Sequenciamento, clonagem e técnicas de hibridização

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Sequenciamento,
clonagem e técnicas
de hibridização
Prof.ª Camila Freze Baez
Descrição
Introdução aos métodos de sequenciamento de material genético, tecnologia do DNA recombinante e técnicas de hibridização
de ácidos nucleicos.
Propósito
Compreender as metodologias de estudo e análise da sequência de DNA, uma ação importante para entender a sua
manipulação para fins de biotecnologia, bioinformática, diagnóstico e outras aplicações, como pesquisa.
Objetivos
Módulo 1
Principais métodos de sequenciamento do DNA
Distinguir as características dos principais métodos de sequenciamento do DNA.
Módulo 2
Principais técnicas de clonagem molecular
Reconhecer as principais técnicas de clonagem molecular, suas formas de uso e suas vantagens e desvantagens.
Módulo 3
Métodos de hibridização de ácidos nucleicos e aplicações
Identificar os métodos de hibridização de ácidos nucleicos, suas diferenças e aplicações na rotina do biologista molecular.
Introdução
As características hereditárias são passadas de geração em geração através do material genético codificado em nosso DNA.
Existe um grande interesse em conhecermos a fundo o nosso DNA, que tem sido alvo de estudos cada vez maiores e mais
profundos desde sua descoberta, na década de 1950.
O conhecimento do DNA humano e de outros organismos trouxe consigo múltiplas aplicações, que vão do conhecimento em si
ao entendimento de doenças genéticas, estudo comparativo entre espécies, ferramentas em biotecnologia e bioinformática, e
discussões éticas. Tudo isso foi possível graças às técnicas em biologia molecular que precederam e inspiraram o
desenvolvimento do sequenciamento, como as técnicas de restrição enzimática, de clonagem molecular e de hibridização.
Atualmente, elas são protagonistas e trabalham em conjunto para o avanço da ciência, da biotecnologia e da saúde humana e
animal.
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1 - Principais métodos de sequenciamento do DNA
Ao �nal deste módulo, você será capaz de distinguir as características dos principais
métodos de sequenciamento do DNA.
Princípios do sequenciamento
A quantidade de conhecimento que temos sobre o genoma humano e de outras espécies aumentou extraordinariamente a partir
do desenvolvimento de tecnologias de sequenciamento do DNA. A maior iniciativa para sequenciamento de genomas foi o
Projeto Genoma Humano, que gerou uma quantidade de informação gigantesca. Atualmente, sabemos que o genoma humano
tem mais de 3 bilhões de pares de bases e que 99,9% da população humana compartilha o mesmo DNA. Ainda assim, não
sabemos a função de aproximadamente metade dos genes descobertos.
A informação genética está contida no DNA (ácido desoxirribonucleico), uma longa molécula que é formada por nucleotídeos.
Para entendermos como as técnicas a serem exploradas neste conteúdo funcionam, precisamos relembrar alguns conceitos-
chave do DNA e da biologia molecular.
DNA: construção complexa
O primeiro deles é a ideia de que o DNA é uma construção complexa, como uma casa luxuosa. Por mais luxuosas que sejam, as
casas são feitas de tijolos, que são as unidades mínimas na nossa metáfora. No DNA, as unidades básicas são os nucleotídeos.
Cada nucleotídeo tem três regiões principais, veja:
Observe os detalhes na imagem a seguir:
Os nucleotídeos.
As bases nitrogenadas são a principal diferença entre os nucleotídeos de DNA e são as responsáveis por codificar a informação
genética. Afinal, precisamos ter pelo menos algumas letras diferentes para codificarmos uma informação no texto complexo que
é o nosso genoma. Em uma fita dupla de DNA, as bases nitrogenadas estão livres e pareiam entre si − purinas (A e G) com
pirimidinas (T e C) −, graças ao que chamamos de complementariedade das fitas de DNA. Isso garante que a informação
genética seja estável e permite a replicação (ou duplicação) do DNA com o mínimo de erros possível.
Veja abaixo o esquema mostrando a estrutura do DNA e pareamento das bases por complementariedade. Note as pontes de
hidrogênio duplas (seta azul) entre Adenina e Timina, e triplas (seta preta) entre Citosina e Guanina.
Pareamento das bases nitrogenadas.
Essa junção do nucleotídeo é feita a partir da energia presente no grupamento trifosfato no quinto carbono do nucleotídeo livre e
a hidroxila livre do terceiro carbono da desoxirribose do nucleotídeo que já faz parte da fita em síntese. Essa ligação é chamada
de fosfodiéster e é uma ligação covalente, ou seja, forte e difícil de ser quebrada. Agora que sabemos esses aspectos do DNA e
de sua replicação, podemos conhecer as técnicas para identificação dos nucleotídeos que os formam.
Replicação do DNA
O segundo conceito que precisamos revisar é o da replicação do DNA. A DNA-polimerase é uma enzima capaz de sintetizar uma
nova fita de DNA a partir de um DNA molde. Suas principais funções são reconhecer o nucleotídeo lido na fita molde, pareá-lo
com seu nucleotídeo complementar e fazer a junção desse segundo nucleotídeo à fita que está sendo sintetizada.
Um açúcar chamado de desoxirribose (por não conter oxigênio no segundo carbono da ribose). No terceiro
carbono da desoxirribose, temos um álcool orgânico (grupamento hidroxila) importante para a replicação.
No quinto carbono da ribose, temos um grupamento fosfato.
No primeiro carbono da ribose, temos uma base nitrogenada (Adenina, Timina, Citosina, Guanina - A, T, C, G).
Sequenciamento Sanger original
Uma das primeiras técnicas de sequenciamento de DNA a ganhar grande espaço no mundo científico foi desenvolvida na
década de 1970 pelo cientista Frederick Sanger e, até os dias atuais, o chamado Sequenciamento Sanger é uma das técnicas
mais robustas e precisas em uso.
Nesse método, Sanger e seus colegas usaram nucleotídeos especiais, com duas grandes diferenças dos nucleotídeos normais
que encontramos nas células: os nucleotídeos que Sanger usava eram marcados com radioisótopos, de forma que eles
pudessem identificar qual base nitrogenada foi adicionada; já as desoxirriboses foram modificadas pela retirada da hidroxila no
terceiro carbono, o que impede a adição de nucleotídeos novos pela polimerase. Por isso, o Sequenciamento Sanger leva o nome
oficial de terminação de cadeia, ou dideoxy (pela falta de duas (di-) hidroxilas, no segundo e terceiro carbonos da ribose – os
ddNTP).
Material genético e sequência de nucleotídeos de diversos indivíduos.
Radioisótopos
São átomos que emitem radioatividade detectável por aparelhos especializados.
Veja os detalhes na imagem a seguir:
Representação esquemática de um Didesoxinucleotideo (ddNTP), sem um OH no carbono 3 (cinza) e um desoxinucleotídeo (dNTP).
Em um Sequenciamento Sanger, precisamos amplificar o DNA-alvo a ser sequenciado. Normalmente, usamos um produto de
PCR (reação em cadeia da polimerase) como amostra, pois precisamos de grande quantidade de DNA-alvo. Mesmo assim, o
Sequenciamento Sanger exige uma reação de amplificação independente e, por isso, é classificado como um sequenciamento
por síntese – SpS.
A amplificação feita no Sequenciamento Sanger original contava com uma DNA-polimerase e seu
tampão, iniciadores (oligonucleotídeos curtos que se ligam especificamente ao DNA-alvo a ser
amplificado), desoxirribonucleotídeos trifosfato (dNTPs) e ddNTPs.
Como a marcação radioativa era a mesma para cada nucleotídeo, a identificação de qual ddNTP havia sido adicionado se dava
pela separação física, em tubos diferentes, dos ddNTPs marcados. Assim, o Sanger original tinha quatro tubos diferentes, cada
um contendo polimerase, iniciadores, tampão, os 4 nucleotídeos (dNTPs) e um didesoxinucleotídeos (ddNTP), marcado com
radioatividade.
Exemplo
Em um dos quatro tubos, tínhamos dATP (desoxirribonucleotídeo trifosfato de adenina), dCTP (desoxirribonucleotídeo trifosfato
de citosina), dTTP (desoxirribonucleotídeo trifosfato de timina) e dGTP (desoxirribonucleotídeo trifosfato de guanina) e um
didesoxirribonucleotideo trifosfatado de guanina (ddGTP) marcado com radioisótopo; nos outros, estavam presentes os
mesmos dNTPSe em cada um ddNTP diferentes (adenina, tirosina e citosina).
A cada ciclo de amplificação, os dNTPs são adicionados até que o ddNTP marcado com radioisótopo seja adicionado, o que faz
com que a adição de nucleotídeos à fita nova seja parada apenas para aquela fita. As outras fitas que estão sendo sintetizadas
na mesma reação continuam sendo sintetizadas até que o ddNTP seja adicionado. Dessa forma, temos sequências de DNA de
diferentes tamanhos, todas terminando em um ddNTP marcado com radioisótopo. Assim, sabemos qual ddNTP terminou a
cadeia, pois eles estão em tubos separados!
Da mesma forma que revelamos o resultado de uma PCR convencional separando o produto amplificado em um gel de agarose
através da eletroforese e corando-o com um agente intercalante de DNA que seja fluorescente, a revelação do Sequenciamento
Sanger também se baseava na separação por eletroforese e revelação.
Quando o gel de agarose polimeriza, forma uma malha frouxa, que não é estreita o suficiente para separar sequências com
diferenças de até um único nucleotídeo (ou ddNTP, no caso do Sequenciamento Sanger) que precisamos detectar. Então,
usamos outro tipo de gel, ou polímero: a poliacrilamida, feita a partir da polimerização da acrilamida/bisacrilamida, que nos dará
uma malha muito mais intricada (forma poros regulares e de tamanho uniforme) e capaz de distinguir pequenas diferenças no
tamanho do DNA.
Preparo de gel de agarase.
Cada um dos quatro tubos de sequenciamento diferentes, contendo os ddNTPs marcados, usará um poço no gel de
poliacrilamida para sua resolução. Esperamos que, em cada tubo, os ddNTPs tenham sido usados mais de uma vez. Então,
desejamos ver múltiplas bandas em cada uma das linhas do gel correspondentes a cada ddNTP utilizado.
Sequenciamento Sanger manual e imagem real do sequenciamento.
Além disso, como a intenção do gel é a separação dos produtos por tamanho quando submetidas a uma corrente elétrica, as
moléculas de DNA menores migram mais rapidamente pelo gel e, por isso, estão localizadas mais abaixo do que as moléculas
maiores. Finalmente, a revelação é feita através da emissão de radioatividade, que ficava impressa em um filme de raios X, e, em
seguida, a sequência é montada a partir dos tamanhos de DNA obtidos. Na imagem apresentada, vemos que cada ddNTP
marcado com radioisótopos foi colocado em tubos separados e, após eletroforese em gel de poliacrilamida, foram obtidos
diferentes tamanhos de DNA.
Após revelação, conforme se observe na imagem apresentada anteriormente, a sequência é montada de forma manual a partir
desses tamanhos.
Automação do Sequenciamento Sanger
A técnica original de sequenciamento Sanger era bastante trabalhosa e exigia um nível de complexidade muito grande. Além de
serem quatro tubos, os ddNTPs radioativos precisavam ser manipulados em ambiente controlado por oferecerem risco à saúde
dos trabalhadores, e tudo era feito manualmente, inclusive a interpretação do gel de poliacrilamida para determinação da
sequência. Isso trazia imensas limitações ao uso do sequenciamento. Por isso, os pesquisadores automatizaram o
sequenciamento para reduzir custos, riscos e tempo de execução, além de, claro, aumentar a precisão na determinação das
bases em sequência.
Para que a automatização fosse bem-sucedida, entretanto, eles precisaram modificar algo crucial: o uso de radioisótopos. Por
serem a maior limitação da técnica, eles foram substituídos por fluoróforos. O uso deles na marcação dos ddNTPs concedeu
outra grande vantagem: além de serem mais seguros, podem ser utilizados vários fluoróforos que se excitam e emitem
fluorescência em comprimentos de onda diferentes ao mesmo tempo. Isso permite que vários fluoróforos sejam usados na
mesma reação, abolindo o uso de quatro tubos.
Fluorófos
São pequenas moléculas que, quando excitadas em determinado comprimento de onda, emitem fluorescência que pode ser
facilmente detectada.
Com cada ddNTP marcado com fluoróforo de cor diferente, o sequenciamento é mais seguro e mais
barato, pois já não precisamos lidar com a segurança extra contra a radioatividade e reduzimos a
reação a um único tubo.
Com o uso de quatro fluoróforos, um para cada ddNTP e em um único tubo de amplificação, outra limitação ao uso do
sequenciamento foi superada: a forma de leitura.
Na automação
A leitura dos fragmentos com terminação em ddNTPs marcados com fluoróforos passou a ser feita por eletroforese em capilar,
ou seja, em um tubo extremamente fino contendo um polímero semelhante à poliacrilamida pela qual cada fragmento passa, um
de cada vez. Veja como acontece o processo:
À medida que cada fragmento passa pelo capilar, um laser incide sobre a sequência, e os ddNTPs marcados
emitem fluorescências em comprimentos de onda diferentes que são detectadas por um aparelho.
Os aparelhos mais modernos conseguem sequenciar cerca de 900 pares de base (pb) em uma cadeia, e possuem
múltiplos capilares para a leitura de dezenas de amostras diferentes.
O aparelho também processa e filtra a fluorescência de ruído (ou background) de cada ddNTP lido e nos fornece
uma representação gráfica da sequência e de sua qualidade.
A representação gráfica é o resultado que iremos analisar, e seu nome oficial é eletroferograma. Este consiste em
picos coloridos, em que a altura do pico representa a qualidade da leitura – picos mais altos possuem melhor
qualidade e são mais confiáveis (ou seja, a probabilidade de a fluorescência da detecção estar errada é muito
pequena), e cada cor representa uma base nitrogenada diferente detectada por fluorescências distintas.
Observe a seguir:
Esquema do Sequenciamento Sanger automatizado.
Sequenciamento de Nova Geração (Next Generation Sequencing)
Enquanto a técnica de Sanger era aperfeiçoada e automatizada, outros esforços para sequenciamento de DNA apareceram.
Durante essa época, surgiu o pirosequenciamento, capaz de detectar a produção de um fosfato livre – ou pirofosfato –,
decorrente da adição de um nucleotídeo.
O pirofosfato é produzido quando o trifosfato da extremidade 5’ de um nucleotídeo é clivado e dá energia à ligação fosfodiéster
catalisada pela DNA polimerase. Assim, o pirosequenciamento também é um sequenciamento por síntese (SpS), como o Sanger.
Porém, dispensa o uso de ddNTPs marcados com radioisótopos ou fluoróforos, assim como eletroforese em capilar. O
pirofosfato é detectado ao ser convertido em ATP por uma enzima (ATP sulfurilase). O ATP é, então, usado pela luciferase, uma
segunda enzima que oxida a luciferina, um substrato em oxiluciferina, e, durante essa transformação, ocorre a formação de luz,
que pode assim ser quantificada.
No pirosequenciamento, cada dNTP é adicionado separadamente à reação, de forma que se saiba qual foi o nucleotídeo inserido
que gerou luz. Os nucleotídeos que não foram usados são degradados por uma terceira enzima, a apirase. O ciclo se repete com
o próximo nucleotídeo. Veja:
Pirosequenciamento
Também conhecido pelo nome comercial Roche 454.
Esquema das etapas da reação de pirosequenciamento.
A partir da imagem, observamos que o DNA genômico é clivado, ligado a adaptadores e imobilizado em microesferas (beads),
nas quais acontecerá a amplificação do DNA por PCR em emulsão (que vamos entender a seguir). No sequenciamento, vemos
cada novo nucleotídeo adicionado pela DNA polimerase e detectado pela emissão de luz decorrente da liberação de um
pirofosfato.
Com a criação do pirosequenciamento, surgiu uma nova geração de sequenciamento (NGS – Next Generation Sequencing).
Nessas metodologias, usamos o conceito de formação de bibliotecas de DNA para o sequenciamento. Vamos entender como:
As bibliotecas são formadas por meio da “quebra” do DNA extraído, seja por ele ter sido digerido em pequenos
fragmentos usando enzimas, seja por ter sido clivado usando métodos físicos, como a sonicação (é utilizada a
energia de ondas sonoras para quebrar macromoléculas – nesse caso, o DNA).
O DNA fragmentado é ligado a adaptadores, que são pequenassequências sintéticas, conhecidas e exógenas
(não pertencentes ao DNA a ser sequenciado), usadas na identificação das amostras. Cada extremidade (5’ e 3’)
do DNA fragmentado em uma biblioteca se liga a um adaptador distinto, com sequências de DNA diferentes. O
d d t d iti i t d iõ d DNA ã tí h h i t fi i t
Esse sistema permite a existência de milhares de microesferas, cada uma com uma sequência de DNA única, amplificada e
sequenciada. Assim, milhões de pares de base podem ser sequenciados muito mais rapidamente do que pelo método de
Sanger.
O mesmo princípio de criação de bibliotecas de DNA com o uso de adaptadores, imobilização e sequenciamento por síntese foi
uso de adaptadores permitiu o sequenciamento de regiões do DNA que não tínhamos conhecimento suficiente
para desenharmos oligonucleotídeos iniciadores, e foi desenvolvido ainda na era Sanger.
Os adaptadores imobilizam o fragmento de DNA e auxiliam o início da síntese, pois se ligam por
complementariedade a oligonucleotídeos iniciadores aderidos a microesferas, de forma que cada microesfera
tenha apenas um fragmento de DNA ligado a ela.
Cada microesfera será depositada em um micropoço (em um microchip), local onde ocorrerá uma PCR diferente,
chamada de PCR em emulsão ou em gotícula de óleo água (nessa emulsão de água, em uma fase oleosa, as
gotículas de água contêm os reagentes de PCR, uma fita de DNA a ser sequenciado e uma bead para sua
ancoragem).
Assim, cada microesfera terá várias cópias idênticas do mesmo DNA. Isso é importante para amplificação do sinal
emitido pelo pirofosfato, que precisa ser suficiente para que nossos métodos de detecção disponíveis consigam
captar esse sinal.
Em seguida, as fitas duplas ligadas à microesfera são desnaturadas em fitas simples, e estarão prontas para
iniciarmos a reação de sequenciamento.
Na etapa de sequenciamento, um único dNTP é adicionado por vez à reação. Assim, quando o dNTP
complementar à sequência-molde é adicionado pela polimerase, o pirofosfato liberado na formação da ligação
fosfodiéster dá energia para a reação luminosa ocorrer, que é, por sua vez, detectada por um sensor.
aperfeiçoado e modificado posteriormente. Um dos métodos mais famosos e mais usados é o sequenciamento Illumina/Solexa.
Nessa técnica, a biblioteca de DNA é ligada aos adaptadores. Vamos entender como isso é feito?
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Os fragmentos de DNA são anelados a iniciadores aderidos a uma placa (chamada de célula de fluxo ou flowcell) por meio dos
adaptadores, e a síntese por ponte de DNA começa usando dNTPs normais.
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Na síntese por ponte, cada extremidade do DNA contém adaptadores diferentes capazes de se anelar aos primers
complementares já aderidos à placa.
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A DNA polimerase sintetiza todas as fitas complementares, formando agrupamentos (ou clusters, em inglês) de DNA idênticos,
que são desnaturados em fitas simples e usados como molde para a etapa do sequenciamento
Após formação da biblioteca de DNA ligada a adaptadores (rosa e verde), o DNA-alvo é fragmentado e ligado aos iniciadores
aderidos na placa através de complementariedade com os adaptadores, para que a amplificação por ponte aconteça. Veja a
representação esquemática da amplificação por ponte da técnica de sequenciamento Illumina/Solexa:
Esquema da amplificação pela técnica de sequenciamento Illumina/Solexa. Na imagem, os adaptadores estão em verde e rosa.
O sequenciamento em si é efeito de forma semelhante ao Sanger, em que didesoxinucleotídeos (ddNTPs) marcados com
fluoróforos são adicionados à reação, causando a terminação da polimerização. No caso do sequenciamento Illumina, os
nucleotídeos marcados com fluorescência são terminadores reversíveis da polimerização, ou seja, após uma simples lavagem, o
sequenciamento pode continuar com a incorporação de novos nucleotídeos marcados com fluoróforos feita pela DNA
polimerase.
A fluorescência de cada ciclo é obtida em diferentes comprimentos de onda para cada ddNTP e é detectada pelo aparelho
sequenciador, que decodifica o sinal. Cada corrida pode ter milhões de clusters diferentes, o que nos gera uma quantidade
gigantesca de dados
Esquema do sequenciamento Illumina.
Talvez esta tenha sido a maior vantagem dos sequenciamentos de nova geração: a introdução de métodos de alto rendimento, o
que significa um sequenciamento de um número gigantesco de bases, de forma muito mais rápida do que o Sequenciamento
Sanger.
Contudo, as NGS possuem desvantagens, como perda de precisão quando as sequências são muito
repetitivas em um único nucleotídeo, pois é difícil para o aparelho saber quantas bases idênticas
foram adicionadas em um ciclo apenas, já que o pico de luz fica bem mais extenso ou mais longo.
Nesses casos, podemos usar o Sequenciamento Sanger, que é mais confiável para determinação de
sequências repetitivas por também separar as moléculas de DNA por tamanho.
Outra desvantagem do NGS é o tamanho máximo das sequências lidas: enquanto no Sequenciamento Sanger lemos cerca de
900 pb, nos primeiros NGSs, as leituras eram bem mais curtas – inicialmente, apenas 30 a 40 bases eram lidas por fragmento.
Saiba mais
Atualmente, na terceira geração de NGS, existem equipamentos capazes de ler sequências maiores, de 200 a 300 pb. Novas
tecnologias capazes de sequenciar até 50 kbp em uma leitura contínua, assim como técnicas para sequenciamento em tempo
real, também foram desenvolvidas e estão constantemente sendo aprimoradas.
Toda essa capacidade de sequenciamento introduziu outra questão importante: como unir esses pequenos fragmentos e
reconstituir a sequência contínua original de milhões de pares de base, como as que existem nos organismos vivos?
Com o desenvolvimento tecnológico que permitiu os sequenciamentos de alto rendimento, vimos o desenvolvimento de
softwares e algoritmos especializados na resolução do quebra-cabeças gerado ao produzirmos centenas de milhões de
sequências. Com o estudo da genômica e da transcriptômica, um campo novo de intercessão entre biologia e informática
cresceu muito: a bioinformática.
Transcriptômica
Estudo do total de genes que estão sendo transcritos em determinada célula, pela síntese da cDNA a partir do RNA mensageiro.
Sequenciamento de nova geração
Conheça um pouco sobre os métodos de NGS de terceira geração.

Falta pouco para atingir seus objetivos.
Vamos praticar alguns conceitos?
Questão 1
O sequenciamento do DNA permitiu grande quantidade de conhecimento sobre o genoma de diversas espécies. Sobre os
métodos de sequenciamento, é correto afirmar que
Parabéns! A alternativa C está correta.
O Sequenciamento Sanger é muito mais confiável que a maioria dos NGS, especialmente para identificar nucleotídeos em
regiões repetitivas, pois também é capaz de separar as sequências terminadas em ddNTPs marcadas de acordo com seu
tamanho. No entanto, cada corrida de Sequenciamento Sanger consegue identificar uma quantidade de pares de base muito
pequena (cerca de 900 bp) comparada à capacidade de sequenciamento de NGS, que pode chegar a milhões de pares de
base (ou Mpb) por corrida.
Questão 2
O Sequenciamento Sanger foi um grande avanço tecnológico dentro das análises moleculares e até hoje tem sido aplicado
em muitos trabalhos. Sobre este método, é correto afirmar que
A o método mais antigo, conhecido como pirosequenciamento, utiliza a liberação de um pirofosfato
terminador de cadeia para revelar qual nucleotídeo foi adicionado.
B
um dos métodos mais confiáveis de sequenciamento é o pirosequenciamento, pois consegue identificar
regiões com nucleotídeos repetitivos com alta resolução.
C
os Sequenciamentos de Nova Geração (NGS) não são tão confiáveis quanto o Sequenciamento Sanger,
porém produzem grande quantidade de informação em um intervalo de tempo muito curto.
D
o sequenciamento Illumina e o pirosequenciamento não fornecem muita informação, pois sequenciam
apenas algumas dezenas de pares de base por corrida.
E
com a chegada de NGS, o Sequenciamento Sanger se tornou obsoleto e não tem mais utilidade paraa
maioria das aplicações em ciência, saúde e biotecnologia.
A
utiliza a terminação da cadeia em ribonucleotídeos marcados com radioisótopos, o que limita a aplicação do
método.
B
utiliza didesoxirribonucleotídeos marcados com fluoróforos, que são identificados ao longo da cadeia
durante a síntese.
C
parte do princípio de separação das moléculas de DNA em gel de agarose e revelação dos nucleotídeos por
emissão de luz ultravioleta.
Parabéns! A alternativa D está correta.
O Sequenciamento Sanger automatizado usa didesoxinucleotídeos marcados com fluoróforos e separação por eletroforese
em capilares, o que permitiu o sequenciamento de dezenas de amostras em uma mesma corrida.
2 - Principais técnicas de clonagem molecular
Ao �nal deste módulo, você será capaz de reconhecer as principais técnicas de clonagem
molecular, suas formas de uso e suas vantagens e desvantagens.
Tecnologia do DNA recombinante
A tecnologia do DNA recombinante é uma ferramenta com grande aplicação em biotecnologia. É usada para transferir uma
informação genética de um organismo para outro, pela união de duas fitas de DNA de origens diferentes e sua inserção em um
organismo hospedeiro. Veja:
A tecnologia do DNA recombinante consiste na união de duas fitas de DNA.
D foi automatizado, de forma que a terminação da cadeia por nucleotídeos modificados e marcados possa ser
identificada mais rapidamente.
E
depende da leitura de lasers, que excitam os radioisótopos a emitirem radiotividade no comprimento de onda
a ser detectado.
Também é conhecido como clonagem molecular, pois nesse processo temos a expansão de organismos hospedeiros idênticos
geneticamente, ou clones, todos contendo o DNA recombinante. Com o uso da tecnologia do DNA recombinante, conseguimos
produzir proteínas humanas em larga escala, para terapia, diagnóstico e até prevenção de doenças.
Exemplo
A clonagem molecular permite: que bactérias sintetizem insulina humana, usada no tratamento de diabetes mellitus tipo I; usar
genes inseridos em plasmídeos como forma de amplificarmos o gene e usá-los como curva de quantificação em uma qPCR;
fabricar vacinas contra o papilomavírus humano (HPV) usando apenas a proteína externa do vírus produzida em levedura.
Além disso, podemos alterar geneticamente organismos complexos, como plantas e animais, ao introduzirmos genes de outras
origens – os transgenes, gerando os organismos transgênicos – ou modificando genes que já existem em determinado
organismo. Criamos, assim, os chamados organismos modificados geneticamente (GMO, genetically modified organisms).
Entretanto, com essa capacidade, vieram muito questionamentos éticos sobre o que podemos e devemos modificar nos
organismos.
Para dominarmos essa poderosa ferramenta, precisamos conhecer alguns pontos-chave sobre a informação que queremos
transferir, sobre as formas de transferência e sobre o sistema para onde estamos transferindo a informação genética.
A informação que queremos transferir, nesse caso, é uma sequência de DNA de interesse, que pode
ser tanto um gene, uma região regulatória, ou pequenas sequências que determinam epítopos
antigênicos (regiões que causam uma resposta imunológica que podemos detectar) que não serão
expressos, que chamamos de inserto. A forma de transferência dessa sequência é o que
chamamos de vetor.
Assim como uma encomenda precisa ser transportada por caminhão, moto, navio ou avião para chegar até seu destino, a
sequência genética precisa de uma forma de transporte até o organismo-alvo. O sistema de utilização é o nosso organismo final,
que apresente a capacidade de expressar determinado gene ou seja modificado geneticamente, o qual chamamos
de hospedeiro. Veja:
Esquema das partes essenciais da clonagem molecular: sequência de interesse (ou inserto), vetor (plasmídeo) e hospedeiro (bactéria).
Vamos conhecer cada etapa da clonagem molecular passo a passo.
Isolamento do fragmento de interesse
O primeiro passo para clonagem molecular é a identificação do gene ou da sequência de DNA que queremos clonar, que, como
já aprendemos, é chamada de inserto.
Para isso, podemos partir de uma sequência já conhecida. Nas últimas duas décadas, uma quantidade gigantesca de
informação genética foi produzida, e existem diversas ferramentas de informática disponíveis na internet para conhecermos a
sequência exata de genes e regiões não codificantes de diversos organismos. A maior plataforma pública e gratuita que
armazena sequências de DNA (e cDNA, caso estejamos interessados em RNA) e mais conhecida é o GenBank (ou banco de
genes, em tradução livre), do Instituto Nacional de Saúde dos Estados Unidos da América (NIH – National Health Institute). Mas
cuidado:
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Caso seu gene de interesse não esteja entre as sequências armazenadas e disponíveis ao público, você poderá sequenciar a
região. Nesse caso, basta amplificarmos a sequência ou a região próxima que a flanqueie (ou seja, as regiões que estão antes e
depois de determinada sequência) por PCR. Após a amplificação, iremos separar as sequências obtidas na PCR por eletroforese
em gel de agarose e observar se existem vários produtos ou apenas um.

Caso tenhamos apenas um produto, podemos purificar a PCR e extrair apenas o DNA amplificado – ou seja, remover todo
tampão, enzima Taq e os iniciadores, que poderiam interferir no sequenciamento. Caso mais de uma banda esteja visível no gel
de agarose, precisaremos cortar a banda de tamanho desejado e purificá-la a partir do gel. Assim, eliminamos produtos de PCR
inespecíficos e impedimos que eles influenciem nosso Sequenciamento Sanger, o que será feito a seguir.
Mas o que fazer caso não haja informação suficiente sobre o organismo estudado sequer para desenhar iniciadores para a PCR?
Nesse caso, pode-se usar novas tecnologias de sequenciamento, conhecidas como sequenciamento de nova geração, que usam
adaptadores para amplificar o genoma. Uma vez que tenhamos nosso inserto amplificado e sua sequência conhecida, podemos
colocá-lo (ou inseri-lo) no nosso vetor.
Escolha do vetor e estratégia de inserção
Uma vez determinada com exatidão a composição da sequência, precisamos observar seu tamanho. Assim como usamos
meios de transporte diversos para diferentes tamanhos de encomendas, precisamos escolher qual o melhor vetor para
transportar a sequência.
Os vetores são pequenos DNAs autorreplicantes e circulares que conseguem ser transferidos para dentro das células. Existem
diversos tipos de vetores, baseados em seu tamanho total, no tamanho da sequência de DNA recombinante que pode
transportar e organismos em que podem ser usados.
Os vetores mais conhecidos são os plasmídeos, que são pequenos DNAs circulares autorreplicantes, de origem bacteriana, que
podem ser transportados para dentro e para fora da célula. Eles ocorrem na natureza e acredita-se que sejam originados de
restos de genomas bacterianos que mantêm todos os elementos necessários à sua própria replicação e que foram absorvidos
por outra bactéria. Assim, os plasmídeos são considerados elementos genéticos móveis, ou seja, eles podem ser transferidos
(ou transportados) de uma célula a outra, ou adquiridos a partir do ambiente.
Bactéria da peste Yersinia pestis, mostrando estrutura da célula com DNA, plasmídeos e ribossomos.
Normalmente, as bactérias conseguem sobreviver sem plasmídeos – por isso, são considerados como extracromossomais –,
mas, por vezes, a informação codificada neles oferece vantagem em ambientes seletivos.
Exemplo
Um plasmídeo pode ter uma sequência de DNA que codifique uma proteína de canal, que, por sua vez, confere resistência a certo
antibiótico. Ao entrar em uma célula que esteja sob pressão seletiva pelo tal antibiótico – ou seja, uma célula que esteja lutando
para sobreviver ao antibiótico –, a aquisição desse plasmídeo conferirá resistência, e a bactéria poderá sobreviver facilmente.
Como comentamos anteriormente, os plasmídeos são autônomos em sua replicação e, por isso, precisam ter determinados
elementos que permitamsua duplicação e expressão independentemente do momento em que a célula se encontre. Um
plasmídeo criado em laboratório com o mínimo de informação necessária para ser funcional contém três regiões:
Observe a imagem do plasmídeo a seguir:
Representação esquemática de um vetor comum, o plasmídeo.
Lembre-se de que essas são as regiões mínimas à replicação em uma bactéria e que seu organismo hospedeiro pode ser um
eucarioto (leveduras, células animais e vegetais), que pode requerer outras regiões para replicação do plasmídeo e sua
expressão.
Exemplo
Devemos sempre priorizar o uso de promotores gênicos derivados de leveduras, caso nosso sistema hospedeiro seja a levedura,
e de usar promotores e potenciadores preferencialmente virais para células de mamífero, em adição à origem de replicação e um
marcador de seleção de eucariotos.
Os plasmídeos são amplamente usados em biotecnologia e em clonagem molecular, por serem resistentes ao ambiente,
facilmente inseridos dentro de células procarióticas (bactérias) e eucarióticas (como leveduras, células animais e vegetais) e de
fácil manipulação. Os plasmídeos podem ter tamanho total entre alguns milhares a dezenas de milhares de pares de base e
podem conter insertos de tamanhos variados, desde que o tamanho total do plasmídeo permaneça inferior a 10 mil pares de
base (10 kb), muito embora alguns plasmídeos permitam insertos de até 15 kb.
A origem de replicação, que a DNA-polimerase da sua célula-hospedeira bacteriana reconhece e onde todos os
fatores necessários à abertura da forquilha de replicação se ligam.
Um gene de resistência a antibiótico, que auxilia na seleção das bactérias que contêm o plasmídeo.
O sítio múltiplo de clonagem (multiple cloning site – MCS), que deve incluir um promotor gênico (promotor gênico
é uma sequência curta no DNA que precede o gene e sinaliza à maquinaria celular de transcrição de RNA o local a
que ela deve se ligar para encontrar o início do gene), diversos sítios de restrição por diferentes enzimas e um
terminador (é uma sequência curta que define o sitio de finalização da transcrição para liberar a maquinaria de
transcrição).
Existem situações em que pode ser necessário usar insertos maiores, e, nesses casos, outros sistemas podem ser usados. Por
exemplo, o sistema de cosmídeos permite insertos de até 50 kb, pois sua composição genética é uma mistura entre plasmídeos
e bacteriófagos. Entretanto, cosmídeos exigem que seu genoma seja empacotado, ou seja, que uma camada de proteína
chamada capsídeo viral recubra o DNA do cosmídeo, para protegê-lo e para que haja infecção de novas células. Outras opções
são os cromossomos artificiais bacterianos (Bacterial Artificial Chromosome – BAC) ou de levedura (Yeast Artificial
Chromosome – YAC), para insertos de tamanho superior a 100 kb.
Bacteriófagos
São vírus capazes de infectar bactérias, injetando o material genético viral através da parede celular até o citoplasma da bactéria.
Estratégias de clonagem
Uma vez que conheçamos a sequência do nosso inserto e tenhamos escolhido o vetor que melhor se adeque às nossas
necessidades, podemos começar a clonagem. Para isso, vamos explorar duas estratégias principais. A primeira baseia-se na
digestão do DNA e utiliza as chamadas enzimas de restrição. A segunda, mais recente, utiliza apenas PCR. Vamos explorá-las
com detalhes a seguir.
Clonagem por restrição
As enzimas de restrição são capazes de reconhecer sequências internas e muito especificas do DNA fita dupla e cortá-lo ao
clivarem a ligação fosfodiéster entre dois nucleotídeos, e, por isso, são classificadas como endonucleases − endo = interno;
nucle = núcleo (relativo ao DNA); ase = enzimas. Elas são encontradas na natureza em bactérias e funcionam como um sistema
de defesa bacteriano contra DNA invasores potencialmente perigosos, como o DNA de bacteriófagos (vírus que infectam e
matam as bactérias).
Existem dois tipos de enzimas de restrição, baseado em como o corte, ou clivagem, do DNA é feito, veja:
Blunt end (em tradução livre “fim abrupto”): A endonuclease pode reconhecer o seu sítio de clivagem e cortar as duas fitas de
DNA no mesmo ponto.
Sticky end (em tradução livre “extremidade grudenta” ou “pegajosa”): A enzima pode cortar o DNA fita dupla com uma
diferença de poucos nucleotídeos entre as fitas complementares, deixando esses poucos nucleotídeos em fita simples, o que
torna muito mais fácil o pareamento por complementariedade entre as bases nitrogenadas. Esse método é preferível ao
primeiro.
Observe os detalhes na imagem a seguir:
Ilustração representando clivagem por enzima de restrição “sticky” ou “pegajoso” e clivagem “blunt”, ou “plano”.
Para usar o método de clonagem por enzimas de restrição, tanto nosso inserto quanto nosso vetor precisam ter sítios de
clivagem pela enzima de restrição de nossa escolha. É de extrema importância que o sítio de restrição (ou clivagem) no vetor
seja único, caso contrário ele será digerido em diversos fragmentos não funcionais, e nossa clonagem não funcionará, conforme
é demonstrado na imagem a seguir:
Ilustração exemplificando sítio de clivagem para enzimas de restrição “sticky” (esquerda) e “blunt” (direita). Na imagem, são exemplificadas enzimas de restrição.
Caso nosso inserto não possua o sítio de restrição naturalmente em suas extremidades, podemos colocar a sequência que a
enzima reconhece nas extremidades durante a amplificação por PCR. Para isso, basta acrescentarmos o sítio de restrição às
extremidades dos iniciadores. Em seguida, faremos a digestão do inserto e do vetor pela mesma enzima de restrição em
microtubos separados. A reação de digestão é normalmente feita a 37°C por uma hora, embora a reação possa ser deixada de
um dia para o outro para aumentar a digestão.
Uma vez que a restrição tenha acontecido, veremos se o vetor foi linearizado – lembre-se de que
ele era circular – pela eletroforese em gel de agarose. Esperamos ver apenas uma banda, mais
abaixo que a banda do plasmídeo não digerido, pois o DNA linear migra mais rapidamente que o
circular. Se virmos mais de uma banda no gel, será porque nossa enzima de restrição encontrou
mais de um sítio de clivagem no vetor. Isso pode ser o que você deseja, caso queira remover uma
sequência primeiro e depois, colocar seu inserto no local.
Para evitar que o vetor digerido volte a ser um círculo (já que as extremidades digeridas são complementares entre si,
especialmente se uma única enzima de restrição para as duas extremidades estiver sendo usada), devemos usar fosfatases,
para remover o fosfato nas extremidades 5’, o que impede a circularização espontânea.
Atenção!
Lembre-se de usar a fosfatase apenas no tubo do vetor, e não no do inserto. Essa é uma boa forma de controle de qualidade da
nossa digestão e para assegurar que nossa clonagem será bem-sucedida.
Em seguida, precisamos fazer a ligação entre as extremidades do nosso inserto e as do vetor linearizado, ou seja, precisamos
colocar o inserto no vetor. As “pontas grudentas”, em que há alguns poucos nucleotídeos com bases nitrogenadas livres,
conseguem parear por complementariedade. Assim, a extremidade 5’ do inserto pareará com a extremidade 3’ do vetor e a
extremidade 3’ do inserto com a 5’ do vetor.
No entanto, o pareamento das bases não será suficiente para que uma ligação estável aconteça, pois a complementariedade das
bases se dá por pontes de hidrogênio facilmente desfeitas pelo calor. Para termos uma ligação estável, precisamos que ela seja
covalente, o que significa que precisamos fazer a ligação fosfodiéster entre as extremidades 5’ e 3’ das duas fitas pareadas.
Para isso, usamos uma enzima chamada DNA ligase. Veja:
DNA ligase que forma ligação fosfdiéster entre as fitas complementares do vetor e do inserto, após digestão por enzimas de restrição.
Clonagem livre de restrição
A segunda estratégia que podemos usar é chamada de clonagem livre de restrição (restriction free cloning – RFC). Na primeira
parte do processo, não precisamos de enzimasde restrição. Nela, amplificamos o DNA do inserto em uma PCR especial, que
utiliza oligonucleotídeos iniciadores com duas regiões: a região 3’ é usada para amplificar o inserto, pois o reconhecem e se
anelam a ele; e a região 5’ é uma região complementar ao vetor, que será usada na segunda etapa da RFC. Por isso, os primers
para RFC são maiores que os iniciadores convencionais, com comprimento médio de 50 pb, sendo que 25 pb devem se anelar ao
inserto e os 25 pb restantes ao vetor.
Na prática, é importante que as duas regiões dos iniciadores senso e antissenso tenham
aproximadamente a mesma temperatura de anelamento para que a PCR funcione. Usaremos esses
oligonucleotídeos para amplificar o inserto e, ao mesmo tempo, adicionar a ele uma região de
complementariedade ao vetor. Existe ainda a possibilidade de seu inserto ser pequeno o suficiente
para estar contido dentro de iniciadores um pouco mais longos, o que reduz a RFC a apenas uma
PCR.
A ciclagem da PCR em si é praticamente a mesma que qualquer outra, com temperaturas de desnaturação, anelamento e
extensão padrões – lembrando que o tempo de extensão depende do tamanho do amplicon (produto formado ao final do PCR) a
ser gerado.
Como queremos amplificar um vetor de clonagem com milhares de pares de base, cada extensão deverá ter 1 minuto por kb –
ou seja, para um plasmídeo de 7 kb, serão 7 minutos de extensão por ciclo. Como em uma PCR convencional, validaremos a
reação vendo o amplicon de tamanho desejado na eletroforese em gel de agarose.
Veja o passo a passo a seguir:
A ciclagem será um pouco diferente da PCR convencional, pois usamos menos ciclos, uma vez que a longa fita
consumirá os reagentes rapidamente. Em seguida, purificaremos esse produto de PCR para eliminar os reagentes
de PCR e usá-lo em uma segunda reação, como o megaprimer: as extremidades do nosso inserto irão anelar com
as extremidades complementares do vetor.
Além disso, podemos fazer a RFC-PCR sem temperatura de anelamento, usando apenas uma extensão a 72°C.
Para essa segunda PCR, precisamos usar o megaprimer; o vetor da nossa escolha; Taq polimerase, de preferência
uma adequada para polimerização de longas fitas; e dNTPs.
Como os iniciadores são maiores, sua temperatura de anelamento também será maior e mais próxima à de
extensão.
Finalmente, o vetor parental deverá ser digerido por uma enzima chamada Dpn1, uma endonuclease que apenas
reconhece e cliva o DNA metilado (DNA com adição de grupamentos metil, decorrentes da replicação in vivo) –
como o DNA amplificado por PCR não contém grupamento metil, nosso DNA recombinante fica intacto, enquanto
o vetor parental, que havia sido purificado depois de replicado na bactéria, é digerido.
A partir da a ilustração a seguir, podemos ver que os iniciadores usados na primeira PCR (amplificação de inserto) possuem
regiões sobrepostas para posterior anelamento ao vetor (2º PCR). Observe:
Representação esquemática da clonagem livre de restrição.
Uma vez que tenhamos inserido nossa sequência de interesse em um vetor, quer usando enzimas de restrição, quer não,
precisamos verificar se nosso inserto está presente. Para isso, fazemos uma PCR com um iniciador senso que se anele próximo
ao sítio de clonagem e um iniciador antissenso que se anele à sequência do inserto.
Esperamos que essa PCR de detecção do DNA recombinante funcione e nos dê uma banda única, do tamanho esperado para o
intervalo entre os primers. Esse é o controle de qualidade da clonagem, que vamos repetir mais à frente. Estamos prontos, então,
para colocar esse vetor recombinante dentro de uma bactéria. Essa etapa é necessária para que mais vetores sejam produzidos,
mesmo que nosso hospedeiro final não seja a bactéria. Assim, conseguiremos quantidade de vetores suficientes para outros
hospedeiros.
Transformação, seleção dos clones recombinantes e multiplicação
Para colocar nosso vetor recombinante dentro de uma célula, usamos uma técnica chamada de transformação − processo de
aquisição horizontal de DNA exógeno do meio ambiente que algumas bactérias possuem. A principal bactéria usada em
clonagem molecular é a ], um bacilo Gram-negativo com fácil multiplicação e manutenção em cultura, alta eficiência de
transformação e que possui cepas usadas em laboratório que não são patogênicas. No entanto, a E. coli não é naturalmente
capaz de adquirir DNA a partir do meio.
Para ser passível de transformação, precisamos fazer como que a E. coli seja competente.
Conseguimos isso ao congelarmos instantaneamente as células, usando nitrogênio líquido e na
presença de tampão rico em cálcio, que fará com que a parede celular da E. coli fique permeável e
apresente pequenos orifícios para a entrada do DNA durante a transformação.
Após tornarmos a E. coli competente para a entrada do DNA exógeno na célula, podemos transformar nosso vetor recombinante.
A transformação bacteriana mais comumente usada é a de choque térmico. As células que estão congeladas serão
descongeladas e misturadas com o DNA do vetor plasmidial. Tudo isso deve ser feito em gelo; caso contrário, a célula perderá
sua competência.
Após curta incubação em gelo, fazemos o choque térmico ao colocarmos as bactérias na temperatura de 42°C por menos de 1
minuto, seguido de banho de gelo por mais uns poucos minutos. Então, fazemos a semeadura das bactérias transformadas em
placa de cultivo bacteriano seletivo. No dia seguinte, após deixarmos nossa placa em incubadora de 37°C, veremos o surgimento
de colônias, cada uma correspondendo à expansão clonal de um único transformante − bactéria que foi transformada. Veja:
Representação da transformação bacteriana.
Ao analisarmos a imagem apresentada anteriormente, vemos que:
Assim, a transformação é diretamente proporcional à quantidade de DNA plasmidial: quanto mais DNA, maior o número de
colônias no final. Por isso, tenha em mente que DNA em excesso pode ser tão prejudicial quanto em escassez, pois pode não ser
possível diferenciar as colônias bacterianas no final nem separar seus clones.
Entretanto, é importante sabermos que a transformação para clonagem tem eficiência muito mais
baixa do que a transformação apenas para expansão do vetor (ou seja, apenas para aumentarmos a
quantidade que temos de determinado plasmídeo). Por isso, normalmente tentamos obter e usar o
máximo de DNA para a transformação durante a clonagem.
A entrada do vetor na E. coli competente precisa distinguir a célula na qual a transformação foi bem-sucedida da que não foi.
Portanto, usamos alguns marcadores de seleção que estão presentes nos vetores e que farão a distinção entre as bactérias. O
marcador de seleção mais usado é o antibiótico ampicilina. A ampicilina é um antibiótico derivado da penicilina, capaz de matar
bactérias e usado em infecções bacterianas comuns. As espécies de E. coli são sensíveis à ampicilina, o que significa que essas
bactérias morrem na presença do antibiótico. Vamos aprender mais sobre esse assunto a seguir:
Neste método de clonagem, a maioria dos plasmídeos usados em clonagem molecular possuem o gene que codifica
resistência ao antibiótico ampicilina. Dessa forma, apenas as E. coli que adquiriram o vetor serão resistentes à ampicilina
e capazes de crescer em cultura. Portanto, usamos as colônias de clones bacterianos que cresceram em ampicilina, pois
apenas estes apresentam o vetor. Entretanto, precisamos, ainda, checar se nosso vetor está vazio ou se contém nosso
inserto.
Para isso, selecionaremos várias colônias para verificarmos mais uma vez se a clonagem molecular funcionou, usando a
PCR de detecção do DNA recombinante. Apenas os clones cuja banda do vetor-inserto estiver presente serão usados
para purificação do plasmídeo.
A purificação do plasmídeo recombinante é uma extração de DNA por coluna, a partir de bactérias, podendo ser feita
Após congelamento instantâneo de bactéria sensível a antibiótico, a parede celular fica permeável.
O plasmídeo é incubado com a bactéria e pode entrar mediante o choque térmico.Os clones que tiveram uma transformação bem-sucedida são capazes de crescer sob seleção, ou seja, tornam-se
resistentes ao antibiótico presente na placa pela aquisição do plasmídeo.
Seleção por antibiótico 
rapidamente com uso de kits. Uma vez purificado, um bom controle de qualidade é enviar o plasmídeo para
Sequenciamento Sanger, a fim de verificarmos se nosso inserto está incorporado de forma correta no vetor e se nenhuma
mutação indesejada ocorreu durante a duplicação bacteriana.
Neste método de clonagem, é possível distinguir visualmente não apenas quais colônias de clones bacterianos tiveram o
plasmídeo transformado com sucesso (com o uso de antibióticos), mas também quais clones tiveram
o inserto integrado ao vetor com sucesso.
Para entender como isso funciona, vamos conhecer alguns detalhes:
A bactéria E. coli possui uma enzima chamada beta-galactosidase, codificada por um dos genes presente em uma estrutura de
genes expressos contiguamente em um único mRNA chamado operon lac.
A expressão desse operon é induzida pela presença de lactose no meio e expressa a enzima beta-galactosidade; é reprimida
por um composto chamado IPTG (isopropil-beta-D-1-tiogalactopiranosideo).
Quando a beta-galactosidase é expressa, ela cliva (quebra) um composto, chamado x-gal, em galactose e em um corante azul
insolúvel.
A beta-galactosidase contém um segmento, chamado peptídeo-alfa, para ser funcional e clivar o x-gal.
No plasmídeo usado nesse sistema, a beta-galactosidase não contém esse segmento, mas ele está presente em outra região,
no sítio de clonagem múltipla (MCS). Esse é o sítio no qual o nosso DNA-alvo deve ser inserido.
Caso o inserto seja adicionado com sucesso, ele o fará no meio da sequência do peptídeo-alfa, impedindo que este último seja
expresso.
Portanto, a beta-galactosidase não será capaz de clivar x-gal, e o corante azul não será feito. Nesse caso, o inserto é detectado
pela falta do corante azul, o que torna a colônia de clones branca.
Caso o inserto não tenha sido inserido com sucesso, o gene do peptídeo-alfa permanece intacto, e a beta-galactosidase poderá
usá-lo e clivar x-gal, produzindo o composto azul. Dessa forma, as colônias negativas, em que a clonagem não ocorreu, serão
azuis.
Veja no esquema a seguir:
Esquema simplificado da seleção azul-branca. As colônias cujo inserto foi integrado ao plasmídeo crescem na cor branca.
A purificação do plasmídeo recombinante poderá ser feita e, apesar de não ser absolutamente necessária, é recomendável fazer
o sequenciamento do inserto.
Seleção azul-branca 

Clonagem molecular
Conheça agora um pouco sobre a clonagem molecular.
Falta pouco para atingir seus objetivos.
Vamos praticar alguns conceitos?
Questão 1
A tecnologia do DNA recombinante possui muitas aplicações em medicina, agronegócios e biotecnologia. Com relação ao
DNA recombinante, analise as afirmativas abaixo e assinale a alternativa correta.
I – As bactérias podem ser usadas como fábricas para proteínas de origens exógenas.
II – O DNA recombinante consiste na união de sequências de DNA de duas ou mais origens diferentes.
III – Podemos produzir vacinas seguras e eficazes a partir de leveduras, por meio da recombinação de DNA.
IV – A diabetes mellitus do tipo I pode ser controlada pelo uso de insulina produzida por tecnologia do DNA recombinante.
V – A clonagem molecular não é útil na modificação de organismos pluricelulares, pois não gera organismos estáveis.
A Apenas as afirmativas II e III estão corretas.
B Somente a afirmativa I está correta.
C Apenas as afirmativas III e IV estão corretas.
D Apenas as afirmativas I, II, III, IV estão corretas.
E Apenas as afirmativas IV e V estão corretas.
Parabéns! A alternativa D está correta.
Uma das maiores e mais lucrativas aplicações da tecnologia do DNA recombinante é o desenvolvimento de organismos
complexos, como plantas e animais, chamados de organismos geneticamente modificados.
Questão 2
Para a clonagem molecular, precisamos de um inserto, um vetor e um hospedeiro. Sobre a clonagem molecular, é correto
afirmar que
Parabéns! A alternativa A está correta.
Vetores de clonagem molecular são DNAs circulares extracromossomais, dispensáveis à sobrevivência da célula na
ausência de pressão seletiva, e que são replicados de forma independente por possuírem todos os elementos básicos à
replicação, como origem, promotores e terminadores.
A os plasmídeos são vetores autorreplicativos nos quais inserimos um DNA exógeno a ser clonado.
B
chamamos de transformação o processo de transformar organismo selvagem em geneticamente
modificado.
C bactérias não são bons organismos hospedeiros, pois são incapazes de fazer transformação.
D
as enzimas de restrição são usadas na clonagem para sintetizar novas sequências de DNA, pela sua
capacidade sintetase.
E os clones são selecionados baseados em sua semelhança fenotípica em microscopia ótica.
3 - Métodos de hibridização de ácidos nucleicos e
aplicações
Ao �nal deste módulo, você será capaz de identi�car os métodos de hibridização de
ácidos nucleicos, suas diferenças e aplicações na rotina do biologista molecular.
Técnicas de hibridização
As técnicas de hibridização consistem na identificação de sequências de DNA fita simples ou RNA específicas por meio de seu
pareamento por complementariedade – ou hibridização – com sequências sintéticas. O termo hibridização pode ser, por vezes,
equivalente ao pareamento por complementariedade. Assim, pode-se dizer que os oligonucleotídeos iniciadores hibridizam com
o DNA-alvo em uma PCR. Para definirmos melhor o conteúdo a ser abordado neste módulo, vamos falar de técnicas de
hibridização que não se baseiam na amplificação do DNA pela Taq polimerase.
Para detectar o DNA fita simples ou RNA nesse grupo de técnicas, usamos oligonucleotídeos marcados, chamados de sondas.
Na maioria das aplicações de técnicas de hibridização, desenhamos sondas que cubram a maior extensão possível de nosso
gene, sequência ou mensageiro de interesse.
Tais sondas podem ser curtas ou longas, e são normalmente marcadas com isótopos radioativos,
enzimas, anticorpos, substratos ou com fluoróforos, dependendo da técnica em questão.
Dessa forma, podemos classificar os métodos de revelação em dois tipos de métodos:
Diretos
As sondas são marcadas diretamente com o emissor de sinal (por exemplo, radioisótopos ou fluoróforos) e são, portanto,
proporcionais à quantidade de moléculas existentes na amostra analisada.
Indiretos
As sondas estão marcadas com agentes intermediários que são usados para aumentar o sinal emitido (como enzimas,
substratos e anticorpos).
Técnicas de transferência (blottings)
Existe um grupo de três técnicas de hibridização chamadas blots (manchas, em inglês), que são baseadas na separação das
macromoléculas alvo (DNA, RNA ou proteínas), desnaturação e transferência para uma membrana porosa que permitirá
a hibridização com as sondas para revelação. Vamos conhecer cada uma dessas técnicas em detalhes a seguir.
Southern blotting
Criada pelo bioquímico britânico Edwin Southern, em 1975, recebe o seu nome. Nessa técnica, identificamos sequências
específicas de DNA. Para isso, precisamos, primeiro, extrair o DNA total da nossa célula ou do tecido e digeri-lo usando enzimas
de restrição. Uma vez que o DNA tenha sido fragmentado, podemos separá-lo usando eletroforese, que pode ser feita em gel de
agarose ou em poliacrilamida, dependendo da resolução que se queira. Em suma, a eletroforese é feita da mesma forma que a
usada para ler o produto da amplificação de uma PCR, e podemos ler seu resultado ao adicionarmos brometo de etídio ao gel.
Atenção!
Lembre-se de que a eletroforese separa as moléculas de DNA de acordo com o tamanho através da sua migração pelo gel em
direção ao polo positivo (ou cátodo), que acontece quando ele é submetido à corrente elétrica em tampão aquoso.
Após a separação por eletroforese e leitura em transiluminador ultravioleta, o DNA é desnaturado (em fitas simples)em solução
alcalina por cerca de meia hora, e então é neutralizado de volta a pH 7. Então, podemos proceder para a transferência do DNA do
gel para a membrana porosa, feita de nitrocelulose ou nylon.
Para isso, precisamos montar uma espécie de sanduíche, no qual as duas “fatias de pão” são placas de vidro, cada uma
acompanhada por papel absorvente do lado de dentro, e o gel em contato com a membrana porosa como “recheio”. O sanduíche
deve sempre ser montado dentro de uma cuba contendo o tampão de transferência, de forma que todos os componentes fiquem
encharcados e nenhuma bolha de ar fique presa. Isso porque as bolhas de ar impedem a transferência, formadas quando o
tampão aquoso é submetido a corrente elétrica – por isso, usamos papel absorvente para manter a membrana e o gel em
contato com o tampão durante todo o período de transferência, que pode levar mais de três horas dependendo do tamanho dos
fragmentos digeridos. Após a transferência, o DNA fica fixado na membrana, que pode ter seus sítios de ligação inespecífica
bloqueados e pode ser armazenada por longos períodos em geladeira.
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Para a etapa de hibridização propriamente dita, usamos sequências conhecidas, as sondas. As
sondas são complementares às sequências-alvo e se anelam a elas, fazendo parte do sistema de
detecção do sinal. Tanto as sequências-alvo quanto as sondas podem ser feitas de DNA ou de RNA.
Originalmente, eram usadas sequências de RNA produzidas em células a partir de DNA recombinante e tratadas
momentaneamente com radioisótopos – por isso, a técnica era chamada de hibridização, pelo uso de híbridos de DNA-RNA.
Com o uso de oligonucleotídeos sintéticos, as sondas de DNA têm substituído as de RNA, pois são mais estáveis que as últimas.
A membrana deve ficar imersa em solução contendo a sonda, em agitação, por pelo menos uma hora. Após essa incubação, a
membrana é lavada, e todas as sondas que não se ligaram por complementariedade ao DNA desnaturado em fita simples serão
removidas do sistema, restando apenas aquelas que se anelaram ao DNA.
Etapas de separação, transferência e hibridização doSouthern blotting, para identificação de DNA.
A leitura da hibridização dependerá da forma como as sondas foram marcadas. Caso tenhamos usado radioisótopos,
precisamos revelar usando filmes de raios X, em que a radioatividade marcará uma impressão.
Atenção!
Caso decidamos usar sondas fluorescentes, colorimétricas ou quimioluminescentes, precisamos revelá-las de acordo. Essas
últimas opções são preferíveis à primeira, por serem mais seguras para o manipulador e o meio ambiente.
Na revelação colorimétrica, a sonda está marcada com um substrato que é usado por uma enzima, em uma etapa adicional, para
produção de um composto colorido. Assim, a posição da sonda pode ser visualizada a olho nu. As sondas fluorescentes
precisarão de leitura em aparelho especializado, que excitará o fluoróforo e permitirá a identificação do local onde a sonda está.
No método quimioluminescente, temos uma enzima que catalisa uma reação, cujo produto emite luz em determinado
comprimento de onda (dependendo de qual enzima reveladora for usada) e, por isso, também precisamos de aparelho para
leitura da reação.
Northern blotting
Northern blotting é uma técnica de hibridização para identificação de sequências específicas de RNA, dentre uma mistura
complexa de ácidos nucleicos, cujo nome é derivado da técnica desenvolvida para DNA (Southern blotting).
O Northern blotting pode ser usado para avaliar a presença e a quantidade da expressão de determinado gene, assim como
avaliar se o mRNA está associado a proteínas, após a purificação das últimas. Os mesmos princípios da técnica de Southern
blotting são usados para o Northern blotting. Conheça:
Primeiro, vamos desnaturar e separar o RNA total extraído por eletroforese em gel de agarose contendo
formaldeído − um composto químico que usamos para fixação e preservação da amostra, que é especialmente
útil quando trabalhamos com RNA.
Observe os detalhes na imagem a seguir:
Esquema ilustrando a técnica de Northern blot.
Hibridização in situ
A hibridização in situ (in situ hybridization – ISH) foi uma das primeiras técnicas de biologia molecular a ser aplicada ao
diagnóstico clínico de doenças. Ela permite a detecção e a quantificação de ácidos nucleicos em cortes histológicos especiais e
cultivos celulares e nos informa onde o ácido nucleico investigado está localizado dentro da célula e do tecido.
A ISH tem sido usada para diagnóstico citogenético e de doenças infecciosas, como no caso da infecção pelo papilomavírus
humano (HPV), causador do câncer do colo do útero, em cérvice uterina. Outros exemplos de aplicação da ISH incluem a
detecção de cromossomos aberrantes, com alterações como duplicações, deleções e inserções genômicas que não deveriam
existir e que podem causar doenças, como ocorre na distrofia muscular de Duchenne, na fibrose cística e em alguns tipos de
câncer.
Hibridização in situ de RNA - Melanoma Humano em Seção de Tecido fixado em formalina e embebido em parafina.
A ISH originalmente usava isótopos radioativos para marcação das sondas. Porém, com o desenvolvimento de marcadores
fluorescentes mais seguros, a ISH evoluiu para FISH (fluorescent in situ hybridization, ou hibridização in situ fluorescente). As
outras abordagens de leitura do sinal vistas nos blottings, como quimioluminescência e colorimetria, também podem ser usadas
em ISH, porém são menos difundidas que a FISH.
Já que trabalhamos com tecidos ou células em cultivo, a leitura dos resultados normalmente é feita em microscopia. Para isso,
precisamos ter um microscópio de fluorescência, capaz de excitar os fluoróforos e detectar o local de emissão da fluorescência
com a precisão necessária ao sistema. Nesse caso, podemos usar microscópio com precisão na casa de nanômetros, ou seja,
na casa de bilionésimo de um metro, algo em torno de 0,000000001 metro, observe os detalhes na imagem:
Representação esquemática das etapas da hibridização in situ fluorescente.
Em seguida, vamos transferi-lo do gel para a membrana de nitrocelulose ou nylon. Para isso, montamos o mesmo
sanduíche, contendo a membrana e o gel no meio, dentro de folhas de papel absorvente e com as placas de vidro
como “pão”.
Após a transferência ocorrer e fixarmos o RNA, passamos à etapa de hibridização das sondas e revelação do
resultado, de acordo com a marcação das sondas usadas
O primeiro ponto que avaliamos em uma IHS ou FISH é o desenho da sonda. Caso queiramos identificar uma sequência, um
gene ou um mRNA longo, podemos usar dezenas de sondas curtas, de cerca de 20 pb cada uma, que se anelem ao longo da
sequência-alvo. Isso dá grande especificidade ao método, além da ótima sensibilidade dada pelo aumento do sinal emitido, já
que todas estarão marcadas.
Caso desejemos detectar uma região muito curta, na qual não poderemos sintetizar e anelar dezenas de sondas diferentes,
podemos usar uma técnica chamada de branched-FISH (ou FISH ramificado). Nessa técnica, usamos oligonucleotídeos que
tenham duas regiões:
Primeira região
É complementar à sequência-alvo, presente no tecido ou na célula.
Segunda região
É usada como alvo para as sondas marcadas se anelarem, essa é mais longa.
Com isso, conseguimos aumentar o sinal de detecção da sequência-alvo.
Como em outras técnicas de hibridização, na ISH ou FISH, precisamos desnaturar o DNA fita dupla em fitas simples. Como agora
estamos trabalhando com tecidos ou células fixados e aderidos a uma lamínula de microscopia, não podemos usar agentes que
destruam o tecido, como acontece se tratarmos ele com tampões extremamente alcalinos.
Atenção!
Por isso, a desnaturação do DNA normalmente é feita por calor controlado, de forma a não destruirmos a célula ou o tecido. Se
nosso ácido nucleico-alvo for RNA, não poderemos usar calor, então utilizamos um composto químico chamado de formamida
para desnaturação de proteínas que possam estar ligadas ao RNA, liberando-o para ahibridização.
Precisamos ainda considerar como as sondas entrarão nas células, e isso depende diretamente do material que estamos
usando e da natureza das células. Se estivermos fazendo FISH para células ou tecidos de mamíferos, permeabilizamos as
membranas plasmáticas usando álcool (etanol) e detergentes suaves (Triton 0.1%). Caso trabalhemos com leveduras,
precisamos permeabilizar uma estrutura mais resistente, a parede celular, o que fazemos usando digestão enzimática da parede.
Finalmente, podemos fazer a hibridização, ao incubar nossa amostra fixada, desnaturada e permeabilizada com as sondas
marcadas. Após lavagens para remover o excesso de sondas, podemos montar nossa lâmina de microscópio e observar a
presença de nosso DNA ou RNA-alvo ao excitarmos os fluoróforos das sondas e detectarmos o sinal emitido por eles. Em
muitos casos, vamos querer obter imagens e salvá-las, para não somente detectar a presença ou ausência do sequência-alvo,
mas também quantificar o sinal e sua intensidade, determinar sua localização, analisar os dados e emitir os resultados,
conforme demonstrado na imagem a seguir.
Esquema ilustrando a FISH usando como agente desnaturante a formamida e um sistema de revelação pelo método indireto (com a utilização de um anticorpo).

Técnicas de hibridização
Conheça um pouco mais sobre as técnicas de hibridização.
Falta pouco para atingir seus objetivos.
Vamos praticar alguns conceitos?
Questão 1
As técnicas de hibridização de DNA e RNA foram umas das primeiras a serem usadas e aplicadas em biologia molecular.
Sobre hibridização, selecione a opção correta.
Parabéns! A alternativa E está correta.
A
As técnicas de blotting baseiam-se na separação de DNA ou RNA amplificados in vitro e na transferência
para membranas de nitrocelulose.
B
O northern blot foi desenvolvido para separação e identificação de proteínas, DNA e RNA, podendo ser usado
igualmente para as três moléculas.
C
As amostras usadas em técnicas de hibridização devem estar frescas e as células, vivas, senão a técnica
não irá funcionar.
D
As moléculas-alvo de hibridização precisam estar fixadas em suporte de vidro, encharcadas em tampão,
para que a hibridização aconteça.
E
A hibridização corresponde ao anelamento por complementariedade entre uma sonda marcada e o ácido
nucleico da amostra.
As técnicas de hibridização baseiam-se na capacidade de bases nitrogenadas em uma fita simples formarem pontes de
hidrogênio com bases nitrogenadas de outras fitas de forma específica. Conhecemos essa capacidade como pareamento
por complementariedade e a identificamos pela marcação das sondas para identificação posterior.
Questão 2
A hibridização in situ (ISH) é usada no diagnóstico de diversas doenças genéticas e infecciosas. A respeito da ISH e suas
variações, leia as afirmativas abaixo e assinale a alternativa correta.
I. As sondas são desenhadas de forma a cobrirem a menor área possível do gene ou sequência-alvo.
II. As sondas são marcadas com radioisótopos, enzimas, substratos ou fluoróforos para posterior identificação.
III. As ISH são úteis para a detecção, localização e quantificação da sequência-alvo.
IV. A hibridização in situ fluorescente (FISH) exige leitura em microscópio de fluorescência para obtenção dos resultados.
V. Na FISH, usamos agentes desnaturantes dos ácidos nucleicos, como o calor, e fixadores, como o formaldeído.
Parabéns! A alternativa B está correta.
As sondas usadas em ISH são sequências de DNA curtas e marcadas. Para que tenhamos a especificidade – dada pela
ligação das sondas ao DNA-alvo – e sensibilidade – dada pela capacidade de detecção do sinal −, precisamos usar o
máximo de sondas marcadas, o que significa que o máximo do gene deve estar coberto por sondas.
A Somente as afirmativas I, II e III estão corretas.
B Somente as afirmativas II, III, IV e V estão corretas.
C Somente as afirmativas II e III estão corretas.
D Somente as afirmativas III e IV estão corretas.
E Somente as afirmativas IV e V estão corretas.
Considerações �nais
Neste conteúdo, aprendemos como as grandes contribuições do conhecimento do genoma humano e de outros organismos
foram feitas pelas técnicas moleculares. Vimos também o sequenciamento, um conjunto de diferentes técnicas que visam
descobrir a sequência de nucleotídeos presentes no DNA. Dentre esse conjunto de técnicas, exploramos o sequenciamento
Sanger e o sequenciamento de nova geração.
Visitamos também a tecnologia do DNA recombinante, aprendendo todas as etapas da clonagem molecular, a escolha do
segmento de interesse, do vetor, da estratégia de inserção e de clonagem (por restrição ou livre de restrição), a transformação,
seleção dos clones recombinantes e sua multiplicação. Por fim, entendemos as técnicas de hibridização, que consistem na
identificação de sequências de DNA fita simples ou RNA específicas pelo pareamento por complementariedade com sequências
sintéticas, abordando as técnicas de transferências, Southern blotting e Northern blotting. Além disso, conhecemos a técnica de
hibridização in situ.
O sequenciamento, a clonagem e a hibridização de ácidos nucleicos permitiram avanços importantes na ciência e como esses
conhecimentos são aplicados em saúde, agropecuária e biotecnologia.
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Para saber mais sobre os assuntos tratados:
Assista ao vídeo:
Aulas sobre sequenciamento, no canal de Siomar Soares, da Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM).
Pesquise na internet:
O tópico de Biotecnologia e Clonagem de DNA, em conteúdo de Biologia, no site da Khan Academy.
Referências
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BAJPAI, B. High Capacity Vectors. Advances in Biotechnology. 2013.
CRONAN, J. E. Escherichia coli as an Experimental Organism. eLS, John Wiley and Sons, 2014.
FARACK, L.; ITZKOVITZ, S. Protocol for Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization for Intact Pancreatic Tissue. STAR
Protocols, 2020.
GRIFFITHS, J. Recombinant DNA. Encyclopædia Britannica, 2020.
HEATHER, J. M.; CHAIN, B. The sequence of sequencers: The history of sequencing DNA. Genomics 1 (107): 1-8.
HUBER, D. et al. Fuorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH? Micro
and Nano Engineering, 2018.
LIAO, Y. et al. RNA Isolation and Northern Blot Analysis. Bio-protocol, 2014.
SACRAMENTO STATE. Southern blotting: Probe labeling and Detection. Consultado na internet em: 6 nov. 2020.
SCITABLE BY NATURE EDUCATION. Plasmid definition. Consultado na internet em: 30 out. 2020.
SOUTHERN, E. Southern blotting. Nature protocols, 2006.
VAN DEN ENT, F.; LOWE., J. RF cloning: A restriction-free method for inserting target genes into plasmids. Journal of Biochemical
and Biophysical Methods, 2006.
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