado o gel, pode-se então ser realizada a análise:
● Colocar o tampão de eletroforese, TBE 0,5X, na cuba, retirar as placas da forma e o
pente. O tampão de eletroforese deve cobrir o gel em 1 mm ou um pouco mais. O
tampão fornece as condições ideais para a passagem da corrente e a manutenção do
valor do pH.
● Preparar as amostras para aplicar, usando 1 µL de corante (azul de bromofenol) por
cada 5 µL de amostra. O corante facilita a aplicação da amostra no gel (acrescenta cor
na amostra) e auxilia no monitoramento da corrida, já que apresenta velocidade
conhecida durante a migração na matriz em direção ao pólo positivo.
● Colocar 1 µL de amostra ordenada e cuidadosamente nos pocinhos, e também aplicar
o ladder. O ladder é uma mistura de diversos fragmentos de DNA de tamanhos e
concentrações conhecidos, gerados a partir da digestão de plasmídeos (tipo de DNA
circular presente em bactérias) com enzimas de restrição. Ele permite inferir, por
comparação, o tamanho dos fragmentos presentes na amostra analisada.
● Conectar os fios na cuba e na fonte de energia, verificando se estão corretamente
colocados. Os ácidos nucléicos apresentam carga negativa, por isso com a aplicação
da corrente eles irão migrar em direção ao pólo positivo.
● Ligar a fonte e ajustar a voltagem entre 60 e 100 V (ou 1-5 V/cm de comprimento do
gel), segundo o tamanho e concentração do gel. Depois de começar a corrida, verificar
o passo de corrente no gel e a polaridade de movimentação da amostra.
11
● Desligar a corrente quando as amostras tiverem migrado o suficiente (usar o corante
como referência). Colocar cuidadosamente o gel sem a bandeja no transiluminador,
examinar o gel e fotografar.
Resultados:
Após a realização da eletroforese em gel de agarose, foi possível obter as duas
imagens abaixo:
Figura 8: Eletroforese em gel de agarose das amostras de DNA extraídas em sala
12
Figura 9: Eletroforese de gel de agarose de amostra de RNA
Todas as amostras de DNA inseridas no gel formaram bandas visíveis com sucesso,
sendo que, como todas as amostras foram extraídas da mesma fonte, apresentaram os mesmos
comprimentos de base, tornando as bandas alinhadas. A amostra de RNA avançou mais sobre
o gel devido ao seu menor peso molecular em relação ao DNA. O “arraste” realizado pela
amostra de RNA ocorre devido a interações intramoleculares, onde as moléculas de RNA
podem dobrar-se, alterando a estrutura secundária e afetando a migração das moléculas no
gel. A presença de DNA contaminante também pode ter prejudicado a visualização.
13
Conclusão:
Com base nas atividades práticas realizadas conseguimos finalizar os seguintes
experimentos, como a extração de DNA, PCR e Eletroforese. Os processos citados trouxeram
as análises necessárias para a compreensão de casa experimento.
A extração mostrou uma quantidade aceitável de DNA por μL e sem quantidades
significativas de solventes orgânicos e sem proteínas, que não comprometeram a amostra
utilizada no experimento.
Os dados obtidos da PCR e da Eletroforese, mostraram bandas de DNA visíveis e
alinhadas, foi observado também a amostra de RNA, que se exaltou sobre o gel de
eletroforese. Podemos concluir que com o DNA estudado e analisado pelos métodos das
aulas práticas, podemos usá-los para qualquer aplicabilidade necessária com o DNA
estudado, como exames de DNA, ou aplicação em fármacos, sequenciamentos ou
diagnósticos moleculares.
14
Referências:
BIOMEDICINA PADRÃO. A evolução da PCR. Disponível em
https://www.biomedicinapadrao.com.br/2013/12/a-evolucao-da-pcr.html. Acesso em: 10 jul.
2022.
KASVI. História e evolução da técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction ou
Reação em Cadeia da Polimerase). Disponível em
https://kasvi.com.br/historia-e-evolucao-da-tecnica-de-pcr/. Acesso em: 10 jul. 2022.
OLIVEIRA, M. C. D. S; REGITANO, L. C. D. A. Fundamentos teórico-práticos e
protocolos de extração e de amplificação de DNA por meio da técnica de reação em cadeia da
polimerase. EMBRAPA: Repositório Alice, São Carlos - SP, 2007. Disponível em:
https://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/48295/1/LivroProtMolecular.pdf.
Acesso em: 10 jul. 2022.
KHAN ACADEMY. Eletroforese em gel. Disponível em:
https://pt.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-pcr-elect
rophoresis/a/gel-electrophoresis. Acesso em: 10 jul. 2022.
VALENTINI, Sandro. Protocolos. Disponível em:
http://www.fcfar.unesp.br/laboratorio_sandro_valentini/pdf/A30-%20ELETROFORESE%20
EM%20GEL%20DE%20AGAROSE%20(analitica%20e%20preparativa).pdf. Acesso em: 10
jul. 2022.
GOUVEIA, João José de Simoni; REGITANO, Luciana Correia de Almeida.
ELETROFORESE DE ÁCIDOS NUCLÉICOS.Disponível em:
https://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/48300/4/PROCILCAR2007.00420.p
df. Acesso em: 11 jul. 2022.
15
https://www.biomedicinapadrao.com.br/2013/12/a-evolucao-da-pcr.html
https://kasvi.com.br/historia-e-evolucao-da-tecnica-de-pcr/
https://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/48295/1/LivroProtMolecular.pdf
http://www.fcfar.unesp.br/laboratorio_sandro_valentini/pdf/A30-%20ELETROFORESE%20EM%20GEL%20DE%20AGAROSE%20(analitica%20e%20preparativa).pdf
http://www.fcfar.unesp.br/laboratorio_sandro_valentini/pdf/A30-%20ELETROFORESE%20EM%20GEL%20DE%20AGAROSE%20(analitica%20e%20preparativa).pdf
https://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/48300/4/PROCILCAR2007.00420.pdf
https://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/48300/4/PROCILCAR2007.00420.pdf