Revisão de Literatura Caracterização da diversidade genética, da estrutura populacional e do parentesco de Arara-azul-grande por meio da análise de regiões dos genomas por Náthaly Marcon

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Revisão de Literatura Caracterização da diversidade genética, da
estrutura populacional e do parentesco de
Arara-azul-grande (Anodorhynchus
hyacinthinus) por meio da análise de regiões
dos genomas nuclear e mitocondrial
Santuariodaararaazul.blogspot.com
Revisão Por Náthaly Marcon Souza
Trabalho Original Por:Flavia Torres Presti
São Paulo
2024
Náthaly Marcon Souza
Revisão de Literatura Caracterização da
diversidade genética, da
estrutura populacional e do parentesco de
Arara-azul-grande (Anodorhynchus
hyacinthinus) por meio da análise de regiões
dos genomas nuclear e mitocondrial
Tese originalmente apresentada por Flavia Torres Prestiao
Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo, para a obtenção
do Título de Doutora em Ciências, na área Biologia/Genética.
São Paulo
2024
1
Sumário
Resumo……………………………………………………………………………………………………
………………………………3
Capítulo 1: Introdução
Geral……………………………………………………………………………………………..4
Capítulo 2. Caracterização da diversidade genética e da estrutura populacional da
arara-azul-grande (Anodorhynchus hyacinthinus) por meio da análise de regiões
dos genomas nuclear e
mitocondrial……………………………………………………………………….10
Capítulo 3. Análise do parentesco de pares de filhotes de arara-azul-grande
(Anodorhynchus hyacinthinus): investigando monogamia e fidelidade ao
ninho……………………………………………………………………….28
Capítulo 4. Teste de sexagem com amostras de penas em Anodorhynchus
hyacinthius……………………………………………………………………….31
2
Resumo
O Brasil lidera globalmente em diversidade de psitacídeos, com 77 espécies, incluindo a
arara-azul (Anodorhynchus hyacinthinus), em risco de extinção devido ao tráfico ilegal e
perda de habitat. Este estudo avaliou a variabilidade genética, destacando baixa
diversidade em comparação com outras espécies. Análises revelaram estruturação
genética moderada entre quatro regiões, indicando possível origem de aves apreendidas.
O tempo de divergência estimado foi de 16 a 42 mil anos atrás. Apesar da estabilidade
demográfica, a rede de haplótipos sugere expansão recente, especialmente no nordeste.
Além disso, observou-se comportamento monogâmico predominante, mas com casos de
paternidade extra-par e parasitismo de ninho. A sexagem molecular de penas foi
padronizada. Esses resultados contribuem para compreender a evolução e
comportamento reprodutivo das araras-azuis, informando programas de conservação.
Abstract
Brazil leads globally in parrot diversity, with 77 species, including the blue macaw
(Anodorhynchus hyacinthinus), at risk of extinction due to illegal trafficking and habitat
loss. This study evaluated genetic variability, highlighting low diversity compared to
other species. Analysis revealed moderate genetic structuring between four regions,
indicating possible origin of seized birds. The estimated divergence time was 16 to 42
thousand years ago. Despite demographic stability, the haplotype network suggests
recent expansion, especially in the northeast. Furthermore, predominant monogamous
behavior was observed, but with cases of extra-pair paternity and nest parasitism.
Molecular sexing of feathers has been standardized. These results contribute to
understanding the evolution and reproductive behavior of blue macaws, informing
conservation programs.
3
Capítulo 1: Introdução Geral
1.1 Genética e Conservação da Biodiversidade
Desde 1600, a extinção acelerada de organismos na natureza, superando a taxa natural, é
atribuída principalmente à destruição de habitats pela ação humana (Primack e
Rodrigues, 2002). A preocupação atual com a preservação da biodiversidade visa evitar
mais extinções. A genética da conservação, surgida há cerca de 20 anos, utiliza teoria e
técnicas genéticas para reduzir os riscos de extinção, especialmente em espécies
ameaçadas (Frankham et al., 2002).
Dados genéticos, incluindo marcadores moleculares, desempenham papel crucial. A
genética molecular oferece informações sobre diversidade genética, parentesco, sexo, e
até a origem geográfica de organismos, sendo valiosa para combater o tráfico ilegal de
animais e plantas (Miyaki, 2001; Sole-Cava, 2001).
Em conjunto com estudos ecológicos, comportamentais e demográficos, dados genéticos
aprimoram o conhecimento sobre espécies ameaçadas, enfatizando a necessidade de
uma abordagem multidisciplinar para estratégias de conservação (Sherwin et al., 2000).
Na década de 80, surgiram conceitos como a Unidade Evolutivamente Significativa (ESU)
e Unidade de Manejo (UM), fundamentais para propostas de conservação, destacando a
importância de considerar as características únicas de cada população ou espécie (Ryder,
1986; Moritz, 1994).
1.2 Marcadores Moleculares
4
Marcadores moleculares, como microssatélites e DNA mitocondrial, são essenciais para
estudos populacionais. Microssatélites, unidades de sequências repetidas, são
amplamente utilizados pela sua alta variabilidade, facilidade de amplificação e herança
codominante (Tautz, 1989). Apesar da limitação de tempo e recursos para desenvolver
primers, primers heterólogos têm sido eficazes, reduzindo custos (Parker et al., 1998).
1.2.1 Microssatélites
Microssatélites, como marcadores, apresentam alta variabilidade devido ao modelo de
mutação passo-a-passo (SMM). Embora a amplificação de microssatélites demande tempo
e recursos, primers desenvolvidos para espécies filogeneticamente próximas têm
reduzido custos e tempo em pesquisas (Russello et al., 2001; Caparroz et al., 2003).
1.2.2 DNA Mitocondrial
O DNA mitocondrial (DNAmt) é utilizado em análises populacionais de aves, sendo a
região controladora e o citocromo b comumente empregados (Browne et al., 2008;
Poulakakis et al., 2008). Apesar da menor variabilidade genética em aves comparadas a
outros organismos, o DNAmt fornece informações valiosas em estudos populacionais
(Friesen et al., 2006; Kearns et al., 2008).
1.3 Psitacídeos
Os psitacídeos, compreendendo araras, papagaios e periquitos, enfrentam ameaças como
perda de habitat, introdução de espécies predadoras e competidoras, endogamia e
exploração comercial. No Brasil, o país mais rico em espécies de psitacídeos, 16 das 77
espécies estão ameaçadas (BirdLife International, 2010).
As araras, inseridas nos gêneros Ara e Anodorhynchus, enfrentam desafios de
conservação, com espécies como A. hyacinthinus em perigo. A diversidade genética e a
estrutura populacional dessas espécies são fundamentais para orientar medidas eficazes
de conservação.
5
Figura 1.1: Descreve a reconstrução filogenética de psitacídeos por análise Bayesiana de
6416 pares de base de DNA mitocondrial e nuclear. Os valores dos nós representam
bootstrap de máxima verossimilhança acima de 50% e os valores de probabilidade
posterior da análise Bayesiana. A barra indica os táxons neotropicais, conforme
modificado por Tavares et al., 2006. A seção 1.3.1 menciona "Ara".
6
1.3.1. Arara-azul-grande (Anodorhynchus hyacinthinus)
Figura 1.2. Casal de arara-azul. Foto: Luciano Candisani
A arara-azul-grande, Anodorhynchus hyacinthinus, destaca-se como o maior psitacídeo,
medindo até um metro da ponta do bico à ponta da cauda. Reconhecida por sua
plumagem azul-cobalto e bico desmesurado, é classificada como ameaçada pela CITES,
IUCN e Birdlife International (2010).
Com uma população estimada de 6.500 indivíduos no Brasil, distribuídos em três regiões
distintas (Pará, nordeste do país e Pantanal Matogrossense), essa espécie apresenta
adaptações alimentares específicas para cada região. O Pantanal destaca-se como a área
com programa de monitoramento permanente, revelando detalhes importantes sobre a
biologia da espécie (Guedes, 2004).
Observações indicam a reutilização anual de cavidades como locais de reprodução, com
suspeitas de casais ocupando os mesmos ninhos em anos consecutivos ou alternados. A
7
dependência dos filhotes dos pais, o longo período no ninho (em média 107 dias) e a
permanência dos jovens dependentes após a saída do ninho evidenciam os desafios
enfrentadospela espécie (Guedes, 1993).
A maturidade do casal parece influenciar a frequência reprodutiva, com casais mais
experientes reproduzindo anualmente, enquanto casais mais jovens o fazem em anos
alternados. A socialização é notável, com voos em pares ou grupos e reunião em
"dormitórios" ao entardecer. A monogamia e a cooperação na criação dos filhotes
destacam aspectos interessantes da biologia reprodutiva da arara-azul-grande (Guedes e
Harper, 1995).
Justificativa
A conservação da diversidade genética é reconhecida como uma das prioridades globais
pela IUCN. Para preservar a diversidade genética de uma espécie, é crucial
compreendê-la. A arara-azul-grande, classificada como em perigo, destaca-se como alvo
de estudo devido ao provável declínio da variabilidade genética associada ao pequeno
tamanho populacional (Frankham et al., 2002).
O conhecimento da variabilidade genética é fundamental para entender os processos
evolutivos e direcionar estratégias de conservação. A composição genética das
populações é crucial, especialmente se a variabilidade genética estiver geograficamente
estruturada. Nesse caso, a conservação deve considerar a diversidade local para
preservar adaptações específicas. Esse enfoque direciona eficientemente os esforços de
conservação e contribui para a compreensão das forças evolutivas que moldam a
história da espécie (Haig, 1998).
Determinar a origem de indivíduos sem procedência conhecida é vital para ações
preventivas e programas de reprodução em cativeiro. Evitar o pareamento de casais de
localidades com composições genéticas diferentes é crucial para evitar efeitos de
depressão por exocruzamento na população cativa.
A caracterização da estrutura genética populacional é apenas uma parte do conjunto de
estudos necessários para a conservação efetiva. No entanto, esse conhecimento contribui
para entender a dinâmica populacional, relações interespécies e contribuições para a
8
conservação do habitat como um todo.
O conhecimento aprofundado da espécie, incluindo informações sobre a estrutura
genética populacional, é essencial para estabelecer metas de conservação e fazer
previsões de longo prazo. Além da estrutura genética, o entendimento da biologia
reprodutiva da espécie desempenha papel significativo. Os dados genéticos gerados neste
estudo possibilitaram testar hipóteses sobre a monogamia e filopatria da
arara-azul-grande, derivadas de observações de campo.
Objetivos
Os objetivos do presente projeto foram:
1) Caracterizar a estrutura populacional de Anodorhynchus hyacinthinus, para auxiliar o
plano de
conservação da espécie e verificar a origem de indivíduos sem procedência conhecida;
2) Entender a história demográfica da espécie;
3) Estimar a similaridade genética entre filhotes encontrados no mesmo ninho, visando
auxiliar na
melhor compreensão do comportamento reprodutivo desta espécie, o que pode
contribuir na
elaboração de estratégias de conservação.
Para alcançá-los:
1) Foi Testado mais primers para locos de microssatélites desenvolvidos para
espécies proximamente
relacionadas (em relação ao nosso trabalho anterior [Presti, 2006]);
2) Foi Avaliado a variabilidade genética de A. hyacinthinus de diversas localidades
geográficas
utilizando marcadores nucleares (microssatélites) e mitocondriais;
9
3)Foi Comparado os níveis de estruturação genética encontrados pela análise de
seqüências de genes
do DNA mitocondrial e de locos de microssatélites;
4) Foi testado e padronizamos a sexagem de penas de muda de A. hyacinthinus.
Os resultados aqui obtidos foram organizados por tema em capítulos que se seguem. No
final
da Tese foi anexada uma cópia de um artigo de divulgação publicado sobre dados
biológicos de A. Hyacinthinus coletados no Pará.
Capítulo 2. Caracterização da diversidade genética e da estrutura populacional da
arara-azul-grande (Anodorhynchus hyacinthinus) por meio da análise de regiões
dos genomas nuclear e mitocondrial
2.1.1 Introdução
A estrutura genética das populações naturais é influenciada por fatores biológicos,
ambientais e evolutivos. Processos como deriva genética, seleção natural, mutação e
fluxo gênico desempenham papéis cruciais na diversidade genética e distribuição de
alelos entre as populações.
2.1.2 Influência de Processos Evolutivos:
O isolamento geográfico causado por barreiras naturais ou fragmentação do habitat pode
acentuar diferenças genéticas entre populações, enquanto o fluxo gênico tende a
homogeneizar a composição genética. Espécies altamente móveis, como aves, podem
apresentar altas taxas de fluxo gênico, contrastando com aquelas de baixa capacidade de
dispersão ou alta filopatria, que exibem menor intercâmbio genético.
2.1.3 Impacto da Fragmentação no Contexto Neotropical:
10
As florestas neotropicais, devido à sua alta diversidade e complexidade ecológica, têm
recebido atenção, especialmente em relação à fragmentação. No entanto, estudos sobre o
impacto da fragmentação antrópica na estrutura populacional genética de aves
altamente móveis, como Anodorhynchus hyacinthinus, são escassos.
2.1.4 Relação entre Fragmentação e Composição Genética:
Espécies com alta mobilidade podem não apresentar estruturação genética significativa
devido à fragmentação antrópica, mesmo em condições de alopatria. Contudo, há
evidências de que fragmentos pequenos e isolados podem afetar a abundância e
dispersão de algumas espécies, levando a consequências genéticas, como depressão por
endocruzamento.
2.1.5 Estudos de Caso:
Estudos examinaram o efeito da fragmentação na floresta amazônica ocorrida há
milênios e observaram sinais de estruturação genética em algumas espécies. A filopatria,
associada à territorialidade, também foi identificada como um comportamento que pode
gerar estruturação genética em diversas espécies de aves.
2.1.6 Arara-azul-grande (Anodorhynchus hyacinthinus):
A espécie em foco, Anodorhynchus hyacinthinus, apresenta características ecológicas e
biológicas que podem influenciar sua composição genética, como uma distribuição
geográfica alopátrica e a possível presença de filopatria. O estudo visa analisar 98
indivíduos de três regiões distintas para avaliar a variabilidade e estrutura genética,
além de genotipar amostras de filhotes apreendidos para determinar suas origens.
2.1.7 Perguntas-Chave do Estudo:
1. É possível detectar diferenças genéticas entre os grupos amostrados em diferentes
localidades?
11
2. Em caso de diferenciação genética, é viável identificar a potencial origem geográfica
dos indivíduos apreendidos?
2.2. Materiais e métodos
Figura 2.1 Distribuição geográfica de Anodorhynchus hyacinthinus (em cinza escuro) e
localidades amostradas. ● amostras com origem conhecida; ■ Amostras com origem
exata desconhecida.
2.2.1 Amostragem:
12
As amostras de Anodorhynchus hyacinthinus foram obtidas de diversas localidades,
incluindo regiões no Pará, Pantanal Matogrossense e nordeste do Brasil. O método de
alpinismo, empregando estilingue, chumbada, linhas de nylon, corda fina, cordas de
alpinismo, fitas de ancoragem, cadeirinhas, colete, mosquetões, oito e ascensores, foi
utilizado para coletar sangue de filhotes em potenciais ninhos, sendo os filhotes
devolvidos após a coleta.
2.2.2 Coleta de Dados e Armazenamento:
A coleta de sangue, aproximadamente 0,1 ml da veia braquial, foi seguida pela anilhação
dos filhotes. As amostras foram armazenadas no Laboratório de Genética e Evolução
Molecular de Aves (LGEMA) da Universidade de São Paulo, em etanol absoluto a -20ºC.
Cada ninho foi representado por apenas um indivíduo nas análises populacionais.
2.2.3 Extração e Isolamento de DNA
O DNA foi isolado seguindo o protocolo de extração utilizando proteinase k e
fenol-clorofórmio. O material extraído foi incubado, a fase superior foi transferida para
um novo tubo, e o DNA foi precipitado com fenol:clorofórmio:álcool isoamílico. Após
lavagens com etanol, o DNA foi ressuspenso em TE (Tris 10mM, EDTA 1mM).
2.2.4 AnálisesGenéticas:
Foram consideradas quatro regiões para as análises: Pantanal sul, Pantanal norte,
nordeste e norte. A amostragem no Pantanal sul abrangeu sub-regiões como Miranda,
Abobral, Nhecolândia e Rio Negro. As análises envolveram blocos de microssatélites e
DNA mitocondrial, contribuindo para a compreensão da variabilidade e estrutura
genética da arara-azul-grande.
2.2.5 Contribuições do Estudo:
Este método abrangente de amostragem e análise genética fornece insights valiosos
13
sobre a diversidade e estrutura genética de Anodorhynchus hyacinthinus em diferentes
regiões do Brasil. Essas informações são cruciais para orientar estratégias de
conservação adaptadas às necessidades específicas da espécie, visando preservar sua
variabilidade genética e promover a sustentabilidade das populações.
Tabela 2.1 Origem (localidade e estado), número de amostras de Anodorhynchus
hyacinthinus
utilizadas nas análises com microssatélites (Nmic) e número de indivíduos sequenciados
para DNA
mitocondrial (Nmit), ano de coleta e coletor/coleção
14
em parênteses: número da localidade mostrada na figura 2.1; 2
amostras a analisadas no mestrado para seis blocos de microssatélites; 3 localidade
exata não conhecida.
2.2.2 Análise de Microssatélites
Foram avaliados 19 pares de primers de microssatélites, previamente desenvolvidos para
espécies filogeneticamente próximas. Destes, 13 foram testados anteriormente no
mestrado (Presti, 2006). Oito pares foram projetados para Ara ararauna, cinco para
Amazona guildingii, dois para Anodorhynchus hyacinthinus e quatro para Psittacus
15
erithacus. Os métodos de Caparroz et al. (2003), Russello et al. (2001), Gebhardt e Waits
(2008), Taylor e Parkin (2007a), e dados não publicados de S. Davis foram referenciados.
2.2.3 Condições da PCR:
Cada reação de PCR continha Taq polimerase, primers, MgCl2, dNTPs, tampão, DNA e
água. As condições da PCR foram: desnaturação inicial a 95ºC por 10 min, seguida por 35
ciclos de desnaturação a 95ºC por 1 min, anelamento a 52-58ºC por 40 seg, extensão a
72ºC por 40 seg, e extensão final a 72ºC por 7 min. Os produtos amplificados foram
avaliados em gel de agarose 1,5%.
2.2.4 Avaliação do Polimorfismo:
Pares de primers que produziram uma banda única e nítida foram testados em 10
indivíduos para avaliar o polimorfismo. Para locos polimórficos, novas PCRs foram
conduzidas com a adição de primers M13 marcados com fluorescência e analisados em
sequenciador automático MegaBACE 1000. O polimorfismo foi inicialmente testado em
10 indivíduos, e os locos polimórficos foram posteriormente utilizados na genotipagem
de mais indivíduos.
16
Tabela 2.2 Sequências dos primers de microssatélites, suas referências e temperatura de
hibridação.
P – polimórfico; M- monomórfico; - sem amplificação. *Primers testados no mestrado
(Presti,
2006); **Touch down (decrescendo 0,5oC)
17
2.2.5 Contribuições para o Estudo:
A utilização de microssatélites provenientes de espécies filogeneticamente próximas
proporciona uma base robusta para a análise genética de Anodorhynchus hyacinthinus.
O método detalhado de desenvolvimento e avaliação dos primers permite a identificação
de locos polimórficos, contribuindo significativamente para a compreensão da
variabilidade genética dessa espécie. A abordagem sistemática fortalece a validade e
confiabilidade dos dados genéticos obtidos, essenciais para estudos de conservação e
manejo da arara-azul-grande.
2.2.6 Sequenciamento de DNAmitocondrial
Tabela 2.3 Sequências dos primers utilizados para amplificação e sequenciamento de
regiões
mitocondriais e suas referências
A amplificação do DNA mitocondrial de Anodorhynchus hyacinthinus foi realizada em
um volume final de 10 µl, contendo água Milli Q, tampão, dNTPs, primers, Taq
polimerase e DNA. Foram utilizados cinco conjuntos de primers para diferentes regiões
mitocondriais: ND5 e citocromo b, Região controladora, ND2, ND3 e ATPase 6 e 8, e COI.
18
As condições de amplificação variaram de acordo com as regiões, incluindo diferentes
temperaturas de desnaturação, ciclos de amplificação e extensões finais.Os produtos de
PCR foram purificados utilizando uma solução de polietilenoglicol, seguida por lavagens
com etanol 80%. O precipitado foi seco e ressuspenso em água. A reação de
sequenciamento foi realizada com o kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit da
Applied Biosystems. A mistura contendo solução Big Dye, primer e produto amplificado
foi submetida a ciclos de desnaturação, anelamento e extensão. Após a reação de
sequenciamento, o excesso de reagentes foi removido por precipitação em etanol 95%. A
amostra foi centrifugada, o sobrenadante retirado e o precipitado lavado com etanol
70%. A amostra foi seca a 90 ºC e armazenada a -20 ºC. O sequenciamento foi realizado
utilizando o sequenciador ABI 3100 da Applied Biosystems.
A metodologia detalhada de sequenciamento de DNA mitocondrial em Anodorhynchus
hyacinthinus fornece uma base robusta para a análise genética dessa espécie. A
utilização de diferentes regiões mitocondriais permite a obtenção de informações
abrangentes sobre a variabilidade genética. A purificação eficiente e a análise
subsequente garantem resultados confiáveis, essenciais para estudos de filogeografia e
evolução molecular da arara-azul-grande. Este método é crucial para compreender a
diversidade genética e contribui significativamente para os esforços de conservação e
manejo dessa espécie ameaçada.
2.2.7 Análises dos dados
A análise dos microssatélites envolveu a identificação do tamanho dos alelos usando o
MegaBACE™ Genetic Profiler Software Suite v2.2. O equilíbrio de Hardy-Weinberg e a
associação alélica foram testados usando o Genepop 3.3, enquanto o Micro-checker foi
empregado para detectar alelos nulos, erros de genotipagem e allele dropout. A
diversidade genética foi avaliada com base no número de alelos, heterozigosidades
observada e esperada.No sequenciamento do DNA mitocondrial, o CodonCode Aligner
v.1.6.3 editou e alinhou as sequências. Parâmetros como números de haplótipos,
diversidades haplotípicas e nucleotídicas, além dos índices de neutralidade DT, Fs e R2,
foram estimados pelo DnaSP 4.10.9. A estrutura filogenética foi visualizada através de
redes de haplótipos e árvores filogenéticas.
A população foi investigada utilizando o STRUCTURE 2.2 para identificar o número de
populações. A diferenciação entre grupos foi avaliada pelos índices FST e RST. A análise
19
de variância molecular (AMOVA) e os testes de atribuição foram conduzidos usando o
Arlequin 2.0. A distribuição de mismatch e testes de neutralidade foram executados,
incluindo métodos baseados em microssatélites para inferências demográficas.
O Bottleneck 1.2.02 foi aplicado para testar gargalos populacionais. A distribuição de
mismatch foi usada para estimar o tempo desde a expansão demográfica. O programa
Mdiv forneceu estimativas coalescentes, enquanto simulações no SIMCOAL 2.1.2 foram
empregadas para testar hipóteses sobre a história demográfica, incluindo fragmentação
populacional e gargalos em diferentes períodos.
Essas análises detalhadas contribuem significativamente para a compreensão da
estrutura genética, diversidade e história demográfica das populações de
Arara-azul-grande (Anodorhynchus hyacinthinus). A combinação de microssatélites e
sequenciamento mitocondrial oferece uma visão abrangente, com implicações
importantes para estratégias de conservação e manejo dessas aves, fornecendo insights
sobre eventos históricos e adaptações populacionais ao longo do tempo.
Baseado nos índices de FST e RST e no teste de atribuição tentou-se determinar a origem
de filhotes apreendidos (Tabela 2.1). Os índices de similaridade entre esses filhotes
também foram estimados baseados na fórmula X= 2 NAB/ NA + NB, onde X é o índice de
similaridade, NAB é o número de alelos compartilhados por A e B e NA e NB são o total
de números de alelos dos indivíduos A e B, respectivamente.
2.3 ResultadosForam testados 19 pares de primers de microssatélites, resultando em 13 produtos de
amplificação, sendo 11 polimórficos. A confirmação por sequenciamento revelou
desequilíbrio de Hardy-Weinberg em um loco, não utilizado nas análises. Variações de
dois a nove alelos por loco e heterozigosidades observadas e esperadas foram
documentadas. Os microssatélites mostraram independência, não apresentando
desequilíbrio de ligação. Marcadores mitocondriais foram testados, com foco na região
controladora. A variabilidade genética da região controladora levou à exclusão devido a
sequências dúbias. Regiões polimórficas de ND5, citocromo b e ND2 foram selecionadas
para sequenciamento, exibindo sítios variantes.
Alelos exclusivos em regiões específicas foram identificados, indicando diferenciação
genética. A análise Bayesiana dos microssatélites sugeriu quatro grupos correspondentes
a Pantanal norte, Pantanal sul, norte e nordeste, com uma tendência de mistura entre
20
norte e nordeste. Análises de fixação e FST revelaram estruturação genética significativa,
especialmente entre regiões norte e nordeste. As subpopulações no Pantanal sul
mostraram baixa diferenciação genética, enquanto as sequências mitocondriais
destacaram forte estruturação entre Pantanal norte, Pantanal sul e norte/nordeste.A
análise detalhada dos microssatélites e sequências mitocondriais oferece insights
valiosos sobre a estrutura genética e diferenciação populacional em Arara-azul-grande. A
detecção de alelos exclusivos em regiões específicas destaca a importância da
conservação localizada. Essas informações são cruciais para estratégias de manejo e
conservação, fornecendo uma base genética para futuras ações visando a preservação
dessa espécie emblemática.
A AMOVA inicial considerou sete localidades, agrupadas em Pantanal norte, Pantanal sul,
norte e nordeste. A falta de diferenciação entre sub-regiões do Pantanal sul justificou
agrupá-las. Uma segunda AMOVA, considerando três grupos (Pantanal norte, Pantanal
sul e norte+nordeste), apontou maior variação entre grupos para microssatélites e
sequências mitocondriais.O teste de atribuição revelou que 86,7% dos indivíduos foram
corretamente atribuídos aos grupos originais, apesar da falta de separação genética
entre as regiões norte e nordeste. A rede de haplótipos mostrou exclusividade em
diferentes regiões, indicando possível expansão populacional recente. Dois grupos
independentes de haplótipos do Pantanal sul foram identificados, sem correlação
geográfica.
A árvore filogenética destacou grupos de baixa resolução, com 15 dos 17 indivíduos do
Pantanal norte em um grupo e 34 dos 35 do Pantanal sul em dois grupos não
relacionados. O FST entre indivíduos com haplótipos específicos foi baixo e não
significativo, sugerindo certa mistura genética.
Os resultados indicam uma notável falta de estruturação genética entre as sub-regiões do
Pantanal sul e entre as regiões norte e nordeste. A alta taxa de atribuição correta no teste
e a presença de haplótipos exclusivos em diferentes regiões destacam a complexidade da
dinâmica populacional. A possível expansão recente, evidenciada pelos haplótipos de
baixa frequência, contribui para a compreensão da história demográfica da espécie. A
falta de correlação geográfica nos grupos de haplótipos ressalta a necessidade de
considerar fatores adicionais na interpretação dos padrões de diversidade genética,
como movimentos migratórios e características ambientais. Essas descobertas têm
implicações importantes para estratégias de conservação e manejo da Arara-azul-grande,
destacando a necessidade de abordagens abrangentes que considerem a variabilidade
21
genética em diferentes escalas geográficas.
2.3.1 Inferências demográficas
A ausência de significativo excesso de heterozigotos para os locos de microssatélites
sugere equilíbrio mutação-deriva na população, indicando a falta de sinais de gargalo
populacional. Testes de neutralidade para sequências mitocondriais corroboram essa
estabilidade, não evidenciando expansão populacional.
A análise de mismatch distribution revela padrões distintos entre populações. Curvas
unimodais para N e NE sugerem expansão populacional, enquanto curvas bimodais para
as populações do Pantanal Norte e Pantanal Sul indicam uma população estável,
corroborando com o modelo proposto por Rogers e Harpending (1992).
As estimativas de tempo desde o evento de expansão demográfica (τ) apontam para 8.842
anos no Pantanal Norte, 92.767,5 anos no Pantanal Sul e 24.390 anos nas regiões Norte e
Nordeste. No entanto, a diferença significativa entre os valores mínimo e máximo de τ
para o Pantanal Sul sugere incerteza quanto à detecção de expansão.
Os valores baixos de M concordam com Nm por geração estimados do FST mitocondrial.
As estimativas de tempo de divergência (t) sugerem eventos entre 2700-3400 anos entre
PN e PS, 3600-4600 anos entre PN e N+NE, e 1900-2300 anos entre PS e N+NE.
Os valores observados nos testes de neutralidade assemelham-se aos cenários simulados
para populações com tamanho estável após a fragmentação (cenários 1 e 2). Essas
assinaturas demográficas reforçam a estabilidade populacional e a falta de evidência
para uma expansão significativa nas regiões do Pantanal.
As inferências demográficas sugerem uma história populacional complexa para
Anodorhynchus hyacinthinus. A presença de expansão em algumas regiões e
estabilidade em outras destaca a importância de considerar padrões demográficos
variados na conservação e manejo dessa espécie. O estudo contribui para uma
compreensão mais abrangente da dinâmica populacional da Arara-azul-grande e fornece
informações valiosas para estratégias de conservação.
22
2.3.2 Origem de filhotes apreendidos
A análise de FST e RST entre as sub-regiões do Pantanal Sul e regiões Norte e Nordeste
revelou não significativa diferenciação genética, servindo como base para investigar a
origem de aves apreendidas.Incialmente, sete grupos foram considerados: Pantanal
Norte (PN), Pantanal Sul (PS), Norte + Nordeste (N+NE), e quatro grupos de filhotes
apreendidos (AP1 a AP4). Valores de FST e RST foram cruciais na definição desses grupos
para as análises posteriores.
O teste de atribuição, considerando oito potenciais grupos, destacou que a maioria dos
filhotes apreendidos foi atribuída corretamente a seus grupos geográficos de origem. No
entanto, análises mais detalhadas revelaram probabilidades específicas para cada grupo,
indicando uma alta precisão nas atribuições.
2.3.3 Ìndices de Similaridade e Comparação com Filhotes Não-Relacionados:
Os índices de similaridade simples entre os filhotes apreendidos variaram, indicando
diversidade genética dentro dos grupos. Notavelmente, esses índices foram
significantemente maiores dentro dos grupos de apreensão em comparação com filhotes
não-relacionados, sugerindo padrões genéticos distintos.As análises genéticas
forneceram uma abordagem robusta na determinação da origem de filhotes apreendidos
de Anodorhynchus hyacinthinus. Os resultados indicam uma eficaz atribuição dos
filhotes aos seus grupos geográficos de origem, enfatizando a utilidade da genética na
gestão e conservação dessa espécie ameaçada.
2.4 Discussão
A análise de microssatélites em 98 indivíduos de Anodorhynchus hyacinthinus revelou
dois a nove alelos, com média de heterozigosidade observada de 0,438. Em contraste, as
sequências mitocondriais de 80 indivíduos exibiram baixa variabilidade, indicando
apenas oito sítios polimórficos em 2123 pb e 11 haplótipos, com diversidade nucleotídica
23
de 0,00071. Comparativamente, a espécie Ara ararauna demonstrou maior variabilidade
genética para os mesmos marcadores.
A menor variabilidade nos microssatélites de A. hyacinthinus é discutida, sugerindo que
essa característica pode ser intrínseca à espécie. A utilização de primers heterólogos, a
distância filogenética em relação às espécies originais dos primers, e a categoria de
ameaça da espécie (estimadaem 2.500 a 10.000 indivíduos) podem contribuir para essa
menor variabilidade genética. Contudo, a associação entre ameaça de extinção e baixa
variabilidade genética não é sempre linear, como evidenciado em outros estudos.
Análises Bayesiana e índices de RST com base em microssatélites indicaram uma
moderada diferenciação genética entre os principais grupos: Pantanal Norte (PN),
Pantanal Sul (PS), norte (N) e nordeste (NE). Testes de atribuição e AMOVA também
sustentam a diferenciação entre três grupos geneticamente distintos. Não
surpreendentemente, a diferenciação entre Pantanal e as regiões norte e nordeste foi
observada, dada a considerável distância geográfica.
Embora a região Norte e Nordeste tenha apresentado baixa diferenciação genética em
análises de RST e Bayesianas, os resultados baseados em FST e análises mitocondriais
não indicaram tal diferenciação. Essa aparente contradição é discutida à luz da
distribuição contínua da espécie entre essas regiões, conforme observado em mapas
propostos por Antas et al.
Ao analisar microssatélites e sequências mitocondriais, foram encontrados padrões
distintos. Microssatélites revelaram baixa variabilidade genética comparada a outras
espécies, possivelmente devido à filogenia distante dos primers utilizados. A
diferenciação genética entre Pantanal e regiões norte e nordeste foi esperada, dada a
considerável distância geográfica.
A análise Bayesiana e índices FST e RST indicaram moderada diferenciação entre
Pantanal norte (PN), Pantanal sul (PS), norte (N) e nordeste (NE). No entanto, a baixa
diferenciação entre N e NE sugere possível fluxo gênico ou isolamento recente. Essa
complexidade é destacada pela análise de apreensões, sugerindo tráfico ilegal e a
necessidade de medidas mais eficazes de combate.
A análise da estrutura genética entre Pantanal norte e sul foi inesperada, indicando
possível barreira entre essas áreas. Contrariamente, a ausência de diferenciação entre
sub-regiões do Pantanal sul sugere movimentação e reprodução sem barreiras. Esses
24
resultados desafiam observações de campo e destacam a necessidade de integrar dados
genéticos com outros contextos.
A análise de atribuição revelou alta probabilidade de origem para indivíduos
apreendidos nas regiões norte e nordeste, questionando informações fornecidas por
traficantes. A filopatria de fêmeas e diferenças na dispersão entre marcadores nucleares
e mitocondriais contribuem para a interpretação desses resultados.
Os achados enfatizam a complexidade das dinâmicas genéticas em A. hyacinthinus.
Limitações, como baixo número amostral e origem desconhecida, influenciam os
resultados. O estudo destaca a importância de mais amostras, integração de dados e
aprimoramento das estratégias de conservação, considerando as particularidades
genéticas dessas aves ameaçadas.
2.4.1 Inferências demográficas
O gênero Anodorhynchus, composto por três espécies, incluindo a possivelmente extinta
A. glaucus, enfrenta desafios demográficos. A população de A. hyacinthinus é estimada
em até 10.000 indivíduos, enquanto A. leari possui uma estimativa de 1.200 aves,
considerada historicamente rara. Mudanças ambientais ao longo dos séculos, como
incursões marinhas e eventos geológicos, impactaram a evolução dessas aves sensíveis.A
linhagem do gênero Anodorhynchus surgiu entre 15 e 23 milhões de anos atrás, durante
incursões marinhas na América do Sul. Eventos como o soerguimento dos Andes e
mudanças no curso do rio Amazonas contribuíram para divergências genéticas. A
separação entre A. hyacinthinus e A. leari ocorreu há aproximadamente 3,8 milhões de
anos, durante um período de esfriamento global e expansão de campos.
A análise genética sugere que grupos geneticamente diferenciados de A. hyacinthinus se
separaram entre 16 mil e 42 mil anos atrás, correspondendo ao final do Pleistoceno.
Mudanças climáticas e expansão/contração de habitats podem ter desempenhado um
papel crucial nesse processo. A filopatria das fêmeas e a dependência de árvores para
nidificação contribuíram para a diferenciação genética observada.
Embora a variabilidade genética de A. hyacinthinus seja baixa, indicando possível
redução populacional, testes de neutralidade não revelaram modificações significativas
no tamanho populacional. A análise da mismatch distribution e da rede de haplótipos
indicou sinais de expansão recente, contradizendo os resultados dos testes de
neutralidade. A interação complexa entre eventos históricos, características biológicas e
25
pressões ambientais destaca a importância da conservação, especialmente diante da
destruição do habitat natural e do tráfico ilegal. O Projeto Arara-Azul sugere um aumento
populacional recente, mas as escalas de tempo entre dados genéticos e observações
conservacionistas diferem. Compreender a história demográfica auxilia na previsão de
respostas a pressões futuras e na implementação eficaz de estratégias de conservação.
26
Capítulo 3. Análise do parentesco de pares de filhotes de arara-azul-grande
(Anodorhynchus hyacinthinus): investigando monogamia e fidelidade ao ninho
3.1 Introdução
A análise de similaridade genética e parentesco desempenha um papel crucial em
diversos estudos, destacando-se sua aplicação em programas de reprodução em
cativeiro. Esses dados são essenciais para evitar pareamentos consanguíneos,
especialmente em populações sem um registro genealógico adequado. Além disso,
aspectos da biologia das espécies, como a fidelidade de casais, podem ser explorados por
meio dessas análises.Embora a monogamia seja a estratégia reprodutiva predominante
em aves, estudos genéticos revelam altas taxas de paternidade extra-par em espécies
antes consideradas estritamente monogâmicas. No contexto dos psitacídeos, que são
geralmente considerados estritamente monogâmicos com base em observações de
campo, poucos estudos genéticos foram conduzidos para confirmar essa monogamia
genética.Pesquisas em grandes psitacídeos, como as araras Ara ararauna e Ara
chloropterus, revelaram maior similaridade genética entre filhotes do mesmo ninho em
comparação com filhotes de ninhos diferentes, sugerindo suporte à hipótese de
monogamia genética. No entanto, casos de disputa por ninhos entre dois casais de A.
chloropterus resultaram em menor similaridade genética entre filhotes do que o
esperado entre irmãos, indicando a possível presença de filhotes de casais diferentes no
mesmo ninho. Em um estudo envolvendo Cyanoliseus patagonus, os dados genéticos
indicaram que a espécie é social e geneticamente monogâmica.Outro ponto explorado é a
fidelidade dos casais a determinados ninhos, podendo ser analisada indiretamente
através da similaridade genética entre filhotes do mesmo ninho em diferentes estações
reprodutivas. Se esses filhotes forem mais semelhantes do que filhotes de ninhos
diferentes, a hipótese de casais reutilizando o mesmo ninho em diferentes estações
reprodutivas não pode ser descartada. Esses aspectos ressaltam a importância das
análises genéticas na compreensão da biologia reprodutiva dos psitacídeos.
3.2 Materiais e métodos
O estudo investigou duas populações de Ara hyacinthinus coletadas no Pantanal:
Pantanal norte (PN) na RPPN SESC Pantanal (Barão do Melgaço, Mato Grosso) e Pantanal
sul (PS) nas regiões de Miranda e Nhecolândia (Mato Grosso do Sul). Amostras de 34
filhotes do PN foram coletadas em três estações reprodutivas consecutivas de 2001 a
2003, enquanto amostras de 65 filhotes do PS foram coletadas em 10 estações
27
reprodutivas consecutivas de 1998 a 2007.A dificuldade na captura de adultos devido ao
seu tamanho, força e alta mobilidade levou à coleta de amostras exclusivamente de
filhotes. As amostras foram mantidas no Laboratório de Genética e Evolução Molecular
de Aves (LGEMA), Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo. O DNA foi isolado
usando proteinase K e fenol-clorofórmio seguindo o protocolo de Bruford et al. (1992).
Seis locos de microssatélites foram analisadosno mestrado, e no presente estudo, mais
dois locos foram incluídos.A reação de PCR foi conduzida para amplificação, e os
produtos foram analisados em gel de agarose e no sequenciador MegaBACE 1000. A
variabilidade genética em cada região foi avaliada em termos de número de alelos e
heterozigosidade usando o programa GENEPOP 3.3. Coeficientes de parentesco entre
pares de indivíduos foram obtidos pelos programas Relatedness 4.2 e ML-Relate, levando
em consideração a frequência alélica das populações.A análise estatística comparou
médias de coeficientes de parentesco entre indivíduos do mesmo ninho e de ninhos
diferentes usando o teste T-student e o de Mann-Whitney. Os índices foram categorizados
como baixo, intermediário e alto. O estudo visa entender a fidelidade de araras aos seus
ninhos ao longo das estações reprodutivas, considerando dados genéticos para avaliar o
parentesco entre filhotes.
3.3 Resultados
O estudo utilizou oito microssatélites para analisar duas populações de Ara hyacinthinus
no Pantanal: Pantanal norte (PN) e Pantanal sul (PS). Sete desses locos foram usados para
análises subsequentes devido à monografia de dois microssatélites, um em cada
população. A variabilidade genética foi avaliada em termos de número de alelos a
heterozigosidade observada e esperada.Os resultados mostraram diferenças
significativas entre as populações. No PS, as médias de similaridade genética entre
filhotes do mesmo ninho, na mesma estação reprodutiva, foram significativamente
maiores do que entre filhotes de ninhos diferentes. No entanto, essa diferença não foi
encontrada no PN. Análises de verossimilhança indicaram que, em algumas situações,
não se pode descartar a possibilidade de os filhotes não serem aparentados ou
meio-irmãos, enquanto a maioria dos pares indicou alta probabilidade de serem
irmãos.A análise dos genótipos dos ninhegos revelou combinações de alelos compatíveis
com irmãos na maioria dos ninhos. No entanto, em alguns casos, foram identificadas
combinações que sugerem não serem irmãos, indicando possíveis casos de paternidade
extra-par ou parasitismo de ninho. A maioria dos índices de parentesco observados para
pares de indivíduos do mesmo ninho foi considerada alta.Os resultados indicam variação
28
na fidelidade reprodutiva das araras entre as populações do PN e PS, com implicações
importantes para a compreensão da estrutura genética e comportamental dessas aves no
Pantanal.
3.4 Discussão
O estudo investigou a estrutura genética e os padrões de parentesco em populações de
araras-azuis (Ara hyacinthinus) no Pantanal sul (PS) e no Pantanal norte (PN). Foi
observada uma diferença significativa nas médias dos índices de parentesco entre
filhotes do mesmo ninho na mesma estação reprodutiva no PS, sendo mais elevada do
que entre filhotes de ninhos diferentes. No entanto, essa diferença não foi evidenciada
no PN, possivelmente devido à baixa amostragem de ninhos naquela população.A análise
de cada ninho indicou que a maioria dos filhotes encontrados no mesmo ninho (81,25%)
provavelmente são irmãos de pai e mãe (full siblings), enquanto filhotes de ninhos
diferentes não apresentaram relações de parentesco próximo. Esses resultados são
congruentes com estudos anteriores em Ara ararauna, sugerindo uma monogamia
genética estrita, uma característica incomum em aves.A discussão sobre as possíveis
explicações para os padrões genéticos observados incluiu considerações sobre
monogamia genética, fidelidade dos casais, competição por cavidades de nidificação e
possíveis cenários de paternidade extra-par e parasitismo de ninho. A análise de DNA
revelou que alguns pares de filhotes (12,5%) apresentaram baixas probabilidades de
serem irmãos de pai e mãe, indicando a possibilidade de paternidade extra-par ou
parasitismo de ninho.O estudo destacou a importância da competição por cavidades de
nidificação na ecologia reprodutiva dessas araras, especialmente considerando a
escassez de locais apropriados para reprodução. A comparação entre filhotes de
diferentes estações reprodutivas sugeriu que alguns casais podem se reproduzir
anualmente, enquanto outros podem fazê-lo a cada dois anos. A discussão concluiu
destacando a necessidade de um maior número de locos de microssatélites para
aumentar a robustez dos resultados e enfatizou a importância de integrar dados
genéticos e observações de campo para uma compreensão mais abrangente dos padrões
reprodutivos dessas aves.Em suma, o estudo forneceu insights valiosos sobre a estrutura
genética e os comportamentos reprodutivos das araras-azuis, ressaltando a
complexidade e diversidade desses padrões no contexto do Pantanal.
29
Capítulo 4. Teste de sexagem com amostras de penas em Anodorhynchus
hyacinthius
4.1 Introdução
Este estudo aborda a importância da identificação do sexo de aves em diversas
pesquisas, especialmente em contextos como o manejo de populações ameaçadas e em
cativeiro. A informação sobre o sexo é crucial para a implementação de programas de
reprodução em cativeiro, detecção de viés na razão sexual e condução de estudos
comportamentais. A técnica de sexagem molecular de aves, que utiliza a diferença de
comprimento de um íntron do gene CHD-1, tem sido amplamente aplicada,
especialmente em grupos como os psitacídeos que não apresentam dimorfismo sexual
externo.No entanto, a eficiência dessa técnica é prejudicada ao trabalhar com amostras
de DNA de baixa qualidade, como peles de museu e penas de muda. Estudos anteriores
indicaram que a amplificação de fragmentos de DNA mitocondrial e de microssatélites é
mais eficaz nessas circunstâncias. Para superar essa limitação, o presente estudo buscou
padronizar a metodologia de sexagem para amostras de penas de Anodorhynchus
hyacinthinus, visando melhorar a eficiência da técnica quando aplicada a amostras de
DNA de qualidade inferior. Uma estratégia utilizada para otimizar a técnica foi o
desenvolvimento de um primer interno (M5) para amplificar o CHD-1, resultando em
fragmentos mais curtos (200-250 pb em comparação com os 300-400 pb iniciais). Essa
redução de tamanho facilita a amplificação de amostras de DNA de penas de aves, que
historicamente apresentavam baixa eficiência na sexagem molecular. O estudo
contribui, assim, para aprimorar a aplicabilidade da técnica de sexagem molecular em
contextos onde amostras de DNA de baixa qualidade são comuns.
4.2 Materiais e métodos
O estudo investigou a sexagem molecular de penas de cobertura de aves, especificamente
Anodorhynchus hyacinthinus, usando duas abordagens de extração de DNA. Foram
analisadas penas recém-arrancadas de 14 indivíduos e penas coletadas no solo próximo a
11 ninhos monitorados em uma Reserva Particular do Patrimônio Natural no Pantanal,
Brasil.A extração de DNA das penas de cobertura foi realizada individualmente, seguindo
protocolos distintos para penas arrancadas e penas encontradas no solo. Para penas
arrancadas, foi utilizado o protocolo de digestão com proteinase K seguido de purificação
30
com fenol: clorofórmio: álcool isoamílico. Já para penas encontradas no solo, foi utilizado
o kit DNeasy Tissue Kit com modificações, incluindo o corte longitudinal do cálamo das
penas para facilitar a digestão.As reações de amplificação foram realizadas usando
primers específicos (P2 e P8) em condições padronizadas, e amostras com sexagem não
identificada foram submetidas a uma segunda reação utilizando o primer M5. A
separação dos produtos foi feita em gel de agarose 3%, acompanhada por controle
positivo (amostra de fêmea previamente sexada).A metodologia aplicada neste estudo
busca melhorar a eficiência da técnica de sexagem molecular, especialmente em
amostras de penas de qualidade inferior. O desenvolvimento de estratégias adaptadas à
natureza das amostras é essencial para obter resultados confiáveis na identificação do
sexo de aves em estudos de conservação e comportamentais.
4.3 Resultados e Discussão
Figura 4.1 Gel de agarose
3% com produtosobtidos com os primers M5 e P8. L: ladder 1 kb Plus;1 e 2: penas da
coberteira; 3-13: penas caídas no chão; N: controle negativo; P: controle positivo.
A determinação do sexo em aves é fundamental para estudos de genética da conservação
e manejo de populações. Este estudo avaliou a eficácia de diferentes metodologias de
sexagem utilizando penas coletadas em coberteiras e no solo. Inicialmente, 86% das
penas de coberteiras foram sexadas com sucesso usando os primers P2 e P8, enquanto
nenhuma das penas coletadas no solo resultou em produto utilizando a mesma
abordagem (Griffiths et al., 1998). Diante dessa limitação, foram empregados os primers
31
M5 e P8, conforme proposto por Bantock et al. (2007). Na primeira tentativa, foi possível
sexar as duas penas de coberteiras restantes (100%) e três das 11 penas coletadas no
chão, evidenciando uma melhoria na eficiência da sexagem. Na segunda tentativa,
amplificaram-se três das oito amostras restantes, totalizando seis das 11 amostras com
sexo identificado (56%). Os fragmentos resultantes variaram entre 250 e 300 pb.Os
resultados sugerem que a metodologia de Bantock et al. (2007) é mais eficiente em
estudos com DNA de baixa qualidade devido à produção de fragmentos menores na
amplificação com os primers M5 e P8. Essa eficácia destaca a utilidade dessa abordagem
em estudos genéticos aplicados à conservação e manejo de populações de aves,
corroborando com trabalhos anteriores que enfatizam a importância dessas técnicas em
contextos similares (Bunce et al., 2003; Huynen et al., 2003). Essa adaptação metodológica
revela-se promissora para superar desafios relacionados à qualidade do DNA em
amostras de penas.
CONCLUSÕES GERAIS
A análise de microssatélites e DNA mitocondrial em Anodorhynchus hyacinthinus
proporcionou informações valiosas sobre diversos aspectos genéticos e evolutivos dessa
espécie de psitacídeo. Dentre as principais conclusões, destaca-se a constatação de uma
baixa variabilidade genética nos microssatélites e no DNA mitocondrial, especialmente
quando comparada a outras espécies de psitacídeos. Essa característica pode ser uma
peculiaridade intrínseca à espécie ou indicar uma expansão populacional recente.Os
microssatélites utilizados demonstraram ser informativos na análise da estrutura
genética populacional, fornecendo um panorama detalhado da distribuição genética. No
entanto, a região controladora do DNA mitocondrial revelou-se mais variável, com a
identificação de picos duplos. A subsequente sequenciação de partes específicas dos
genes ND5, citocromo b e ND2, que apresentavam polimorfismo, ofereceu uma
compreensão mais aprofundada dessa variabilidade.A análise indicou uma moderada
diferenciação genética populacional em A. hyacinthinus, com a identificação de quatro
grupos principais nas regiões do Pantanal Norte, Pantanal Sul, Norte e Nordeste.
Entretanto, análises alternativas, como índices de FST e a rede de haplótipos, sugeriram
diferenciação entre apenas três regiões, com Norte e Nordeste apresentando
similaridades genéticas. O isolamento recente das araras nas regiões Norte e Nordeste foi
apontado como um fenômeno, e a sensibilidade de métodos como a análise Bayesiana foi
destacada para detectar tal estruturação.A diferenciação genética mais acentuada
evidenciada pelo DNA mitocondrial em comparação com os microssatélites foi
32
interpretada à luz da dispersão diferencial dos sexos e da herança matrilinear e haploide
do DNAmt. Essas características resultam em um tamanho populacional efetivo menor,
influenciando a taxa de deriva genética. Além disso, a possibilidade de homoplasias nos
microssatélites foi considerada, podendo subestimar a diferenciação populacional.A
atribuição bem-sucedida da maioria dos indivíduos à sua população de origem destaca a
utilidade prática dessa análise na identificação da proveniência de aves apreendidas,
respaldando esforços de conservação. A estimativa da data de divergência entre os
grupos genéticos, ocorrida entre 16 mil e 42 mil anos atrás, alinhada ao final do
Pleistoceno, sugere uma influência significativa das mudanças climáticas desse período
na distribuição atual da espécie.Outro ponto relevante é a análise de simulação,
indicando uma possível estabilidade populacional ao longo do tempo, o que poderia
explicar a baixa variabilidade genética observada. O gênero Anodorhynchus,
compreendendo duas espécies ameaçadas e uma extinta, revela-se sensível às variações
ambientais ao longo de sua história evolutiva.A similaridade genética entre filhotes de A.
hyacinthinus corrobora dados de campo, apontando para um comportamento
predominantemente monogâmico, embora surpreendentemente evidencie uma alta
frequência de paternidade extra-par e parasitismo de ninho. Esses resultados destacam a
complexidade das interações reprodutivas na espécie.A metodologia proposta por
Bantock et al. (2007) para a sexagem, mostrou-se mais eficiente em estudos com DNA de
baixa qualidade, como o extraído de penas, fornecendo uma ferramenta valiosa para
pesquisas genéticas em condições desafiadoras. Essa abordagem é crucial para estudos
de conservação e manejo de populações, bem como para compreender aspectos
comportamentais e reprodutivos da espécie.
33
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