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Relatório da 7º Aula Prática: Isolando Ácidos Nucléicos 1. Introdução Os ácidos nucleicos são moléculas com extensas cadeias carbônicas, formadas por nucleotídeos: um grupamento fosfórico (fosfato), um glicídio (monossacarídeo com cinco carbonos/pentoses) e uma base nitrogenada (purina ou pirimidina), constituindo o material genético de todos os seres vivos. Outrossim, nos eucariontes ficam armazenados no núcleo das células e nos procariontes dispersos no hialoplasma, portanto, podem ser de dois tipos: ácido desoxirribonucleico (DNA) e ácido ribonucleico (RNA), ambos relacionados ao mecanismo de controle metabólico celular (funcionamento da célula) e transmissão hereditária das características. Além do peso molecular, relativa à quantidade de nucleotídeos (tamanho da molécula), existem outras diferenças estruturais, como por exemplo, a diferença das bases nitrogenadas púricas e pirimídicas. No filamento de DNA, obtemos as purinas (adenina e guanina) e pirimidinas (timina e citosina). Já no filamento de RNA, encontramos as purinas (adenina e guanina) e Pirimidinas (uracila e citosina). Temos como diferença na estrutura também, a sequência dos nucleotídeos, implicando na diferença mantida entre os genes no filamento de DNA e dos códons e anticódons no filamento de RNA, na conformação linear ou circular dos filamentos e a duplicidade complementar (fita dupla) observada no DNA, diferenciada da unicidade (fita única/simples) do RNA. Neste relatório, iremos relatar o isolamento do ácido nucléico de um morango. Os morangos que consumimos são plantas da espécie Fragaria ananassa. Estas plantas são rosáceas, ou seja, são da mesma família das rosas que enfeitam muitos jardins. Elas se reproduzem principalmente por meio do estolão, que é um ramo que cresce paralelo ao chão, gerando brotos de novas plantas. As variedades de morangos que consumimos hoje são resultado de cruzamentos de espécies diferente. Uma das razões de se trabalhar com morangos é que eles se prestam muito bem à extração de DNA, porque são muito macios e fáceis de homogeneizar. Morangos maduros também produzem pectinases e celulases, que são enzimas que degradam a pectina e a celulose (respectivamente), presentes nas paredes celulares das células vegetais. Além disso, os morangos possuem muito DNA: eles possuem 8 (oito) cópias de cada conjunto de cromossomos (são octoplóides!). 1.1. Objetivo Principal O objetivo principal desta aula foi observar os aspectos da molécula de DNA, e compreender a técnica de extração, isolando os ácidos nucléicos de um morango. 2. Materiais e Métodos 2.1. Materiais • Morangos • Gral e pistilo • Sal de cozinha • Detergente para louça • Água quente • Filtro de café e suporte para filtro • Gelo • Álcool gelado • Dois frascos de vidro (200 ml) • Um bastão ou arame • Recipiente de 1L 2.2. Métodos Inicialmente, cortamos 5 morangos e colocamos no gral, no qual amassamos com o auxílio de um pistilo. Logo após, adicionamos 80 ml de água quente e 20 ml de detergente em uma proveta, e colocamos nos morangos amassados, juntamente com 1 colher de sal, logo depois de misturarmos bastante, colocamos em um frasco de vidro. A solução ficou em repouso no frasco por 10 minutos. Após esse tempo, colocamos o frasco com a nossa solução em uma bacia coberta de gelo, e esperamos por mais 10 minutos. Seguidamente, filtramos com a ajuda de um filtro de café e um suporte para filtro. Após isto, pegamos o material filtrado, inclinamos o frasco, e pelas bordas, derramamos o álcool gelado. Observando então, duas camadas formadas na solução, no qual é possível observar a formação de um precipitado com aspecto de fiapos esbranquiçados, que são os ácidos nucléicos. Retiramos o mesmo com a ajuda de um grampo, enrolamos o ácido nucléico, de forma que “pescamos” ele. 3. Resultados ( Morangos utilizados no experimento) (Morangos sendo cortados) Os morangos foram macerados para uma maior superfície de contato com a solução de lise e melhor a ação da solução sobre as células. Isto permitiu a liberação de uma maior quantidade de moléculas de DNA e, portanto, um bom rendimento. Veja na imagem a seguir: (Morangos após serem macerados) O DNA está presente no núcleo das células de qualquer organismo, dentro de pequenos pacotes genéticos chamados cromossomos. Para isolá-los separamos o mesmo dos outros componentes celulares. As células são fragmentadas e o DNA é separado do conteúdo lipídico das membranas da célula e dos organitos. Em seguida o DNA foi separado das proteínas, no qual o detergente permitiu a desestruturação das moléculas de lipídios das membranas. Com a ruptura das membranas o conteúdo celular, soltaram e dispersaram na solução. A adição do sal de cozinha proporcionou ao DNA um ambiente favorável para a sua extração, contribuindo com íons positivos que neutralizam a carga negativa do DNA. Observe nas imagens a seguir: (Adicionando o detergente, a água quente e o sal de cozinha) (Resultado da solução após misturarmos tudo) Após 10 minutos descansando, a nossa solução foi para o banho de gelo por mais 10 minutos e colocamos em seguida para fazermos a filtração do mesmo. Depois, colocamos em um frasco limpo como mostra nas imagens a seguir: (Frasco com a nossa solução em banho de gelo) (Coando a solução) (Líquido filtrado) Assim que derramamos o álcool gelado no extrato de morango, começamos a notar fitas brancas muito finas de ADN, que se formaram na interface entre as duas camadas, e pegamos o ácido nucleico com a ajuda de um grampo, finalizando assim o nosso experimento como mostra nas imagens a seguir: (Colocando o álcool gelado na substância pelas bordas com cautela) (Ácido Nucleico sendo ”pescado” da solução) É importante lembrarmos também, que as duas cadeias de polinucleotídios do DNA formam uma dupla-hélice. As cadeias principais estão localizadas na porção externa da hélice, já no interior são observadas as bases nitrogenadas que estão unidas por ligações de hidrogênio. As cadeias principais apresentam as direções 5’ → 3’ opostas, ou seja, uma cadeia está no sentido 5' → 3’, e a outra, no sentido 3' → 5’. Em razão dessa característica, dizemos que as fitas são antiparalelas. A união entre as bases nitrogenadas é que faz com que as duas cadeias fiquem unidas. Vale destacar que o pareamento ocorre entre bases complementares, sendo observada sempre a união de uma base pirimidina com uma base purina. O pareamento entre as bases só acontece das seguintes formas: Adenina é pareada apenas com timina, já a Guanina é pareada sempre com citosina. Como as bases são combinadas de maneira específica, podemos concluir que, na dupla-hélice, uma cadeia sempre será complementar à outra. Podemos observar na imagem apresentada a seguir: (Dupla hélice de DNA) 4. Discussão Durante a aula, tivemos a chance de um melhor conhecimento, prática e visualização das ações feitas e dos resultados obtidos durante o experimento, onde observamos como cada ação e elemento adicionado pode ser importante para que chegamos ao resultado esperado. Assim, com a ajuda dos profissionais presentes conseguimos fazer uma boa utilização dos métodos para isolar os ácidos nucleicos do morango, que é o nosso objetivo. Os ácidos nucleicos são macromoléculas constituídas por nucleotídeo que formam o DNA, onde irá conter as informações genéticas que de transmite de geração em geração. O esmagamento que realizou-se com o morango, foi para romper as paredes celulares e as membranas citoplasmáticas, liberando o conteúdo celular. O processo de filtração permite separar essas paredes celulares e as membranas desse conteúdo, nomeadamente dos núcleos.O detergente utilizado como mistura penetra na estrutura das membranas e separa as grandes moléculas de fosfolipídios, provocando a destruição das membranas. Consequentemente o conteúdo nuclear (DNA e proteínas) dispersa-se na solução. A adição de sal (NaCl) no início do experimento proporcionou ao DNA um ambiente favorável. O sal contribuiu com íons positivos (Na+) que neutralizam a carga negativa do DNA, devido a ionização do grupo fosfato, assim, estabilizando-o. Com isso, as moléculas de DNA agregam-se, formando filamentos espessos e cumpridos e consequentemente mais visível. A solução de DNA tem uma viscosidade maior que a água pura, demorando mais tempo para escoar. Ao aquecermos o DNA, estaremos rompendo as suas ligações de hidrogênio, desnaturando, o que diminui a viscosidade da solução, escoando e menor tempo. Ao resfriar o DNA volta a formar suas ligações de hidrogênio, recuperando sua viscosidade. O DNA não se dissolve no álcool etílico à concentração e temperatura utilizadas na experiência. Como resultado o DNA precipitou e, consequentemente, separou-se da solução tornando possível a sua visualização e "pesca". O álcool, como é menos denso do que a água, flutua em uma camada acima. Portanto, o DNA irá surgir na forma de uma "nuvem" na mistura, formando-se na parte que separa as duas camadas ou fases, e assim com a utilização de um grampo conseguimos fazer sua retirada. 5. Conclusões Após finalizarmos o experimento de isolamento dos Ácidos Nucleicos de um morango, podemos concluir que todos os organismos vivos armazenam todas as suas informações genéticas codificadas e contidas nos ácidos nucleicos (DNA, ácido dioxirribonucleico e RNA ácido ribonucleico). Outrossim, a molécula de DNA é conhecida como a molécula da hereditariedade, pois dentro dela estão contidas todas as informações genéticas das quais os indivíduos necessitam para serem formados, existindo duas longas fitas de nucleotídeos que se enrolam formando uma estrutura de dupla hélice como mostramos anteriormente. Devemos destacar que a solução para extrair DNA também conhecida como solução de lise, é assim denominada devido a sua função de rompimento da membrana plasmática e outras membranas, e quanto mais os morangos forem macerados maior será sua superfície de contato com a solução de lise e melhor a ação da solução sobre as células. Isto permitiu uma liberação maior da quantidade de moléculas de DNA e, portanto, um bom rendimento, e após macetarmos o morango, estouramos a parede celular e a membrana nuclear, na qual deixamos apenas o ácido nucleico. O detergente que utilizamos tem como função principal, retirar os lipídios, e com a ruptura das membranas o conteúdo celular, incluindo as proteínas e o DNA, soltam-se e dispersam- se na solução. Já a água quente, acelera as reações que desejamos obter. Outrossim, o sal de cozinha (NaCl), proporciona ao DNA um ambiente favorável para a sua extração, contribuindo com íons positivos que neutralizam a carga negativa do DNA. E o álcool gelado torna possível a visualização das moléculas, que se agrupam formando um monte de filamentos muito finos tipo fios de algodão, decorrente do fato de a proteína ser insolúvel em álcool, ou seja, ela não se dissolve no álcool. O DNA é menos denso que a água e a mistura aquosa dos restos celulares. Os morangos, por serem muito macios e fáceis de homogeneizar, são mais eficientes para se extrair o DNA. Morangos maduros também produzem pectinases e celulases – enzimas que degradam a pectina e a celulose (respectivamente), presentes nas paredes celulares das células vegetais. Além disso, os morangos possuem muito DNA, possuindo 8 cópias de cada conjunto de cromossomos, o que facilitou a nossa extração. A ADN, que se formou na camada de etanol, este formou fibras como as de algodão, que grudaram no grampo que utilizamos para “pescar”. Quando as moléculas são solúveis em um dado solvente, elas se dispersam neste solvente e não são, portanto, visíveis. Por outro lado, quando as moléculas são insolúveis em um dado solvente, elas se agrupam, tornando- se visíveis. Quanto mais gelado estiver o álcool, menos solúvel o ADN vai estar. Por isso é tão importante que o etanol seja mantido no freezer ou em um banho de gelo até a hora do experimento. Podemos concluir então, que o experimento foi um sucesso, no qual atingimos os objetivos apresentados inicialmente com a ajuda da professora Nora Katia, e sua auxiliar de laboratório Naiara. 6. Questões 6.1. QUAL A FUNÇÃO DO DETERGENTE? Resposta: O detergente ajuda a dissolver a bicamada lipídica que compõe a membrana plasmática e as membranas das organelas. Com a ruptura das membranas o conteúdo celular, incluindo as proteínas e o DNA, soltam-se e dispersam-se na solução. 6.2. POR QUE FOI UTILIZADO O SAL DE COZINHA? Resposta: O sal ajuda a manter as proteínas dissolvidas no líquido extraído, impedindo que elas precipitem com o DNA. O sal contribui com íons positivos que neutralizam a carga negativa do DNA. 6.3. QUAL A IMPORTÂNCIA DA ÁGUA QUENTE? Resposta: A água quente permite a aceleração das reações físicas. Isso acontece porque a temperatura é uma medida da agitação térmica das partículas que compõem uma substância. Isso significa que se aumentarmos a temperatura, a agitação das moléculas também aumentará; e o contrário também é verdadeiro: com a diminuição da temperatura, a agitação das moléculas também diminuirá. 7. Referências • https://mundoeducacao.uol.com.br/biologia/acidos- nucleicos.htm#:~:text=Os%20%C3%A1cidos%20nucleicos%20s%C3%A3o%20mol%C 3%A9culas,de%20todos%20os%20seres%20vivos. • https://www.invivo.fiocruz.br/experimente/dna-de-morango/ • https://pontobiologia.com.br/extraindo-dna-do- morango/?doing_wp_cron=1688929637.5883789062500000000000 https://mundoeducacao.uol.com.br/biologia/acidos-nucleicos.htm#:~:text=Os%20%C3%A1cidos%20nucleicos%20s%C3%A3o%20mol%C3%A9culas,de%20todos%20os%20seres%20vivos https://mundoeducacao.uol.com.br/biologia/acidos-nucleicos.htm#:~:text=Os%20%C3%A1cidos%20nucleicos%20s%C3%A3o%20mol%C3%A9culas,de%20todos%20os%20seres%20vivos https://mundoeducacao.uol.com.br/biologia/acidos-nucleicos.htm#:~:text=Os%20%C3%A1cidos%20nucleicos%20s%C3%A3o%20mol%C3%A9culas,de%20todos%20os%20seres%20vivos https://www.invivo.fiocruz.br/experimente/dna-de-morango/
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