DNA FORENSE

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INTRODUÇÃO
Lição 1 de 28
A identificação humana pelo estudo do perfil genético é amplamente utilizada em casos de caracterização de vínculo genético familiar, seja em processos cíveis (ex.: exclusão ou não da paternidade), como também em processos criminais (ex.: cadáveres e materiais biológicos encontrados na cena do crime). Atualmente, a mídia tem contribuído de forma significativa para a divulgação e popularização dessa tecnologia, que vem evoluindo sobremaneira nas últimas duas décadas.
No entanto, algumas considerações sobre essa tecnologia não passam de mito, pois não se pode concluir que “o DNA resolve tudo”, mas que a análise do perfil genético pode auxiliar na identificação humana fazendo parte das provas periciais de um determinado caso criminal ou civil.
Segundo Butler (2005), os testes de DNA para identificação humana podem ser utilizados para:
· Casos forenses: análise do DNA do suspeito com aquele obtido da evidência biológica encontrada na cena do crime ou nas vítimas;
· Teste de paternidade ou caracterização de vínculo genético familiar: exclusão ou não de supostos pais, filhos, mães e outros membros da família;
· Desastres em massa: identificação dos fragmentos humanos e dos corpos encontrados em um desastre com inúmeras vítimas;
· Investigações históricas;
· Investigações de pessoas desaparecidas;
· Identificação de militares;
· Banco de DNA de criminosos ou de evidências biológicas. 
Para isso, é necessário que alguns conhecimentos sejam adquiridos para sua posterior realização laboratorial. Tais conhecimentos teóricos serão ensinados nesse conteúdo, que englobará desde os fundamentos básicos da biologia molecular até a elaboração de protocolos para a realização do estudo do DNA forense.
BREVE HISTÓRICO DO DNA FORENSE
Lição 2 de 28
Antes da utilização do DNA para identificação humana, os genes e suas estruturas foram estudados para outras finalidades, sendo resumidamente descrito a seguir:
1856-1863
Gregor Mendel
· Considerado o “pai da genética moderna”
· Estabeleceu as regras da herança genética
· Realizou experimentos com 21.000 plantas híbridas para estabelecer o conceito de herança genética
1900-1933
Thomas Hunt Morgan
Thomas Hunt Morgan contribuiu para a genética moderna ao descobrir a herança cromossômica e a recombinação genética.
· Descobriu a herança cromossômica e a recombinação genética, na qual os ocorre a troca de fragmentos cromossômicos antes da divisão celular.
1944
Avery, MacLeod e McCarty
Atribuíram ao DNA a herança genética
· Grupos sanguíneos: Antes dos testes utilizando-se ácidos nucléicos, muitos tipos de exames sanguíneos eram utilizados para auxiliar na investigação de paternidade. Esses testes, baseados em diferentes sistemas de grupos sanguíneos ofereciam resultados de até 70 a 90%, se todos fossem analisados e combinados. 
· Os grupos sanguíneos recomendados pela Associação Médica Americana eram os sistemas eritrocitários: ABO, Rh, MNs, Kell, Duffy, Kidd e o sistema sanguíneo leucocitário HLA (PAGE-BRIGHT,1982).
1953:
James Watson e Francis Crick: Descoberta da estrutura do DNA
1985
Alec Jeffreys - DNA fingerprint
DNA fingerprint ou impressão digital de DNA foi descrito pela primeira vez por Alec Jeffreys, em 1985, e revolucionou a análise do DNA visando a caracterização de vínculo genético.
A identificação das regiões polimórficas é realizada empregando-se Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos de Restrição (Restriction Fragment length polymorphism – RFLP), no qual o DNA é submetido à digestão utilizando-se enzimas de restrição específicas que cortam a dupla fita de DNA em regiões determinadas. 
Os fragmentos são separados eletroforeticamente, e posteriormente desnaturados, neutralizados e transferidos do gel de eletroforese para uma membrana de nylon, em um processo denominado Sourthen blotting. Mediante a presença de uma solução de hibridização com sondas específicas contendo fósforo radioativo, os fragmentos de DNA fita simples irão hibridizar e aqueles não correspondentes serão removidos. Após a autorradiografia, os VNTRs poderão ser visualizados para análise
Na figura, representação esquemática da análise de Repetições Consecutivas de Número Variável ou VNTR.
Desde então, algumas tecnologias foram desenvolvidas incluindo a análise de Repetições Consecutivas Curtas ou STRs (Edwards et al, 1991) por gel de poliacrilamida corados por prata (Nelleman et al, 1994) ou analisados por equipamentos semiautomáticos que utilizam gel de poliacrilamida e realizam a leitura por laser dos fragmentos amplificados pela PCR com iniciadores marcados com fluoróforos que emitem fluorescência (Kimpton et al,1993; Gill et al, 1995).
Atualmente, a eletroforese por capilar (Pearce et al, 1993) é amplamente utilizada e possui o mesmo princípio que a eletroforese em gel analisados por laser, com a diferença de que possui capilares para a separação eletroforética dos fragmentos de DNA (Butler, 2005). Há também relatos da utilização de microchips de DNA para a análise de STRs (Radtkey etal, 2000; Huang et al, 2004; Divine e Allen, 2005; Bienvenue et al, 2005),podendo também ser um potencial para a análise futura dos STRs.
Fórmula química de uma cadeia simples de ácido nucléico e diagrama da molécula de DNA.
O Projeto Genoma concluído agora pode identificar pelo sequenciamento do DNA humano a localização de genes, revelando que há provavelmente cerca de 20.500 genes humanos. Tal fato revelou ao mundo informações detalhadas sobre a estrutura, organização e funcionamento do conjunto completo de genes humanos. O Consórcio Internacional para Sequenciamento do Genoma Humano publicou o primeiro rascunho do genoma humano na revista Nature, em fevereiro de 2001, com a sequência de todo o genoma de três milhões de pares de bases, cerca de 90% completo. 
A surpreendente conclusão desta primeira versão era de que o número de genes humanos pareceu ser significativamente menor do que estimativas anteriores, a qual variou de 50.000 genes a 140.000 (NATIONAL HUMAN GENOME RESEARCH INSTITUTE, 2008). A sequência completa foi concluída e publicada em abril de 2003. Após a publicação da maioria do genoma, em fevereiro de 2001, Francis Collins, diretor do Instituto Nacional de Pesquisa do Genoma Humano (National Human Genome Research Institute – NHGRI), observou que o genoma poderia ser pensado em termos de um livro com várias utilizações: “Trata-se de um livro de história, uma narrativa da viagem da nossa espécie através do tempo. É um trabalho manual, com um projeto para construção incrivelmente detalhado d ecada célula humana. E é um livro-texto transformador da medicina, cominformações que darão aos profissionais da saúde novos poderes para tratar,prevenir e curar as doenças” (NATIONAL HUMAN GENOME RESEARCHINSTITUTE, 2008).
As ferramentas criadas através do Projeto Genoma também estão sendo utilizadas para caracterizar o genoma de outros organismos usados extensivamente em pesquisa biológica como ratos, moscas e frutas. Tal pesquisa é importante porque a maioria dos organismos tem genes muito semelhantes ou “homólogos”, possuindo funções similares. Estes objetivos são necessários e continuarão a exigir uma variedade de novas tecnologias que tornarão possível e relativamente rápido construir um primeiro esboço do genoma humano, assim como aperfeiçoar este projeto (NATIONAL HUMAN GENOME RESEARCH INSTITUTE, 2008). 
FUNDAMENTOS DE BIOLOGIA MOLECULAR
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O DNA (ácido desoxirribonucléico) armazena toda a informação genética, sendo encontrado nos cromossomos do núcleo e nas mitocôndrias, a maior parte localizada no primeiro
O DNA pode ser extraído de amostras de sangue, de esfregaços bucais, de saliva, de osso, de dente, de tecidos e órgãos, de fios de cabelos, de sêmen, entre outros materiais biológicos (Brettell et al, 2005)
 
As moléculas de DNA caracterizam-se por polímeros de alto peso molecular, compostos de unidades básicas de nucleotídeos contendo 2-desoxirribose ligados entre as posições 3’ e 5’ de carbonos por ligações fosfodiéster.A estrutura do DNA é uma dupla hélice de cadeias complementares opostas, na qual as duas moléculas são mantidas juntas por fracas pontes de hidrogênio.
Estrutura química da molécula de DNA, com sua natureza antiparalela com o carbono 3’ com o carbono 5’.
As bases C e G são ligadas por três pontes de hidrogênio e as A e T, por duas.
 
 Representação esquemática da molécula de DNA
A base adenina liga-se com timina e citosina com a guanina através de duas ou três uniões de hidrogênio respectivamente. Essas bases nitrogenadas (adenina - A, timina - T, citosina - C e guanina – G ou g), ao se ligarem com o açúcar, constituem o nucleosídeo; sendo que o último ligado com um grupamento fosfato, constitui o nucleotídeo, que é a unidade básica de repetição na fita de DNA (Watson & Crick, 1953)
A base adenina liga-se com timina e citosina com a guanina através de duas ou três uniões de hidrogênio respectivamente. Essas bases nitrogenadas (adenina - A, timina - T, citosina - C e guanina – G ou g), ao se ligarem com o açúcar, constituem o nucleosídeo; sendo que o último ligado com um grupamento fosfato, constitui o nucleotídeo, que é a unidade básica de repetição na fita de DNA (Watson & Crick, 1953)
Determinados fragmentos de DNA especificam a síntese de RNA em um processo denominado transcrição. O ácido ribonucléico (RNA) é um polímero linear composto de cadeia de unidades de ribose ligadas pelas posições 3’ e 5’ por intermédio de grupamentos fosfodiéster, tendo como função a síntese protéica e também pode constituir o genoma de alguns vírus.
O gene é uma unidade de transcrição que consiste de um segmento de DNA específico que se estende do início do sítio de transcrição ao sítio de término de transcrição. O RNA especifica a síntese de polinucleotídeos que formarão as proteínas, sendo tal processo denominado tradução, ocorrendo nos ribossomos, nas mitocôndrias e cloroplastos (Beard &Armentrout, 1967; Srinivasan & Yathindra, 1977).
 Fluxograma da transcrição e tradução
As regiões de um gene que codificam proteínas são denominadas éxons e aquelas que não a realizam, íntrons. Cada éxon codifica uma porção específica da proteína completa. Em algumas espécies, incluindo a humana, os éxons são separados por longas regiões de DNA denominadas íntrons ou DNA“lixo”, que aparentemente não estão associadas à codificação de proteínas (National Human Genome Research Institute, 2008)
Diferenças entre os éxons e íntrons.
Os alelos constituem as variantes de um gene em uma região particular, ou lócus, em um cromossomo. Diferentes alelos produzem variações nas características individuais como, por exemplo, cor do cabelo ou tipo sanguíneo (National Human Genome Research Institute, 2008)
A duplicação celular ocorre através da mitose e a formação de gametas masculinos e femininos ocorre através da meiose.
A mitose é responsável pelo crescimento e desenvolvimento dos indivíduos, bem como a reposição de células injuriadas ou destruídas do corpo.
A meiose é um processo de divisão celular pelo qual uma célula diplóide (pares de cromossomos, sendo um materno e outro paterno) origina quatro células haplóides (um cromossomo), reduzindo à metade o número de cromossomos constante de uma espécie.
A transferência das informações genéticas de uma geração a outra ocorre através da replicação do DNA, catalisada por enzimas denominadas DNA polimerases. Essas enzimas mediam a síntese da nova fita de DNA in vivo, utilizando como molde (template) a fita complementar da molécula existente. Inicialmente, a molécula de DNA tem as suas fitas separadas pelo rompimento das ligações de hidrogênio que mantêm a dupla hélice, em um processo denominado desnaturação, que ocorre in vivo em pH alcalino. 
Além da fita molde, é necessária a presença de um oligonucleotídeo iniciador ou primer, ou seja, um pequeno fragmento de DNA simples, complementar a fita molde, desoxinucleotídeos trifosfatados (dATP, dCTP, dGTC, dTTP), que serão incorporados à fita duplicada. A replicação do DNA ocorre em regiões específicas denominadas origem de replicação (Marmur & Doty, 1959). Sucintamente, a replicação ocorre com a adição de um nucleotídeo à fita de DNA pela ligação de seu grupo fosfórico, presente no carbono 5' da desoxirribose, com a hidroxila do carbono 3' da desoxirribose do último nucleotídeo presente na cadeia replicada. Por esse motivo, descreve-se que a síntese de DNA ocorre no sentido 5 ́-> 3 ́  (Marmur & Doty, 1959;).
Todo o processo descrito acima será a base do princípio da amplificação do DNA in vitro denominada reação em cadeia pela polimerase (Polymerase Chain Reaction – PCR), que será estudado nos tópicos adiante.
DNA GENÔMICO X DNA MITOCONDRIAL
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O conjunto completo de sequências no material genético de um organismo é denominado genoma, incluindo todos os cromossomos mais qualquer DNA presente nas organelas. O genoma nuclear humano possui cerca de 3300 Mb, distribuídos em 22 cromossomos autossômicos e 2 sexuais, compostos de 30 a 35 mil genes, caracterizando por 1,5% a 2% de DNA codificante de proteínas, sendo que 46% do total constitui-se de sequências de DNA repetitivas (Wiemann, 2001; Szymasky, 2005)..
A finalização do sequenciamento do DNA humano trouxe alguns dados que alteraram os valores esperados pela comunidade científica,como por exemplo, a quantidade de genes. Estimava-se que o genoma humano possuía mais de 80.000 genes, mas após o Projeto Genoma, estima-se que existam de 20.000 a 25.000 genes.
Quantidade de nucleotídeos em cada cromossomo humano
Resumo das características básicas do genoma humano
O genoma mitocondrial possui particularidades que o diferenciam do genoma cromossômico, sendo sua herança materna. Sua estrutura circular de 16,5Kb lhe fornece maior resistência à digestão enzimática de uma única célula há a presença de milhares de mitocôndrias, cada qual com uma cópia de DNA mitocondrial, sendo que 93% do seu genoma é codificante, não possuindo íntrons e com poucas regiões repetitivas (Anderson et al, 1981). Dentro de uma única célula há inúmeras cópias do genoma mitocondrial, ao contrário do genoma nuclear, que possui uma cópia por célula (Budowle et al, 2003) 
Diferenças básicas entre o DNA genômico ou nuclear e mitocondrial
Representação esquemática do DNA genômico ou nuclear e do DNA mitocondrial (mtDNA)
MARCADORES DE VARIAÇÃO GENÉTICA
Lição 6 de 28
A variabilidade do DNA humano confere a diferença entre cada ser vivo, sendo que pode ser denominada por polimorfismo se a variação genética possuir frequência acima de 1% em determinada população e mutação abaixo desse valor (Beiguelman, 2006). Jeffreys et al. (1985) foi um dos primeiros a analisar as regiões de minissatélites do DNA humano, possibilitando a investigação de paternidade e a identificação em casos criminais. O polimorfismo dos minissatélites permite que ocorra a diferenciação dos indivíduos, aumentando a possibilidade de termos uma quantidade maior de alelos na população, desde que não sejam gêmeos idênticos, posto que terão o mesmo perfil genético. Para a análise do minissatélite, Jeffrey et al. desenvolveram o DNA fingerprint (impressão digital de DNA). Ao utilizar a tecnologia de Southern blot, obtiveram um padrão de bandas específico para cada indivíduo, como se fosse uma impressão digital.
Os Single Sequence Length Polymorphism (SSLP) ou polimorfismo de comprimento de sequência única englobam os VNTR (Variable Number ofTandem Repeats) ou repetições consecutivas de número variável (Wyman eWhite, 1980; Jeffreys et al,1985; Wolff et al,1989) ou minissatélites descritos no parágrafo anterior, e também os STR (Short Tandem Repeats) ou repetições consecutivas curtas ou microssatélites (Edward et al, 1991; Edward et al, 1992)(Figuras 36, 37 e 38).A diferença entre eles é o tamanho da sequência que se repete, sendo que nos microssatélites essa estrutura é menor, pois possuem repetições constituídas de2 a 9 pares de bases, e o minissatélite, de 10 a 64 pares de bases. Esse DNA satélite na maioria das vezes não é transcrito, consequentemente não está associado com a expressão da informação genética (Nelleman et al, 1994; Hamond et al, 1994; Gill et al, 1994; Urquart etal, 1994; Chakraborty et al, 1999).
Representação esquemática comparando as VNTRs dasSTRs, segundo sua unidade de repetição.
Representação esquemática das repetições consecutivas do STR TPOX e seus respectivos alelos.
Os Single Nucleotide Polymorphism (SNP) ou polimorfismo denucleotídeo único é uma variação na sequência de DNA que ocorre quando umnucleotídeo é alterado por outro em sequências de DNA que podem ou nãocodificar genes (Delahunty, 1996; Sobrino et al, 2005; Butler, 2005) (Figuras 38e 39).
Representação esquemática comparando os polimorfismos de sequência com os de comprimento
Representação esquemática de sequências de DNA de três indivíduos distintos com a presença de um SNP (polimorfismo de sequência) e um STR (polimorfismo de comprimento), mostrando suas diferenças.
Atualmente, os STRs e SNPs são empregados amplamente para a identificação humana e possuem diferenças relevantes (Gill et al, 2004; Butler,2005) 
Comparação entre os STRs e SNPs (adaptado de Butler, 2005).
Vantagens STRs e SNPs respectivamente
A análise dos SNPs também pode estar associada aos fenótipos individuais, havendo uma possibilidade futura de identificação de traços físicos como, por exemplo, a cor da íris (Frudakis et al, 2003). Sua grande aplicação na atualidade se dá nas pesquisas de farmacogenética e na indústria farmacêutica, na caracterização de doenças de origem genética e bioquímica (Wang et al, 1998).Jobim et al. (2006) relata que os melhores STRs utilizados na identificação humana são aqueles com maior polimorfismo (maior número de alelos), menor tamanho (100 a 200 pares de bases), elevado índice de discriminação e heterozigose, e baixa frequência de mutações. Para isso, há a necessidade dos laboratórios realizarem a frequência genética em pelo menos 100 indivíduos não relacionados.
ANÁLISE DO DNA FORENSE: ASPECTOS GERAIS
Lição 7 de 28
Para analisar uma amostra de material biológico visando caracterização de vínculo genético, seja familiar ou em casos criminais,qualquer contaminação de DNA estranho, ou mesmo a inadequação das metodologias aplicadas, pode resultar tanto na impossibilidade de estabelecer os perfis genéticos como na inutilização da amostra, posto que principalmente em casos forenses a amostra pode ser única.
A primeira preocupação no estudo do perfil genético, visando à identificação humana, é avaliar o quanto as metodologias de detecção utilizadas pelos laboratórios são válidas, assim como seus princípios moleculares e genéticos. Tendo em vista assegurar uma geração de dados corretos e tecnologias adequadas, um apropriado programa de controle de qualidade é essencial para os laboratórios de análises clínicas que realizam identificação humana pelo DNA. Todas as metodologias de análise de DNA forense devem ser submetidas a um programa de validação visando assegurar a segurança, a reprodutibilidade e robustez da técnica (Klosterman, 2001). Resumidamente, a análise de DNA forense ocorre da seguinte maneira:
Esquema da sequência dos métodos a serem utilizados para o estudo do DNA forense, englobando os estudos da Biologia, da Tecnologia envolvida e da Genética aplicada.
Desde 1989, a Sociedade Internacional de Hemogenética Forense (ISFG), que atualmente é denominada de Sociedade Internacional de Genética Forense (ISFG), publica recomendações envolvendo polimorfismos de DNA, demonstrando o interesse em avaliar a reprodutibilidade e exatidão das metodologias utilizadas. O FBI acrescenta alguns itens para o controle de qualidade dos laboratórios que trabalham com evidências de DNA forense, que inclui, além desses cuidados, a realização de periódicos testes de proficiência (a cada 180 dias) e auditorias anuais, para a manutenção da garantia de qualidade. 
O teste de proficiência é utilizado para monitorar o rendimento e identificar tópicos que devem ser aperfeiçoados e a auditoria para averiguar a qualidade das atividades realizadas pelo laboratório (DNA Advisory Board,2000). Os exercícios propostos para laboratórios que realizam caracterização de vínculo genético normalmente são constituídos de amostras biológicas de indivíduos mãe, filho e suposto pai, com o intuito de comparar as estratégias utilizadas, seus protocolos metodológicos, assim como os resultados obtidos entre os participantes (Bjerre et al, 1997; Hallengerb e Morling; 2001).
No Brasil, tais testes de proficiência em identificação humana pelo DNA são realizados pelo Grupo Espanhol e Português da Sociedade Internacional de Genética Forense (Grupo Español Y Portugués - International Society for Forensic Genetics), não havendo um grupo específico que realize testes de proficiência no país. Esses testes consistem na análise de amostras de sangue e outro fluido biológico que simulam um caso forense para a manutenção da qualidade na análise do DNA de amostras (ISFG, 2000).As contaminações das amostras pelos investigadores e pessoas do laboratório podem resultar em uma incorreta interpretação do perfil genético. Dessa maneira, o desenvolvimento e cumprimento de normas de procedimentos e treinamentos específicos para o exame de DNA tornaram-se imprescindíveis (Neumayer, 1998; INTERPOL, 2001).
Nos EUA o FBI implantou o CODIS - Combined DNA Index System, que tornou-se operacional em 1998, e combina a ciência forense com a tecnologia eletrônica, formando um banco de dados de perfis genéticos de DNA extraído de evidências biológicas coletadas na cena do crime e DNA de criminosos condenados por agressão sexual e outros tipos de violência física. Todos os estados americanos podem ter acesso a esse banco de DNA e, dessa maneira, há a possibilidade de comparar os perfis genéticos de um suspeito em um crime com os perfis contidos no CODIS, averiguando se o mesmo cometeu anteriormente outra infração (FBI, 2002).
Inspeção visual de evidência forense
O CODIS selecionou 13 STRs para a análise do perfil genético: CSF1PO, FGA, TH01, TPOX, vWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179,D13S317, D16S539, D18S51, e D21S11 (Budowle & Moretti, 1999). Esse conjunto de loci transformou-se uma referência para outros países do mundo, no que se refere à ciência forense (Sun et al, 2003).
STRs recomendados pelo Banco de DNA, vinculado ao FBI (CODIS), segundo a sua distribuição nos cromossomos humanos.
O DNA working group of the European Network of Forensic Science Institutes (ENFSI) e Scientific Working Group on DNA Analysis Methods (SWGDAM) (Gill et al, 2004) levantam a possibilidade futura da substituição do banco de dados de DNA atualmente contendo os 13 STRs indicados pelo CODIS do FBI por um banco de dados de DNA contendo informações de SNPs. Entretanto, os autores citam que a curto e médio prazo não haverá a substituição dos bancos de dados, inclusive das tecnologias utilizadas, e sim a incorporação dos mesmos em estudos forenses visando à padronização do seu uso assim como de sua análise.
Essa normatização possibilita maior facilidade em comparar tanto as frequências alélicas populacionais como os resultados dos perfis genéticos, mesmo que seja realizada em outros países. Visando futuramente implantar um banco de perfis genéticos de criminosos como o CODIS, o governo federal brasileiro já adotou os STRs sugeridos pelo CODIS como referência em perícias criminais em seu Manual de Padronização de Exames de DNA em Perícias Criminais (Secretaria Nacional de Segurança Pública - SENASP,2006), que está sendo utilizado como referência para os laboratórios que trabalham com identificação humana.
ESTUDO DA METODOLOGIA APLICADA À IDENTIFICAÇÃO HUMANA
Lição 8 de 28
A análise do DNA em caracterização do vínculo genético engloba desde o domínio da metodologia de coleta do material biológico até a interpretação dos resultados obtidos (Butler, 2004). Cada qual possui sua particularidadee cuidados inerentes à técnica que podem oferecer vantagens e desvantagens, de acordo com o objetivo almejado.
Esquema de todos os procedimentos envolvidos em caracterização do vínculo genético.
A análise do DNA compreende diversas etapas, independente da metodologia a ser empregada e do tipo de amostra que será analisada (COMMITTEE ON DNA TECHNOLOGY IN FORENSIC SCIENCE, 1992;BONACCORSO, 2005). 
O processo inclui:
1. coleta de amostras;
2. extração,purificação e quantificação do DNA de todas as amostras;
3. análise dos loci;
4. visualização dos fragmentos e caracterização;
5. interpretação e análise comparativa dos resultados (INTERPOL, 2001).
No entanto, para fins didáticos, os tópicos serão divididos em:
EXAME PERICIAL EM LOCAL DE CRIME
Lição 9 de 28
Em 2000, a Agência Federal de Investigação dos Estados Unidos(EUA), mais conhecida como FBI (Federal Bureau of Investigation), elaborouum guia para a investigação da cena do crime (TWGCSI – Grupo de trabalhotécnico da investigação da cena do crime, 2000). Esse manual visa àpadronização das práticas adotadas para a investigação da cena do crime dospoliciais e peritos americanos, tornando-se referência em investigação da cenado crime, seja para o exame de DNA forense ou não. Eles elaboraram essemanual dividindo em cinco sessões distintas: chegada à cena do crime,documentação preliminar, avaliação da cena, processando a cena, finalizandoa investigação da cena do crime.
Chegada à cena do crime	
Um dos cuidados mais importantes da perícia criminal é a manutenção das evidências físicas e a preservação da cena do crime, que deve ser realizada imediatamente após sua constatação, e é realizado normalmente pela polícia local.
· Anotar o local, a data, o tipo de ocorrência, casas, veículos, eventos ocorridos e elementos envolvidos;
· Não permitir que pessoas, veículos ou objetos saiam da cena do crime, identificando possíveis vítimas e suspeitos;
· Aproximar-se da cena cuidadosamente e verificar a possibilidade de outros crimes ao redor;
· Realizar observações iniciais (olhar, ouvir e cheirar) o ambiente e anotá-los;
· Observar a possibilidade de perigo de explosão e contaminação por materiais perigosos ou tóxicos e, se necessário, chamar policiais especializados para analisar a cena do crime;
· Não permitir que pessoas, veículos ou animais se aproximem da cena do crime, evitando contaminações e perigos como explosões;
· Após controlar as situações de perigo e isolar a área, a próxima atenção é chamar socorro médico para dar assistência médica necessária aos feridos, minimizando ao máximo a contaminação da cena do crime;
· Anotar todas as etapas dos cuidados médicos, desde sua hora de chegada até os cuidados prestados;
· Assegurar que evidências como roupas, objetos e manchas encontradas no corpo sejam preservadas pela equipe médica;
· Documentar todos os comentários e testemunhos de pessoas envolvidas ou presentes no local do crime ou ao seu redor;
· Um oficial da polícia deve sempre que possível acompanhar a vítima para o hospital para garantir a preservação das evidências ou mesmo documentar comentários feitos pelo paciente;
· Lacrar a cena do crime com faixas e adesivos;
· Controlar o fluxo de pessoas, inclusive peritos e outros policiais;
· Se possível, efetuar mensurações e tirar fotografias com escalas, para preservar as evidências – como pegadas, marcas de pneu no chão, etc –,presentes na cena do crime, caso chova, neve ou derreta (se for gelo);
· Não permitir que qualquer pessoa fume, masque chiclete, use o telefone ou banheiro, coma ou beba qualquer coisa, mexa nos vidros e janelas, mude os móveis de lugar, etc. Ou seja, não permitir que mexam em qualquer objeto presente na cena do crime ou ao seu redor;
· Toda a documentação e anotações feitas pelo policial devem ser entregues ao investigador de polícia para posterior estudo e análise.
Documentação preliminar e avaliação da cena:
· O investigador de polícia deverá documentar todas as informações recolhidas pelo policial, organizá-las e identificá-las com os dados da região do crime (delegacia, responsável, cidade, estado, etc);
· Continuar a manutenção da cena do crime descrita anteriormente, documentando todas as pessoas que estiverem participando da investigação;
· Definir estratégias para a análise fotográfica e recuperação dos vestígios encontrados na cena do crime.
Processando a cena:
· O investigador deverá avaliar e posteriormente solicitar a presença de peritos criminais, de acordo com a especialidade envolvida;
· O controle da contaminação deve ser extremamente rígido, evitando-se o contágio dos profissionais, das vítimas, da cena do crime, dos objetos, etc.;
· Utilizar equipamentos de proteção individual (EPI), como luvas(obrigatório), gorros e protetores de sapato (se necessário);
· Todo material utilizado para coleta das evidências deve estar devidamente limpo ou até esterilizado, caso seja para coleta de material biológico, e deve ser corretamente acondicionado
· Toda evidência deve ser corretamente documentada, citando-se a localização, identificação e condições que se encontravam, fotografada com escalas de referência e/ou filmadas antes de ser removida da cena do crime;
· Analisar e verificar a metodologia utilizada para a coleta da evidência. Por exemplo, cada método requer equipamentos e materiais diferenciados para a sua realização. Sendo assim, para fazer a análise de impressões digitais não se utiliza o mesmo equipamento para exame demarcas de mordidas, e assim por diante;
· Documentar qualquer intercorrência ou dificuldade havida durante a coleta do material;
· Preservar adequadamente o material coletado com a finalidade de minimizar sua degradação: refrigerado, congelado, local seco, local úmido, etc.;
· Encaminhar para os respectivos laboratórios periciais.
Finalizando a investigação da cena do crime:
· Determinar quais evidências foram coletadas;
· Discutir com toda a equipe envolvida na cena do crime as intercorrências e evidências.
COLETA DO MATERIAL BIOLÓGICO
Lição 11 de 28
As amostras de material biológico devem ser minuciosamente colhidas, seja quando dispostas na cena do crime ou quando forem de indivíduos devidamente identificados. É importante que todas as pessoas que manipulam as amostras tenham conhecimentos específicos baseados na literatura especializada, e ainda possuam treinamento em boas práticas de manipulação em laboratórios forenses, com rígida formação em controle de qualidade (INTERPOL, 2001). 
Amostras que não estiverem adequadamente identificadas e documentadas podem ser questionadas; aquelas que não forem corretamente coletadas são passíveis de não serem analisadas; outras, se não forem devidamente acondicionadas podem sofrer contaminação e se não forem criteriosamente preservadas pode ocorrer decomposição e deterioração (FBI,2003).
O FBI (1999, 2001) e a INTERPOL (2001) elaboraram normas para os laboratórios forenses que participam da formação dos bancos de DNA internacional, englobando principalmente a metodologia de coleta de evidências biológicas para análise do DNA, assim como aspectos importantes para o treinamento de pessoal que serão descritas adiante. O material biológico presente na cena do crime pode aparentar invisível a olho nu, dessa maneira, utiliza-se reagente como o luminol que não interfere na análise do DNA para detecção de amostras com vestígios de sangue, sendo que reage com o ferro presente na hemoglobina, exibindo uma quimioluminescência (GROSS et al, 1999).
Outros kits de reagentes são empregados: aqueles que contém antígeno próstata-específico para sêmen (HOCHMEISTER et al, 1999) e para saliva, o teste de detecção de amilase por Phadebas® (WILLOTT &GRIFFITHIS, 1980) etc. 
Diversos cuidados devem ser tomados para a documentação das amostras coletadas na cena do crime: fotografar o local de remoção das evidências, realizar anotações da sua disposição e de características pertinentes (SÃO PAULO, 1999; INTERPOL, 2001 ; FBI, 2003;BONACORSO, 2005). Amostras de sangue podem ser coletadas dos indivíduos, encontradas emcorpos, objetos e superfícies. Qualquer que seja o material biológico a ser coletado, o manipulador deverá utilizar luvas ou pinças estéreis. A coleta de sangue em indivíduos hígidos deverá ser realizada em dois tubos de 5mL contendo EDTA como anticoagulante, devidamente identificado e a seguir refrigerado.
Recomenda-se que os objetos, superfícies ou corpos que possuem as amostras de sangue sejam recolhidos se possível, além de realizar esfregaços nas formas líquidas ou, se secas, umidificar a região com água estéril, seguida de esfregaço. Em ambos os casos aconselha-se esperar secar os esfregaços para depois serem embalados em envelope de papel limpo, evitando que a umidade facilite o crescimento de bactérias e fungos. Amostras de sêmen, de saliva e urina, ou de objetos que os contém, podem ser utilizadas e seguem a mesma metodologia descrita anteriormente. Tecidos, dentes, ossos e fios de cabelos também podem servir de fonte de células para análise de DNA (FBI, 2003). A estocagem do material deve ser em refrigerador a 4°C ou em freezer a -20°C, no entanto, para longos períodos,estocar a -70 a -80°C (BUTLER, 2005).
Coletor estéril apropriado para coleta de materiais biológicos presentes na cena do crime.
O armazenamento do material biológico úmido em sacos plásticos deve ser de no máximo 2 horas ou, quando possível, permitir que seque antes do acondicionamento final. Cada tipo de amostra de material biológico (sangue,saliva, osso, dente, etc.) deve ter sua coleta e disposição individualmente descrito (Secretaria de Segurança Pública de São Paulo – SSP-SP, 1999;INTERPOL, 2001). 
A degradação do DNA de amostras biológicas, utilizadas em investigação criminal, pode ocorrer decorrente de um processo natural de exposição ao meio-ambiente. Luz, umidade, temperaturas elevadas, bem como contaminações bacterianas ou fúngicas levam à degradação química do DNA humano (SCHNEIDER et al, 2004).
A comissão de DNA da Internacional Society For Forensic Haemogenetics – ISFH sugeriu algumas recomendações para a análise de DNA pela PCR, incluindo que essa contaminação pode ser evitada, atendendo a certos cuidados durante todo o processo de análise de DNA, que vão desde a coleta e armazenamento do material biológico do qual será extraído o DNA, até o próprio local de preparação da PCR. As contaminações das amostras pelos investigadores e pessoas do laboratório podem resultar em uma incorreta interpretação do perfil genético. Dessa maneira, o desenvolvimento e cumprimento de normas de procedimentos e treinamentos específicos para o exame de DNA tornaram-se imprescindíveis (INTERPOL, 2001). 
Visando o estabelecimento de normas para coleta e exame de materiais biológicos para identificação humana, a Secretaria de Segurança Pública do Estado de São Paulo (SSP-SP) baixou a Resolução SSP-194, em 2 de junho de 1999 (São Paulo, 1999):
“Considerando:
a) a necessidade de normatizar os serviços periciais relativos à coleta de materiais biológicos para exames de identificação humana, tanto nos locais de crime quanto na pessoa humana, viva ou morta;
b) que os procedimentos a serem seguidos pelos órgãos policiais e periciais oficiais devem estar em consonância com os ditames da legislação em vigor, e
c) que é imprescindível a correta preservação das amostras para não haver contaminações ou outros prejuízos (p. 104)”.
Continuando na mesma Resolução, em seu anexo cita os cuidados que devemos ter para a coleta, armazenamento e análise do material biológico para a extração de DNA. Os cuidados incluem utilização de luvas descartáveis; instrumentos de coleta, armazenamento e análise devem ser estéreis; a documentação completa do vestígio eleito para a coleta, incluindo-se fotografias da região, tipo de armazenamento, entre outros; o armazenamento do material biológico úmido em sacos plásticos deve ser de no máximo 2 horas ou, quando possível, permitir que seque antes do acondicionamento final. Cada tipo de amostra de material biológico (sangue, saliva, osso, dente, etc.) deve ter sua coleta e acondicionamento individualmente descrito. 
EXTRAÇÃO DE DNA
Lição 12 de 28
A quantidade, a pureza e a integridade do DNA dependem de vários fatores, podendo ser influenciados pelas metodologias aplicadas para a sua extração. Após a coleta do material biológico, o DNA da amostra deverá ser separado de outras substâncias celulares antes de ser examinado. Proteínas celulares, contaminações químicas e microbiológicas diminuem o poder discriminatório das análises utilizando o DNA (BUTLER, 2005; HOFF-OLSENet al, 1999; JUNG et al, 1991).
A escolha do uso de diferentes métodos de extração de DNA está relacionada ao tipo de material envolvido e influencia diretamente o sucesso da análise dos STRs. A maioria dos procedimentos de extração de DNA compreende a lise celular, seguida da remoção das proteínas celulares precipitadas e por fim a precipitação do DNA com sua final eluição.
Existem diversos métodos para obtenção de DNA: a extração orgânica, que é a mais tradicional, empregando-se a proteinase K para lise celular e fenol clorofórmio para a precipitação das proteínas; a extração pela resina Chelex; por FTA; pela sílica; por precipitação salina; e portiocianato de guanidina. Cada uma delas possui suas indicações, vantagens e desvantagens (BONACCORSO, 2005; BUTLER, 2005; RAND et al, 1991; SALAZAR et al, 1998; HIRATA, 2002).
EXTRAÇÃO ORGÂNICA
Esquema da extração de DNA pelo método orgânico
PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE DNA DE SALIVA PELO MÉTODO ORGÂNICO
A amostra de saliva coletada e colocada em tubo estéril é submetida à centrifugação para a separação das células de sua parte aquosa, removendo-a. As pontas contendo o algodão dos swabs – que contém a saliva coletada sobre a pele – foram colocadas em um tubo estéril, sendo imediatamente iniciado o processo de extração, sem nenhum preparo prévio. 
Em seguida,adiciona-se 700 microlitros do tampão de lise para saliva (10mM TRIS pH8,0; 10mM EDTA; 0,1 M NaCl; 2% SDS) e posteriormente 35 microlitros de Proteinase K 20mg/mL. Após agitação, a tampa do tubo deve ser vedada com Parafilm® e incubada por uma noite a 56ºC. A seguir, a Proteinase K é inativada a 95ºC por 10 minutos, adicionando-se 700 microlitros de fenol tamponado com pH 8,0 e homogeneizando-se com movimentos manuais leves por 5 minutos. Centrifuga-se e o sobrenadante é transferido para outro tubo, utilizando uma micropipeta com ponteira estéril. 
Acrescenta-se fenol/ clorofórmio/ álcool isoamílico (25:24:1) na mesma quantidade do sobrenadante removido, homogeniza-se, centrifuga-se e remove-se o sobrenadante novamente para outro tubo. Adiciona-se ao sobrenadante cerca de 2 ou 3 vezes o volume recuperado, álcool 100% e 10% do volume em acetato de sódio 5M. Incuba-se durante uma noite a -20ºC. No terceiro dia de extração, centrifuga-se a mistura. Dispensa-se o etanol, e ao precipitado adiciona-se 1mL de etanol 70%, homogeneizando-se cuidadosamente. Centrifuga-se e novamente é removido o álcool. Seca-se totalmente o "pellet". Ressuspende-se o "pellet" com 100microlitors de T.E. (Tris-base 100mM, pH 7,6; EDTA 10mM, pH 8,0).
EXTRAÇÃO PELA RESINA CHELEX
EXTRAÇÃO POR FTA
A técnica mais amplamente empregada envolve, em sua primeira fase, a lise celular, seguida de desnaturação ou inativação de proteínas. Com solventes orgânicos o DNA é posteriormente separado de macromoléculas, como as proteínas através de solubilização em água, e em seguida precipitado com etanol. Outras metodologias com o mesmo princípio, inclusive kits comerciais, podem ser utilizadas para cada tipo de amostra biológica. Há diferentes metodologias para a extração de DNA de sangue total (Salazar etal., 1998; Schneider, 1998), de esfregaços vaginais e de amostras de sêmen (Schneider, 1998), de saliva total e de materiais contendo saliva (Walsh D etal., 1992; Sweet et al., 1996; Hochmeister et al., 1998; Anzai et al., 2001,Anzai-Kanto, 2005); de dente humano (Oliveira, 2000), de osso (Hagelberg etal., 1991; Alves, 2000); de material parafinado (Mesquita et al.,2001), tecidosremovidos de cadáveres (Hochmeister, 1998) entre outros.
Extração de DNA Do Sangue
As amostras de sangue foram submetidas à lise celular com 1000μL do tampão Tris-1 (Tris HCl 10mM pH 8,0, KCl 10mM, MgCl2 10mM EDTA 2mMpH 8,0) contendo Triton X-100 a 2.5%. Após a centrifugação, os núcleos celulares foram lisados com 220μL do tampão Tris-2 (Tris-HCl 10mM pH8,0,KCl 10 mM, Mg Cl2 10mM, EDTA 2mM pH 8,0, NaCl 0,4 M) contendo SDS a 1%. As proteínas foram removidas por precipitação salina com 100% seguindo de lavagem etanol 70%, por 3 vezes. Posteriormente o DNA foi ressuspendido em 100μL do tampão TE (Tris-HCl 10 mM e 1mM EDTA, pH 8,0) mantidos a -20ºC.
A quantidade, a pureza e a integridade do DNA dependem de vários fatores como condições da amostra e da conservação, sendo necessário utilizar critérios para escolha da metodologia de extração para cada tipo de amostra (HAGELBERG et al., 1991; HOCHMEISTER, 1998; SALAZAR et al.,1998; SCHNEIDER, 1998; ALVES, 2000; ANZAI et al., 2001; MESQUITA et al,2001; OLIVEIRA et al, 2002).
O DNA pode ser obtido inclusive de células únicas, como as bucais. O isolamento de DNA micromanipulado de cada uma das 226 células utilizadas, a alteração da concentração de iniciadores, a utilização de AmpliTaqGold® e reação de PCR com 34 ciclos, possibilitou que Findlay et al. (1997) obtivessem sucesso ao amplificar o DNA de cada uma dessas células. AmpliTaqGold tem uma estabilidade à temperatura maior do que outras taqs, como a taqpolimerase comum. Ao amplificarem individualmente o DNA de cada célula, obtiveram amplificação em 91% (206), sendo que em 50% (114) o perfil genético (7 loci) foi completo, em 64% (144) amplificou-se 4 a 6 loci.
Os autores insistem no rigoroso controle da contaminação, posto que mesmo tomando esse cuidado em sua pesquisa obtiveram 28% com alelos adicionais aos verdadeiros alelos, e 11% somente com alelos adicionais. 
QUANTIFICAÇÃO DE DNA
Lição 13 de 28
A quantificação do DNA após a sua extração é importante para o aperfeiçoamento da qualidade do produto de DNA resultante da PCR (Internacional Society for Forensic Haemogenetics, 1992). O excesso de DNA em uma amostra de PCR poderá saturar a reação, fazendo com que apareça artefatos de técnica e amplificações inespecíficas que podem dificultar a sua análise. Já a sua falta poderá acarretar a perda de um dos alelos, quando o indivíduo é heterozigoto, ou mesmo na não amplificação dos mesmos (Butler,2005).
A qualidade e quantidade de DNA devem ser examinadas após a extração, além de verificar a possibilidade de degradação (JUNG et al, 1991;HOFF-OLSEN et al, 1999). O DNA pode ser quantificado por espectrofotometria em espectrofotômetro a 260 nm, sua pureza pela relação 260/280 nm e a sua integridade pode ser avaliada em géis de agarose. No entanto, esses métodos avaliam a quantidade geral de DNA, seja ele humano ou de outro tipo. Quando se refere às amostras utilizadas em investigação criminal ou passíveis de degradação e contaminação, recomenda-se a utilização da quantificação de DNA de humano (INTERNACIONAL SOCIETY FOR FORENSIC HAEMOGENETICS - ISFH, 1992).
Essa quantificação pode ser realizada por hibridização de uma sonda utilizando-se um determinado lócus (D17Z1) em uma amostra de DNA imobilizada de uma membrana de náilon – dot blot (WALSH et al., 1992;ANDERSEN, 1998), e por kits comerciais como, por exemplo, o AluQuantTMhuman DNA quantitation system (WAYE et al, 1989; HOFF-OLSEN et al, 1999;MANDREKAR et al., 2001; SCHNEIDER et al, 2004; BUTLER, 2005). 
Apesar dessas técnicas serem mais complexas e caras que a espectrofotometria, elas quantificam somente o DNA humano, pois possuem sondas específicas para o mesmo. Tal característica pode ser imprescindível em casos forenses que haja a possibilidade de contaminação de DNA externo. No entanto, muitas vezes não é utilizada, pois há a necessidade de 5 a 10μL de produto de DNA, o que muitas vezes não é obtido. Uma metodologia que está substituindo as outras técnicas de quantificação por utilizar pouca quantidade de DNA, ser específico para DNA e inclusive possibilitando verificar a presença de inibidores da enzima polimerase é a quantificação de DNA por PCR em tempo real. Principalmente em casos forenses que existe ínfima quantidade de DNA, está sendo altamente recomendada. 
Consiste no emprego de marcadores específicos marcados com fluorescência que são utilizados para a amplificação de regiões do genoma humano. No entanto, para fins didáticos, será explicado após a explicação da reação em cadeia pela polimerase (PCR), pois envolve a amplificação do DNA. A amostra biológica sendo preservada adequadamente e realizada em ótimas condições de extração e quantificação obtém-se quantidades maiores ou menores de DNA. 
Quantidade de DNA extraído de diversos tipos de material biológico:
	TIPO DE AMOSTRA
	QUANTIDADE DE DNA
	Sangue total
	20000 - 40000 ng/mL
	Mancha de sangue
	250 - 500 ng/cm3
	Líquido seminal
	150000 - 300000 ng/mL
	Esfregaço de material vaginal pós coito
	10 - 3000 ng/esfregaço
	Fio de cabelo com bulbo
	1 - 750 ng/fio
	Pelo com bulbo
	1 - 10 ng/pelo
	Saliva total
	1000 - 10000 ng/mL
	Esfregaço bucal
	100 - 1500 ng/esfregaço
	Urina
	1  - 20 ng/mL
	Osso
	3 - 10 ng/mg
	Tecido
	50 - 500 ng/mg
REAÇÃO DE AMPLIFICAÇÃO PELA POLIMERASE - PCR
Lição 14 de 28
Uma tecnologia que revolucionou o campo da biologia molecular foi a PCR, tendo como seu inventor Kary Mullis, recebendo o Prêmio Nobel por essa descoberta (INTERPOL, 2001). A PCR consiste na amplificação seletiva de uma sequência-alvo de DNA específica a partir de uma coleção heterogênea de DNA, empregando-se um par de oligonucleotídeos iniciadores que são complementares a uma certa extensão em ambas as fitas do DNA a ser amplificado (Saiki et al, 1985). Várias sequências de iniciadores de diversas regiões do DNA humano já foram estabelecidas possibilitando a amplificação de seus respectivos STRs nas reações de PCR (Polymeropouloset al., 1991; Polymeropoulos et al., 1992; Nishimura & Murray, 1992; Li et al.,1993; Moller et al., 1994; Urquhart et al., 1994; Urquhart et al., 1995; Jin et al.,1997). A sequência-alvo de DNA, cuja continuação é originalmente conhecida, é denominada DNA molde.
A PCR envolve três etapas:
1. Desnaturação
2. Hibridização 
3. Extensão. 
A desnaturação ocorre quando a molécula de DNA é aquecida acima da temperatura de 90°C, na qual as pontes de hidrogênio da dupla hélice se rompem, ocorrendo a separação das cadeias complementares. Os iniciadores se ligam especificamente às sequências de DNA complementares no processo de hibridização, mediante uma temperatura que pode variar de 45 a 72°C e deve ser previamente otimizada, estando relacionada à temperatura de melting(Tm), que é medida através de uma fórmula específica que envolve a quantidade de C e G em sua sequência. A prevalência de ligação dos iniciadores ocorre pela sua alta concentração no meio da reação. A enzima termoestável denominada DNA polimerase direciona o posicionamento dos precursores do DNA – dNTP –iniciando a síntese de novas fitas de DNA. Com um novo aumento de temperatura, a enzima DNA polimerase catalisa a reação, incorporando o nucleotídeo na posição terminal do iniciador, complementando as bases do DNA molde, promovendo a extensão da fita (Saiki, 1985, Sambrook et al, 2001)
Esquema da reação de PCR, com visualização dos fragmentos.
Esquema representativo de exemplo de ciclagem para uma PCR convencional
A PCR é realizada em equipamentos denominados termocicladores que controlam e variam a temperatura automaticamente para cada programa pré-estabelecido pelo pesquisador
A reação de PCR é preparada utilizando-se diversos reagentes que devem possuir concentrações específicas para cada tipo de análise.
Atualmente, existem diversos kits de PCR contendo todos os reagentes pré-padronizados que facilitam a utilização da PCR em laboratórios forenses. No entanto, é de grande importância que o pesquisador entenda todo o processo de amplificação e seus reagentes. O reagente que vai direcionar a otimizaçãode cada reação será o primer ou iniciador, que flanqueará a região do DNA a ser copiada, sendo um oligonucleotídeo sintetizado quimicamente e é adicionado à reação em altas concentrações (Butler, 2005).
Reagentes utilizados em uma PCR com a respectiva concentração ótima
As ciclagens da PCR variam de acordo com os reagentes empregados, principalmente com a enzima polimerase, que altera a temperatura de extensão, os primers, que muda a temperatura de hibridização; e com a amostra de DNA, pois apresenta-se em pouca quantidade, podendo aumentar o número de ciclos. 
Só para ter uma ideia da variação das condições de ciclagem para kits diferentes utilizados em DNA forense foram colocados na tabela abaixo exemplos de parâmetros de duas empresas distintas:
Parâmetros utilizados para a ciclagem da PCR em kits de PCR multiplex comercialmente disponíveis no mercado, e que são os mais utilizados mundialmente.
As vantagens da utilização da PCR na ciência forense são a sua sensibilidade, pois é capaz de amplificar sequências a partir de quantidades ínfimas da sequência-alvo de DNA e até mesmo do DNA de uma única célula; e sua robustez, permitindo a amplificação de sequências específicas a partir de material biológico degradado (ISFH, 1992, INTERPOL, 2001; Sambrook, 2001).
No entanto, tal eficiência e sensibilidade implicam também na atenção aos cuidados para evitar-se a contaminação de DNA externo, que pode ocorrer durante todo o processo de análise do DNA (Internacional Society For Forensic Haemogenetics – ISFH, 1992). 
Kwok & Higuchi (1989) elucidaram vários cuidados pertinentes à preparação do material para a PCR, objetivando evitar a contaminação das amostras:
A preservação do DNA forense para a amplificação pela PCR também envolve o controle da temperatura, da umidade, o valor do pH, a presença de ácido húmico e fúlvico e microrganismos. 
A temperatura baixa pode preservar o DNA, seja ele datado de milhares de anos, ou de amostras forenses, assim como o DNA pode ser mais bem preservado em ambientes secos e com o mínimo crescimento de microrganismos. A presença de ácido fúlvico e húmico pode comprometer a amplificação pela PCR pelo fato de inibir os efeitos da enzima polimerase utilizada na reação. O pH neutro ou levemente alcalino na amostra também ajuda na preservação do DNA. Os microrganismos podem metabolizar o DNA por completo, se em grande quantidade (Burger et al., 1999).
Regiões específicas de amplificação são escolhidas de acordo com o objetivo da análise. Atualmente, as regiões mais utilizadas são as STRs para a identificação humana. Edwards et al (1991) relata que as melhores STRs empregadas na identificação humana são aquelas com maior polimorfismo (maior número de alelos), menor tamanho (100 a 200 pares de bases), elevado índice de discriminação e heterozigose e baixa frequência de mutações. Esses dados são levantados por estudos populacionais de regiões distintas, que serão descritos posteriormente. A PCR permite que mais de uma região possa ser copiada simultaneamente se adicionado mais de um iniciador sense e antissense em uma única reação.
A amplificação simultânea de duas ou mais regiões de DNA é conhecida por PCR multiplex. Para essa reação a temperatura de hibridização dos iniciadores deve ser compatível e a complementaridade excessiva das regiões deve ser criteriosamente analisada, para prevenir a formação de dímeros de iniciadores que não hibridização com o DNA (EDWARDS & GIBBS, 1994).
Kit Multiplex de duas empresas distintas comercialmente disponíveis para a realização de PCR em uma única reação.
Há diversas vantagens da PCR multiplex para DNA forense: 
· diminui o tempo de preparo e a quantidade de reagentes utilizados; 
· diversos loci podem ser amplificados em uma única reação, empregando-se pouca quantidade de DNA, aumentando a chance de sua amplificação. 
Atualmente há diversos conjuntos multiplex disponíveis no comércio, facilitando apadronização e comparação dos resultados entre os laboratórios forenses(LEVEDAKOU et al., 2002; WALLIN et al., 2002; KRENKE et al, 2002;COLLINS et al, 2004).
Esquema representativo da PCR em tempo real, na qual sondas com fluorescências são utilizadas para a amplificação de uma região específica de DNA. Após a hibridização da sonda com a molécula de DNA, a enzima taq polimerase atua amplificando a região alvo, liberando um fluoróforo que será analisado em tempo real pelo equipamento termociclador, sendo conectado a um computador que através de programas específicos realiza a interpretação dos dados.
Outra técnica que deve ser comentada seria a utilização da PCR em tempo real, que, no momento, está sendo aproveitada em ciência forense para determinar a quantidade de DNA humano viável para a amplificação. A PCR em tempo real amplia regiões específicas de DNA. Diferencia-se da PCR tradicional, pois possui sondas marcadas com fluoróforos proporcionando detecção em tempo real dos fragmentos amplificados, sendo simultaneamente quantificados. Dessa maneira, não há necessidade da utilização de géis e análise por Southern Blot como nas outras técnicas quantitativas descritas anteriormente (ANDREASON, 2003).
Entretanto, para a realização da PCR em tempo real é necessário equipamento específico e sondas adequadas. O DNA humano pode ser especificamente quantificado para posterior análise do perfil genético pelas STRs, assim como verificar a presença ou não de inibidores da enzima polimerase (APPLIED BIOSYSTEMS, 2006).
ELETROFORESE E DETECÇÃO DOS FRAGMENTOS DE DNA
Lição 16 de 28
Os fragmentos de DNA amplificados por PCR são identificados após a eletroforese em gel de poliacrilamida, seguido da coloracão com prata, ou pela detecção de sinal fluorescente, na qual os iniciadores utilizados no PCR são marcados com fluorocromos, possibilitando a análise por sequenciador automático (Gill, 1992; Sullivan et al, 1992; Frégeau e Fourney, 1993).
A eletroforese é uma metodologia amplamente empregada para a separação, isolamento, análise e manipulação dos ácidos nucléicos. Os ácidos nucléicos possuem uma carga geral total negativa, devido aos seus grupamentos fosfato do arcabouço, consequentemente, quando aplicados em um gel de agarose ou poliacrilamida, eles migrarão em direção ao ânodo em um campo elétrico (Aaji e Borst, 1972; Southern, 1979). Em condições apropriadas de tampão, voltagem e miliamperagem, os fragmentos pequenos migrarão mais facilmente do que os maiores.
Fragmentos de DNA carregados negativamente migram ao pólo positivo mediante a presença de um campo elétrico específico.
Esquema da corrida de eletroforese com visualização dos fragmentos de DNA e das partículas de gel e dos poros, seguida de imagem dos fragmentos de DNA corados com brometo de etídeo exposto a luz ultravioleta.
A variação do tipo e concentração do gel propicia diferentes características de separação, permitindo distintas resoluções e análises.
Em caracterização de vínculo genético utiliza-se eletroforese em gel de poliacrilamida ou eletroforese capilar para a análise das imagens. Em inclusão ou exclusão de paternidade, compara-se os alelos presentes no filho com o do suposto pai, sendo que um seria o alelo obrigatório materno e o outro paterno. 
Esquema representativo da análise de uma eletroforese em gel de poliacrilamida corado com prata contendo DNA de amostras biológicas da mãe, do filho e do suposto pai, de um STR amplificado pela PCR analisados juntamente com marcadores alélicos.
O mesmo acontece em inclusão de suspeitos de um crime, no qual compara-se o DNA encontrado na vítima, como ocorre com marcas de mordida ou presença de sêmen, ou na cena de um crime. Pode ocorrer uma mistura de amostras biológicas contendo DNA da vítima e do agressor. Dessa maneira, confronta-se o DNA da vítima com o dos suspeitos e, sucessivamente, com o DNA das amostras presentes na cena do crime. Tais análises são realizadas em pelo menos 13 STRs distintos (Jobim et al, 2006; Budowle &Moretti, 1999; INTERPOL, 2001; Secretaria Nacional de Segurança Pública -SENASP, 2006).
Esquema representativoda análise de uma eletroforese em gel de poliacrilamida corado com prata contendo DNA de amostras biológicas da vítima, do material biológico coletado de uma marca de mordida, e de três suspeitos distintos de um STR amplificado pela PCR, analisados juntamente com marcadores alélicos.
Diversos tipos de equipamentos podem ser utilizados para a sua realização, podendo ser horizontais e verticais, grande e pequenos, sendo sua indicação própria para cada tipo de procedimento que queira realizar.
Generaliza-se da seguinte maneira:
- Cubas horizontais: gel de agarose
- Cubas verticais: gel de poliacrilamida
 	
Cubas horizontais: gel de agarose Cubas verticais: gel de poliacrilamida
Géis de agarose e poliacrilamida podem ser feitos de uma variedade de formas, tamanhos e porosidades e podem ser corridos em um número diferente de configurações. As escolhas desses parâmetros dependem primeiramente no tamanho dos fragmentos a ser separados. 
Géis de poliacrilamida são mais eficientes em separações de pequenos fragmentos de DNA (5-500pb), que é o caso da análise do DNA forense. O poder de resolução é extremamente alto, e fragmentos de DNA que diferem em tamanho por pouco tão pouco quanto 1pb (par de base) em comprimento ou 0,1% de sua massa podem ser separados uns dos outros. Apesar de serem corridos rapidamente e acomodarem comparativamente grandes quantidades de DNA, géis de poliacrilamida possuem a desvantagem de serem mais difíceis de preparar e manusear do que eletroforese capilar. Géis de poliacrilamida são corridos em uma configuração vertical de uma corrente elétrica constante (Sambrook et al,2001).
GEL DE AGAROSE
Lição 17 de 28
Géis de agarose possuem menor poder de resolução do que géis de poliacrilamida, mas possuem maior alcance de separação. DNAs de 50pb até alguns megabases em extensão podem ser separados em géis de agarose de diferentes concentrações e configurações. Pequenos fragmentos de DNA (50-20000pb) são melhores resolvidos em géis de agarose corridos em conformação horizontal em um campo elétrico de força e direção constantes. Os fragmentos de DNA são comparados com marcadores de tamanho ou ladders ou padrões (Sambrook, 2001).
Diferentes marcadores de tamanho molecular ou Ladders utilizados em eletroforese em gel de agarose ou até mesmo de poliacrilamida.
No entanto, atualmente, os géis de agarose só são utilizados em DNA forense para a checagem do produto amplificado antes da sua eletroforese por capilar.
Na figura abaixo: gel de agarose a 2% corado por Brometo de Etídeo, fotografado durante exposição à luz ultravioleta, contendo um marcador de 100 pares de bases (primeira coluna: cada banda equivale ao peso molecular de 100 em 100 pares de bases). Os produtos de PCR de aproximadamente 220 pares de bases são visualizados em todas as outras colunas. Na quarta coluna,verifica-se que não existe banda, caracterizado pela não-amplificação do controle negativo da PCR (que não possui DNA).
De forma generalizada, cubas horizontais são utilizadas em gel de agarose e as verticais em gel de poliacrilamida. Sistemas para eletroforese em gel horizontal consistem de uma caixa que é dividida em dois compartimentos e contém uma plataforma no meio, que servirá de suporte para o gel, que ficará totalmente submergido em tampão. 
Os eletrodos presentes em cada compartimento fornecerão os campos elétricos. A corrente resultante atravessará o gel e o tampão que circunda o gel. Com isso, a espessura do gel e a quantidade de tampão a ser colocada deverá ser controlada para a obtenção de resultados reprodutíveis. O resfriamento é promovido pelo tampão que circunda o gel, que fica recirculando para prevenir o desenvolvimento de gradiente de pH e também mantém a temperatura controlada e uniforme (Sambrook et al, 2001).
Cubas de eletroforese horizontal de diferentes tamanhos
Para cada sistema de cubas e plataformas há diferentes tipos de pentes para a formação de poços no gel de agarose com capacidade volumétrica diferenciada para a deposição das amostras. De acordo com a quantidade de agarose colocada na plataforma, altera-se a sua altura, possibilitando uma maior capacidade de volume do poço
Capacidade de amostragem para Cuba Horizon 58 relativa à espessura do gel
Os cuidados para o preparo do gel de agarose estão dispostos a seguir:
Montar as peças do equipamento
–
Montar as peças do equipamento de acordo com a figura abaixo
Preparar o gel de agarose
–
1. Escolha a porcentagem do gel de agarose, a quantidade de solução que colocará na plataforma (Tabela ABAIXO);
2. O gel de agarose 1% equivale a 1g de agarose para cada 100mL. Calcular a quantidade de agarose a ser pesada e volume total de tampão a ser utilizado. Coloque a agarose e o tampão 1x ou 0,5x em um Erlenmeyer;
3. Pese o frasco contendo a solução e anote o valor;
4. Dissolva a agarose em TBE por aquecimento em forno microondas ou banho de água quente, misturando ocasionalmente. Os cristais de agarose devem estar totalmente dissolvidos;
5. Pesar o frasco novamente e acrescentar água deionizada para compensar a evaporação;
6. Pipetar ou verter a quantidade desejada de solução na plataforma;
7. Assegure que agarose foi distribuída por toda superfície e, se necessário, remova as bolhas;
8. Espere que a solução esfrie até sua total solidificação.
Eletroforese do gel de agarose
–
1. Adicione de 100 a 150 mL de tampão na cuba sobre o gel polimerizado;
2. Remova cuidadosamente o pente e o vedador;
3. Remova as bolhas que eventualmente estejam entre o tampão e o gel;
4. Pipete as amostras cuidadosamente na parede do casulo. As amostras devem conter quantidade suficiente de glicerol ou sucrose para serem mais densos que o tampão;
5. Feche a tampa da cuba de eletroforese;
6. Conecte a cuba em uma fonte para eletroforese;
7. Ligue a fonte e selecione a voltagem desejada. Pequenas bolhas formarão perto dos eletrodos quando a cuba está corretamente conectada;
8. A voltagem e o tempo requeridos de acordo com o tampão utilizados estão dispostos na tabela abaixo. A corrente e o tempo de eletroforese variam de acordo com o volume de tampão, espessura do gel e voltagem aplicada. Para voltagens acima de 175V ocorre suficiente aquecimento do gel levando a desnaturar o gel de agarose. É necessário o resfriamento a 4°C da unidade durante a eletroforese. Géis contendo menos que 0,5 de agarose também devem ser resfriados durante a eletroforese por serem muito fracos.
Pós-eletroforese
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1. Após desconectar os cabos da fonte de eletroforese, desconecte os cabos da cuba, aba a tampa e retire a plataforma contendo gel do tampão;
2. Remova o gel com cuidado para a coloração;
3. Remova o tampão da cuba e descarte-o apropriadamente, não reutilizando. Enxágue com água destilada;
4. Remova qualquer tipo de resíduo de agarose das peças utilizadas e enxágue com água destilada.
Coloração do gel de agarose: brometo de étídeo
Ácidos nucléicos submetidos à eletroforese através de géis de agarose podem ser visualizados p coloração e com luz UV a 300nm. Dois métodos são utilizados para essa finalidade: a coloração por brometo de etídio e por SYBR gold.
O brometo de etídio é preparado como uma solução estoque de 10mg/ml em H2O e estocado à temperatura ambiente em frascos âmbar ou enrolados em papel alumínio. O corante é geralmente incorporado ao gel de agarose e tampões eletroforéticos em concentrações de 0,5μg/ml. A vantagem de se acrescentar o brometo de etídio na preparação do gel é que pode-se examinar os fragmentos de DNA durante a corrida ou ao final dela. A desvantagem é a redução da mobilidade eletroforética em ~15%, além da maior contaminação do equipamento pelo brometo. Quando efetua-se a corrida na ausência do corante, DNAs com formas de platôs finos são conseguidos (Sharp et al. 1973; Sambrook et al, 2001).
O brometo de etídio contém grupos planares tricíclicos que intercalam entre as bases do DNA, com pequena ou nenhuma preferência sequencial. Em soluções saturadas de alta força iônica, aproximadamenteuma molécula de etídio intercala a cada 2.5pb (Waring 1965). Após inserção na hélice, o corante fica perpendicular ao eixo helicoidal e faz ligações de Van der Waals com as bases acima e abaixo (Lepecq, 1966). A UV é absorvida pelo DNA em 254nm e transmitida para o corante; radiação a 302nm e 366nm é absorvida pela própria ligação ao corante. Em ambos os casos, a energia é retransmitida a 590nm. O brometo de etídio pode ser usado para detecção de RNA e DNA, mas a afinidade é maior para o DNA (Sambrook et al,2001).
Estrutura molecular do DNA após intercalação do brometo de etídeo
O brometo de etídeo é um potente mutagênico, pode ser absorvido pela pele, irritante para os olhos, boca e trato respiratório superior. Deve ser estocado longe de agentes oxidantes em um local resfriado, seco e em recipiente indestrutível e fechado. Inúmeras precauções para manuseio e descarte devem ser realizadas para reduzir a contaminação tanto do pesquisador como ambiental:
Cuidados para a manipulação e descarte do Brometo de Etídeo
Luvas: Utilizar luvas de nitrila para prevenir contaminação das mãos. Luvas descartáveis (como 4, 6 ou 8 mil azul luvas de nitrila) usadas em operações de laboratório suprem apenas uma barreira de contato e devem ser descartadas imediatamente quando há suspeitas de contaminação. Luvas descartáveis não podem ser usadas para proteção de materiais químicos perigosos sem utilização de duas luvas devido ao potencial de formar buracos mínimos. Luvas de látex descartáveis são passíveis de apresentar defeitos e buracos mínimos e não são recomendadas.
Óculos: Utilize óculos de proteção aos químicos com escudo lateral.
Trajes de laboratório: Sempre use calças compridas, sapatos fechados e aventais quando manusear materiais perigosos.
Procedimentos de Emergência e Primeiros Socorros: Providencie ajuda de primeiros socorros até que auxílio apropriado chegue ao local.
Ingestão: Se a pessoa estiver consciente, lave a boca com água. Não induza vômito. Mantenha a pessoa afetada aquecida e descansada até que auxílio médico chegue.
Inalação: Remova a vítima do local de exposição a um local arejado imediatamente. Se a respiração cessar, tenha uma pessoa qualificada que possa fazer respiração artificial. Mantenha a pessoa afetada aquecida e descansada até que auxílio médico chegue.
Contato com a pele: Remova roupas contaminadas (incluindo os sapatos) imediatamente. Lave o local afetado com sabão e detergente suave com grande quantidade de água até que nenhuma evidência de químico esteja presente (pelo menos 10 a 20 minutos). Chame um médico se você notar irritação nos olhos ou no trato respiratório.
Contato com os olhos: Lave os olhos imediatamente com grande quantidade de água ocasionalmente levantando as pálpebras inferiores
Descontaminação de substâncias tóxicas: brometo de etídio
A prática de processos referentes à biossegurança é essencial para a manutenção da saúde das pessoas que lidam diretamente com organismos vivos e substâncias tóxicas para o ser humano. No caso dos microrganismos é fundamental o uso de fluxos laminares ou outras técnicas de contenção (como o do bico de Bunsen) que impeçam a sua dispersão durante a manipulação. Outra prática muito importante é que todos os materiais derivados de cultivos de microrganismos devem ser submetidos à esterilização (por exemplo, autoclavagem) antes de serem descartados. Por outro lado, é também importante eliminar ou minimizar os riscos de contaminação do ambiente, soluções, bancadas, equipamentos, utensílios (pinças, espátulas, etc.) ou vidrarias por substâncias tóxicas para o organismo humano.
O processamento de substâncias com alto potencial tóxico ou mutagênico, como o Brometo de Etídio (EtBr), tem sido um dos grandes problemas da maioria dos laboratórios. O Brometo de Etídio (EtBr) é comumente utilizado nos laboratórios para corar ácidos nucléicos submetidos à eletroforese em gel de agarose ou a gradiente de Cloreto de césio. A ação do EtBr como corante se deve a sua capacidade de intercalar entre as bases dos ácidos nucléicos e fluorescer sob luz ultravioleta. Este caráter intercalante do EtBr também é responsável pelo seu alto potencial mutagênico, pois pode gerar alterações na estrutura do DNA as quais poderão ser permutadas durante o processo de duplicação. Dessa forma, a leitura errada das sequências de bases do DNA pode resultar em mutação.
Tratamento de soluções concentradas de EtBr (até 10 mg/ml)
Existem várias técnicas para o tratamento de descontaminação do EtBr. A mais simples e fácil de ser aplicada na rotina é baseada no tratamento de soluções de EtBr com Permanganato de Potássio em condições de acidez. Durante esse tratamento haverá oxidação do EtBr pelo Permanganato resultando na formação de um precipitado marrom escuro. Posteriormente, esta mistura é neutralizada com NaOH e descartada (Sambrook et al., 1989). 
O protocolo, como descrito em Sambrook et al. (1989) é o seguinte: adicionar, se necessário, água na solução concentrada até diluir a concentração de EtBr para 0,5mg/ml. Em seguida adicionar KMnO4 0,5M equivalente a 1 volume da solução que será descontaminada. Misturar cuidadosamente e, em seguida, adicionar 1 volume de HCl 2,5M. Misturar com atenção e deixar descansando por várias horas à temperatura ambiente. Para finalizar, neutralizar essa mistura adicionando 1 volume de NaOH 2,5N. Novamente misturar e a solução poderá ser descartada na pia sob água corrente.
Este método de descontaminação de soluções concentradas de EtBr (10mg/ml) é capaz de reduzir a atividade mutagênica em até 3.000 vezes como foi descrito por Quillardet & Hofnung(1988).
Obs.: No caso da água utilizada no descoramento de géis, onde existe uma baixa concentração de EtBr, utilizar Hipoclorito de sódio (água sanitária comercial) na proporção de 1:2, antes de descartar na pia. Os resíduos sólidos (géis e papéis) são secos à temperatura ambiente e posteriormente incinerados em forno de alta temperatura.
SYBR gold
Atualmente, existem outros tipos de alternativas que estão sendo incorporadas ao mercado, como o SYBR gold, que é o nome comercial para um corante ultrassensível com alta afinidade pelo DNA e uma grande ligação fluorescente com o ácido nucléico. Esta ligação fluorescente é >1000 vezes maior do que para o complexo do DNA com o Brometo de Etídio.
Assim, <20pg de DNA de dupla hélice pode ser detectada no gel de agarose e a coloração de géis de poliacrilamida com este corante pode captar 100pg de DNA de fita única ou 300pg de RNA. SYBR gold apresenta máximo de excitação em 495nm e possui um pico secundário em 300nm. A emissão fluorescente ocorre em 537nm (Tuma et al, 1999).Géis corados com SYBR gold não deixam background na hora da revelação e podem ser fotografados diretamente sem descoloração prévia. O SYBR gold não pode ser acrescido ao gel antes da eletroforese, pois sua presença no gel endurecido pode causar distorção das bandas de DNA e RNA(Sambrook et al, 2001).
A sensibilidade do SYBR® Gold é maior do que a do brometo de etídeo, sendo que a ligação fluorescente é >1000 vezes maior do que para o complexo do DNA com o Brometo de Etídio:
Gel de agarose corado com SYBR gold acima e brometo de etídio abaixo
GEL DE POLIACRILAMIDA
Lição 18 de 28
Os géis de poliacrilamida foram muito utilizados para a análise de regiões polimórficas do DNA para o exame do perfil genético em identificação humana. No entanto, atualmente os laboratórios utilizam a eletroforese capilar, como será depois apresentado e estudado. Mas para que haja melhor compreensão da eletroforese capilar existe a necessidade de estudarmos a eletroforese em gel de poliacrilamida, pois foi primordial para a sua realização em equipamentos contendo capilares.
Géis de poliacrilamida são mais eficientes em separações de pequenos fragmentos de DNA (5-500pb). O poder de resolução é extremamente alto e fragmentos de DNA que diferem em tamanho por tão pouco quanto 1pb em comprimento ou 0,1% de sua massa podem ser separados uns dos outros (por exemplo,1pb em 1000pb). Comparado com o gel de agarose, a separação dos fragmentos menores, como de 100 em 100 pares de bases, é maior, melhorando a análise do fragmento, principalmente se possuem variação de poucas bases. Outras vantagens em relação aos géis de agarose é que eles aceitam maiores quantidades de amostra sem que haja perda na resolução e o DNA recuperado dos géis de poliacrilamida são extremamente puros e podem ser utilizados para muitas finalidades. Géis de poliacrilamida possuem a desvantagem de serem mais difíceis de preparar e manusear do que géis de agarose (Sambrook et al, 2001).
Gel de poliacrilamida a 8% corado com prata contendo produto de PCR, cujo tamanho varia de
270 a 280 pares de bases.
Monômeros de acrilamida são polimerizados em longas cadeias de uma reação iniciada por radicais livres (Raymond et al, 1959). Na presença de N-N’-metilenobisacrilamida, essas cadeias formam ligações cruzadas. A porosidade do gel resultante é determinado pelo tamanho das cadeias e graus de ligações cruzadas que ocorrem durante a reação de polimerização. A porcentagem de monômeros de acrilamida utilizados na preparação do gel são determinadas pelo tamanho dos fragmentos de DNA a serem analisados (Chramback e Rodbard, 1971; Luney et al, 1971; Holmes et al, 1991; Sambrooket al, 2001).
Polimerização dos monômeros de acrilamida e N-N’-metilenobisacrilamida, em longas cadeias cruzadas em uma reação iniciada por radicais livres pelo persulfato de amônia, na presença de N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (TEMED).
A porcentagem da concentração total de acrilamida mais a bis-acrilamida é definida por T% e porcentagem de ligações cruzadas devidas a bis-acrilamida, por C% (Stellwagen, 1997). O aumento do valor de T diminui o tamanho dos poros do gel de poliacrilamida. 
A relação do valor de C com o tamanho do poro é mais complexa. Geralmente o valor mínimo do tamanho do poro ocorre quando C é aproximadamente 5%, como se dá em um gel com porcentagens de 19:1 de acrilamida e bis-acrilamida. 
Diminuindo o valor de C há um aumento da estrutura do poro porque ocorre a diminuição de ligações cruzadas:
Utilização do gel de poliacrilamida de acordo com a sua porcentagem de monômeros de acrilamida e da razão acrilamida e bis-acrilamida
Há diferentes tipos de gel de poliacrilamida e cada um com suas indicações. 
Géis de poliacrilamida desnaturantes são utilizados para separação e purificação de fragmentos de DNA de fita única. São polimerizados na presença de um agente (formamida ou uréia) que suprime o pareamento de bases em ácidos nucléicos, saturando as pontes de hidrogênio. DNAs desnaturados migram através desses géis em uma razão que é praticamente independente da composição de bases e sequência. Entre os usos da poliacrilamida desnaturante estão o isolamento e análise de cada fita de DNA, análise de produtos de digestão por nuclease S1 e análise de produtos de reações de sequenciamento de DNA (Sambrook et al, 2001).
Géis de poliacrilamida não desnaturantes são utilizados na separação e purificação de fragmentos de DNA de dupla-fita, não sendo utilizados, atualmente, para a análise do perfil genético. Entretanto, a mobilidade eletroforética também é afetada pela composição de bases e sequência, de modo que os dúplices de DNA de mesmo tamanho podem diferir na mobilidade em mais do que 10%. Os géis de poliacrilamida não desnaturantes são usados frequentemente para preparar fragmentos de DNA altamente purificados e para detecção de complexos de proteína-DNA (Sambrook et al, 2001).
São utilizados os mesmos tampões descritos para o gel de agarose. A porcentagem de monômero de acrilamida a ser escolhida para utilização estará relacionada com a faixa de separação dos ácidos nucléicos a serem analisados.
Faixa efetiva de separação da eletroforese em gel de poliacrilamida e o valor em bp correspondente à migração da coloração xileno cianol e azul de bromofenol (Sambrook et al, 2001).
O EQUIPAMENTO utilizado para a eletroforese em gel de poliacrilamida é composto por duas placas de vidro separadas por espaçadores de até 2 mm, devidamente montadas em um sistema composto de uma caixa para tampão que entrará em contato com a parte inferior, e outra parte com a superior. A única conexão entre o tampão da caixa superior e inferior é o gel. Quanto mais alta a voltagem para a eletroforese, a menor espessura do gel e/ou maior porcentagem de poliacrilamida, há um aumento da resistência do gel, aumento demasiadamente a temperatura. Com isso, recomenda-se a utilização de placas com sistema de resfriamento ou aquecimento em eletroforese desnaturante em poliacrilamida, contendo uma placa de metal para dissipar o calor ou para seu aquecimento (Wartell et al, 1990; Sambrook et al,2001)..
Equipamento para eletroforese em gel vertical 
Existem diferentes tipos de tampões de corrida, como aqueles que contêm Tris-acetato e EDTA (pH 8,0; TAE), Tris-borato (TBE) ou Tris-fosfato (TPE) em concentrações de ~50mM (pH 7.5-7.8). Segundo Sambrook et al (2001), TAE possui a menor capacidade tamponante e TBE e TPE são mais caros do que o TAE, mas possuem maior capacidade tamponante. Para fragmentos de baixo peso molecular, entretanto, a resolução é melhor nos tampões TBE ou TPE
Tampões para eletroforese
Os tampões de corrida ou “loading buffers” possuem 3 finalidades:
1. aumentar a densidade das amostras, assegurando que ela afunde no pocinho;
2. colorir as amostras, facilitando sua visualização;
3. contém corantes que movem para o ânodo em um campo elétrico em taxas previsíveis.
Azul de Bromofenol migra através do gel de agarose ~2.2 vezes mais rápido do que o Xileno Cianol e, corridos em tampão TBE 0,5X, cruza aproximadamente na mesma velocidade de DNA de dupla-fita de 300pb em comprimento, enquanto o xileno cianol percorre aproximadamente na mesma velocidade do DNA de dupla-fita de 4kb em extensão. Esta relação não muda muito para géis de agarose de porcentagem entre 0.5% a 1.4% (Sambrook etal, 2001).
Tipos de tampão de corrida para eletroforese
A eletroforese capilar é amplamente utilizada em análise de DNA forense, por permitir que grandes quantidades de amostras sejam analisadas de maneira automatizada, além de necessitar de poucas quantidades de amostra para o processo de injeção e podem ser facilmente reinjetadas, se necessário. Separação eletroforética em capilar é realizada em menos de 1 hora, se comparado com as muitas horas necessárias para àquela realizada em géis de poliacrilamida para identificação humana. 
Além do tempo, a quantidade de passos para a elaboração do gel de acrilamida fazem com que possa haver uma chance maior de erro durante a manipulação. A desvantagem é o custo inicial para a compra dos equipamentos, sendo bem mais alta do que aqueles empregados na eletroforese em gel de poliacrilamida. No entanto, a eletroforese capilar é a mais empregada nos laboratórios de DNA forense (Butler, 2005) 
Abaixo segue esquema representativo de eletroforese capilar: o capilar é um tubo de fibra de vidro com aproximadamente 50 μm em diâmetro e é completado com uma solução de polímero viscoso específico para tal finalidade, que funciona como o gel das eletroforeses descritas anteriormente. As amostras são colocadas em uma bandeja e injetadas para o capilar aplicando-se uma voltagem de cerca de 15000 volts, que separará o DNA em poucos minutos. Os fragmentos de PCR com fluoróforos são analisados assim que passam pela janela de detecção e são excitados por um laser específico. Os dados são automaticamente computadorizados e permitem um armazenamento e rápida análise.
Manipulação do sequenciador automático, que possui o sistema de eletroforese capilar.
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
Lição 20 de 28
Após a visualização, dá-se a análise dos resultados comparando os fragmentos de DNA amplificados das amostras do pai, mãe e filho em caso de paternidade; ou das amostras encontradas na cena do crime, em corpos ou vítimas com as de suspeitos (INTERPOL, 2001; BUTLER, 2005). No entanto, durante a PCR, um grande número