Sexagem molecular em aves silvestres (Artigo) Autor J N Vieira, E G A Coelho e D A A Oliveira

Rev Bras Reprod Anim, Belo Hori zonte, v.33, n.2, p.66-70, abr ./jun. 2009. Disponível em www.cbra.org.br _________________________________________ Recebido: 18 de julho de 2008 Aceito: 22 de fevereiro de 2010 Sexagem molecular em aves silvestres Molecular sexing in wild birds J.N. Vieira 1,3 , E.G.A. Coelh o 2 , D.A.A. Oliveira 2 1 Curso de Pós-Graduação, Departamento de Zootecnia , Escola de Veteri nária da UFMG, Belo Horizonte , MG, Brasil 2 Escola de Veteriná ri a da UFMG, Belo Ho rizonte, Belo Horizonte, MG , Brasil 3 Correspondência: nobrevieira.j@gmail.com Resumo A identificação do sexo em aves s ilvestres é im prescindível para a produção e com ercialização destas em criadouros conservacionistas ou comerciais. Estima-se que cerca da metade das espécies existe ntes no m undo não possui dimorfismo sexual e, quando existe, é geralmente sutil, p odendo ocorrer somente a partir do período de maturidade sexual. Por meio da técnica da PCR, é possí vel realizar a sexagem pela detecção dos genes CHD- Z e CHD-W, que e stão localizados nos cromossom os sexuais de todas as aves . O CHD-W, localiz a-se no cromossom o W, somente nas fêm eas, e o gene CHD-Z é enco ntrado no crom ossomo Z, ocorrend o em ambos os sexos. A técnica é simples, conveniente, barata, rápi da e segura, po dendo apresentar vári as vantagens, com o: reduz custos de manutenção de aves jovens, evita a formação de casais do mesm o sexo, ou entre pare ntes próximos ou casais ao acaso, facilita o m anejo genético em criações c om sistema de produção de aves por separação por sexo. Palavras-c have: identificação do sexo em aves, PCR, CHD-W e CHD-Z . Summary Sex identification in wild birds is essen tial for the production and marketing o f these in conservation or breeding busi ness. It is esti mated that a pproximately half of the species in the world has no sex ual dimorp hism, and where there i s usually subtle and m ay only occur from the perio d of sexual maturity. Thro ugh the technique of PCR is possible to de tect the genes CHD-Z and CHD-W, located in the sexual chromosomes of a ll the birds. The gene CHD-W is located on the W chromosome, only in females and the gene CHD-Z is found on the Z chromosome occurring in both sexes. The technique is simp le, convenient, che ap, fast and safe and may provide several advantages, such as reduction costs of maintenanc e of young bir ds to prevent t he formation of same-sex couples, or between close relatives o r couples at random , to facilitate management in g enetic creations with poultry production system for separation f or sex. Keywords: avi an sex identification, PCR, CHD-W and CHD-Z. Introdução Segundo o Comitê Brasileiro de Registros Orn itológicos (CBRO), o Brasil possui cerca de 1.801 espécies de aves, que re presentam 20% das 9. 000 espécies existentes n o mundo. É o t erceiro país em diversidade de aves (atrás apenas da Col ômbia e do Peru). No entant o, é o prim eiro em número de espécies em extinção. Das 1.212 aves ameaçadas no m undo, 120 estão no país ( Espécies ..., 2009). Também é considerado com o um dos países com maior porce ntagem de espécies endêm icas (10% ), o que o torna um dos mais im portantes em relação a investim entos em preservaçã o de aves (All gayer e Cziulik , 2007). A crescente degra dação do meio am biente provoca da por desmatam entos, construçõe s de barragens, poluição quím ica produzida p or indústrias e po r acidentes com derram amentos de óleo, assim como o própri o desenvolvim ento de centros urbanos oc upando áreas progre ssivamente m aiores, vêm causan do redução e fragmentação de inúm eros ecossistemas. Como conseq uênc ia direta desses fatos, muitas espécies de aves caminham para a extinçã o (Almeida, 2003), com o é o caso das duas es pécies já extinta s no Brasil, o Mutum do nordeste (Mitu mitu) e a Ararinha azul (Cyanopsitta spixii) ( Espécies ..., 2009). O Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e d os Recursos Naturais Renováveis (IBAMA), por meio das Portarias 117 e 118, de 15 de outubro de 1 997, que normatiz am a criação em cativeiro de espéci es nativas e a comercialização de animais vivos e abatidos, além de pa rtes e produtos da fauna na tiva, propiciou que, nos últimos anos, houvesse um incremento na criação legal desses anim ai s. Essas portarias visam colaborar com a conservação da fauna brasileira e c ombater o comércio clandestino de animais silvestres. Acre dita-se que o comércio ilegal deverá reduzir progressivamen te à medida que exista a possibilid ade de aquisição de animais de maneira lícita e confiável, com docu mentação correta, sa úde, origem cont rolada e nascim ento em cativeiro. A regulament ação de criadouros con servacionistas pel o IBAMA trouxe um a nova visão do concei to de reproduçã o Vieira et al . Sexagem molecu lar em aves s ilvestres. e manutenção de aves silve stres em ca tiveiro (Allgayer e Cziulik, 2007). A sexagem das aves é uma prática de extrema im portância , visto que pelo m enos metade da s aves existentes no mundo não poss ui dimorfismo sexual e, quando e xiste, é geralmente sutil, podendo ocorrer somente a parti r do período de m aturidade sexual. O dimorfism o sexual é uma caracterí stica fenotípica observada ent re machos e fêm eas de uma mesm a espécie, difere nciando-os em al guns aspectos com o tamanho ou coloração das penas e/ou bicos (Pough e H arvey, 1999). Dentre as aves qu e não apresentam dimorfismo sexual, estão o Fura-barreira ( Hylocryptus rectirostris ) (Faria et al., 2007), o Papagaio-v erdadeiro (Amazo na aestiva) , o Periquito/Maritaca (Aratinga sp.), a Arara ( Ara sp.) e o Tucano ( Ramphastos toc ) (Miyaki et al. 1998; Allgayer e Cziulik, 2007 ). Já entre as que apresentam o dim orfismo, estão o Ta ngarazinho (Ilicura militaris), cujos machos adultos são re conhecidos por sua plumagem (Anciães e Nassif Del Lama, 2002), e o Galito ( Alectrurus tricolor ), cujo macho possui c oloração alvinegra, um \u201cV\u201d bra nco no lado superior e um a faixa peitoral negra incompleta, e a fêm ea é parda, com asas e cauda m ais escuras e garganta branca (Cestari, 2006). Entretanto, na maioria dos ca sos, o sexo é determinado pela identificação dos c romossomo s sexuais (Griffiths et al., 2002). Os vertebrad os apresentam duas categorias de cr omossomos, os autossomos e os sexuais. A m aioria dos cromossom os em um genom a é de autoss omos, que const am de cópias materna e pat erna destes e, portanto, são idênticos. Os cromossomos sexuais são f ormados por ap enas um par, mas são bem distintos entre si (Ohno, 1967, citado por Griff iths, 2000; Griffiths et al., 2002). Nas aves, os crom ossomos sexuais Z e W aprese ntam os genes CH D-Z e CHD-W (CHD: chromo- helicase-DNA -binding ). O gene CHD -Z é encontra do no crom ossomo Z, ocorrendo em ambos os sexos, e o ge ne CHD-W localiza-se no crom ossomo W, pres ente som ente nas fêmeas (Griffiths et al . , 1998). O crom ossomo Z tem o tam anho muito uniform e para todas as espécies, m as o crom ossomo W varia de tam anho na maiori a delas (Fridolfsson e Ellegren 2000; Ezaz et al., 2006). Apenas na s aves ratitas (Ordem Struthioniphorme), os cromossomos sexuais Z e W são morfol ogi camente sim ilares aos autosso mos, mostrando pequena diferença no tamanho (Tag aki et al., 1972, citados p or Griffiths et al., 1998; Ansari et al ., 1988). Nessas espécies, a única diferença existe nte entre os cromossom os sexuais está na ausência do gene DM RT1 ( Doublesex and Mab-3 Related Transcriptio n Factor 1) no cromossom o W, pois am bos os crom ossomos têm o gene IREBP ( Iron- responsive elemente -binding port ein ). Já nas outras espéci es de aves, além da di ferença do tam anho dos cromossomos, o W tem somente o gene CHD-W, enquan to o Z tem o DMRT1, o IR E BP e o CHD-Z (Ezaz et al., 2006; Fig. 1) . O gene DMRT 1 foi mapeado na re gião do br aço curto do crom ossomo Z e codifica proteínas que controlam o desenvolvim ento sexual bem com o o fenó tipo dos machos. Já o gene I REBP, que possui um a proteína resp onsável pela regulaçã o do ferro no m RNA, está locali zado na região do braço longo dos cromossomos Z em todas as espécies e tam bém no W em ratitas (Ellegren, 2002). Figura 1. Morfologia dos cromossomos sexuais d e aves (ratitas e outras espécies de aves ). Fonte: Ezaz et al. (2006). Evolução e determinaç ão dos cromossomos sexuais As espécies de aves e mamíferos apresenta m os cromossom os sexuais bem diferenci ados na sua base filogenética ( Artoni et al., 20 00). A hipótese da ev olução dos crom ossomos sexuais de ve rtebrados é que o sistema XY de mamíferos pode ter sido originado dire tamente do sistema ZW do ancestral réptil e não do Rev Bras Reprod Anim, Belo Horiz onte, v.33, n.2, p.66-70, abr ./jun. 2009. Disponível em www.cbra.org.br 67 Vieira et al . Sexagem molecu lar em aves s ilvestres. ambiente. Po rtanto, faz-se necessári o um importa nte e re levant e estudo de cromossom os sexuais de vertebra dos dos sistemas XY de m amíferos e ZW de serpentes e de av es, bem com o de algum as espécies de peixes, anfíbios e répteis a ambos os sistem as (Modi e Crews, 2005; Ezaz et al., 2006). A maioria dos vertebrados te m os indivíduo s separados sexualm ente, mas o sexo é dete rminado por d ois diferentes caminhos, pelo am biente e pelo genótipo (Ezaz et al., 2006). Mu itas espécies de peixes e répteis utilizam a temperatura/ambiente para a determ inação do sexo (Ezaz et al., 2006 ; Uller et al., 2007). No entanto, em outras espé cies dessas mesmas cla sses de vertebrados bem como em todos os anfíbios, aves e mamí feros, o sexo é determinado ge neticamente (Ezaz et al., 2006). A transiçã o entre a determinação genética do sexo e a determinação pela temperatura/am biente pode ocorrer rapidam ente e durante o estágio interm ediário/transitório, sendo que tant o os fatores g enéticos quant o os ambient ais influenciam na determi nação de sexo (Ulle r et al., 2007). A árvore filogenética de determin ação do sexo, Fig. 2, mostra que espécies de peixes, quelônios e lagartos têm o sexo determ inado tanto de form a genética quanto tem peratura-depe ndente, pode ndo ser pel os sistemas XY ou ZW, enquant o os anfíbi os possuem o sexo determinado a penas geneticam ente e também apresentam ambos os sistem as. Os cr ocodilianos têm a determ inação do sexo temperatura-de pendente, enquanto serpentes e aves (sist ema ZW) e mamí feros (sistema XY) t êm o sexo defini do genetic amente (Modi e C rews, 2005). Entre as espécies que usam a genética como dete rm inante do sexo , os machos po dem ser hetero gamétic os (XY) ou h omogaméticos (Z Z), enquanto as fêmeas po dem ser hom ogaméticas (XX) e heterogam éticas (XY) (Griffiths et al., 1998; Modi e Crews, 2005; Ezaz et al., 2006). As espécies com cromossom os sexuais heterogam éticos têm ní veis iguais da expressão de ca da gene, p ois um sexo tem somente um a cópia, ZW ou X Y, e o outro se xo tem duas c ópias de um cromossom o em particul ar, ZZ ou XX ( Modi e Crews , 2005). Os cromossom os sexuais Y e W, determ inantes do sexo m asculino e femi nino, respectivam ente (Schartl, 2004), s ão altamente het erocromátic os e, consequentement e, menores que os X e Z, respectivamente (El legren, 2000; Dua n e Fuerst, 2001; Charles wor th e Charlesworth, 2005; Ezaz et al., 2006). Rev Bras Reprod Anim, Belo Horiz onte, v.33, n.2, p.66-70, abr ./jun. 2009. Disponível em www.cbra.org.br 68 Figura 2. A filogeni a dos vertebrados que ilust ra as formas da determinação de sexo. \u201cFêm ea\u201d e \u201cmacho\u201d têm a determinação genética do sexo (GSD) com fêmeas e machos heterogam éticos, respectivam ente. O ESD/STD represe nta a determinação de sex o temperatura-de pendente. Fonte: Modi e Crews (2005). Importância da sexagem A identificação do se xo em aves monom órficas é fundamental para o sucesso reprodut ivo de espécies silvestres mant idas em cativeiro (R aso e Werther , 2004), sendo t ambém um a ferramenta vali osa para os est udos comportame ntais e populacionais em espécies sem dimorfismo sexual apar ente, ass im como em criatórios conservacionistas e comerciais (Faria et al., 2007). A sexagem apresenta vári as vantagens, com o: reduz custos de manutenção de aves jove ns, uma vez qu e a identificação do sexo pouc os di as após o nascimento fa cilita sua comercialização; evita a formação de casais do mesmo se xo, ou entre parentes próxim os ou casais ao acaso; facilita o manejo em criações com sistema produção de aves por separação por sexo (Grando, 2002). O manejo da s aves signifi ca não apenas a c onduç ão da criação em si (acasalamento, postura, alimentação), mas tam bém o manejo genético (seleção de casais visando a m elhores resultados) (Silva, 2005). Para tanto, há necessidade de se tom ar o cuidado com a formação de futuros casais, pois a endogam ia pode Vieira et al . Sexagem molecu lar em aves s ilvestres. provocar a diminuição da heterozigose e, consequent emente, aum ento da hom ozigose, que pode ocorrer tanto em genes dominantes qua nto em recessivos, sendo necessário que ha ja a seleção se estes são preferidos em relação aos heterozigotos. Ao reduzir a hetero zigose, pode-se favorecer a ocorrência de genes re cessivos indesejáveis ou de efeitos deletérios. A perda da variabilidade genética em populações pequenas tende a ocorrer aleatoriamente, causando mudanças nas frequências alélicas e genotípicas , fixando alguns alelos e elim inando outros, processo este denominado deriva genética. A maioria desses genes está relacionada com redução da fertilidade, aumento da mortalidade , aumento de doenças devi do à dimi nuição da resistência e do vigor híbrido e a umento do val or genético adapt ativo (Falcone r, 1970; Pereira, 2 004). Portanto, a m anutenção das carac terísticas genét icas é de suma importância. Para a realização do teste de sexagem em aves silvestres via técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR ), faz-se a extração do DNA de penas e/ou de sangue , seguindo os p rotocolos de Sam brook et al . (1989) e Rudbek e Dissing (1998), respectivamente. É importante ressalt ar que a coleta das pen as e/ou do sangue das ave s é minim amente invasiva (G riffiths et al., 1998). Os produtos da PCR dos genes CHD-Z e CHD- W podem ser discrim inados pela prese nça ou ausência de sítios de restrição específico s por meio da enzima ou pela extens ão de seus íntrons (Anciães e Nassif Del Lama, 2002) . Embora o DN A codificant e seja conser vado, os com primentos dos DNAs não codi ficantes diferem entre si. Como os ta manhos dos dois pr odutos da PCR do CHD-W e do CHD-Z sã o diferentes, macho s e fêmeas são facilmente identificados . No caso da extens ão de seus íntrons, a fêmea que possui os dois crom ossomos diferentes, W e Z, m ostrará duas bandas no gel, caracter ística de heterozigot o; enquanto o macho, possuindo apenas um t ipo de cromosso mo, o Z, most rará uma única banda , pois é hom ozigoto (Griffi ths et al., 1998; Fridolfsson e Ellegren, 2000; Griffith s, 2000). É importante obser var que o tamanho dos pares de base (pb) em relação aos alelos do sexo pode variar de e spécie para espécie, como é mostrado na Fig. 3. Quando se usa a enzima de restrição, a fêm ea apresenta três bandas, e o m acho duas (Griffiths et al ., 1998; Anciães e Nassif Del Lama, 2002) . Isso porque a enzima corta o gene CHD-Z que está localizado no c romossomo Z. Figura 3. Gel de poliacrilamida 8%, mostrando o resultado da sexa gem em aves via PCR pela extensão do s íntrons : um alelo representa o m acho/M (nº s 3, 5 e 7), e dois alelos a fêmea/F (nº s 2, 4 e 6) . Na canaleta 1, est á o peso m olecular/PM pGEM® (Promega). A PCR é uma técnica simples, conveniente, barata, rápi da, sensível e eficaz para identificar o sexo das aves e depende nte de pequena am ostra de DNA (Gri ffiths et al., 1998; Griffiths, 2000). Após o material chegar ao laboratório, o resultado pod e ser obtido em apenas dois dias e com um custo que oscila entre R$10,00 e R$20,00, de pendendo do la boratório de escolha e da qua ntidade de exam es solicitado. Já o preço das aves pode ser bastante elevado. Para se ter uma ideia sobre o valor comercial das aves silvestres ou exóticas, pode-se citar o caso das aves canoras, cujo preço pode variar de espécie para espécie e dentro da própria espécie em função da idade, sexo, tipo de canto e filiação . Por exemplo, um Azulão macho ( Passeri na brissonii ) chega a custar R$500,00, e a fêm ea R$200,00. O p reço dos Bicudos ( Oryz oborus c. maxi miliani ) e Curiós ( Ory zoborus angolensis ) pode variar entre R$80 0,00 e R$10.000,00, dependendo do tipo de canto. A variação de preços de Trinca-ferro ( Saltator similis ) e Sabiá-laranjeira ( Turd us rufiventris) é de R$200,0 0 a R$3.000,00. Em d iversas espécies da ordem Psittaciphorm e, a oscilação de pr eços é de R$600,00 a R$15.000,00, podendo alcançar valores superiores. Como o valor do teste é baixo, torna-se frequente a identificação do sexo em 100% das aves de um criador por meio da PCR , pois um erro na se xagem tradici onal pode comprom eter toda a históri a individual, bem com o a do casal prédeterm inado. Rev Bras Reprod Anim, Belo Horiz onte, v.33, n.2, p.66-70, abr ./jun. 2009. Disponível em www.cbra.org.br 69 Vieira et al . Sexagem molecu lar em aves s ilvestres. Rev Bras Reprod Anim, Belo Horiz onte, v.33, n.2, p.66-70, abr ./jun. 2009. Disponível em www.cbra.org.br 70 Referências bibliogr áficas Allgayer MC, Cziulik M . Reprodução de psitacídeos em cativeiro . Rev Bras Reprod Anim, v.31, p.344- 350, 2007. Disponível em: www.cbra.org.br/publicacoes/rbra.do Almeida MA . 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