04b - Caracterizaçao de NMs - parte II

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17/09/2023
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Caracterização físico-química de 
nanocarreadores
Prof. Dr. Bruno Fonseca-Santos
Por quê caracterizar?
 Tamanho, forma e distribuição de partícula
 Rugosidade e topografia de partículas
 Área superficial e ligantes na superfícies
 Estabilidade (aglomeração, dispersão, …)
 Reatividade e/ou toxicidade em meio biológico
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Técnicas de caracterização
Métodos de caracterizaçãoPropriedades de NPs
Espalhamento de luz dinâmicoMorfologia
Microscopia eletrônica (transmissão/varredura)
Microscopia de força atômica
Análise de Rastreamento de Nanopartículas
Difração de raio-XTopografia (superfície)
Espalhamento de Raio-X à Baixos Ângulos
Brunauer–Emmett–Teller (BET)
Técnicas de caracterização
Métodos de caracterizaçãoPropriedades de NPs
Espectroscopia de fotoelétrons excitados por 
raios X (XPS)
Ligantes à superfície
Espectroscopia no Infravermelho 
Ressonância Magnética Nuclear
Espectroscopia Raman
Potencial zeta
Análise de Rastreamento de NanopartículasConcentração
Espectroscopia no Ultravioleta
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Técnicas de caracterização
Métodos de caracterizaçãoPropriedades de NPs
Difração de raio-XCristanilidade
Calorimetria Exploratória Diferencial
CentrifugaçãoCarregamento
Ultracentrifugação
Diálises
Ultrafiltração
Cultura celular/Métodos alternativosBiológica
Modelos in vivo
Espalhamento de Luz
 Movimento Browniano ⇒ determinação do tamanho
 Laser ⇒ espalha no objeto 
 Homogeneidade ⇒ índice de polidispersão
 Limitação ⇒ não avalia morfologia
 Angulação ⇒ diferentes tamanhos
 Medição de tamanhos de 10 um a < 1 nm
 Técnica rápida, reprodutivel
 Requer diluições adequadas
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Espalhamento de Luz
 Ângulos: 173°, 13° e 90°
 Diâmetro: 0,3 nm a 15 μm
 Volume mínimo: 3 μL
 Proteínas: 0,1 mg/mL de 15 kDa
 Até 40% w/v
 Faixa PM de 980 Da – 20 Mda
 Concentração de partículas: 108 a 1x1012 partículas/mL
Espalhamento de Luz
 Ângulos: 173°, 13° e 90°
 Diâmetro: 0,3 nm a 15 μm
 Volume mínimo: 3 μL
 Proteínas: 0,1 mg/mL de 15 kDa
 Até 40% w/v
 Faixa PM de 980 Da – 20 Mda
 Concentração de partículas: 108 a 1x1012 partículas/mL
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Espalhamento de Luz
Espalhamento de Luz
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Espalhamento de Luz
Espalhamento de Luz
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Espalhamento de Luz
Espalhamento de Luz
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Espalhamento de Luz
Rastreamento de Nanopartículas
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Rastreamento de Nanopartículas
 Análise individual
 Partículas de 10nm a 1000 nm
 Alta resolução
 Distribuições de tamanho
 Quantificação de partículas
 Complementa com DLS
Rastreamento de Nanopartículas
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Rastreamento de Nanopartículas
Rastreamento de Nanopartículas
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Rastreamento de Nanopartículas
Rastreamento de Nanopartículas
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Rastreamento de Nanopartículas
Rastreamento de Nanopartículas
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Rastreamento de Nanopartículas
Rastreamento de Nanopartículas
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Microscopia Eletrônica
 Avaliação da forma e tamanho
 Preparo adequado da amostra
 Não degradabilidade da amostra
 Processamento da amostra ⇒ mudança de tamanho
 Amostras ⇒ filmes
 Amostras em estado líquido ⇒ liquid TEM
 Amostras congeladas ⇒ cryo-TEM ou cryo-SEM ⇒ estrutura interna
Microscopia Eletrônica
 Varredura
MEV JEOL Neoscope JCM-5000
Canhão com filamento de tungstênio convencional
Tensões de aceleração fixas: 15 – 10 – 5 kV
Magnificação máxima: ×40.000
Observação em alto e baixo vácuo (30 Pa)
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Microscopia Eletrônica
Varredura
 Preparo das amostras ⇒ stubs
 Fita adesiva ⇒ ouro, níquel, prata ou carbono
 Pincel ou micropipetas
 Amostra líquida ⇒ evaporação ⇒ vácuo ou freeze-dryer
 Ouro ou carbono ⇒ sputtering
 Amostra biológica ⇒ processamento adequado ⇒ água ⇒ vácuo
 Materiais metálicos ⇒ visualização direta
Microscopia Eletrônica
Varredura
Carbono
Carbono
Cobre
Alumínio
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Microscopia Eletrônica
Varredura
Microscopia Eletrônica
Varredura
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Microscopia Eletrônica
 Transmissão
MET JEOL JEM 2100
Tensão de aceleração máxima: 200 kV
Resolução: 0,23 nm (ponto) ; 0,14 nm
Magnificação máxima: ×1.500.000
Microscopia Eletrônica
Transmissão
 Preparo das amostras ⇒ grids
 Amostras devem ser finas ⇒ ultramicrotomia
 Desidratação adequada ⇒ vácuo
 Contrastação adequada ⇒ nanoestruturas
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Microscopia Eletrônica
Varredura
 Carbono
 Aço 
 Titânio
 Alumínio
 Ouro
Microscopia Eletrônica
transmissão
 Grid com suporte
 Formvar
 Carbono
 Silicone
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Microscopia Eletrônica
Microscopia Eletrônica
Contraste ⇒ metal pesado
 OsO4 – tetróxido de ósmio ⇒ liga-se com lipídios
 Acetato de uranila ⇒ contrasta ácidos nucleicos
 Citrato de chumbo, molibidato de amônia e fosfato de tungstênio ⇒ fase aquosa
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Microscopia Eletrônica
 Preparo da amostra
Microscopia Eletrônica
 Ultramicrotomia
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Microscopia Eletrônica
Criomicroscopia
 Congelamento ultrarrápido ⇒ cristais de gelo
 Ideias para amostras biológicas
 Integridade da amostra (estado natural)
 TEM ou SEM
 Fratura ⇒ corte transversal
Microscopia Eletrônica
Criomicroscopia
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Microscopia Atômica
 Atração e repulsão
 Varredura da superfície da amostra
 Modo de contato ⇒ penetração na amostra
 Modo de não contato ⇒ oscilação (100 kHz a 1 MHz)
 Modo contato intermitente ⇒ amostras rugosas
 Interações substratos – nanopartículas
 Avaliação do tamanho, morfa, altura, rugosidade, etc.
Microscopia Atômica
Alta resolução
Alta resolução
Baixa resolução
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Microscopia Atômica
Microscopia Atômica
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Microscopia Atômica
Mica
Ouro
Prata
Microscopia Atômica
AFM amplitude image of
the muscle of cat's mite 
Otodectes cynotis. The 
contrast covers amplitude 
variation in the 1-3nm 
range. Size of the whole
image equals 4.6microns. 
Nadejda Borisovna
Matsko, Institut für
angewandte Physik, ETH 
Zürich.
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Potencial zeta
 Carga na superfície (material particulado)
 Dupla camada elétrica
 Dissociação de grupos ionogênicos na superfície da partícula
 Adsorção diferencial de íons da solução na superfície da partícula
 Estabilidade coloidal ⇒ agregação
Potencial zeta
 Dupla camada
 Camada interna ⇒ ligados a superfície
 Camada interna ⇒ distruibição de íons (equilíbrio)
 Potencial zero ⇒ potencial da solução
 Potencial zeta ⇒ plano de cisalhamento
 Carga elétrica ⇒ movimento de partículas
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Potencial zeta
Potencial zeta
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Potencial zeta
Potencial zeta
 Mobilidade eletroforética
 Movimento da partículas no capilar
 Velocidade ⇒ efeito Doppler
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Potencial zeta
Potencial zeta
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Potencial zeta
Importância:
 Relacionados com a formulação (pH)
 Estabilidade coloidal
 Controle da agregação/floculação da formulação
 Estudos de biointerface
Potencial zeta
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Potencial zeta
Potencial zeta
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Espalhamento de Raio- X a baixo 
ângulo (SAXS)
Usos:
 Medir o tamanho e a forma das nanopartículas 
 Caracterizar o mecanismo de crescimento e automontagem
 Medir a distribuição do tamanho de partícula em dispersões de coloides, 
em pós ou em matriz de polímero
 Determine o alinhamento dos nanotubos de carbono durante o 
processamento
Espalhamento de Raio- X a baixo 
ângulo (SAXS)
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Espalhamento de Raio- X a baixo 
ângulo (SAXS)
Espalhamento de Raio- X a baixo 
ângulo (SAXS)
 Tamanho
 Forma
 Estrutura interna
 Cristanilidade
 Porosidade
 Orientação
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Espalhamento de Raio- X a baixo 
ângulo (SAXS)
Espalhamento de Raio- X a baixo 
ângulo(SAXS)
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Espalhamento de Raio- X a baixo 
ângulo (SAXS)
Espalhamento de Raio- X a baixo 
ângulo (SAXS)
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Difração de Raio-X (DRX)
 Raio X incide sobre a amostra
 Espaçamento dos átomos ⇒ difração
 Estrutura cristalina ou amorfa
 Usos em nanocarreadores
⇒ Tamanho
⇒ Distribuição
Difração de Raio-X (DRX)
⇒ Amostras sólidas (pós)
⇒ Líquidas (suspensões)
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Difração de Raio-X (DRX)
10.3109/21691401.2015.1036997
Monostearato de glicerila
Ácido kójico
Difração de Raio-X (DRX)
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Calorimetria Exploratória Diferencial 
(DSC)
 Medida de temperaturas e o fluxo de calor
 Informações qualitativas e quantitativas sobre mudanças 
físicas e químicas
 Processos endotérmicos (absorção de calor)
 Exotérmicos (liberação de calor) 
 Mudanças de capacidade calorífica
Calorimetria Exploratória Diferencial 
(DSC)
 Aquecer ou arrefecer uma amostra a uma taxa controlada
 Sob ação de um gás de purga especifico com fluxo controlado, 
 e monitoramento contínuo com dispositivo de detecção adequado para 
observar a diferença de entrada de calor entre o material de 
referência e um material de ensaio
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Calorimetria Exploratória Diferencial 
(DSC)
Calorimetria Exploratória Diferencial 
(DSC)
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Calorimetria Exploratória Diferencial 
(DSC)
Calorimetria Exploratória Diferencial 
(DSC)
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Calorimetria Exploratória Diferencial 
(DSC)
Técnicas de eficiência de 
encapsulação
 Determinar a capacidade de encapsulação
 Eficiência de encapsulação (Drug encapsulation) ⇒ API no sistema
 Análise de conteúdo (Drug loading contente) ⇒ Dose
 Não trazem todos os dados!
 Diferentes metodologias
 Depende das características do fármacos 
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Técnicas de eficiência de 
encapsulação
UC% (mg/g)EE%
Fármaco na 
NPsNPs (mg)
Fármaco 
(mg)Lote
0.1100.0110001A
0.5100.0510005B
1.0100.010100010C
5.0100.050100050D
10.0100.01001000100E
10.020.01001000500F
10.013.31001000750G
Técnicas de eficiência de 
encapsulação
 Centrifugação ⇒ fármacos insolúveis
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Técnicas de eficiência de 
encapsulação
 Centrifugação ⇒ fármacos insolúveis
vs.
Técnicas de eficiência de 
encapsulação
 Centrifugação
Força-G ⇒ atuação da gravidade
Força-G ⇒ tamanho do rotor 
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Técnicas de eficiência de 
encapsulação
Exemplo:
Diâmetro do rotor: 14 cm 
Diâmetro do rotor: 6,5 cm 
Técnicas de eficiência de 
encapsulação
Fórmula:
Raio (cm)
6,516rpm
1,84,5500
251000
5121500
22562000
2305703000
50.378-14000
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Técnicas de eficiência de 
encapsulação
Técnicas de eficiência de 
encapsulação
 Valor de S (S-value)
Se:
o S > 0 ⇒ partícula se sedimenta
o S < 0 ⇒ partícula flutua
o S = 0 ⇒ partícula não se move
d: diâmetro (cm)
𝜎: densidade da partícula (g/cm³)
𝜌: densidade do meio (g/cm³)
𝜂: viscosidade do meio (Poise)
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Técnicas de eficiência de 
encapsulação
S𝜂 (P)𝜌 (g/cm³)𝜎 (g/cm³)Diâmetro (cm)Diâmetro (µm)
6.2E+060.89111.10.0110
1.6E+080.89111.10.0550
6.2E+040.89111.10.0011
6.2E+020.89111.10.00010.1
6.2E+000.89111.10.000010.01
S𝜂 (P)𝜌 (g/cm³)𝜎 (g/cm³)Diâmetro (cm)Diâmetro (µm)
-1.2E+070.89110.80.0110
-3.1E+080.89110.80.0550
-1.2E+050.89110.80.0011
-1.2E+030.89110.80.00010.1
-1.2E+010.89110.80.000010.01
Técnicas de eficiência de 
encapsulação
 Determinar o tempo de sedimentação
https://www.beckman.com/centrifuges/rotors/calculator
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Técnicas de eficiência de 
encapsulação
 Determinar o tempo de sedimentação
Max RPM:65000
Rmin: 35
Rmax: 77
Técnicas de eficiência de 
encapsulação
 Determinar o tempo de sedimentação
10 nm100 nm1 µm10 µm10 nm100 nm1 µm10 µm
Tempo de centrigugação 
(h)
Tempo de 
centrigugação (s)Valor de SFator kforça grpm
320832190.1925662462352623519120000861000
12831380.07706624623526235191800021005000
305320.018366246235262351911900860010000
142110.008566246235262351918872000015000
801< 10.004866246235262351914993400020000
20< 1< 10.0012662462352623519112513700040000
13< 1< 10.000866246235262351918021500050000
8< 1< 10.000566246235262351914736500065000
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Técnicas de eficiência de 
encapsulação
 Centrifugação ⇒ fármacos insolúveis ⇒ suspensão grosseira ⇒ meio 
aquoso
Centrifugação
Técnicas de eficiência de 
encapsulação
 Método indireto ⇒ fármaco não encapsulado
Solubilizar
Detecção
MA = Massa adc (teórico)
MQ = Massa quantificada
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Técnicas de eficiência de 
encapsulação
 Método direto ⇒ fármaco na NPs
Sobrenadante Solução de lise
Fármaco 
liberado
Análise
Técnicas de eficiência de 
encapsulação
 Método por ultracentrifugação ⇒ fármacos solúveis
 Fármacos em solução ⇒ não separam
 Materiais suspensos ⇒ alta força G ⇒ sedimentação
 Fármacos em suspensão + NPs ⇒ sedimentação
 Eficiência correta (?)
 Alta força G ⇒ destruir o sistema
 Gradiente de rotação ⇒ melhora a sedimentação
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Técnicas de eficiência de 
encapsulação
Suspensão de NPs Fármaco em solução Fármaco em suspensão
Técnicas de eficiência de 
encapsulação
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Técnicas de eficiência de 
encapsulação
Método por exclusão por ultra-filtração
 Tubos contem uma membrana filtrante
 Uso de centrifugação para separação
 Passagem pelo poros ⇒ fármaco hidrofílico
 Permite concentração de amostras ⇒ outras análises FQ
 Diversos tamanhos ⇒ quantidade de amostra
 Tamanho de poro ⇒ passagem do analito
Técnicas de eficiência de 
encapsulação
 Método por exclusão por ultra-filtração
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Técnicas de eficiência de 
encapsulação
 Método por exclusão por ultra-filtração
Mínimo concentradoMáximo amostraVolume do 
tubo (mL)
15 µL500 µL0,5
15 – 75 µL 2 mL2
50 µL 4 mL4
500 µL 1515
Técnicas de eficiência de 
encapsulação
 Método por exclusão por ultra-filtração
Rmin (nm)Exclusão peso molecular
1,103 kDa
1,4210 kDa
1,7820 kDa
2,450 kDa
3,05100 kDa
3,84200 kDa
5,21500 kDa
https://nanocomposix.com/pages/molecular-weight-to-size-calculator
Rmin (nm)PM (g/mol)
0,54150
0,682100
0,926250
1,200500
1,364800
1,4691000
2,55000
https://www.fluidic.com/resources/Toolkit/hydrodynamic-radius-Converter/
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Técnicas de eficiência de 
encapsulação
Técnicas de eficiência de 
encapsulação
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Técnicas de eficiência de 
encapsulação
Técnicas de eficiência de 
encapsulação
 Método por filtração em gel ⇒ fármacos solúveis
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Técnicas de eficiência de 
encapsulação
 Método por filtração em gel ⇒ fármacos solúveis
Técnicas de eficiência de 
encapsulação
 Método por filtração em gel
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Técnicas de eficiência de 
encapsulação
 Método por filtração em gel
Técnicas de eficiência de 
encapsulação
 Método por filtração em gel
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