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- -1 REPRODUÇÃO ASSISTIDA PRODUÇÃO DO EMBRIÃO E SUA IMPLANTAÇÃO Autoria: Dra. Carolina Galvão Sarzedas - Revisão técnica: Dr. Vinicius Canato Santana - -2 Introdução Nessa unidade estudaremos a inseminação artificial e a fertilização , vendo até onde as técnicas sein vitro assemelham, qual é mais acessível e em quais casos de infertilidade cada uma deve ser empregada. Por mais que a tecnologia reprodutiva tenha evoluído nas últimas décadas, é preciso deixar claro que há limites para o desenvolvimento de embriões em laboratório e que não há 100% de garantia de que embriões saudáveis serão suficientes para uma gestação de sucesso. Mostraremos o desenvolvimento embrionário desde a fecundação, seja pela FIV clássica ou pela FIV com ICSI. O amadurecimento do zigoto que passa pela multiplicação celular até formação do blastocisto, quando o embrião está viável para ser transferido para o útero. E, ainda, o preparo do útero para receber o embrião, mas mesmo com toda a tecnologia, a partir da transferência para o útero, a implantação e o sucesso da gravidez não estão mais nas mãos da medicina reprodutiva. Os embriões produzidos não utilizados, os gametas e os tecidos ovarianos podem ser criocongelados. Por motivos de doenças ou por escolha, as clínicas de reprodução vêm oferecendo opções para indivíduos que sonham em ter filhos. Algumas questões precisam nortear nosso estudo, como: vale mais a pena um procedimento de menor custo como a inseminação artificial que pode ser mais demorado ou investe-se mais na FIV para um processo de gravidez mais rápido? A FIV, por usar mais tecnologia e implantar somente embriões saudáveis, possui maior índice de gravidez em relação a inseminação artificial? Os diferentes protocolos de criocongelamento podem interferir na qualidade dos embriões? Bons estudos! Tempo estimado de leitura: 63 minutos. 4.1 Fecundação O processo de fecundação ocorre quando o núcleo de um espermatozoide se funde ao núcleo de um oócito. Ocorre no terço superior da tuba uterina e, em seguida, o óvulo fecundado se encaminha para o útero. Esse óvulo fecundado dá origem ao zigoto que se divide em duas células, depois em quatro, até que no 5º dia do desenvolvimento tem a formação do blastocisto com mais ou menos 128 células. O zigoto vai multiplicando as células enquanto se desloca em direção ao útero e no estágio de blastocisto, em torno do 5º dia, se implanta na parede do útero, em semanas ocorre a formação do embrião. - -3 As técnicas de reprodução assistida possuem diferenças importantes, principalmente no que tange ao processo de fecundação. Enquanto a inseminação artificial consiste na injeção de espermatozoides diretamente no útero, ocorrendo a fecundação dentro do corpo da mulher, a fertilização realiza o processo de fecundação emin vitro laboratório através da manipulação dos gametas masculinos e femininos e no 5º dia de desenvolvimento embrionário faz-se a transferência para o útero (SILVA, 2018). Tanto a fertilização quanto a inseminação artificial são procedimentos semelhantes de manipulação de in vitro gametas, utilizados em casos de infertilidade conjugal ou para promover a gravidez em casais homossexuais ou mulheres solteiras. A técnica a ser utilizada deve ser discutida com um especialista de acordo com as condições de saúde das pessoas envolvidas, como a idade da mulher e a presença de alguma doença que impeça uma gestação natural (FILHO, 2018). 4.1.1 Fertilização in vitro A FIV é um tratamento de alta complexidade, porque consiste na coleta de óvulos e espermatozoides para fertilização em laboratório. A FIV é indicada quando há fator tubário parcial ou total, endometriose moderada ou grave, infertilidade sem causa aparente, fator ovulatório severo, fator masculino moderado ou severo, idade materna avançada, solicitação de diagnóstico ou rastreamento genético pré-implantacional e quando outras técnicas como coito programado e IIU falharam. Podemos dividir a FIV em clássica, onde, em laboratório, os espermatozoides são colocados em contato com o oócito e a fecundação ocorre de maneira natural, e com injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), onde apenas um espermatozoide é introduzido no óvulo com o auxílio de uma agulha especial. A primeira etapa tanto da inseminação artificial quanto da FIV é a estimulação hormonal ovariana (SILVA, 2018). Os folículos estimulados são aspirados de dentro dos ovários, são levados para o laboratório e dependendo da técnica utilizada pode ter dois destinos: FIV clássica ou FIV ICSI. FIV clássica Os gametas são colocados em uma placa com meio de cultura e o processo de fecundação ocorre de maneira natural. FIV ICSI - -4 O óvulo é fertilizado com apenas 1 único espermatozoide com o auxílio de um microscópio acoplado a um micromanipulador. Os embriões gerados são cultivados até que atinjam o estágio de blastocisto, então são transferidos para o útero com o auxílio de um cateter. Figura 1 - A transferência de embriões para dentro do útero através de um cateter Fonte: SILVA, C.H.M. Manual SOGIMIG de reprodução assistida. 1. ed. Rio de Janeiro: Medbook, 2018. p. 141. #PraCegoVer Na figura, a imagem de um útero, na região inferior temos a introdução de uma cânula liberando embriões fecundados por FIV dentro dele. - -5 Quando ouvimos falar em fertilização e inseminação artificial, geralmente tratamos ambos os in vitro procedimentos como sendo a mesma técnica, com a mesma preparação, a mesma complexidade e até os mesmos custos. O que vamos deixar claro, porém, é que a principal diferença entre elas é a maneira como a fecundação acontece. 4.1.2 Inseminação artificial A inseminação artificial é considerada um procedimento de baixa complexidade, porque a fecundação acontece dentro do útero da mulher. Dentre as técnicas de inseminação artificial mais difundidas, podemos citar a inseminação intrauterina (IIU) e o coito ou relação sexual programada (SILVA, 2018). A IIU é indicada para casais que têm problemas de infertilidade, que não conseguem engravidar mesmo após 12 meses de relações sexuais regulares, mas que possuem boa quantidade de espermatozoides e ovários, trompas e útero viáveis. O principal objetivo da técnica é conseguir uma quantidade concentrada de espermatozoides e depositar direto no útero no momento da ovulação. Muitas vezes, a IIU é a primeira tentativa em um tratamento por ser uma técnica de baixa complexidade, eficaz, não invasiva e com menor impacto psicológico. A IIU pode ser realizada utilizando sêmen do próprio parceiro (IIU homóloga) ou com sêmen proveniente de banco de sêmen (IIU heteróloga). A IIU homóloga é indicada para os casos de fator masculino leve, fator cervical, infertilidade sem causa aparente, endometriose mínima/leve e vaginismo. A IIU heteróloga tem indicação nos casos de azoospermia secretora, doenças genéticas ligadas ao parceiro, isoimunização Rh, doenças infecciosas e casais homossexuais femininos. O processo se inicia com a estimulação hormonal ovariana com uso de citrato de clomifeno, gonadotrofinas ou letrozol durante a fase folicular e dura em torno de 5 dias consecutivos. Para ciclos de IIU não é recomendado o uso de antagonistas ou agonistas do hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH), porque sua administração previne o amadurecimento prematuro dos folículos, mas não aumenta as chances de gravidez (SILVA, 2018). Nesse caso, o crescimento folicular é monitorado por ultrassonografias e quando pelo menos 1 folículo alcança um diâmetro mínimo de 17 mm, administra-se gonadotrofina coriônica humana (hCG) exógena. A ovulação vai ocorrer entre 34 e 38 horas. A amostra de sêmen é previamente colhida através de masturbação após 3 dias de abstinência e preparada em laboratório com a remoção do plasma seminal, para diminuir o risco de infecções, melhorar a capacidade de fertilização e a qualidade dos espermatozoides. - -6 A inseminação ocorre em sala comum de exame ginecológico, com a pacienteem posição ginecológica e com a bexiga cheia para alinhar o útero, facilitando a passagem do cateter. O colo do útero é limpo com soro fisiológico aquecido e a amostra (em torno de 1 mL) é depositada no colo do útero, no peritônio ou nas tubas uterinas. Figura 2 - Inseminação artificial ou fertilização in vivo Fonte: SILVA, C.H.M. Manual SOGIMIG de reprodução assistida. 1. ed. Rio de Janeiro: Medbook, 2018. p. 140. #PraCegoVer A figura mostra o desenho frontal de um útero, das trompas e dos ovários. Dentro do ovário há o processo de maturação e liberação do folículo que se direciona para a trompa. Espermatozoides sobem pelo canal uterino e do lado esquerdo da figura os espermatozoides se encontram com o óvulo. Do lado direito estão representadas as fases do desenvolvimento do embrião, desde a fecundação até sua descida até o local de implante o útero. Para aumentar as chances de sucesso, orienta-se o casal a ter relações sexuais entre 1 e 2 dias após o procedimento de IIU. O que as duas técnicas compartilham é a limitação de só interferir até o momento da transferência de espermatozoides ou embriões, o restante do processo de implantação no útero e a manutenção da gravidez, cabe à paciente. O processo de reprodução assistida passa por várias etapas. A primeira consiste em estimular a ovulação para que a mulher produza mais oócitos do que o normal. Após essa etapa, os folículos produzidos são aspirados por uma cânula que penetra pela vagina e vai até os ovários. No laboratório, oócitos e espermatozoides são colocados em uma mesma placa para que ocorra a fecundação. Em torno do 5º dia do desenvolvimento embrionário, os melhores embriões são selecionados para serem transferidos para o útero. TESTE SEUS CONHECIMENTOS (ATIVIDADE NÃO PONTUADA) - -7 O texto apresentado descreve, resumidamente, um tipo de reprodução assistida, cuja indicação correta está na alternativa: a) O texto fala sobre a FIV clássica, uma técnica de alta complexidade indicada para pessoas que já tentaram coito programado e inseminação artificial e que possuam infertilidade média, severa ou sem causa aparente. b) O texto indica o processo de inseminação artificial, um procedimento de alta complexidade, realizado no próprio consultório médico sem necessidade de qualquer tipo de analgesia. c) O texto descreve a FIV com ICSI, pois é uma técnica de alta complexidade, onde a fecundação ocorre externamente ao corpo da mulher. d) O texto se refere ao processo de inseminação artificial que deve ser realizado após o procedimento de TESA. e) O texto descreve a FIV clássica, onde os oócitos são colocados em contato com espermatozoides selecionados e testados para doenças genéticas. Resposta(s) correta(s): a) O texto fala sobre a FIV clássica, uma técnica de alta complexidade indicada para pessoas que já tentaram coito programado e inseminação artificial e que possuam infertilidade média, severa ou sem causa aparente. Com o avanço e aprimoramento das técnicas (tanto de FIV clássica como ICSI) as taxas de sucesso nesses procedimentos vêm crescendo. Embora haja diferenças entre dados publicados por diferentes grupos, taxas bastante elevadas de sucesso são descritas. Em um estudo publicado por Busso e colaboradores (2007), no qual 60 casais se submeteram a técnica de ICSI, foi identificada uma taxa de fertilização de 70% e as taxas de transferência embrionária por punção e por oócito maduro foram de 52 e 67,5%, respectivamente. As técnicas de reprodução assistida trazem para os indivíduos que desejam ter um filho uma grande esperança, porém nem sempre o sucesso é imediato. A FIV é um procedimento que, segundo a Sociedade Brasileira de Reprodução Assistida, resulta em gravidez em 50% dos casos, mostrando que, por mais assertiva que seja, tem limitações. Quando ocorrem falhas, é preciso fazer um rastreamento rigoroso para estabelecer os fatores decisivos para o fracasso do procedimento. A maior causa de insucesso se deve a problemas no processo de implantação do embrião, que se devem a: • qualidade do espermatozoide e do oócito;• - -8 • qualidade do embrião; • endométrio: receptividade e espessura. Problemas na fecundação podem ser resultado da incapacidade do espermatozoide em iniciar a ativação oocitária ou de alterações em sua morfologia. Podemos falar da enzima fosfolipase C-zeta (PLCz) presente no espermatozoide, com a função de induzir as oscilações de cálcio. Em caso de deficiência da PLCz espermática, pode haver falha na ativação oocitária, que é uma rede complexa de oscilações da concentração citoplasmática do cálcio. Alguns defeitos encontrados nos espermatozoides podem ser limitantes para a fecundação natural ou pelo uso de técnicas como inseminação artificial e FIV clássica, como a globozoospermia (ausência de acrossoma). Para esse tipo de caso a FIV ICSI é a única indicação. Ainda existe espermatozoides com vacúolos na região pós-acrossomal, que podem provocar modificações na forma e na textura do núcleo. Por ser a região onde se encontra o núcleo do espermatozoide, pode dificultar a fecundação. Algumas pacientes são más respondedoras, pois mesmo com doses altas de medicamentos recrutam um número pequeno de folículos (3 ou menos). Uma mulher má respondedora possui pelo menos 2 das situações a seguir: • mulher com mais de 40 anos ou com algum fator de risco para baixa resposta (doenças genéticas ou adquiridas, cirurgias, quimioterapia, ciclo menstrual curto, entre outros); • má resposta prévia (menos de 3 oócitos após estimulação convencional); • reserva ovariana alterada. Por isso, um resultado negativo no processo de fecundação pode estar relacionado com a aspiração de poucos oócitos, problemas na maturação citoplasmática e nuclear do oócito e falhas na ativação oocitária. • • Você sabia? O mineral Ca+ é um mensageiro universal que regula diversos fenômenos, entre eles a fecundação. Seu papel na fertilização é o de auxiliar no processo de capacitação dos espermatozoides, como hiperativação da motilidade, reação acrossômica, fusão do espermatozoide com o oócito, além da ativação do oócito. • • • - -9 A síndrome do folículo vazio também é um dos responsáveis pelo resultado negativo em processos de fertilização. É um evento raro que ocorre em 1 entre 6 pacientes a cada 1.000 ciclos de FIV, onde após a aspiração folicular não é possível recuperar nenhum oócito. A qualidade do embrião é determinada pela sua capacidade de se implantar no útero e depende de inúmeras variáveis, algumas podem ser controladas, como a qualidade dos gametas, outras são indefinidas. Como garantir que uma análise embrionária realizada antes da transferência vai ter sucesso na implantação e na continuidade da gestação? Para isso, o principal método de seleção é a avaliação morfológica ao longo do desenvolvimento do embrião. Para haver um consenso entre os especialistas, alguns parâmetros foram definidos para auxiliar no processo de análise, como os horários das avaliações que são padronizados e anotados, pois fora do horário pode haver divergência entre o número de células previsto. Maior ou menor taxa de divisão celular representa menor potencial de implantação. Nos dias 2 e 3 a morfologia do embrião tem parâmetros analisados, como: número e tamanho das células, fragmentação, multinucleação, granulidade citoplasmática e presença de vacúolos. Falhas recorrentes na implantação podem ser devido à problemas como o endométrio fino, que mede menos de 7 mm no da ovulação (fim da fase folicular). A pequena espessura do endométrio é um ambientetrigger prejudicial à implantação do embrião e à continuidade da gestação. Um casal heterossexual procura um especialista, pois está em busca do sonho de ter um filho. Esse casal tem relações sexuais regulares, porém nunca perceberam se as relações ocorriam no período fértil da mulher. Para começar uma investigação de possível infertilidade, o médico especialista em reprodução precisa fazer umavarredura no histórico de saúde e nos hábitos de vida de ambos os indivíduos. Com base nos seus conhecimentos, quais são as condições ideais para esse casal engravidar? Em caso de precisar recorrer à reprodução assistida, em ordem de complexidade, qual seria a recomendação? Você quer ler? O seguinte artigo mostra a análise de 193 mulheres, que realizaram técnicas de reprodução assistida entre 2010 e 2012 em determinada clínica da cidade de Uberlância. O trabalho mostra uma importante correlação entre o uso de folículos antrais, folículos aspirados e sucesso na fertilização . in vitro Acesse https://www.scielo.br/j/rbgo/a/Cwcvb4y4sT4dvLNBCT8mxvQ/?lang=pt&format=pdf - -10 Feedback As primeiras avaliações que o especialista precisa dizem respeito ao processo de ovulação (contagem de folículos, reserva ovariana, idade da mulher), o desimpedimento do caminho das trompas até o útero (exames de imagem) e a presença de espermatozoides viáveis (espermograma). Dependendo dos exames, o médico pode indicar em ordem de complexidade: coito programado, inseminação artificial, FIV clássica e, em último caso, FIV com ICSI. 4.2 Desenvolvimento embrionário e transferência de embriões A fertilização se inicia fora do corpo dos pacientes, isto é, homens e mulheres precisam se submeter ain vitro procedimentos preparatórios para obtenção de gametas. Em laboratório, esses gametas são analisados, o óvulo é fecundado por espermatozoides, para, somente depois, haver a transferência desse embrião para o útero da mulher (SILVA, 2018). Na mulher, o processo se inicia com a indução da ovulação feita por hormônios, que vão estimular o amadurecimento de vários folículos de uma só vez. Após esse processo, puncionam-se esses folículos para separação e análise dos mais viáveis. No homem, é preciso que haja coleta de espermatozoides através de masturbação ou por punção nos testículos. 4.2.1 Etapas do desenvolvimento embrionário in vitro O desenvolvimento embrionário se inicia com a penetração do espermatozoide dentro do oócito formando um zigoto, uma célula especializada, que vai se diferenciar em todos os tipos de tecidos e órgãos. O zigoto é diploide, geneticamente único e formado por cromossomos maternos (23) e paternos (23), o que gera grande variabilidade genética na espécie humana. Em torno de 30 horas após a fecundação, o zigoto começa a sofrer muitas e repetidas divisões mitóticas (clivagens), gerando um rápido aumento do número de células denominadas de blastômeros. O zigoto, nesse momento, ainda está envolto pela zona pelúcida e a clivagem produz blastômeros cada vez menores, devido ao espaço restrito. Figura 3 - Clivagem do zigoto mostrando estágios com 2 blastômeros (esquerda) e 4 blastômeros (direita) Fonte: MOORE, Keith L.; PERSAUD, T. V. N. Embriologia básica. 9. ed. Rio de Janeiro: Elsevier 2016. p. 44. - -11 #PraCegoVer A figura mostra duas células redondas do mesmo diâmetro. Ambas estão envolvidas por uma membrana lipoprotéica denominada zona pelúcida. À esquerda, a ilustração mostra a zona pelúcida envolvendo 4 estruturas arredondadas, 2 grandes que são os blastômeros e 2 bem menores, que são os corpúsculos polares. A ilustração da direita mostra a zona pelúcida envolvendo 4 estruturas do mesmo tamanho mais agrupadas, representando 4 blastômeros. Até atingirem o número de 8 blastômeros, as células formam um grupo sem associação entre si. A partir da terceira clivagem ocorre a compactação, que promove o agrupamento dos blastômeros que se juntam formando uma bola compacta de células unidas por junções de oclusão, que se comunicam por junções comunicantes. Ocorre uma segregação das células internas com as células externas. Depois de aproximadamente 3 dias da fertilização, as células compactadas se dividem e formam uma mórula com 16 blastômeros. A massa celular interna da mórula (embrioblasto) dará origem aos tecidos do embrião, enquanto a massa celular externa (trofoblasto), mais tarde fará parte da placenta. Figura 4 - Clivagem do zigoto mostrando estágios com 8 blastômeros (esquerda) e 16 blastômeros, formando a mórula (direita) Fonte: MOORE, Keith L.; PERSAUD, T. V. N. Embriologia básica. 9. ed. Rio de Janeiro: Elsevier 2016. p. 44. #PraCegoVer A figura mostra duas células redondas do mesmo diâmetro. Ambas estão envolvidas por uma membrana lipoprotéica denominada zona pelúcida. À esquerda, a ilustração está de frente e mostra a zona pelúcida envolvendo 8 estruturas arredondadas agrupadas (blastômeros). A ilustração da direita tem corte lateral, mostra a zona pelúcida envolvendo 16 estruturas do mesmo tamanho mais agrupadas, representando 16 blastômeros. Essa estrutura recebe o nome de mórula. Em torno do 4º dia após a fecundação, o embrião passa a ser chamado de blastocisto e a zona pelúcida desaparece. Agora, o embrioblasto se projeta para dentro da cavidade do blastocisto, enquanto o trofoblasto forma a parede do blastocisto. A degeneração da zona pelúcida permite que o blastocisto possa aumentar de tamanho rapidamente. - -12 Figura 5 - Esquema da clivagem do zigoto mostrando a formação do blastocisto Fonte: MOORE, Keith L.; PERSAUD, T. V. N. Embriologia básica. 9. ed. Rio de Janeiro: Elsevier 2016. p. 44. #PraCegoVer A figura mostra duas células redondas (embriões). Na ilustração da esquerda a célula está envolvida em uma zona pelúcida fragmentada, cheia de pedaços. Dentro, a ilustração mostra uma camada de células (trofoblasto) ao redor de uma cavidade chamada de blastocística e um grupo de células bem compactadas em uma extremidade, o embrioblasto. Na ilustração da direita, a célula já é maior e a cavidade blastocística e ocupa todo o espaço interno. A cavidade possui o trofoblasto ao redor e o embrioblasto em uma das extremidades. Em uma fecundação natural, no 6º dia o blastocisto adere ao epitélio do endométrio, o trofoblasto se prolifera rapidamente e se diferencia em citotrofoblasto (camada interna) e sinciciotrofoblasto (camada externa). No caso de embriões gerados por FIV clássica ou ICSI, o embrião fresco ou criopreservado é transferido para o útero entre o 5º e 6º dia, na etapa do blastocisto. 4.2.2 A transferência de embriões A transferência de embriões é a etapa onde se insere os embriões desenvolvidos no laboratório dentro do útero da mulher. Os embriões podem ser provenientes de uma produção fresca (entre o 5º ou 6º dia após a fecundação no laboratório) ou criocongelados. Em casos de criocongelamento, os embriões passam por um processo de descongelamento antes de serem implantados. O embrião antes de ser implantado passa pelas seguintes avaliações: Fragmentação Os fragmentos não são um tipo de anormalidade, mas representam uma imperfeição na divisão do citoplasma. Em uma mesma paciente pode haver diversos graus diferentes de fragmentação do embrião. Você quer ver? No vídeo disponibilizado pelo Dr. Júlio Voget, podemos ver o desenvolvimento do embrião em laboratório com uso de uma incubadora com uma câmera acoplada. Esse equipamento conhecido como Time-lapse (lapso de tempo) faz uma sequência de fotos e depois as converte em um vídeo. Como resultado, gera o acompanhamento em tempo real do desenvolvimento de embriões. Acesse https://www.youtube.com/watch?v=BjLDQJydFjw - -13 O problema da fragmentação está na possibilidade de danos aos blastômeros adjacentes, ao risco de anormalidades cromossômicas, da deficiência na produção de ATP, instabilidades da rede de microfilamentos corticais e nos processos de apoptose. Por isso, uma boa competência embrionária está relacionada com um baixo grau de fragmentação (<10%), enquanto um alto grau de fragmentação (>25%) pode causar baixo potencial de implantação. Multinucleação É melhor avaliada no 2º dia do desenvolvimento embrionário e está associada ao aumento de cromossomos anormais devido à presença de um ou mais núcleos em um mesmo blastômero, além da diminuição da taxa de implantação e um maior risco de abortamento. SimetriaOs blastômeros dos embriões com 2, 4 e 8 células devem ter o mesmo tamanho, a falta de simetria é esperada apenas enquanto o processo de clivagem não estiver completo. A análise do blastocisto é abrangente e inclui a avaliação da taxa de desenvolvimento e grau de expansão, avaliação da massa celular interna e Trofectoderme. Avaliação da taxa de desenvolvimento e grau de expansão: • blastocisto inicial: < 50% de cavitação; • blastocisto: 50% de cavitação; • expandido: cavitação completa; • expandido: cavidade maior do que o embrião original; • em eclosão: ;Hatching • eclodido: .Hatched Avaliação da massa celular interna: • boa: massas celulares facilmente identificadas, células bem identificadas, aderidas e compactadas; • regular: massas em fase de fácil identificação, com células fracamente aderidas; • ruim: massa celular mal delimitada, com poucas células e sem aderência. Trofectoderme (é uma camada celular que delimita externamente o blastocisto, responsável pela formação dos tecidos de comunicação entre mãe e filho): • • • • • • • • • - -14 • boa: presença de células coesas; • regular: presença de células pouco coesas; • ruim: presença de poucas células, sem coesão. Para ser considerado de ótima qualidade, o embrião precisa atingir a etapa de blastocisto em 5 dias após a captação, precisa estar em com massa celular facilmente identificável, com células compactadas e hatching, aderidas e trofectoderme formando epitélio coeso. Embora muitos pensem que apenas o desenvolvimento de embriões saudáveis seja suficiente para o sucesso de uma gravidez, é preciso entender que o procedimento de transferência de embriões é crucial para o início da implantação desses embriões no útero materno. Inúmeras intercorrências podem ser vistas no processo, incluindo contaminação do cateter, embriões que ficam retidos ou são expulsos do cateter, uso de meio de cultura contaminado, falta de experiência do profissional que está fazendo o procedimento ou, ainda, problemas específicos da paciente que não foram detectados anteriormente. Para uma transferência de sucesso seguida por uma implantação no útero, é preciso primeiro que este endométrio seja previamente preparado. A transferência de embriões pode ser feita com embriões frescos, ou seja, assim que formam os blastocistos, implantados em torno do 5º/6º dia ou podem ser provenientes de criopreservação. Antes da disseminação da criopreservação, os embriões frescos transferidos tinham uma grande chance de não serem implantados, pois o útero da mulher que passou por um processo de hiperovulação pode não ser tão bom para implantação quanto um útero natural. A transferência de embriões frescos, atualmente, só é indicada para mulheres com baixo risco de síndrome de hiperestimulação ovariana (SHO) ou com resposta ovariana limitada. Por isso, uma análise prévia das condições do útero, como a espessura adequada do endométrio para a implantação (mínimo de 7 mm), é capaz de fornecer uma janela de implantação, onde o endométrio se encontra com a espessura ideal para receber o blastocisto. No caso do útero precisar de uma preparação prévia, os embriões podem ser criopreservados por tempo indeterminado sem risco de prejudicar o embrião. O preparo do útero para o recebimento do embrião inclui a administração de estrogênio por 2 semanas, mais ou menos, para aumentar a espessura do útero e, em seguida, de progesterona em concentração proporcional ao número de dias de desenvolvimento do embrião. Por exemplo: a mulher que receberá um embrião com 5 dias de desenvolvimento, fará uso de progesterona por 5 dias. • • • - -15 O cálculo da dose dos hormônios e do momento ideal da transferência do embrião podem ser fatores decisivos no processo de implantação no útero. 4.3 Criobiologia Vamos começar definindo que a criobiologia é uma parte da biologia que estuda os efeitos das baixas temperaturas em diferentes tecidos, órgãos e células. E dentro dessa especialidade ainda temos subdivisões, como os diferentes comportamentos entre animais, plantas e microorganismos submetidos a baixas temperaturas, a criopreservação de gametas, embriões, células e tecidos, liofilização de compostos químicos e biológicos, preservação de órgãos em baixa temperatura para transplante, entre outras aplicações. A técnica de vitrificação usa nitrogênio líquido para conservar células em temperaturas em torno de 196º C negativos. No caso da reprodução assistida, a evolução da técnica de vitrificação vem sendo utilizada para congelar gametas masculinos e femininos e embriões. O congelamento, nesses casos, vem da necessidade em manter a capacidade de reprodução de homens e mulheres que, por opção ou por alguma situação adversa, queira postergar uma gravidez. 4.3.1 Criopreservação de gametas A maior parte das clínicas de reprodução assistida, atualmente, congelam gametas através do método mais moderno de congelamento rápido, a vitrificação. De maneira resumida, a técnica consiste em desidratar parcialmente a célula, carrega-la com crioprotetores e ser resfriada para obtenção de um estado vítreo dentro da célula ou pode ser resfriada de maneira ultra rápida, obtendo-se um estado vítreo dentro da célula sem necessidade de desidratação ou uso de crioprotetores. Criopreservação é a única maneira de manter gametas ou qualquer outro material biológico perecível preservado, armazenado e viável para o uso. A criopreservação pode ser realizada de duas maneiras: Congelamento lento: É uma técnica clássica, menos usada atualmente. Consiste em adicionar concentrações moderadas de crioprotetores, que vão evitar a formação de cristais no interior das células e conservar sua estrutura e depois o resfriamento ocorre gradualmente. Vitrificação: É uma técnica mais moderna, utilizada na maior parte dos laboratórios de reprodução assistida e bancos de gametas. Faz uso de uma maior concentração de crioprotetores, de modo que a água seja retirada em poucos minutos. A temperatura é diminuída rapidamente atingindo -196 ºC. - -16 Figura 6 - Organização molecular em estado líquido, em congelamento lento e vitrificação Fonte: CARVALHO, A. A. et al. Vitrificação: uma alternativa para a preservação de embriões e material genético de fêmeas mamíferas em criobancos. Acta Veterinaria Brasilica. v. 5, n. 3, p.236-248, 2011. p. 237. #PraCegoVer A figura mostra 3 placas quadradas. A 1ª placa tem 8 bolinhas desordenadas representando as moléculas de água, a 2ª placa à direita possui 6 moléculas ordenadas unidas por linhas retas e a 3ª placa tem 4 moléculas desordenas unidas por linhas retas. As células são compostas por grandes quantidades de água, por isso quando resfriamos a célula a temperaturas muito baixas e de maneira lenta essa água forma cristais de gelo, que pode provocar prejuízos para a células. Para evitar esse tipo de dano, passou a ser indicada a desidratação quase total da célula e o uso da vitrificação. O uso de agentes crioprotetores é importante para proteger os gametas e atenuar as lesões nas estruturas celulares causadas pelos processos de congelamento e descongelamento. Dentre as substâncias crioprotetoras podemos separá-las em não permeáveis (proteínas de alto peso molecular) e permeáveis (metanol, dimetilsulfóxido-DMSO e glicerol). Crioprotetores não permeáveis são mais eficientes nos processos de congelamento rápido, pois, como o próprio nome diz, eles cobrem a célula, induzindo a formação de cristais de gelo em volta da membrana plasmática. Em contrapartida, os crioprotetores permeáveis são mais efetivos nos procedimentos de congelamento mais lentos, pois entram uniformemente dentro das células, provocando desidratação por substituição. A substância crioprotetora substitui a água intracelular, impedindo que a concentração de solutos aumente e que ocorra a formação cristais de gelo. A criopreservação de espermatozoides é indicada para homens que querem adiar a paternidade, que vão se submeter a tratamentos como radioterapiaou quimioterapia ou que possuem problemas ejaculatórios. É uma técnica muito usada em bancos de sêmen no programa de doação de espermatozoides. A amostra de sêmen é colhida através de masturbação e antes do congelamento são feitos testes para Hepatite B, HIV, Sífilis e vírus T-linfotrópico humano (HTLV I e II). Logo após, aguarda-se em torno de 1 hora para que o sêmen se liquefaça e seja realizado um espermograma para controle. - -17 Como já mencionado, o criocongelamento pode ser realizado de maneira lenta (programado) ou rápida (vitrificação) e cada laboratório pode ter o seu método. As amostras podem ficar congeladas por um tempo indeterminado. A criopreservação de gametas femininos é um pouco mais complexa, pois os oócitos são células grandes, com muito citoplasma que se encontram no processo de meiose. A formação de cristais de gelo pode interferir na meiose do oócito, em contrapartida, o espermatozoide, por ser uma célula pequena e com pouco citoplasma, não tem suas funções comprometidas pela criopreservação. O processo de criopreservação, armazenamento e descongelamento de oócitos têm uma taxa de sucesso variável. Por conta da quantidade de água no citoplasma e pelo tamanho da célula, a técnica mais indicada para a criopreservação de oócitos é a vitrificação. Quando a mulher toma a decisão de criopreservar seus oócitos, precisa passar pela estimulação hormonal ovariana e punção dos folículos, comum no processo da fertilização . in vitro O protocolo para a criopreservação envolve a preparação de várias soluções de crioprotetores em concentrações crescentes, que serão adicionadas aos oócitos para solubilização e lavagem. Todo o processo de congelamento dura 2 horas. 4.3.2 Criopreservação de tecido gonadal Tecidos gonadais são aqueles derivados dos testículos e ovários. Alguns homens e mulheres se submetem a processos que acarretam a perda da função gonadal, como o uso de drogas gonadotóxicas ou possuem doenças, como anemia aplásica, talassemia major, doenças autoimunes, entre outras. Em casos onde são Você sabia? De maneira resumida podemos descrever o melhor protocolo de vitrificação da seguinte maneira: equilibra-se previamente os embriões ou gametas entre 10 e 15 minutos e DMSO 7,5% e etilenoglicol 7,5%. Incuba-se o material por 60 segundos em DMSO 15% e etilenoglicol 15%. Imediatamente, carrega-se o material nas palhetas e todo o conjunto é submerso em nitrogênio líquido. - -18 necessários transplantes de medula óssea ou rádio e quimioterapia, pode ser da vontade do indivíduo que sua capacidade de fertilidade seja preservada. Em, mulheres dependendo da idade, congela-se oócitos ou tecido ovariano. A infertilidade como consequência de alguma doença ou algum tratamento, como quimio ou radioterapia, deixou de ser um fator limitante para a geração de um futuro bebê. Estudos acerca da preservação de tecidos gonadais, como parênquima testicular e tecido ovariano, atualmente têm avançado cada vez mais. Muitas técnicas vêm sendo utilizadas na medicina veterinária com o objetivo de manter a capacidade reprodutora de alguns animais. Contudo protocolos para criopreservação nesses casos ainda vem sendo aprimorados, pois não basta congelar, o material tem que resistir ao descongelamento e ainda ser viável. Os ovários e os tecidos ovarianos são muito sensíveis a agentes citotóxicos e o criocongelamento vem sendo uma alternativa promissora para a manutenção da fertilidade de pacientes com câncer, principalmente em mulheres jovens ou pré-púberes que ainda não tem oócitos formados ou que não aguentariam, por conta da doença, uma estimulação ovariana para a punção de folículos para congelamento. O tecido ovariano é retirado da paciente antes que ela inicie o tratamento de radio ou quimioterapia, através de videolaparoscopia, com um pós-operatório rápido e que possibilita prontamente o começo do tratamento quimio ou radioterápico. Esse tecido, principalmente fragmentos do córtex ovariano, é criopreservado, e reimplantado após o término do tratamento. O tempo no qual o tecido é mantido criopreservado parece não interferir no método e nem na eficácia do material. Entre os dois métodos mais usados de criocongelamento (vitrificação e congelamento lento), o congelamento lento vem sendo apontado como o mais efetivo para tecidos ovarianos, por conta da diminuição gradual da temperatura, aliado ao uso de menores concentrações de agentes crioprotetores. Especula-se que a vitrificação até seja uma técnica promissora, porém, o uso de grandes quantidades de crioprotetores ainda é um fator limitante por ser nociva aos fragmentos de tecidos ovarianos. O tecido ovariano criopreservado pode ser descongelado e reimplantado na mulher após a finalização do tratamento quimioterápico e a cura da doença. O reimplante pode ser realizado em sítio ortotópico, ou seja, na mesma região do ovário (superfície ovariana ou cavidade pélvica), ou heterotrópico, em local diferente, como antebraço ou parede abdominal. O reimplante ortotópico é realizado por videolaparoscopia e possui algumas questões técnicas, como a grande perda de folículos causada pela isquemia que ocorre até que o ovário esteja totalmente implantado, pois existe a necessidade de reconstrução da vascularização do tecido ovariano. Mesmo com todas as dificuldades, já há relatos de bebês nascidos vivos a partir de tecidos ovarianos reimplantados de maneira ortotópica. No caso de reimplante heterotópico, a futura gestação não será espontânea, sendo necessária que a maturação de folículos seja estimulada por hormônios, seguida de punção folicular e fertilização .in vitro - -19 O reimplante pode ser classificado como: Xenotransplante: é o método de implante de tecidos entre espécies diferentes, sendo um importante modelo que elimina o risco de transferência de células malignas residuais contidas no tecido reimplantado. Autotransplante: é realizado no próprio indivíduo, recomendado para mulheres com idade entre 35 e 38 anos e tem grande potencial em restaurar a função ovariana perdida durante o tratamento do câncer. O reimplante, porém, só pode ser feito após a constatação de que o tecido criopreservados não possui células cancerosas. A técnica de criopreservação de tecidos gonadais ainda está em pleno desenvolvimento e mostra, em outras espécies, resultados promissores que ainda não foram comprovados em humanos. 4.3.3 Criopreservação de embriões Uma questão ética de grande discussão sempre foi qual destino dar para os embriões desenvolvidos, mas que não foram transferidos para o útero. A criopreservação de embriões vem, então, sendo desenvolvida a partir da necessidade de se guardar esses embriões produzidos na FIV e não usados prontamente. O processo para a fertilização geralmente é física e psicologicamente desgastante para as pessoasin vitro ansiosas por uma gestação de sucesso. Por isso, durante o processo de punção ovariana, aspira-se a maior quantidade possível de oócitos, que fecundados em laboratório podem gerar diversos embriões. Contudo a Resolução no 2.294/2021 do Conselho Federal de Medicina limita para 8 o número total de embriões produzidos, assim como a transferência de embriões fica restrita a 2 em mulheres com até 37 anos e 3 para mulheres acima de 37 anos. Sendo assim, os embriões excedentes ficavam sem destino certo. Estudo de Caso O casal americano Tina e Ben Gibson vinham tentando uma gestação de modo natural por mais de 5 anos. Após todo esse tempo de tentativas fracassadas tentaram um novo caminho. Eles tentaram todos os tratamentos disponíveis usando os próprios gametas, como já estavam desanimados pelo fracasso de diversos tratamentos, fizeram contato com a National Embryo Donation Center (NEDC), uma organização sem fins lucrativos - -20 O desenvolvimento da criopreservação de embriões passou a ser uma alternativa adicional à gestação, permitindo que eles sejam usados em ciclos posteriores da mesma mulher ou doados para aquelas impossibilitadasde gerar oócitos saudáveis. E, ainda, a FIV é uma técnica de custo alto, por isso a criopreservação passa a ser uma boa opção para reduzir os custos de uma nova tentativa de gestação. A melhor etapa para o congelamento do embrião ainda é controversa, mas a se guir descreveremos as mais comuns, com os prós e contras da utilização de cada uma: Zigoto: a sobrevivência do embrião após o descongelamento é entre 70 e 100%, com 30% de chances de gravidez. • A vantagem é que se pode maximizar o número de zigotos congelados, porque não há uma seleção embrionária no momento do congelamento; • A desvantagem é não dá para saber se os embriões de melhor qualidade serão gerados; • Possibilita o congelamento de zigotos em pacientes com Síndrome de Hiperestimulação Ovariana (SHO). Células (2º ou 3º dia): a taxa de sobrevivência do embrião ao processo de criocongelamento seguido de descongelamento é em torno de 80%, com 35% de chance de gestação após o implante. • A grande vantagem é permitir a seleção dos embriões com base no seu desenvolvimento e na morfologia; • O criocongelamento de embriões já clivados aumenta a taxa de sobrevida após o descongelamento; • É mais vantajoso o congelamento no 3º dia (D3) para evitar que o embrião seja mantido na etapa de 4 células. que armazena embriões congelados de pacientes de fertilização que decidiram in vitro não usar e optaram por doar. O casal, então, adotou um embrião congelado em outubro de 1992 e deu à luz a uma menina saudável em fevereiro de 2020, chamada Molly. O recorde anterior também era da família Gibson, a primogênita do casal, Emma, nascida em 2017, também foi proveniente de um embrião congelado em 1992. Acesse • • • • • • https://www.bbc.com/portuguese/geral-55178686 - -21 Blastocisto (5º ao 7º dia): o congelamento nessa etapa só ocorre quando o cultivo no laboratório se prolonga até o 5º ou 7º dia. • Geralmente, os embriões são implantados antes disso, assim, acabam restando poucos embriões para serem congelados; • O estágio de blastocisto é onde o embrião tem a maior capacidade de implantação, sendo necessário o uso de menor quantidade de embriões; • O congelamento nessa etapa permite a identificação daqueles embriões com pouco ou nenhum potencial de desenvolvimento, diminuindo o número de embriões a serem congelados. A técnica de congelamento lento é considerada clássica na criopreservação de embriões em todo o mundo, pois utiliza baixas concentrações de crioprotetores, causando menos danos aos embriões. Entretanto, a vitrificação é um método rápido, porém com uso limitado, porque faz uso de altas concentrações de crioprotetores, o que pode prejudicar a viabilidade dos embriões. Congelamento lento: a técnica mais difundida emprega o propanodiol (PROH), especialmente usado nos estágios embrionários iniciais. Vem mostrando embriões com 78% de sobrevida após o descongelamento. Após a passagem sequencial por soluções em diferentes concentrações, os embriões são colocados em palhetas plásticas com altas concentrações do crioproteror. É feita a programação de um protocolo em rampa, onde a amostra vai sendo submetida a variações de temperatura que vão desde a temperatura ambiente até -196 ºC, respeitando as pausas para a indução da formação dos cristais de gelo. Vitrificação: a vantagem é a rapidez da passagem do estado fluido para o sólido, a desvantagem é que para evitar a formação de cristais de gelo, usa altas concentrações de crioprotetores, o que prejudica a viabilidade dos embriões após o descongelamento. Assim como no congelamento rápido, os embriões também passam por uma sequência de soluções com diferentes concentrações de solução crioprotetora. O descongelamento dos embriões é uma etapa tão crucial quandoTécnica de descongelamento de embriões: o congelamento, pois é o que garante a viabilidade dos embriões para uso. • • • Você o conhece? Zoe Leyland é uma mulher australiana que nasceu em 1984, proveniente de um embrião criopreservado. Sua mãe havia constatado problemas de fertilidade e optou por produzir embriões através da reprodução assistida. Ao todo 11 oócitos foram aspirados e 3 embriões foram implantados em uma primeira tentativa, sem sucesso, os demais foram - -22 Os embriões criopreservados podem ser descongelados no dia anterior ou no mesmo dia da transferência para o útero. Em caso de descongelamento no dia anterior, somente os embriões clivados serão transferidos. A viabilidade do embrião é atestada se pelo menos 50% dos blastômeros permanecerem intactos após o descongelamento. Vários protocolos estão disponíveis para criocongelamento e descongelamento, contudo, atualmente, o melhor protocolo de descongelamento quanto à viabilidade dos embriões é aquele que usa dimetilsulfóxido (DMSO) e etilenoglicol como crioprotetores, embora o DMSO seja considerado o crioprotetor mais tóxico. O processo de descongelamento consiste na retirada gradativa dos crioconservantes. Em seguida, são colocados em meio de cultura para avaliar sua capacidade de divisão celular. Aqueles que sofrerem divisão celular em 24 horas serão transferidos. Segundo a resolução no 2.294 de 27 de maio de 2021 do Conselho Federal de Medicina, gametas, embriões e tecidos gonadais podem ser criopreservados pelas clínicas e centros de reprodução assistida. O uso da criopreservação vem sendo disseminado em todo o mundo, uma vez que mantém, por tempo indeterminado, material biológico em estado viável de uso. O processo de criopreservação consiste em preservar o material biológico em nitrogênio líquido a -196 ºC, com uso de crioprotetores que tem função de diminuir o dano ao material no momento do descongelamento. Analise as afirmativas a seguir e assinale V para a(s) verdadeira(s) e F para a(s) falsa(s): I. ( ) A criopreservação é uma técnica indicada para pacientes com câncer que vão se submeter à quimio e radioterapia. II. ( ) A criopreservação é uma técnica já bem estabelecida, com protocolos fixos que recupera 100% das funções biológicas do material congelado. III. ( ) O uso de crioprotetores é optativo e depende do tipo de criopreservação utilizado. criopreservados. No período fértil seguinte, 2 embriões considerados viáveis foram transferidos, sendo que apenas 1 foi implantado no útero. Após 34 semanas, Zoe nasceu saudável. TESTE SEUS CONHECIMENTOS (ATIVIDADE NÃO PONTUADA) - -23 IV. ( ) A criopreservação de embriões é indicada quando são produzidos mais embriões do que pode ser implantado. V. ( ) A criopreservação mantém o material dentro de tanques de nitrogênio líquido mantidos a uma temperatura de -196 ºC. Assinale a alternativa que apresente a sequência correta: a) V, F, V, F, V. b) V, F, V, V, F. c) F, V, V, V, F. d) F, V, F, V, V. e) V, F, F, V, V. Resposta(s) correta(s): e) V, F, F, V, V. - -24 Conclusão A unidade sobre produção de embriões, seus métodos de implantação e de conservação nos deu a oportunidade de entender o desenvolvimento de técnicas de manipulação de gametas e embriões. Vimos as diferenças entre inseminação artificial e fertilização , assim como descrevemos todas as etapas quein vitro englobam o desenvolvimento embrionário até o momento da transferência do embrião para o útero materno. Pudemos entender que a criobiologia é uma ciência em grande velocidade de desenvolvimento, com técnicas e metodologias sendo determinadas para a conservação e o armazenamento de gametas e embriões. Nesta unidade, você teve a oportunidade de: • aprender as diferenças e semelhanças entre as técnicas de inseminação artificial e fertilização ;in vitro • analisar as etapas do desenvolvimento embrionário, separando as que podem ocorrer , daquelas in vitro que dependem da implantação no útero; • comparar as melhores técnicas de criopreservação, de acordo com o material biológico a ser conservado; • entender que a tecnologia reprodutiva tem limitações e que os estudos ainda estão em andamento e aperfeiçoamento. • • • •- -25 Referências BUSSO, N. E. Prado, R. A. A. Fertilização in vitro com injeção et al. intracitoplasmática de espermatozoide em ciclos naturais. , v. 29, n. 7, p. 342-7, jun. 2007.Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetrícia Disponível em: https://www.scielo.br/j/rbgo/a/VWjpFMFM5VJ3HB4H9fXNnmn/?lang=pt&format=pdf. Acesso em: 23 set. 2021. CARVALHO, A. A. Vitrificação: uma alternativa para a preservação de embriões e material genético deet al. fêmeas mamíferas em criobancos. . v. 5, n. 3, p.236-248, 2011. Disponível em: Acta Veterinaria Brasilica https://periodicos.ufersa.edu.br/index.php/acta/article/view/2321/5009Acesso em 16 out. 2021. CONSELHO FEDERAL DE MEDICINA. Resolução no 2.294, de 27 de maio de 2021. Adota as normas éticas para a utilização das técnicas de reprodução assistida - sempre em defesa do aperfeiçoamento das práticas e da observância aos princípios éticos e bioéticos que ajudam a trazer maior segurança e eficácia a tratamentos e procedimentos médicos, tornando-se o dispositivo deontológico a ser seguido pelos médicos brasileiros e revogando a Resolução CFM nº 2.168, publicada no DOU de 10 de novembro de 2017. Disponível em: https://www.in.gov.br/en/web/dou/-/resolucao-cfm-n-2.294-de-27-de-maio-de-2021- 325671317. Acesso em 16 out. 2021. CURI, R. Rio de Janeiro: Guanabara Koogam, 2009.Fisiologia Básica. FILHO, O.B.D. – Mulher. 1. ed. Rio deCondutas Práticas em Infertilidade e Reprodução Assistida Janeiro: Elsevier, 2018. GUYTON, A.C. & HALL, J.H. 12. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2011.Tratado de fisiologia médica. AHUMADA, A. Laboratório de Reprodução Assistida. Irapuato: Red et al. Manual de procedimentos: Latinoamericana de Reprodicción Asistida, 2006. 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