Biologia Molecular - Sequenciamento de DNA e banco de dados

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Aula 9 – Banco de dados e sequenciamento do DNA
O sequenciamento do DNA é uma técnica para identificar organização da ordem dos nucleotídeos do material genético. Serve para entender a estrutura e função dos genes, identificar a presença de elementos móveis (vírus, plasmídeos), identificar relações evolutivas (como a relação entre humanos e neandertal), identificar genes adquiridos por transferência horizontal.
A Bioinformática é a área da ciência que utiliza métodos da biologia, matemática e da computação para solucionar questões e problemas relevantes a partir de dados biológicos.
Banco de dados biológicos (BDB)
Armazenamento e agrupamento categorizados a partir do tipo e conteúdo dos dados:
	Primário
	Secundário
	Especializados
O sequenciamento do DNA é feito em partes, havendo a leitura de fragmentos do genoma. Não é possível fazer a leitura do genoma inteiro.
Sequenciamento de DNA – Primeira Geração
Maxam Gilbert - Fragmentava por enzima de restrição, marcava a extremidade 5’ por um fósforo radioativo e fazia a leitura por eletroforese.
Sanger – É utilizado dideoxinucleotídeos para marcar a extremidade da fita de DNA, de forma que ao se ligar a fita, não é mais possível outros nucleotídeos se ligarem a sequência devido a não haver mais uma hidroxila.
Sequenciamento de DNA – Segunda geração
Pirosequenciamento - DNA fragmentado com necessidade de uma extremidade livre liga-se adaptadores com ligases e amplifica. Os nucleotídeos são ligados individualmente um por um. Ao cada nucleotídeo se ligar, há luz emitida que é medida constantemente. Não é bom para genomas que possuem muita repetição de nucleotídeos.
Illumina – Amostras de DNA são fragmentadas aleatoriamente, mas não ocorre PCR de emulsão. Neste caso, adaptadores são ligados nas extremidades de cada fragmento e ligados adaptadores complementares numa placa de vidro. Cada sequência presa a essa placa será amplificada por PCR criando cluster. Esses clusters contêm aproximadamente um milhão de cópias do mesmo fragmento. Na última etapa, há a determinação de cada nucleotídeo da sequência. Para isto, é feita uma solução com os quatro nucleotídeos modificados com marcadores fluorescentes, iniciadores de sequenciamento e DNA polimerase. Essa mistura é incorporada aos fragmentos e os clusters são excitados por lasers para emitir um sinal específico para cada nucleotídeo. Essa luz será detectada e traduzida por softwares.
Solid – Primeiro são inseridos adaptadores nos fragmentos de DNA que passam por uma emulsão no PCR. Depois são anexados em uma lâmina de vidro com uma etiqueta fluorescente no final. Essa etiqueta vai se ligar aos fragmentos de DNA e a cor emitida por cada nucleotídeo vai ser registrada. O sequenciador repete este ciclo e a cada ciclo a fita complementar é removida, isto é repetido até que cada base seja sequenciada duas vezes.
Ion Torrent – Não utiliza fluorescência nem luminescência. Tem um modo de sequenciamento similar ao pirosequenciamento, mas no lugar do pirofosfato, são detectados íons H+ por uma diferença de pH causada pela liberação de prótons.
Sequenciamento de DNA – Terceira geração
PacBio – Utiliza a mesma marcação fluorescente de outras tecnologias, porém os sinais são detectados em tempo real. Isso é possível devido a estrutura composta por muitas células SMRT, as nanoestruturas microfabricadas (ZMWs) em um filme de metal que, por sua vez, é depositado em um substrato de vidro. Cada nanoestrutura contém uma DNA polimerase anexada à sua parte inferior e o fragmento de DNA alvo para o sequenciamento. Quando o DNA se incorpora aos nucleotídeos marcados por fluorescência ele libera um sinal luminoso captado por sensores, tornando possível determinar a sua sequência.
MiniON – Desenvolvido pela Oxford Nanopore Technologies em 2014, nesta tecnologia de sequenciamento, a primeira fita da molécula de DNA é ligada por um grampo a sua fita complementar. O fragmento de DNA passa por um nanoporo e sofre uma variação de corrente iônica causada pela ligação de vários nucleotídeos no mesmo poro. Esta variação de corrente iônica é registrada progressivamente em um modelo gráfico e então interpretada para identificar a sequência gerando leituras 1D ou 2D quando são lidas uma ou duas fitas de DNA (forward e reverse) respectivamente.
Banco de Dados
É uma coleção reunindo sequências de DNA já descobertas, associadas com outras informações como doenças, sinais e sintomas de um portador de uma mutação ou a frequência de variantes genéticas, juntas de artigos científicos que descrevem a alteração, caso já tenha sido estudada.
Os bancos de dados podem ser classificados de acordo com o quão curado é as informações contidas nele:
	Primário – Armazena dados originais de sequências de nucleotídeos ou proteínas. Destacam-se o GenBank, EMBL e o DDBJ.
	Secundário – Armazenam resultados de análises feitas a partir de dados primários. Destacam-se o SWISS-Prot e o PIR
	Especializados – São aqueles que atendem um interesse particular de pesquisa. Destacam-se o Flybase, HIV sequence database e RDP (Ribosomal Database Project).