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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DOS ALIMENTOS Luana Sielski Galvão Soares PERFIL DE RESISTÊNCIA A ANTIMICROBIANOS DE Salmonella enterica subsp. enterica SOROVAR Heidelberg ISOLADAS DA CADEIA DE PRODUÇÃO DE FRANGO E POTENCIAL EFEITO ANTAGONISTA POR BACTÉRIAS ÁCIDO LÁCTICAS Florianópolis 2022 Luana Sielski Galvão Soares PERFIL DE RESISTÊNCIA A ANTIMICROBIANOS DE Salmonella enterica subsp. enterica SOROVAR Heidelberg ISOLADAS DA CADEIA DE PRODUÇÃO DE FRANGO E POTENCIAL EFEITO ANTAGONISTA POR BACTÉRIAS ÁCIDO LÁCTICAS Dissertação submetida ao Programa de Pós- Graduação em Ciência dos Alimentos da Universidade Federal de Santa Catarina, como requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciência dos Alimentos. Orientador: Prof. Dr. Juliano De Dea Lindner Coorientador: Prof. Dr. Eduardo Cesar Tondo Florianópolis 2022 Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor, através do Programa de Geração Automática da Biblioteca Universitária da UFSC. Soares, Luana Sielski Galvão PERFIL DE RESISTÊNCIA A ANTIMICROBIANOS DE Salmonella enterica subsp. enterica SOROVAR Heidelberg ISOLADAS DA CADEIA DE PRODUÇÃO DE FRANGO E POTENCIAL EFEITO ANTAGONISTA POR BACTÉRIAS ÁCIDO LÁCTICAS / Luana Sielski Galvão Soares ; orientador, Juliano De Dea Lindner, coorientador, Eduardo Cesar Tondo, 2022. 74 p. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós Graduação em Ciência dos Alimentos, Florianópolis, 2022. Inclui referências. 1. Ciência dos Alimentos. 2. Microbiologia. 3. Resistencia a antibióticos. 4. Genes de resistência. 5. Bactérias ácido láticas. I. De Dea Lindner, Juliano . II. Cesar Tondo, Eduardo. III. Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos. IV. Título. Luana Sielski Galvão Soares PERFIL DE RESISTÊNCIA A ANTIMICROBIANOS DE Salmonella enterica subsp. enterica SOROVAR Heidelberg ISOLADAS DA CADEIA DE PRODUÇÃO DE FRANGO E POTENCIAL EFEITO ANTAGONISTA POR BACTÉRIAS ÁCIDO LÁCTICAS O presente trabalho em nível de mestrado foi avaliado e aprovado por banca examinadora composta pelos seguintes membros: Prof.(a) Gilberto Vinícius de Melo Pereira, Dr.(a) Universidade Federal do Paraná Prof.(a) Fabienne Antunes Ferreira, Dr.(a) Universidade Federal de Santa Catarina Prof.(a) Silvani Verruck, Dr.(a) Universidade Federal de Santa Catarina Certificamos que esta é a versão original e final do trabalho de conclusão que foi julgado adequado para obtenção do título de mestre em Ciência dos Alimentos ____________________________ Coordenação do Programa de Pós-Graduação ____________________________ Prof.(a) Juliano De Dea Lindner, Dr.(a) Orientador(a) Florianópolis, 2022. AGRADECIMENTOS A minha mãe Dora e minha irmã Juliana, que são minhas maiores incentivadoras desde o início da pós-graduação e sempre estão presentes em todos os momentos da minha vida, dando apoio e condições para que eu alcance todos os meus objetivos. Ao meu marido Rodrigo, pela dedicação, carinho e apoio durante todo o período do mestrado, principalmente por fazer parte dessa conquista, pela paciência e ajuda fundamental nesses dois anos durante a realização deste projeto. Ao meu pai Ailton que sempre deu apoio, incentivo e conselhos para a realização deste trabalho. A toda minha família (tios, tias e primos) que estão sempre ao meu lado e são pessoas que poderei contar pelo resto da vida. A minha amiga Ana Paula Zapelini que esteve ao meu lado durante a realização do mestrado, me ajudando desde a inscrição para o mestrado até a entrega do trabalho e em todos os momentos que precisei. Ao meu orientador Juliano Lindner pela orientação, oportunidade, atenção e apoio, mesmo durante a pandemia e pelas parcerias para a realização das análises que tornaram esse trabalho possível. Ao meu coorientador Eduardo Tondo, que apoiou o projeto desde o início sempre nos ajudando em tudo que foi necessário. As meninas do laboratório de saúde animal e a minha chefe Sabine, que sempre me deu suporte e condições para a realização das análises necessárias, além de incentivo para que o projeto fosse realizado. Agradeço ao pessoal da FAMERP, Mara Nogueira, Tiago Casella e aos orientandos, que me receberam muito bem, onde tive a oportunidade de aprender novas técnicas e enriquecer minha pesquisa. Ao professor Glauber Wagner e seus alunos Vilmar Benetti e Eric Kazuo (MIP/UFSC) pela realização da analises de bioinformática e pelo auxilio em todas as questões que precisei. A empresa Neoprospecta, em especial ao Wellington Omori e Rafael Oliveira pelas análises de sequenciamento genético. Ao doutorando Ivan de Marco, pelo auxilio com as cepas e analises relacionadas as bactérias ácido láticas. Por fim, agradeço a todos que de alguma maneira contribuíram para a realização deste trabalho. RESUMO Salmonella é o principal patógeno humano presente na cadeia avícola, e o surgimento de cepas resistentes a antibióticos dificulta o controle dessa bactéria na agroindústria e no tratamento de possíveis salmoneloses humanas de origem alimentar. Atualmente, Salmonella Heidelberg é um dos sorovares mais importantes para a saúde pública, uma vez que tem sido isolado com frequência em aves de diversos países e pode apresentar multirresistência. Este estudo foi realizado com 130 isolados de S. Heidelberg coletados de granjas de frango de corte pré-abate entre os anos de 2019 e 2020 em 18 cidades de três estados do Brasil, com o objetivo de estudar sua resistência genotípica e fenotípica. Os isolados foram testados e identificados utilizando antissoros somáticos e flagelares (0:4, H:2 e H:r) e o antibiograma foi realizado frente a 11 antibióticos de uso veterinário. As cepas foram tipadas por Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (ERIC)-PCR e representantes dos principais clusters dos perfis identificados foram sequenciados por Whole Genome Sequencing (WGS). Os resultados dos antibiogramas demonstraram que 100% dos isolados foram resistentes à sulfonamida, 54% foram resistentes à amoxicilina, e apenas um foi sensível à tetraciclina. Doze isolados foram multirresistentes. O dendrograma obtido a partir da ERIC-PCR demonstrou que as cepas foram agrupadas em 27 clusters com similaridade acima de 90%, com alguns isolados apresentando 100% de similaridade, porém com perfis fenotípicos de resistência antimicrobiana diferentes. Cepas idênticas coletadas em uma mesma granja em datas diferentes foram identificadas, indicando serem residentes. O WGS identificou um total de 66 genes de resistência. Destacaram-se os genes sul2 (presente nas 13 amostras) e tet(A) que foram validados na análise experimental. O gene fosA7 também foi identificado nas 13 amostras sequenciadas, porém não foi observada resistência no teste fenotípico, possivelmente por heterorresistência das cepas de S. Heidelberg avaliadas. O teste de antagonismo demonstrou que as cepas de bactérias ácido láticas (BAL) podem ter efeito antimicrobiano sobre os isolados testados de S. Heidelberg. Levando em consideração que a carne de frango é uma das carnes mais consumidas no mundo, os dados aqui obtidos podem corroborar com o mapeamento da origem e tendências da resistência antimicrobiana. Palavras-chave: Bactérias Ácido Lácticas. Cadeia de produção de frango. Multirresistência microbiana. Segurança de alimentos. ABSTRACT Salmonella is the primary human pathogen in the poultry chain, and the emergence of antibiotic-resistant strains makes it challenging to control this bacterium in the agro-industry and treatpossible food-borne human salmonellosis. Salmonella Heidelberg is one of the most important serovars for public health since it has been frequently isolated in poultry from different countries and may present multidrug resistance. To study their genotypic and phenotypic resistance, this study was carried out with 130 S. Heidelberg isolates collected from pre-slaughter broiler farms between 2019 and 2020 in 18 cities in three Brazilian states. The isolates were tested and identified using somatic and flagellar antisera (0:4, H:2, and H:r), and an antibiogram was performed against 11 antibiotics for veterinary use. The strains were typed by Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (ERIC)-PCR, and representatives of the main clusters of the identified profiles were sequenced by Whole Genome Sequencing (WGS). Antibiogram results showed that all isolates were resistant to sulfonamide, 54% were resistant to amoxicillin, and only one was sensitive to tetracycline. Twelve isolates were multidrug resistant. The dendrogram obtained from the ERIC-PCR showed that the strains were grouped into 27 clusters with similarity above 90%, with some isolates showing 100% similarity but with different phenotypic profiles of antimicrobial resistance. Identical strains collected on the same farm on other dates were identified, indicating that they were residents. The WGS identified a total of 66 resistance genes. The sul2 genes (present in the 13 samples) and tet(A) were highlighted and validated in the experimental analysis. The fosA7 gene was also identified in the 13 samples sequenced, but no resistance was observed in the phenotypic test, possibly due to the heteroresistance of the S. Heidelberg strains evaluated. The antagonism test demonstrated that lactic acid bacteria (LAB) strains might have an antimicrobial effect on the tested isolates of S. Heidelberg. Considering that poultry meat is one of the most consumed meats in the world, the data obtained here can corroborate the mapping of the origin and trends of antimicrobial resistance. Keywords: Lactic acid bacteria. Poultry production chain. Food safety. Micorbial multi- resistance. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Dendrograma da análise de 124 isolados de S. Heidelberg. ..................................... 42 Figura 2. Perfis de resistência in silico para amostras de Salmonella Heidelberg. .................. 47 Figura 3. Perfis de resistência in silico para amostras de Salmonella Heidelberg em ambos bancos de dados (RGI e ResFinder). ........................................................................................ 48 LISTA DE QUADROS Quadro 1. Origem e data de coleta dos isolados utilizados no estudo. ..................................... 28 Quadro 2. Identificação das cepas de BAL utilizadas para o teste de antagonismo. ............... 31 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Resistência das cepas de Salmonella Heidelberg frente aos antibióticos testados. .. 36 Tabela 2. Cepas selecionadas para o teste de antagonismo e sequenciamento completo. ....... 44 Tabela 3. Halo de inibição formado no teste de antagonismo de S. Heidelberg com BAL. .... 44 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AMX - Amoxicilina AN - Ágar nutriente BAL - Bactérias ácidos láticas BHI - Brain heart infusion (infusão cérebro coração) CARD - Comprehensive Antibiotic Resistance Database CDC - Centers for Disease Control and Prevention (Centro para Controle e Prevenção de Doenças dos Estados Unidos) CLSI - Clinical e Laboratory Standards Institute CN - Gentamicina EFT - Ceftiofur ENR - Enrofloxacina ERIC - Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (consenso intergênico repetitivo de enterobactérias) FOS - Fosfomicina GRAS - Geralmente reconhecidas como seguras KAN - Canamicina LSP - Lincomicina + espectinomicina MAPA - Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento MDR - Multi-drug resistant (cepa multidroga resistente) MRS - Man, Rogosa e Sharpe NEO - Neomicina NOR - Norfloxacina PCR - Polymerase Chain Reaction (reação em cadeia da polimerase) SUL - Sulfonamida TBE - Tris/borato/EDTA TET - Tetraciclina WGS - Whole genome sequencing (sequenciamento do genoma completo) WHO - World Health Organization (Organização Mundial da Saúde) SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 13 2 OBJETIVO ....................................................................................................................... 16 2.1 OBJETIVO GERAL .................................................................................................. 16 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................... 16 3 REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................................ 17 3.1 SALMONELLA SPP. .................................................................................................. 17 3.1.1 Salmonella spp. em granjas de frango de corte .................................................. 18 3.2 SALMONELLA HEIDELBERG ................................................................................ 20 3.3 RESISTÊNCIA A ANTIMICROBIANOS .................................................................... 21 3.4 SAÚDE ÚNICA (ONE HEALTH) ............................................................................ 22 3.5 SEQUENCIAMENTO DO GENOMA COMPLETO (WGS) .................................. 24 3.6 BACTÉRIAS ÁCIDO LÁTICAS (BAL) ....................................................................... 26 4 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 27 4.1 MATERIAL ............................................................................................................... 27 4.1.1 Micro-organismos ............................................................................................... 27 4.2 MÉTODOS ................................................................................................................ 31 4.2.1 Análise de Salmonella ............................................................................................. 31 4.2.2 Sorotipificação das amostras de Salmonella ...................................................... 32 4.2.3 Testes de sensibilidade a antibióticos ................................................................. 32 4.2.4 Extração do DNA ............................................................................................... 33 4.2.5 Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (ERIC – PCR) ...................... 33 4.2.6 Sequenciamento do genoma completo ............................................................... 34 4.2.7 Identificação in silico de genes de resistência a antibióticos.............................. 35 4.2.8 Testes de antagonismo por BAL ............................................................................. 35 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................................... 35 5.1 RESISTÊNCIA A ANTIBIÓTICOS .............................................................................. 35 5.2 ERIC – PCR ............................................................................................................... 41 5.3 TESTE DE ANTAGONISMO POR BAL ................................................................. 43 5.4 GENES DE RESISTÊNCIA A ANTIBIÓTICOS ..................................................... 46 6CONCLUSÃO .................................................................................................................. 51 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 52 13 1 INTRODUÇÃO O gênero Salmonella é conhecido há mais de 100 anos, o nome é uma referência ao médico veterinário e microbiologista Daniel Elmer Salmon que descreveu a doença associada à bactéria pela primeira vez (SARAIVA et al., 2016). O gênero Salmonella possui mais de 2.600 sorovares identificados (LEE et al., 2015) e é formado por pequenos bastonetes Gram-negativos, pertencentes à família Enterobacteriaceae (FORSYTHE, 2013). É uma bactéria causadora de infecções alimentares e geralmente estão associadas ao consumo de água e alimentos contaminados (aves, suínos e ruminantes), ou com o contato direto com animais infectados (MUNCK et al., 2020). A presença de Salmonella spp. em animais, matérias-primas de alimentos e ração gera um grande impacto econômico negativo para a agroindústria, podendo causar impedimento de comercialização e exportação de seus produtos (RODRIGUEZ; SUAREZ, 2014). Na Europa, as infecções alimentares causadas por Salmonella spp., de sorotipo não tifoide, são uma das principais causas de doenças transmitidas por alimentos, com mais de 90 mil casos confirmados em humanos relatados em 2019 e uma taxa de notificação de 20 casos por 100 mil habitantes (EFSA e ECDC, 2021). Nos Estados Unidos, Salmonella causa cerca 1,35 milhões de infecções, mais de 26 mil hospitalizações e 420 mortes anualmente (CDC, 2021). Já no Brasil, a real prevalência de infecções causadas por Salmonella não é precisa, pois apesar de se tratar de uma doença de notificação compulsória, os surtos nem sempre são notificados às autoridades sanitárias. Isso se deve também ao fato de que a maioria das gastroenterites não necessitam de hospitalização, nem de isolamento do agente causador (SANTOS et al., 2002). As notificações de doenças transmitidas por alimentos no Brasil, entre anos de 2013 e 2017 foram de mais de 3.500 casos, sendo que 123 foram comprovadamente causados por Salmonella spp. (CAETANO e PAGANO, 2019). A transmissão em humanos desse microrganismo patógeno pode ocorrer por meio do consumo de carne de aves e ovos, por isso é fundamental o controle e intervenções na cadeia de produção, o controle ambiental e a biossegurança nas granjas de frango têm um papel fundamental a fim de reduzir a contaminação por Salmonella no produto final (SERVER e AKAN, 2019; XIMENES et al., 2019). O controle de Salmonella spp. nas granjas de frango de corte é realizado através do tratamento em diferentes fontes. Diversos procedimentos, simultâneos ou sequenciais, são aplicados pelos veterinários e produtores das granjas, os quais podem ser: vacinação; tratamento com antimicrobianos; procedimentos de análise de chifonetes em equipamentos; entre outros (CHAMBERS e GONG, 2011; TELLEZ et al., 2012). 14 Em pesquisas recentes, o aumento no isolamento de cepas de Salmonella resistentes a diversos antibióticos gerou uma preocupação mundial, pois as medidas de tratamento das infecções podem se tornar limitadas (TACCONELLI et al., 2018). As bactérias podem adquirir genes de resistência a antibióticos de diferentes maneiras, envolvendo humanos, animais e ambiente. A aquisição desses genes geralmente é acelerada por meio de pressão seletiva. Na cadeia de produção, essa pressão seletiva pode ocorrer através da ração animal suplementada com antibióticos e/ou metais pesados, uso de antissépticos, biocidas e desinfetantes (FOUNOU et al., 2016; MARQUES et al., 2017; ONICIUC et al., 2019; RENSING et al, 2018; SOUCY et al., 2015;). Embora haja algumas exceções, os antibióticos utilizados na saúde humana geralmente são da mesma classe ou compostos usados na medicina veterinária e, ao contrário da medicina humana, o uso desses medicamentos na produção animal pode ser indicado para a promoção de crescimento e prevenção de doenças nas aves. Mesmo que atualmente haja um movimento global para reduzir o uso desses antimicrobianos para a promoção de crescimento, os antibióticos, ainda que utilizados em baixas dosagens, podem resultar no aumento e persistência de bactérias resistentes (ECONOMOU e GOUSIA, 2015). Devido a sua facilidade de adaptação, a aquisição de genes de virulência por Salmonella pode facilitar a disseminação dessa bactéria ao longo da cadeia alimentar (FOUNOU et al, 2016; ONICIUC et al., 2019). O surgimento de resistência bacteriana ocorre na interface de um sistema multifacetado de saúde única, acredita-se que a saúde humana não dependa apenas do comportamento relacionado a saúde da população humana, mas também das práticas industriais, agrícolas e veterinárias, bem como das condições ambientais (HERNANDO-AMADO et al., 2019). Um dos motivos que aceleram a resistência bacteriana é a “seleção”, predominantemente pelo uso de antibacterianos, em sua maioria (73%) utilizados em animais de produção (VAN BOECKEL et al., 2017, 2019). A prevenção e redução da carga de bactérias resistentes dentro de um sistema único de saúde deve ter uma abordagem multifatorial com foco nas especificidades do uso de antibióticos e nos tipos e prevalência das cepas resistentes em cada sistema (saúde humana, cadeia de produção e meio ambiente) (HOLMES et al., 2016). A saúde única visa alcançar resultados ótimos de saúde pública por meio de formulação e implementação de políticas, legislação, pesquisa científica e projetos em que vários setores colaborem juntos (LAXMINARAYAN et al., 2015). O compartilhamento eficiente de dados epidemiológicos, informações laboratoriais e a colaboração entre governo, medicina e agricultura são benéficos ao desenvolvimento da abordagem de saúde única para a prevenção e controle da resistência aos antibióticos (WANG et al., 2021). 15 Devido à preocupação aos riscos de contaminação por Salmonella na cadeia produtiva do frango, o setor tem buscado cada vez mais por alternativas que atendam aos preceitos de segurança dos alimentos, dos organismos de saúde nacionais e internacionais (NUNES et al., 2012). O controle de patógenos na agroindústria se concentra principalmente no uso de sanitizantes comerciais nas plantas de processamento com o objetivo de minimizar a contaminação cruzada entre as carcaças de frango e a contaminação dos equipamentos utilizados no processo (RASSCHAERT et al., 2008; USDA, 1996;). Ainda que a indústria venha trazendo cada vez mais medidas e tenha um papel importante no combate a contaminação por patógenos no produto final, métodos utilizados para reduzir esses patógenos ainda nas granjas podem ser eficazes para diminuir a contaminação nas carcaças de frango (ARSENAULT et al., 2007; GAST, 2007). Entre as medidas de segurança utilizadas nas granjas de produção de aves estão: vacinação nas matrizes de frango; ventilação para diminuir a umidade nas granjas; controle de insetos, pássaros e roedores; tratamento térmico da ração; tratamento da água potável; entre outros (GAST, 2007; MCKEE, 2012). As bactérias ácido láticas (BAL) desempenham um papel fundamental nos processos fermentativos, atuando na preservação dos alimentos. Isso é possível pois essas bactérias produzem uma variedade de antimicrobianos, como ácidos orgânicos, peróxido de hidrogênio, peptídeos antifúngicos e bacteriocinas (QUIGLEY et al., 2013). As BAL podem se tornar dominantes durante processos fermentativos de alimentos como resultado de sua conversão extremamente eficiente dos açúcares disponíveis na matriz e rápida formação de ácidos orgânicos capazes de inibir o crescimento de outros micro-organismos que podem estar presentes no meio (HUGENHOLTZ, 2008). O uso abusivo de antibióticos ao longo dos anos na avicultura contribuiu para o aparecimento de cepas resistentes (TEILLANT et al.,2015). A identificação dessas cepas é importante para que se busque novas possibilidades de impedir o seu desenvolvimento. Diante disso, vários estudos vêm sendo realizados para gerar alternativas para a substituir o uso de antibióticos e minimizar a contaminação por Salmonella. A caracterização dessas cepas em granjas é um dos passos mais importantes para identificar estratégias de prevenção e controle de Salmonella na cadeia de alimentos avícolas e para evidenciar o atual cenário em relação as cepas resistentes a antibióticos na cadeia produtiva. O presente estudo tem como objetivo avaliar o perfil fenotípico e genotípico de resistência a antimicrobianos em cepas de Salmonella Heidelberg isoladas da cadeia de produção de frango e o efeito antimicrobiano das BAL frente as cepas selecionadas com base no perfil de resistência encontrado, visando fornecer um 16 potencial antimicrobiano biológico para inibir o desenvolvimento de S. Heidelberg na cadeia de produção de frango. 2 OBJETIVO 2.1 OBJETIVO GERAL Avaliar o perfil fenotípico e genotípico de resistência a antimicrobianos de Salmonella Heidelberg isoladas da cadeia de produção de frango provenientes da análise de propés de cama aviária e o efeito antimicrobiano de cepas específicas de BAL frente a cepas selecionadas de S. Heidelberg com base no perfil de resistência encontrado. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Caracterizar o perfil de resistência a antimicrobianos das amostras de Salmonella Heidelberg isoladas frente aos principais antibióticos utilizados na produção de frango; Comparar o perfil genético das amostras de Salmonella Heidelberg utilizando a metodologia de ERIC – PCR; Analisar os genes de resistência a antibióticos através do sequenciamento total das amostras selecionadas a partir do antibiograma e ERIC-PCR; Avaliar in vitro o efeito antagonista de BAL frente as cepas selecionadas de Salmonella Heidelberg. 17 3 REVISÃO DA LITERATURA 3.1 SALMONELLA SPP. Salmonella spp. é uma bactéria Gram-negativa e de grande importância para a saúde pública em diversos países devido as doenças de origem alimentar causadas por ela. Pertencente à família Enterobacteriaceae, é dividida em duas espécies principais: Salmonella bongori e Salmonella enterica, possuindo mais de 2.600 sorotipos diferentes. É uma bactéria presente em diversos ambientes, que pode resistir por várias semanas em ambientes secos e por vários meses na água (COBURN et al., 2007). Segundo a Organização Mundial da Saúde, a Salmonella spp. é uma das quatro causas principais de doenças diarreicas afetando cerca de 550 milhões de pessoas por ano no mundo. As infecções em humanos são geralmente leves e se manifestam como uma gastroenterite autolimitada. Porém, grupos de alto risco, como bebês, idosos e indivíduos imunocomprometidos, podem desenvolver doenças sistêmicas que requerem intervenção antibiótica. Em alguns casos podem evoluir e até tornar-se fatal, isso irá depender de diversos fatores, desde as condições do hospedeiro, concentração do inóculo, fatores de virulência até o sorotipo de Salmonella spp. que causou a infecção (CRUMP et al., 2015). As infecções causadas por Salmonella geralmente são limitadas, e geralmente são indicados apenas a reposição de fluidos e eletrólitos. A recomendação para o uso de antibióticos em humanos é que devem ser reservados para pacientes com casos graves ou pacientes que já tenham algum risco de saúde pré-existente (CRUMP et al., 2011). A falta de controle no uso de antibióticos contribui para a resistência antimicrobiana desse agente infeccioso (KUMAR et al., 2013). Salmonella é conhecida por sua capacidade de formar biofilme em diferentes superfícies como aço inoxidável, madeira, plástico e vidro (DANTAS et al, 2018; OLIVEIRA et al., 2014; WANG et al., 2013). A produção de biofilme é uma estratégia de sobrevivência para esse patógeno, pois o mesmo protege os microrganismos presentes na matriz, aumentando sua resistência em ambientes desfavoráveis e à ação de antibióticos, sanitizantes e do sistema imunológico, permitindo assim a propagação de Salmonella no ambiente e sua transmissão para novos hospedeiros (SPECTOR e KENYON, 2012; ZADERNOWSKA e CHAJECKA- WIERZCHOWSKA, 2017; ZHAO et al, 2017). O controle do crescimento de Salmonella na carne, desde a etapa de produção, é necessário para prevenir possíveis surtos de infecção alimentar. Saber a extensão do seu crescimento é importante para a avaliação da segurança e risco de produtos contaminados (HUANG, 2020). 18 Existe cada vez mais uma preocupação com a segurança microbiológica dos alimentos desde o produtor até o consumidor. Diversos métodos de desinfecção são conhecidos para combater micro-organismos patogênicos, como ácidos orgânicos, desinfetantes, vapor d’água, entre outros. Porém, alguns podem alterar as propriedades organolépticas dos alimentos (SPRICIGO et al., 2013). Na carne e produtos cárneos, o tratamento térmico é o principal meio de inativação de micro-organismos patógenos que podem estar presentes nos alimentos (GRIFFIS E OSAILI, 2009). Sua eficácia depende do tempo e da temperatura de exposição do patógeno e também da composição do produto submetido a esse método (OSAILI et al., 2013). A preocupação, por parte do consumidor, com a adição de compostos sintéticos nos alimentos e a procura por alimentos “mais naturais; clean label”, gera um interesse cada vez maior no desenvolvimento de antimicrobianos orgânicos para a conservação dos alimentos (NAIR et al, 2014). 3.1.1 Salmonella spp. em granjas de frango de corte A presença de Salmonella em aves saudáveis, ou seja, sem sintomas detectáveis (infecções subclínicas/portadores saudáveis), é considerado o principal fator de risco para doenças de origem alimentar, pois o transporte dessas aves vivas assintomáticas aumenta o risco de disseminação do patógeno na granja e permite que essas bactérias sejam transmitidas facilmente através dos ovos e carne de aves para os consumidores (CAP et al., 2020; DEWI et al., 2021). Embora Salmonella esteja presente em diversos tecidos das aves, em localizações intra e extracelulares, seu principal reservatório é o trato intestinal, caracterizando a transmissão horizontal na cadeia produtiva (BARROW et al., 2012). O trato digestivo das aves possui um diverso grupo de microrganismos, onde há interações complexas com o hospedeiro e o ambiente. Essas interações mantem a saúde das aves e influenciam o sistema imunológico do hospedeiro, modulando as funções bioquímicas associadas a quebra de nutrientes, fortalecendo a morfologia e fisiologia intestinal, atuando sobre as toxinas e patógenos (PAN e YU, 2014). O sistema digestivo das aves é curto se comparado a outros animais, seu trânsito total é inferior a 3,5 horas, essa característica favorece a sobrevivência de microrganismos com alta capacidade de adesão na mucosa intestinal, como é o caso de Salmonella (HUGHES, 2008; PAN e YU, 2014). A cadeia de produção de frango consiste em operações integradas que compreende granjas de matrizes, central de incubatório, granjas de frango de corte, abate e processamento de carcaça (GLATZ e PYM, 2015). Portanto, a disseminação de Salmonella em granjas de 19 frango pode ocorrer de maneira vertical através da reprodução de frangos já contaminados, ou de maneira horizontal, por transmissão oriunda de lotes anteriores já contaminados, quando a limpeza da granja não é efetiva contaminando o próximo lote, ou por fontes ambientais como ração ou água contaminada (DAR, et al., 2017; ROSE et al., 2000). Além disso, Salmonella pode resistir por vários meses no trato gastrointestinal do frango e sobreviver por mais de dois anos na cama aviária e na ração (BEAL et al., 2004; DAVIES e BRESLIN, 2003). A contaminação também pode ocorrer duranteas operações pré-abate e transporte dos frangos para o abatedouro, o estresse pode levar ao aumento de eliminação de excreções e a proximidade de outros frangos em caixa pode resultar em uma alta transmissão cruzada (MARIN e LAINEZ, 2009). A contaminação no abatedouro pode acontecer por diferentes maneiras: a presença inicial de Salmonella no frango oriunda da granja, contaminação cruzada de frangos de lotes diferentes que foram abatidos no mesmo dia ou a transmissão através de focos de contaminação de Salmonella já existente no abatedouro (SHANG et al., 2019). No abatedouro, a etapa de evisceração dos animais também é uma importante via de contaminação por Salmonella, a qual pode ocorrer através das fezes das aves ou ferramentas, pisos e paredes mal higienizadas, assim como os próprios manipuladores que também podem ser um meio de contaminação. A contaminação cruzada das carcaças e produtos cárneos também pode continuar durante o manuseio, processamento e preparação da carne (KAGAMBEGA et al., 2013; TADESSE E GEBREMEDHIN, 2015). Em um estudo realizado por Volkova et al. (2010), foi detectada contaminação em cama de granjas de frango, no primeiro ou segundo lote e permaneceu em, pelo menos, mais quatro lotes subsequentes, sendo Salmonella Heidelberg o sorovar mais frequente (87,5%). Esse resultado aumenta a possibilidade de contaminação nas carcaças de frango durante o processamento. A cama das granjas atua como um ambiente extra-intestinal para a seleção natural de cepas de Salmonella, permitindo a adaptação e expressão dos fatores de virulência adquiridos, o que influencia na capacidade de resistência no ambiente tornando as medidas de prevenção e limpeza menos eficazes (OLADEINDE et al., 2018). Diversos fatores genéticos que conferem características fenotípicas como capacidade de adesão, resistência a desinfetantes e metais pesados, bem como mecanismos de imunoevasão, permitem que vários sorotipos de Salmonella persistam no ambiente de produção e estabeleçam infecções bem-sucedidas em aves. Isso dificulta a implementação de estratégias efetivas para o controle de Salmonella nas agroindústrias. Os sorotipos e também genótipos devem ser considerados para entender a dinâmica deste patógeno em todo o sistema de produção (MEDINA-SANTANA et al., 2022). Por esses motivos, o monitoramento é essencial para 20 determinar a prevalência de Salmonella na fase de pré-alojamento nas granjas, onde as análises de amostras ambientais e de equipamentos são consideradas um meio eficiente de detecção e controle de Salmonella (MUELLER-DOBLIES et al., 2009). 3.2 SALMONELLA HEIDELBERG O sorovar Heidelberg foi isolado e relatado em produtos avícolas no Brasil a partir de 1962 (HOFER et al., 1997). Em três frigoríficos diferentes no sul do Brasil, carcaças de frango analisadas antes e depois do resfriamento apresentaram resultados positivos para Salmonella de 31,7 e 20%, respectivamente, e destas, 63,9% foram identificadas como S. Heidelberg (DICKEL, 2004). Outro estudo também realizado no Brasil analisou 146 isolados provenientes de carne de frango nos anos de 2014 e 2017, identificando 55% das cepas como o sorovar Heidelberg (RAU et al., 2021). Em 2012, Bounar-Kechih et al., identificaram 13 sorotipos diferentes em amostras de Salmonella isoladas de aves em 4 províncias da Argélia, sendo que o mais prevalente (24%) foi Salmonella Heidelberg. Nos casos de contaminação em seres humanos, ovos e aves foram identificados como as principais fontes de contaminação por Salmonella Heidelberg, esse sorovar pode ser mais invasivo em humanos do que os outros sorovares não tifoides (CHITTICK et al., 2006). Em 2015, os cinco sorovares de Salmonella enterica mais comumente isolados foram Enteritidis, Typhimurium, Newport, Salmonella monofásica (1,4,[5], 12:i:-) e Heidelberg, sendo esses sorovares responsáveis por mais da metade das infecções por Salmonella nos Estados Unidos (CDC, 2018; MEDALLA et al., 2016). Nos EUA, Canadá e União Europeia, a salmonelose é identificada como a segunda doença mais frequente transmitida por alimentos (SARAIVA et al., 2016). A constante detecção de S. Heidelberg em camas aviárias, especialmente no sul do país, revela que o manejo dessas camas não está sendo adequado e merece especial atenção. Sob o ponto de vista de controle de riscos microbiológicos, o reuso da cama deve ser condicionado ao uso de tratamentos comprovadamente eficazes na inativação de patógenos residuais antes de alojar o lote subsequente (VAZ et al, 2019). No Brasil, S. Heidelberg está entre as Salmonelas não tifoides mais problemáticas para a avicultura de corte, devido a sua habilidade de persistir no ambiente avícola no período entre lotes, (VOSS-RECH et al, 2019), por esse motivo está entre os sorovares mais isolados em carcaças de frangos e perus no país (BRASIL, 2021). 21 3.3 RESISTÊNCIA A ANTIMICROBIANOS Os antibióticos são utilizados desde a década de 1960 para reduzir a mortalidade em aves jovens, que é causada por uma variedade de patógenos, incluindo Salmonella. Seu uso acelerado sempre causou preocupação global com o desenvolvimento de bactérias resistentes, na maioria dos casos mediada por plasmídeos transmissíveis. Em relação a Salmonella, alguns sorovares apresentam resistência a diferentes antibióticos e isso acaba afetando a cadeia produtiva (BARROW et al., 2012). O conceito de resistência antimicrobiana pode ser definido como a habilidade de um micro-organismo continuar a multiplicar-se ou persistir na presença de níveis terapêuticos de um determinado agente antimicrobiano (ANVISA, 2012). Durante as últimas décadas, os antibióticos estão perdendo a sua eficácia devido ao rápido aparecimento de cepas resistentes a antibióticos (SALEEM et al., 2010). Segunda a FDA, nos Estados Unidos, país onde os antibióticos são amplamente utilizados na produção animal, há mais quilos de antibióticos vendidos para esses animais do que para uso em humanos (CDC, 2013). Ainda segundo o CDC, mais de 2,8 milhões de pessoas são infectadas por bactérias resistentes a antibióticos anualmente nos Estados Unidos levando a morte de mais de 35 mil pessoas (CDC, 2021). A coleta e análise de amostras na produção animal é considerada uma prioridade para uma vigilância integrada de bactérias resistêntes a antimicrobianos. Essas amostras podem fornecer uma medida imparcial da resistência antimicrobiana em animais que são fonte de alimentação humana. Em todo o mundo, Salmonella, é prioridade quando se trata de investigação de bactérias resistêntes de origem alimentar. Na cadeia de produção animal, as amostras podem ser coletadas em varias etapas do processo, tanto nas granjas quanto no abatedouro. Essas amostras geralmente são coletadas para atender a uma legislação específica, ou para auto-controle da industria, e servem como dados para investigar possíveis bactérias resistentes a antibióticos (WHO, 2017). O uso contínuo e generalizado de antimicrobianos em frangos para tratamento terapêutico, profilaxia e promoção de crescimento vem gerando um aumento da propagação e seleção de formas multirresistentes de cepas de Salmonella em animais produtores de alimentos, gerando um problema cada vez maior na cadeia produtiva de alimentos (CHANTZIARAS et al., 2014; POSTMA et al., 2016). Esse fato tem ainda mais relevância nos países em desenvolvimento, onde o uso indevido e a falta de controle sobre os antibióticos é um problema que precisa ser solucionado (REARDON, 2014). 22 A resistência de Salmonella a antimicrobianos aumenta a dificuldade de tratamentos e não traz os benefícios esperados no uso de medicamentos (COLLARD et al., 2007). O tratamento de aves com antibiótico também não é uma opção ideal, pois além de promover a resistência de cepas patógenas, os resíduos dos antibióticos administrados nos animais podem afetardiretamente o sistema imunológico, crescimento e os processos do metabolismo humano (MUHAMMAD et al., 2020). Diferentes mecanismos podem causar a resistência de uma bactéria a antibióticos como, produzir enzimas que degradam o princípio ativo do antibiótico, alterar a permeabilidade da membrana celular, afetar a estrutura da parede celular, interferir na síntese de proteínas ou DNA prejudicando o mecanismo de ação do antibiótico ou também reduzir a concentração intracelular do antimicrobiano (BARBOSA e LEVI, 2000; GIEDRAITIENE et al, 2011). Diante do uso expressivo dos antimicrobianos, os micro-organismos podem desenvolver e/ou adquirir uma variedade de genes ou sofrerem mutações que conferem resistência aos antimicrobianos e também aumentam a virulência da bactéria. Alguns desses genes conhecidos estão localizados em elementos genéticos móveis, como plasmídeos, transposons, sequencias de inserção e nas ilhas de patogenicidade. Consequentemente, esses genes são facilmente transferidos entre bactérias que vivem no mesmo habitat. Sendo assim, Salmonella pode desempenhar um papel importante como receptora ou doadora de genes de resistência sendo relevante para a difusão genética, gerando um risco de origem alimentar para a saúde humana (MCMILLAN et al., 2019). A resistência a antibióticos trata-se de um problema global, onde já existem diversos estudos com o objetivo de modificar a forma de tratamento e procedimentos em relação ao uso de antimicrobianos. Com bases nesses estudos, sabemos que os sorovares e níveis de resistência são diferentes de país para país, portanto a determinação de sorovares resistentes em diferentes áreas é necessário para controlar a transmissão de infecção dentro e fora de determinada região. A carne de frango produzida do Brasil é exportada para diversos continentes. Os serviços de saúde, particularmente em saúde alimentar, são os mesmo em muitas regiões do mundo, como nos países da Europa. Porém, em algumas áreas, como no Oriente Médio por exemplo, a cobertura e a qualidade dos programas relacionados à alimentação são muito diferentes entre seus países (NADI et al., 2020). 3.4 SAÚDE ÚNICA (ONE HEALTH) 23 Segundo a Organização Mundial da Saúde, Saúde Única (do inglês one health) é uma abordagem integrada e unificadora para equilibrar e otimizar a saúde das pessoas, animais e ecossistema, usando ligações estreitas e interdependentes entre esses campos para criar novos métodos de vigilância e controle de doenças. A saúde dos seres humanos, animais e ecossistema estão intimamente interligadas, as mudanças nessas relações podem aumentar o risco de desenvolvimento e disseminação de novas doenças tanto em humanos quanto em animais. O objetivo da saúde única é integrar esses setores, em vez de mantê-los separados, para isso é necessário colaboração, comunicação e coordenação entre as partes envolvidas. A agricultura, pecuária, comércio de animais, urbanização, indústrias, mudanças climáticas e invasões de áreas selvagens são alguns fatores que criaram novas oportunidades para o surgimento e disseminação de doenças. Cerca de 60% das doenças infecciosas emergentes relatadas globalmente são de origem animal, tanto selvagem quanto doméstico. Mais de 30 novos patógenos humanos foram descobertos nas últimas 3 décadas, dos quais 75% tiveram origem em animais (WHO, 2022). As origens do termo saúde única são seculares e baseiam-se na dependência mútua de humanos e animais e no reconhecimento de que eles compartilham não apenas o mesmo ambiente, mas também muitas doenças infecciosas (ZINSSTAG et al., 2012). Segundo Burns e Stephen (2015), a saúde única é pragmática por natureza e sustentada por um princípio de pesquisa para ação que busca mudanças no mundo real. Ruegg et al. (2017) argumentam ainda que a saúde única posiciona os profissionais de saúde como agente de mudanças. A saúde única ressalta que o crescimento sustentado da população humana é afetado pelas mudanças climáticas e pela redução dos recursos naturais, sugerindo que vários setores devem trabalhar juntos para a segurança global da saúde humana, animal e do ecossistema (SO et al., 2015). Porem a maioria dos sistemas de vigilância são implementados separadamente para o setor de saúde humana e animal (WENDT et al., 2015). Uma abordagem de saúde única é necessária para abordar efetivamente o surgimento de doenças, bem com outros problemas complexos, como a resistência antimicrobiana, produção sustentável de alimentos, segurança e proteção alimentar, perda de biodiversidade, manutenção de ecossistemas hídricos e as consequências das mudanças climáticas (CRONIN et al., 2014). As oportunidades para aumentar a conscientização e a compreensão da dimensão da resistência antimicrobiana baseada na saúde única incluem a promoção da saúde e programas de proteção da saúde oferecidos por organizações de saúde pública e saúde animal, campanhas de informação ao consumidor, atividades de sensibilização de agricultores, médicos veterinários, publicações por parte das indústrias e desenvolvimentos profissional. O histórico 24 de algumas dessas principais tentativas de abordar os problemas de resistência antimicrobiana na saúde única mostra que existe diferenças notáveis entre os países, na velocidade e eficiência com que eles fizeram grandes mudanças regulatórias na disponibilidade de antimicrobianos para uso em animais com base em preocupações com a saúde humana. Globalmente, a Europa e os Estados Unidos tem sido os centros dominantes de atividade regulatória, com alguns outros países seguindo o exemplo, particularmente em relação as abordagens dos EUA (MCEWEN e COLLIGNON, 2018). A resistência antimicrobiana requer uma abordagem multidisciplinar, multissetorial e coordenada para lidar com as ameaças a saúde na interface humano-animal- ambiente (ROBINSON et al., 2016). De uma perspectiva econômica, a abordagem “One Health” pode coordenar, comunicar e colaborar com vários setores, partes interessadas e formuladores de políticas para melhorar a saúde interligada de humanos, animais e meio ambiente (PRESTINACI et al., 2015). Atualmente, é um desafio mudar o atual paradigma da saúde para o modelo saúde única, baseado em diversas ecologias e geografias. Para estabelecer o padrão saúde única, é essencial uma avaliação forte e considerável de seus benefícios. A economia tem duas características significativas para ajudar a pensar sobre esse conceito, o uso eficiente de recursos e o valor da substituição do modelo de saúde atual. A comparação entre os custos é fundamental para transformar a abordagem convencional de saúde para a abordagem “One Health”. Por exemplo, uma redução na carga de doenças é um resultado potencial do conceito One Health, que pode gerar redução de custos em diversos setores (ASLAM et al., 2021). A relação genética baseada em sequenciamento total entre isolados de diversas fontes pode ser útil para entender as possíveis rotas de transmissão entre os nichos da Saúde Única. Por fim, os registros de metadados precisos é fundamental e deve ser feito de acordo com procedimentos harmonizados entre os diversos setores de atuação (GRIFFITHS et al., 2017). 3.5 SEQUENCIAMENTO DO GENOMA COMPLETO (WGS) A técnica WGS é o método mais discriminatório disponível para estabelecer se um organismo está relacionado a outro. WGS é uma abordagem baseada na identidade genética ou impressão digital de um organismo que é definido em seu ácido desoxirribonucleico (DNA). WGS é uma técnica realizada em laboratório através de um sequenciador. Os dados obtidos são analisados por uma abordagem matemática, denominada bioinformática (BAERT et al., 2021). O fluxo de trabalho WGS consiste em várias etapas, obtenção de uma cultura pura do isolado, 25 extração do DNA, preparação e amplificação da biblioteca, sequenciamento, análise dedados e interpretação de bioinformática (ALLARD et al., 2012; BAERT et al., 2021). WGS tem o poder discriminatório mais forte dos métodos de caracterização atualmente conhecidos e é mais eficaz quando se trata de determinar se vários isolados tem uma origem comum. Essa técnica é capaz de determinar como eles estão relacionados e, através de um banco de dados, é possível determinar se o microrganismo pode estar relacionado algum isolado vinculado a ingredientes, produtos acabados ou surto de doenças. Portanto, o WGS pode ajudar a identificar a causa raiz de uma fonte de contaminação, o que pode levar a eliminação ou evitar sua recorrência. Isolados intimamente relacionados são mais propensos a compartilhar um ancestral comum ou que pode ter sofrido mutação ao longo do tempo. Isso é útil para analisar a causa raiz de uma contaminação na indústria de alimentos por exemplo, pois um alto grau de similaridade, onde apenas alguns pares de bases são diferentes, pode indicar uma fonte comum de contaminação. Porém, algumas bactérias sofrem mutação continuamente, perfis genéticos altamente relacionados podem também ser resultado de eventos paralelos e independentes, portanto as conclusões precisam ser tiradas em conjunto com outros fatos, como origem do isolado, local da amostragem, data, entre outros (BAERT et al., 2021). O WGS pode ser útil para a indústria de alimento revelar mais informações sobre seus isolados microbianos. Por exemplo, identificar uma resistência potencial contra agentes de limpeza e desinfecção pode ser usado para determinar qual método de desinfecção será mais bem sucedido (EFSA et al., 2019). Além da caracterização de isolados, o WGS também é aplicável na microbiologia diagnóstica, para a determinação de perfis de resistência antimicrobiana, estabelecer fontes de infecções recorrentes e transmissão entre pacientes. As sequencias genômicas obtidas também fornecem um rico recurso que pode ser explorado para prever fenótipo do patógeno, as principais características de relevância clínica, resistência a antibiótico e virulência, mas também podem incluir outras características, como a capacidade de formar biofilmes ou a sobrevivência do microrganismo no ambiente (BALLOUX et al., 2018). A tecnologia WGS é altamente adequada para Salmonella e vários outros patógenos de origem alimentar. Para cepas de Salmonella, WGS está substituindo ferramentas convencionais como o Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), que muitas vezes não é adequada para rastrear com precisão fontes de contaminação (ALLARD et al., 2012). O WGS fornece dados que não são possíveis com outras técnicas, pois possui maior poder de discriminação. Esse nível de detalhamento não é necessário em todas as situações, mas em alguns casos, por exemplo, para demonstrar clonalidade entre cepas, o WGS é a única solução (BAERT et al., 2021). Entre as principais vantagens de uso de sequenciamento genético, é que 26 ela permite a geração de um número suficiente de leituras de alta qualidade para os conjuntos de dados WGS e algoritmos de bioinformática para realizar análises subsequentes através da grande quantidade de dados resultantes (KHACHATRYAN et al., 2020). Assim, o WGS já está sendo bastante explorado pela indústria de alimentos para melhorar a segurança dos alimentos (RANTSIOU et al., 2018), porém, devido à alta complexidade, custo e tempo de obtenção dos resultados, ainda não é um método que faz parte da rotina das indústrias. No entanto, o WGS é uma ferramenta poderosa no portifólio de métodos disponíveis para ser utilizado pela indústria (BAERT et al., 2021). 3.6 BACTÉRIAS ÁCIDO LÁTICAS (BAL) As BAL são utilizadas na produção de alimentos fermentados. São caracterizadas como não formadoras de esporos, bastonetes ou cocos Gram-positivos, catalase negativa, que compartilham muitas propriedades bioquímicas e fisiológicas (ABRIOUNEL et al., 2012). As BAL são bactérias de grande interesse para a indústria de alimentos, pois desempenham um papel fundamental no processo de fermentação anaeróbia e por suas características potencialmente probióticas. Elas fazem parte da microbiota saudável do intestino humano. Algumas são consideradas probióticas, pois são bactérias benéficas que colonizam o intestino de humanos e animais. Algumas bactérias desse grupo são tolerantes ao meio ácido e bile e pode aderir a superfícies epiteliais intestinais. Algumas também apresentam atividade antagonista a micro-organismos patogênicos e outras propriedades antimicrobianas, como por exemplo, a produção de ácidos orgânicos, peróxido de hidrogênio, peptídeos antifúngicos e bacteriocinas (QUIGLEY et al., 2013; WAN et al., 2016). Por isso, os efeitos benéficos dessas bactérias não se limitam apenas à produção e preservação de alimentos, mas também podem ser uma alternativa ao uso de antibióticos tradicionais, especialmente no controle do problema global de resistência antimicrobiana (COTTER et al., 2013). Os micro-organismos antagonistas adicionados a produtos alimentícios para inibir patógenos ou prolongar a vida útil dos alimentos, enquanto afetam o mínimo possível as características sensoriais, são chamados de culturas protetoras (LUCKE, 2000). As BAL geralmente são utilizadas como culturas protetoras pela indústria, pois são bactérias que já estão presentes naturalmente em produtos alimentícios, tem um longo histórico de uso seguro e fazem parte da microbiota intestinal de humanos e animais (MARAGKOUDAKIS et al., 2009). Além de serem utilizadas para inibir patógenos nos alimentos, as BAL também podem agregar valor 27 ao produto final. As culturas selecionadas são utilizadas na indústria proporcionando segurança microbiológica, uniformidade e a qualidade do produto final (ROSS et al., 2002). Os ácidos orgânicos produzidos pelas BAL são food grade, e são amplamente utilizados para controlar patógenos de origem alimentar em produtos alimentícios. Sua atividade antibacteriana pode variar dependendo do estado fisiológico do organismo e das características físico-químicas do ambiente externo (AL-NABULSI et al., 2014; RICKE, 2003). A multirresistência das bactérias patógenas e a formação de biofilme levam a falta de eficácia dos antibióticos disponíveis para o tratamento de infecções, enquanto a administração de bactérias ácido láticas tem se mostrado funcional na prevenção e combate de infecções (VUOTTO et al., 2014). Em estudo realizado por Wang et al. (2015), 0,5% de ácido lático foi utilizado para inibir completamente o crescimento de células de S. Enteritidis e Escherichia coli após 1 hora de incubação e Listeria monocytogenes após 2 horas, ambas com concentração inicial de 10-7 UFC/ml. O uso de BAL também são desejáveis em granjas, pois apresentam outras características além do efeito antimicrobiano. Por exemplo, a fosfatase excretada pelas BAL pode levar a melhora da digestão do fosfato em frangos, sendo que algumas BAL com propriedades probióticas podem reduzir micotoxinas quando presentes na ração (NEVELING et al., 2020; HAQUEA et al., 2020). Levando em consideração a importância da Salmonella, o uso de BAL pode ser um mecanismo de prevenção as complicações causadas por esse patógeno (RAHIMIFRAD et al., 2016). 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 MATERIAL 4.1.1 Micro-organismos 4.1.1.1 Isolados de Salmonella Heidelberg Para o desenvolvimento do estudo, cepas de S. Heidelberg isoladas de granjas de frango de corte reincidentes (granjas positivas em amostras de propé de cama aviária para S. Heidelberg em dois lotes seguidos) foram coletadas através de propés de cama aviária em 18 diferentes cidades dos Estados de Santa Catarina, Paraná e Bahia, entre os anos de 2019 e 2020 (Quadro 1). 28 Quadro 1. Origem e data de coleta dos isolados utilizados no estudo. Identificação Data de coleta Origem 1 08/04/2019 Nova Trento – SC2 09/09/2019 Nova Trento-SC 3 23/09/2019 Mafra - SC 4 23/09/2019 Mafra-SC 5 19/12/2019 Mafra-SC 6 05/06/2019 Lapa-PR 7 03/09/2019 Lapa-PR 8 03/09/2019 Lapa-PR 9 30/04/2019 Rio Negro-PR 10 06/08/2019 Rio Negro-PR 11 02/07/2019 São Bonifacio-SC 12 02/07/2019 São Bonifacio-SC 13 09/09/2019 Itaiópolis-SC 14 12/11/2019 Itaiópolis-SC 15 11/02/2019 Araquari-SC 16 03/06/2019 Araquari-SC 17 26/02/2019 Canelinha-SC 18 26/02/2019 Canelinha-SC 19 28/05/2019 Canelinha-SC 20 05/06/2019 Lapa-PR 21 03/09/2019 Lapa-PR 22 03/09/2019 Lapa-PR 23 03/09/2019 Lapa-PR 24 03/09/2019 Lapa-PR 25 03/12/2019 Lapa-PR 26 03/12/2019 Lapa-PR 27 03/12/2019 Lapa-PR 28 24/04/2019 Mandirituba-PR 29 24/04/2019 Mandirituba-PR 30 17/07/2019 Mandirituba-PR 31 10/06/2019 Mandirituba-PR 32 21/08/2019 Mandirituba-PR 33 21/08/2019 Mandirituba-PR 34 20/05/2019 São José dos Pinhais-PR 35 20/05/2019 São José dos Pinhais-PR 36 20/05/2019 São José dos Pinhais-PR 37 20/05/2019 São José dos Pinhais-PR 38 30/07/2019 São José dos Pinhais-PR 39 09/07/2019 São Mateus do Sul-PR 40 03/09/2019 São Mateus do Sul-PR 29 Identificação Data de coleta Origem 41 15/07/2019 Lapa-PR 42 18/12/2019 Lapa-PR 43 24/04/2019 São José dos Pinhais-PR 44 30/07/2019 São José dos Pinhais-PR 45 25/02/2019 Schroeder-SC 46 23/09/2019 Schroeder-SC 47 10/07/2019 Lapa-PR 48 10/07/2019 Lapa-PR 49 10/07/2019 Lapa-PR 50 28/05/2019 Lapa-PR 51 28/05/2019 Lapa-PR 52 13/08/2019 Lapa-PR 53 28/05/2019 Lapa-PR 54 13/08/2019 Lapa-PR 55 08/04/2019 Campo do Tenente-PR 56 15/07/2019 Campo do Tenente-PR 57 10/06/2019 Lapa-PR 58 21/08/2019 Lapa-PR 59 08/04/2019 Lapa-PR 60 30/07/2019 Lapa-PR 61 09/12/2019 Lapa-PR 62 05/06/2019 Lapa-PR 63 05/06/2019 Lapa-PR 64 13/08/2019 Lapa-PR 65 26/10/2020 Mandirituba-PR 66 19/09/2019 Bela Vista do Toldo-SC 67 02/12/2019 Bela Vista do Toldo-SC 68 28/01/2019 Jaraguá do Sul-SC 69 12/11/2020 Coração de Maria-BA 70 21/10/2019 Jaraguá do Sul-SC 71 10/04/2019 Lapa-PR 72 02/07/2019 Lapa-PR 73 02/07/2019 Lapa-PR 74 04/09/2019 Lapa-PR 75 04/09/2019 Lapa-PR 76 04/12/2019 Lapa-PR 77 03/07/2019 Mandirituba-PR 78 04/09/2019 Mandirituba-PR 79 04/09/2019 Mandirituba-PR 80 12/02/2020 Lapa-PR 81 12/02/2020 Lapa-PR 82 04/05/2020 Lapa-PR 83 04/05/2020 Lapa-PR 84 07/07/2020 Lapa-PR 30 Identificação Data de coleta Origem 85 07/07/2020 Lapa-PR 86 04/05/2020 Lapa-PR 87 07/07/2020 Lapa-PR 88 09/03/2020 Rio Negro-PR 89 09/03/2020 Rio Negro-PR 90 19/05/2020 Rio Negro-PR 91 02/01/2020 Canoinhas-SC 92 02/01/2020 Canoinhas-SC 93 08/06/2020 Canoinhas-SC 94 08/06/2020 Canoinhas-SC 95 13/01/2020 Jaragua do Sul-SC 96 09/07/2020 Jaragua do Sul-SC 97 10/03/2020 Rio Negro-PR 98 20/05/2020 Rio Negro-PR 99 25/02/2020 Lapa-PR 100 25/02/2020 Lapa-PR 101 25/02/2020 Lapa-PR 102 25/02/2020 Lapa-PR 103 25/05/2020 Lapa-PR 104 25/05/2020 Lapa-PR 105 25/05/2020 Lapa-PR 106 10/11/2020 Quitandinha-PR 107 25/05/2020 Lapa-PR 108 06/01/2020 Mandirituba-PR 109 06/01/2020 Mandirituba-PR 110 30/03/2020 Mandirituba-PR 111 04/03/2020 Piên-PR 112 05/05/2020 Piên-PR 113 26/02/2020 Lapa-PR 114 08/07/2020 Lapa-PR 115 08/07/2020 Lapa-PR 116 06/04/2020 Lapa-PR 117 10/06/2020 Lapa-PR 118 08/01/2020 Lapa-PR 119 27/05/2020 Lapa-PR 120 06/01/2020 Mafra-SC 121 23/03/2020 Mafra-SC 122 10/02/2020 Rio Negro-PR 123 21/04/2020 Rio Negro-PR 124 10/02/2020 Lapa-PR 125 10/02/2020 Lapa-PR 126 07/07/2020 Lapa-PR 127 20/01/2020 Mafra-SC 128 04/06/2020 Mafra-SC 31 Identificação Data de coleta Origem 129 22/09/2020 Rio Negro-PR 130 28/09/2020 Rio Negro-PR As amostras foram analisadas através da metodologia descrita na Portaria n° 126/1995 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA). Foram utilizadas 130 cepas de S. Heidelberg previamente isoladas e estocadas em temperatura ambiente em tubos contendo ágar nutriente (Kasvi, São José do Pinhais, PR, Brasil). A pureza das cepas foi avaliada antes da reativação utilizando a técnica de esgotamento em ágar Hecktoen (Merck, São Paulo, Brasil). 4.1.1.2 Bactérias ácido láticas (BAL) As BAL foram provenientes do cepário do Laboratório de Tecnologia de Alimentos e Bioprocessos do Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos (CAL) da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC). Foram utilizadas 10 cepas de BAL para o teste de antagonismo reativadas em caldo Man, Rogosa e Sharpe (MRS, Merck, São Paulo, Brasil) (Quadro 2). Quadro 2. Identificação das cepas de BAL utilizadas para o teste de antagonismo. BIOTIPO ESPÉCIE LBP UFSC 001 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus LBP UFSC 013 Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei LBP UFSC 014 Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei LBP UFSC 017 Limosilactobacillus fermentum LBP UFSC 018 Lactobacillus acidophilus LBP UFSC 019 Lacticaseibacillus casei LBP UFSC 021 Lactiplantibacillus plantarum LBP UFSC 022 Latilactobacillus sakei LBP UFSC 024 Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei LBP UFSC 025 Streptococcus thermophilus 4.2 MÉTODOS 4.2.1 Análise de Salmonella A identificação dos isolados foi realizada através da análise microbiológica baseada na Portaria n° 126/1995 – MAPA. As amostras de propés foram diluidas em água peptonada 32 tamponada 1% (Merck, São Paulo, Brasil) na proporção de 1:10 e incubadas a 36±1 °C por 18 a 24 horas, depois foi inoculado 1000 mL em caldo tetrationado (Merck, São Paulo, Brasil) e 100 µL em caldo Rappaport Vassiliadis (Merck, São Paulo, Brasil) e incubados a 42±1 °C por 18 a 24 horas. Posteriormente, as amostras foram plaqueadas em ágar hektoen (Merck, São Paulo, Brasil) e ágar verde brilhante vermelho de fenol (Merck, São Paulo, Brasil) e novamente incubadas a 36±1 °C por 18 a 24 horas. As colônias suspeitas foram submetidas a provas bioquímicas e posteriormente foi realizada a sorotipificação. 4.2.2 Sorotipificação das amostras de Salmonella A partir de uma colônia de Salmonella cultivada em ágar nutriente, foi adicionado 0,5 mL de solução salina NaCl 0,85% (c/v). Em seguida foi pipetado em uma placa de vidro 10 µL da solução bacteriana e acrescentado 10 µL do antissoro somático Poli A-67 (SSI, Hillerod, Dinamarca). Após 30 segundos foi realizada a leitura da formação de grumos, indicando reação positiva ao antissoro testado. Da mesma forma, os isolados foram testados para o antissoro somático 0:4 (grupo B), e para os flagelares H:2 e H:r segundo BRASIL (1995). As 130 cepas utilizadas neste estudo foram positivas para os antissoros testados. 4.2.3 Testes de sensibilidade a antibióticos Os antibiogramas foram realizados de acordo com o método do The Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2021). Cada cultura microbiana foi reativada em caldo BHI (Brain heart infusion) (Merck, São Paulo, Brasil) e incubada a 36 ± 1°C pelo tempo necessário para atingir a turbidez 0,5 da escala McFarland (aproximadamente 1,5 x 108 UFC/g). Após o ajuste da turbidez caso necessário, foi embebido no tubo de crescimento da cultura um swab estéril com posterior espalhamento em ágar Mueller Hinton (Merck, São Paulo, Brasil). Após 5 min, os discos antibióticos (Oxoid) selecionados foram depositados com uma pinça estéril de maneira equidistante no ágar, e a placa incubada a 36 ± 1°C por 24 h. Com o auxílio de um paquímetro foram medidas as zonas completas de inibição no ágar, gerando resultado resistente, intermediário ou sensível em relação a cada antibiótico testado. Isolados que apresentaram resistência a três ou mais classes de antibióticos foram considerados resistentes a multidrogas (MDR), de acordo com Magiorakos et al. (2011). Foi utilizada como cepa controle na realização dos antibiogramas Escherichia coli ATCC 25922. Os antibióticos de uso veterinárioutilizados nesse estudo foram: amoxicilina (AMX; 10 μg), lincomicina + espectinomicina (LSP; 109 µg), fosfomicina (FOS; 50 µg), gentamicina (CN; 10 μg), 33 enrofloxacina (ENR; 5 µg), norfloxacina (NOR; 10 µg), Canamicina (KAN; 30 µg), sulfonamidas (SUL; 300 µg), tetraciclinas (TET; 30 µg), neomicina (NEO; 30 µg) e ceftiofur (EFT; 30 µg). O teste foi realizado em duplicata, os antibióticos utilizados foram escolhidos com base na lista da World Health Organization (WHO, 2017), sendo que alguns deles são classificados como antimicrobianos com alta prioridade para teste. 4.2.4 Extração do DNA A extração do DNA foi realizada para seguir com as análises de ERIC-PCR e WGS. Os isolados estocados em ágar nutriente foram previamente incubados em tubos contendo 10 mL de BHI (Merck, São Paulo, Brasil) por 18 – 24 h, a 36 ± 1 °C, para serem utilizados na extração. A extração do DNA dos isolados de S. Heidelberg foi realizada através de um extrator automático (modelo IndiMag 48s, Indical Bioscience, Leipzig, Alemanha). A extração foi preparada em placas de 96 poços, sendo possível a extração de 24 amostras por placa, os reagentes foram distribuídos da seguinte maneira: 700 µL da solução AW1 em cada poço da 2ª coluna; 700 µL da solução AW2 em cada poço da 3ª coluna; 100 µL da solução de eluição (AVE) em cada poço da 4ª coluna. Em seguida, na primeira coluna foi colocado em cada poço: 20 µL de Proteinase K; 500 µL de solução XVL; 200 µL da amostra. Após a preparação, a placa foi colocada no equipamento para a realização da extração. Depois da conclusão, os DNAs extraídos (aproximadamente 100 µL), foram armazenados em microtubos e congelados a temperatura de -20 °C. Os reagentes utilizados na extração pertencem ao kit adquirido comercialmente da marca INDICAL (Indical Bioscience, Leipzig, Alemanha). A concentração e a pureza do DNA foram determinadas espectrofotometricamente a 260 e 280 nm (espectrofotômetro Jasco V-530, Jasco Inc, Tóquio, Japão). O DNA adquirido foi armazenado em microtubos e congelado a -20°C. 4.2.5 Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (ERIC – PCR) Para avaliar a relação genética dos isolados de S. Heidelberg foi utilizado o método ERIC-PCR de acordo com Versalovic et al. (1991). Cada reação de PCR foi feita para obter um volume final de 25 µL, contendo: 2,5 µL de tampão (10x); 2,0 µL de MgCl2 (25 mmol); 2,0 µL de dNTP (2,5 mmol); 1,5 µl de primer ERIC 2 (10 pmol) (5'- AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'); 1,0 µL de Taq DNA polimerase (5 U/µL); 14,0 µL de água destilada e 2,0 µL do DNA extraído da amostra. A reação de PCR foi realizada através de um termociclador (Bio-Rad, T100 Thermal Cycler) com a seguinte programação: 34 desnaturação inicial de 94 °C por 5 min seguida de 30 ciclos de 94 °C por 1 mim, anelamento a 52 °C por 1 min e extensão a 72 °C por 8 min, com uma extensão final de 72 °C por 16 min. Água destilada foi utilizada como controle negativo. O DNA amplificado foi submetido a eletroforese em gel de agarose a 1,5% (p/v) corados com azul de bromofenol, junto com o marcador de DNA de 1 kb. A corrida foi realizada em cuba horizontal de eletroforese a 100 V por 2 horas em tampão TBE (tris/borato/EDTA). O gel foi corado com brometo de etídio 0,8% (v/v) e a imagem capturada com o aparelho LPix Image (Loccus Biotecnologia, Cotia, SP, Brasil). O software BioNumerics™ 7.6 (Applied Maths-bioMérieux, Sint-Martens-Latem, Bélgica) foi usado para a construção e agrupamento do dendrograma, com base no coeficiente de similaridade de Dice baseado em bandas e no Método Unweighted Pair Group Using Arithmetic Averages (UPGMA). Os isolados foram considerados clonalmente relacionados quando o coeficiente de similaridade foi ≥ 90%. 4.2.6 Sequenciamento do genoma completo A partir dos resultados do antibiograma e ERIC-PCR foram sequenciadas 13 isolados. As amostras de DNA foram sequenciadas na empresa Neoprospecta (Florianópolis, SC, Brasil). As bibliotecas foram preparadas com um kit Nextera® XT (Illumina, Inc., San Diego, CA, EUA) e quantificadas com Kapa Library Quantification (Roche Sequencing Solutions, Inc., CA, EUA) de acordo com as recomendações do fabricante. O sistema Illumina MiSeq® (Illumina) foi usado para gerar leituras brutas com base em 300 ciclos, sequenciamento de extremidade pareada (2 × 150 bp leituras) e 500 ciclos, sequenciamento de extremidade pareada (2 × 250 bp de leitura). Os reads foram montadas com o OneShotWGS (Neoprospecta), um pipeline que considera uma análise inicial nos softwares A5 e Spades (Kmer 21, 33, 55, 77, 99 e 127) (Coil et al., 2015). Em seguida, as melhores montagens foram submetidas à análise no GMCloser para melhorar os resultados, por meio de processamento para ajuste de adaptadores, filtragem de qualidade e correção de erros para gerar contigs e scaffolds (Tritt et al., 2012). A qualidade de todas as sequências foi avaliada pelo QUAST e as leituras com escores de PHRED abaixo de 20 foram descartadas (Huang & Madan, 1999). As sequências obtidas serão depositadas no National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EUA). Os scaffolds foram anotados usando Prokka v.1.12 35 4.2.7 Identificação in silico de genes de resistência a antibióticos Para a identificação dos genes de resistência, genomas montados foram usados como entrada para ResFinder v4.1 (Bortolaia et al., 2020) e Resistance Gene Identifier (RGI) v5.2.0 (Alcock et al., 2019). Os alinhadores locais para ResFinder e RGI foram BLAST+ v2.9.0 (Camacho et al., 2009) e DIAMOND v0.8.36.98 (Buchfink et al., 2021), respectivamente. O ResFinder foi executado para genes de resistência adquiridos com limiares de 0,6 e 0,8 para cobertura e identidade. Os resultados de previsão do ResFinder e RGI foram relacionados por ID do gene para agrupar o mecanismo de resistência e o fenótipo associado de cada gene. Heatmaps foram criados com pheatmap v1.0.12 usando R v4.1.2. 4.2.8 Testes de antagonismo por BAL O teste de antagonismo de BAL frente as cepas de S. Heidelberg foi realizado através do método de difusão em ágar. Para isso, as cepas selecionadas a partir do resultado obtido nos antibiogramas e na análise de ERIC-PCR, foram suspensas em caldo BHI e incubadas a 36 ± 1°C, até atingir a turbidez 0,5 da escala Mc Farland. Quando necessário, foi realizado o ajuste da turbidez. Para espalhamento em ágar Mueller Hinton, um swab estéril foi embebido na cultura. As cepas de BAL, estocadas em glicerol, foram reativadas em caldo MRS e incubadas a 36 ± 1 °C por 18 – 24 h. Poços com 6 mm de diâmetro foram perfurados no ágar e preenchidos com 50 µL da suspensão de BAL. As placas foram incubadas a 36 ± 1 °C por 18 – 24 h. A atividade antimicrobiana foi determinada através do halo de inibição formado. Zonas de inibição de mais de 20 mm, 10 a 20 mm e menos de 10 mm foram consideradas como fortes, intermediárias e baixas inibições, respectivamente (SHOKRYAZDAN, 2014). 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 RESISTÊNCIA A ANTIBIÓTICOS Os resultados obtidos a partir da realização dos antibiogramas (Tabela 1) mostram que todas as amostras testadas foram resistentes a sulfonamida e apenas uma (0,76%) foi sensível a tetraciclinas, mostrando que esses antibióticos não são eficazes frente as cepas de S. Heidelberg utilizadas nesse estudo. Akbar e Anal (2013), também encontraram alta resistência (72,72%) a tetraciclinas em amostras de Salmonella isoladas de carne de aves. Outro estudo realizado por Bacci et al. (2012), também encontrou 86% e 60% de resistência a tetraciclinas em amostras de carcaças e carne de frangos respectivamente, nesse mesmo estudo todas as amostras foram 36 sensíveis a gentamicina, corroborando com os resultados deste estudo, onde apenas uma cepa foi resistente a gentamicina. O alto índice de resistência a tetraciclina pode ser justificado pelo uso frequentedesses antimicrobianos na criação de animais para a produção de alimentos. A tetraciclina foi banida do Brasil para uso como aditivo alimentar em rações animais, mas ainda é utilizada na área terapêutica (GEORGES, et al., 2019). Tabela 1. Resistência das cepas de Salmonella Heidelberg frente aos antibióticos testados. Antibiótico Isolados AMX KAN EFT ENR FOS CN LSP NEO NOR SUL TET 1 R S S S S S S S S R R 2 R S S I S S S S S R R 3 R S R S S S S S S R R 4 R S S S S S S S S R R 5 R S I S S S S S S R R 6 R S I S S S S S S R R 7 R S I S S S S S S R R 8 R S I S S S S S S R R 9 R S S S S S S S S R R 10 S S S S S S S S S R R 11 R S R S S S S S S R R 12 S S S I S S S S S R R 13 R S S S S S S S S R R 14 R S S S S S S S S R R 15 R S S S S S S S S R R 16 R S S S S S S S S R R 17 R S R S S S S S S R R 18 R S S S S S S S S R R 19 R S S S S S S S S R R 20 S S S S S S S S S R R 21 S S S S S S S S S R R 22 S S S S S S S S S R R 23 S S S S S S S S S R R 24 R S S I S S R S S R S 25 S S S S S S S S S R R 26 S S S S S S S S S R R 27 S S S S S S S S S R R 28 S S S S S S S S S R R 29 S S S S S S S S S R R 30 S S S S S S S S S R R 31 S S S S S S S S S R R 32 S S S S S S S S S R R 33 S S S S S S S S S R R 34 R S S S S S S S S R R 37 Antibiótico Isolados AMX KAN EFT ENR FOS CN LSP NEO NOR SUL TET 35 R S I S S S S S S R R 36 R S S S S S S S S R R 37 R S I S S S S S S R R 38 R S S S S S S S S R R 39 R S S S S S S S S R R 40 R S S S S S S S S R R 41 S S S S S S S S S R R 42 S S S S S S S S S R R 43 R S S S S S S S S R R 44 R S S S S S S S S R R 45 R S S S S S S S S R R 46 R S S S S S S S S R R 47 R S S S S S S S S R R 48 S S S S S S S S S R R 49 R S S S S S S S S R R 50 S S S I S S S S S R R 51 R S S S S S R S S R R 52 R S S S S S R S S R R 53 R S S S S S S S S R R 54 R S S S S S S S S R R 55 S S S S S S S S S R R 56 S S S I S S S S S R R 57 S S S S S S S S S R R 58 S S S S S S S S S R R 59 R S R S S S S S S R R 60 R S S S S S S S S R R 61 R S S S S S S S S R R 62 R S S S S S S S S R R 63 R S R S S S S S S R R 64 R S I S S S S S S R R 65 S S S S S S S S S R R 66 S S S I S S S S S R R 67 R S I S S S S S S R R 68 R S I S S S S S S R R 69 S S R S S S S S S R R 70 R S S S S S S S S R R 71 R S S S S S S S S R R 72 R S S S S S S S S R R 73 R S S S S S S S S R R 74 S S S S S S S S S R R 75 R S S S S S S S S R R 76 S S S S S S S S S R R 77 R S R S S S S S S R R 78 R S S S S S S S S R R 38 Antibiótico Isolados AMX KAN EFT ENR FOS CN LSP NEO NOR SUL TET 79 R S I S S S S S S R R 80 S S S I S S S S R R R 81 S S S S S S S S S R R 82 S S S S S S S S S R R 83 S S S S S S S S S R R 84 S S S S S S S S S R R 85 S S S S S S S S S R R 86 R S S S S S S S S R R 87 R S S S S S S S S R R 88 R S S S S S S S S R R 89 R S S S S S S S S R R 90 R S S S S S S S S R R 91 R S S S S S S S S R R 92 R S S S S S S S S R R 93 R S S S S S S S S R R 94 R S S S S S S S S R R 95 R S S S S S S S S R R 96 R S S S S S S S S R R 97 S S S S S S S S S R R 98 S S S I S S S S S R R 99 R S I S S S S S S R R 100 S S S S S S S S S R R 101 S S S S S R S S S R R 102 S S S S S S S S S R R 103 S S S S S S S S S R R 104 S S S S S S S S S R R 105 S S S S S S S S S R R 106 S S S S S S S S S R R 107 S S S S S S S S S R R 108 S S S S S S S S S R R 109 S S S I S S S S S R R 110 S S S S S S S S S R R 111 S S S S S S S S S R R 112 S S S S S S S S S R R 113 R S S S S S R S S R R 114 R S S S S S R S S R R 115 R S S S S S R S S R R 116 S S S S S S S S S R R 117 S S S S S S S S S R R 118 S S S S S S S S S R R 119 S S S S S S S S S R R 120 S S S S S S S S S R R 121 S S S S S S S S S R R 122 S S S S S S S S S R R 39 Antibiótico Isolados AMX KAN EFT ENR FOS CN LSP NEO NOR SUL TET 123 S S S S S S S S S R R 124 S S S S S S S S S R R 125 R S S S S S S S S R R 126 R S S S S S S S S R R 127 S S S S S S S S S R R 128 S S S S S S S S S R R 129 R S R S S S S S S R R 130 R S I S S S S S S R R AMX: Amoxicilina. KAN: Canamicina. EFT: Ceftiofur. ENR: Enrofloxacina. FOS: Fosfomicina. CN: gentamicina. LSP: Lincomicina + espectinomicina. NEO: Neomicina. NOR: Norfloxacina. SUL: Sulfonamidas. TET: Tetraciclinas. R: Resistente. I: Intermediário. S: sensível. Silva et al. (2014), encontraram 58,8% de resistência para sulfonamida em amostras de Salmonella spp. isoladas de carne e fezes de frango e fezes humanas. Ainda de acordo com os resultados obtidos no presente estudo, Zottola et al. (2013) encontraram o maior percentual de resistência para sulfonamida ao avaliar a susceptibilidade antimicrobiana de 499 cepas de Salmonella isoladas de javali. Em relação a amoxicilina, 70 isolados apresentaram resistência (53,85%), resultado maior do que estudos anteriores realizados por Marrero-Ortiz et al. (2012) que encontraram 33% de resistência a amoxicilina em cepas de Salmonella de diversos sorovares isoladas de fezes de gado, e nenhuma resistência a gentamicina. Li et al. (2020) encontraram 52,2% de resistência a amoxicilina/ácido clavulânico em cepas de Salmonella de diversos sorovares isoladas de carcaças de frango cru, e baixa resistência a gentamicina (28,6%) e também por Gebremedhin et al. (2021), que relataram 30% de cepas resistentes a amoxicilina, oriundas de carne bovina. Em um estudo realizado por Nadi et al. (2020), com amostras isoladas de pacientes com infecção alimentar ocasionada por Salmonella, uma amostra de Salmonella Enteritidis (4,8%), foi sensível a ceftriaxona que é uma cefalosporina de terceira geração muito utilizada no tratamento de salmonelose em humanos. A resistência a esse antibiótico indica o uso extensivo desse medicamento, o que pode ameaçar o tratamento de casos graves de infecções por Salmonella. No presente estudo foi identificado uma resistência de 6% ao ceftiofur que também é uma cefalosporina de terceira geração e possui mecanismos comuns de resistência com a ceftriaxona, porém utilizado na medicina veterinária. Esse resultado confirma a hipótese que o uso de ceftiofur em aves está contribuindo para a resistência de cefalosporina de terceira geração em infecções humanas por S. Heidelberg (DUTIL et al., 2010). A resistência às fluoroquinolonas testadas nesse estudo (enrofloxacina e norfloxacina) foi baixa, apenas um 40 isolado apresentou resistência à norfloxacina. Bounar-Kechih et al. (2012) não encontraram resistência a fluoroquinolonas em 100 cepas de Salmonella de diferentes sorovares isoladas em aves. Isso pode ser justificado pelo fato de estes antibióticos não serem comumente utilizados em aves de corte, pois alguns mercados externos não aceitam resíduos de tais medicamentos, a administração desses fármacos dificultaria a exportação das aves. Os resultados mostram que das 130 cepas testadas, 12 (9,2%) foram resistentes a 4 clases de antibióticos dos 11 testados. Sendo as 12 consideradas MDR (cepa multidroga resistente), resistentes a um ou mais antimicrobianos de três ou mais classes testadas, conforme estabelecido pelo CLSI. Os perfis de MDR foram AMX-EFT-SUL-TET para sete isolados e AMX-LSP-SUL-TET para cinco. Um estudo realizado por Gieraltowski et al. (2016), com cepas de Salmonella Heidelberg isoladas de um surto alimentar relacionado com uma empresa avícola nos Estados Unidos, no qual 635 pacientes foram identificados com a infecção e 38% foram hospitalizados, após análise de resistência a antibióticos, concluiram que 35% dos isolados eram cepas consideradas MDR. Outro estudo conduzido por Medalla et al. (2013), obteve 3.247 (13%) cepas MDR de Salmonella originarias de infecções alimentares, sendo que destas, S. Heidelberg estava entre os 3 sorotipos que mais apresentam
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