AULA 3

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BIOLOGIA MOLECULAR E
DIAGNÓSTICO POR DNA
AULA 3
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Profª Liana Oliveira
CONVERSA INICIAL
Nesta aula, iremos conversar sobre a citogenética clássica e molecular. Quando falamos em
citogenética, estamos falando em analisar nossos cromossomos e suas alterações. Inicialmente, era
possível perceber apenas alterações estruturais grandes que fossem visíveis ao microscópio com
técnicas de citogenética convencional. Porém, foram surgindo técnicas que permitiam detectar
alterações menores, sendo estabelecida a citogenética molecular.
As técnicas que veremos nesta aula permitem o diagnóstico de diversas doenças, incluindo
aneuploidias, como a Síndrome de Down, mas também alterações menores, como deleções,
relevantes para casos de desordens do neurodesenvolvimento, ou translocações, relevantes em casos
de câncer. Para isso, vamos inicialmente relembrar os tipos de alterações cromossômicas que existem.
Ao final desta aula, você deverá conhecer as técnicas para detecção de alterações cromossômicas
numéricas e estruturais e entender as possibilidades e limitações de cada uma delas.
TEMA 1 – CROMOSSOMOS E SUAS ALTERAÇÕES
Entre a gama de variações genéticas que podemos detectar utilizando nosso DNA estão as
alterações cromossômicas. Antes de relembrarmos os tipos de alterações cromossômicas, vamos
relembrar a estrutura dos cromossomos. Cada cromossomo é composto por uma molécula de DNA e
várias proteínas, que mantêm essa molécula de DNA organizada. Numa célula que não está se
dividindo, cada cromossomo é composto por uma única cromátide. Nessa fase do ciclo celular, se
corarmos o DNA de uma célula, iremos visualizar o núcleo inteiro corado. Não é possível enxergar
cromossomos individualizados numa célula em interfase, pois eles estão pouco condensados e
sobrepostos, exercendo sua função.
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Quando a célula vai se dividir, ela duplica seus cromossomos e eles passam a ter duas
cromátides. Durante a divisão celular, há maior condensação dos cromossomos, justamente para que
cada um fique individualizado e não ocorram quebras no momento de separar os cromossomos para
as células-filhas. Esse maior grau de condensação permite a visualização de cada cromossomo ao
microscópio. Por isso, a imagem que temos de cromossomos em formato de “X” representa
cromossomos duplicados, na fase de metáfase da divisão celular, na qual estão muito condensados e
podemos vê-los ao microscópio óptico.
Cada cromossomo possui um centrômero, que é a região que une as cromátides. Acima do
centrômero, teremos o braço curto do cromossomo, chamado de p e, abaixo, o braço longo,
chamado de q. As extremidades dos cromossomos são chamadas de telômeros. Temos 22
cromossomos autossômicos, numerados de 1 a 22 de acordo com forma e tamanho. Para cada um
deles, temos duas cópias, uma materna e outra paterna. O cromossomo 1 paterno é homólogo ao
cromossomo 1 materno, eles têm o mesmo tamanho, mesma forma e mesmos genes nas mesmas
posições (figura 1). Da mesma forma, os demais cromossomos (2 a 22) também têm seu homólogo.
Além desses, temos os cromossomos sexuais, sendo dois cromossomos X nas mulheres e um X e um
Y nos homens.
Figura 1 – Cromossomos homólogos antes e depois da replicação
Créditos: Trinset/Adobestock.
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Além do tamanho, também classificamos os cromossomos de acordo com a posição do
centrômero. Quando o centrômero está bem no meio do cromossomo, este será um cromossomo
metacêntrico. Se o centrômero tiver um pouco acima do meio, como nos cromossomos mostrados
na figura 1, será um cromossomo submetacêntrico. Já um cromossomo em que o centrômero estiver
muito próximo à extremidade será um cromossomo acrocêntrico.
Os cromossomos humanos são classificados do maior para o menor e separados em grupos de
acordo com o tipo de cromossomo. A figura 2 mostra um ideograma, que é um esquema de cada um
dos 22 cromossomos autossômicos e dos cromossomos sexuais, considerando seus tamanhos, formas
e bandas, quando submetidos à técnica de bandeamento G, que veremos ainda nesta aula.
Figura 2 – Ideograma dos cromossomos humanos
Créditos: Alila Medical Media/Shutterstock.
1.1 ALTERAÇÕES CROMOSSÔMICAS NUMÉRICAS
Existem alterações numéricas e estruturais. Alterações numéricas representam a presença de um
número de cromossomos diferente do característico da espécie. No caso da espécie humana, temos
46 cromossomos por célula. Qualquer número de cromossomos diferente disso representa uma
alteração cromossômica numérica. Entre as possíveis variações numéricas, as mais comuns são as
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aneuploidias, que representam perda ou ganho de cromossomos em um número não múltiplo do
conjunto haploide. Nosso número haploide é de 23 cromossomos, então qualquer número de
cromossomos não múltiplo de 23 caracteriza uma aneuploidia.
As aneuploidias explicam cerca de 50% dos casos de abortos espontâneos ocorridos antes de 15
semanas de gestação. Porém, algumas aneuploidias não são incompatíveis com a vida. A aneuploidia
mais comum na espécie humana é a trissomia do cromossomo 21, conhecida como Síndrome de
Down. A idade materna avançada é o principal fator de risco para as aneuploidias, por ocorrência de
não-disjunção na meiose. Por exemplo, considerando nascidos vivos, a frequência de aneuploidias em
filhos de mães com 35 anos é de 1 em 204, enquanto de mães com 45 anos é de 1 em 19 (Maluf,
2011).
1.2 ALTERAÇÕES CROMOSSÔMICAS ESTRUTURAIS
As alterações cromossômicas estruturais são alterações que envolvem segmentos
cromossômicos, e não cromossomos inteiros. Existem quatro tipos de alterações estruturais: deleção,
duplicação, inversão e translocação. Na deleção, ocorre a perda de um segmento de um
cromossomo. Na duplicação, um segmento do cromossomo é duplicado. Esse segmento duplicado
pode estar logo em seguida do segmento original (figura  3), ou em outro local do mesmo ou de
outros cromossomos.
Figura 3 – Tipos de alterações cromossômicas estruturais
Créditos: Griskeviciene/Shutterstock.
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Na inversão, um segmento do cromossomo é quebrado e religado, mas em sentido trocado
(figura 3). Se esse segmento incluir o centrômero, teremos uma inversão pericêntrica. Se o segmento
não incluir o centrômero, será uma inversão paracêntrica.
Já a translocação é uma troca de segmentos entre cromossomos não homólogos (figura 3). Por
exemplo, há uma quebra no cromossomo 1 e esse segmento é unido ao cromossomo 5, enquanto
um segmento do cromossomo 5 vai para o cromossomo 1.
Um ponto importante é que nas inversões e nas translocações, pode ou não haver perda de DNA.
Quando não há nenhuma perda ou ganho, será uma alteração balanceada. Nesses casos, pode não
haver comprometimentos no indivíduo. Porém, é possível que os pontos de quebra sejam dentro de
genes, podendo comprometer a função do gene quebrado, ou até unir segmentos de dois genes
diferentes, formandos genes de fusão, que codificam proteínas aberrantes.
TEMA 2 – CITOGENÉTICA CONVENCIONAL
Na citogenética, avaliamos os cromossomos em metáfase ao microscópio óptico, devido ao alto
grau de enovelamento que permite a visualização de cada cromossomo de maneira individualizada,
como já comentado. Isso significa também que os cromossomos observados estão duplicados, com
duas cromátides. Para possibilitar a observação de cromossomos em metáfase, precisamos colocar as
células da amostra em meio de cultivo e estimular a divisão celular.
A escolha da amostra é feita de acordo com o paciente e a indicação clínica. Geralmente, será
utilizado sangue periférico,mas o cultivo pode também ser feito por meio de líquido amniótico,
medula óssea ou de biópsias de tumores sólidos, entre outros. O cultivo de células sanguíneas
geralmente é feito por 48 horas, mas o cultivo de outros tecidos pode ser mais longo.
Após o período de cultivo, é adicionada colchicina ao meio, que irá impedir a formação de fibras
do fuso mitótico, fazendo com que as divisões celulares sejam interrompidas na fase de metáfase.
Após incubação com colchicina, as células são fixadas e submetidas a uma solução hipotônica. Para o
preparo da lâmina, serão pingadas gotas da solução com as células em lâmina aquecida e úmida.
Quando as gotas caem na lâmina, por conta da solução hipotônica colocada, muitas células irão
estourar e espalhar os cromossomos.
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As lâminas ficam em estufa até o dia seguinte, pois esse “envelhecimento” contribui para a
melhor resolução das bandas a serem observadas depois.
Para criar o padrão de bandas que observamos nos cromossomos, as lâminas são colocadas em
solução de tripsina EDTA por poucos segundos, havendo digestão parcial do cromossomo em pontos
específicos. Depois, há coloração com corante Giemsa, caracterizando a técnica conhecida como
bandeamento G, utilizada para análise de cromossomos humanos. Cada cromossomo terá sempre o
mesmo padrão de bandas.
No microscópio, veremos os cromossomos como na primeira imagem da figura 1. Então, uma
câmera irá captar a imagem dos cromossomos e analistas irão montar o cariograma, classificando os
cromossomos e procurando por alterações. São avaliadas 20 metáfases por paciente, possibilitando a
definição do cariótipo. No caso da segunda imagem da figura 4, temos o cariograma de um paciente
com cariótipo 47, XY, +21, o que caracteriza Síndrome de Down.
 
Figura 4 – Metáfases ao microscópio e cariograma de paciente com Síndrome de Down
Créditos: Rattiya; Jens Goepfert/Shutterstock.
A citogenética convencional permite o diagnóstico de aneuploidias e de variações estruturais,
desde que os segmentos envolvidos sejam grandes, com no mínimo 5 a 10 megabases (Mb), ou seja,
5 milhões de pares de base. A figura 5 mostra um desenho exemplificando uma translocação muito
comum em leucemias, t(9;22), que leva ao surgimento de um gene de fusão BCR-ABL no chamado
cromossomo Philadelphia, que é o cromossomo 22 translocado, que fica com o tamanho bem
reduzido.
Figura 5 – Esquema mostrando translocação entre os cromossomos 9 e 22
https://www.shutterstock.com/pt/image-photo/chromosomes-human-under-microscope-education-lab-1235867533
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https://www.shutterstock.com/pt/image-photo/karyotyp-human-male-trisomy-21-down-99447500
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Créditos: Kateryna Kon/Shutterstock.
TEMA 3 – FISH
O nome da técnica de FISH vem do inglês fluorescence in situ hybridization, que significa
hibridização in situ com fluorescência. A ideia dessa técnica é utilizar uma sonda fluorescente para
hibridizar no DNA das células e observar os sinais em microscópio de fluorescência. É in situ, pois não
há extração do DNA, observamos ele diretamente da célula. A sonda irá hibridizar no DNA alvo, que é
complementar a ela. Depois, é feita uma lavagem para retirar as sondas que não hibridizaram. Assim,
ao observar ao microscópio, iremos visualizar os sinais referentes ao DNA com a sonda ligada a ele.
Já falamos em sondas no contexto da PCR em tempo real com sonda de hidrólise e na PCR-SSO.
Nesse caso, as sondas eram sequências pequenas de DNA, de cerca de 20  pb. Já na FISH, essas
sondas precisam ser muito maiores, pois precisamos conseguir observá-las ao microscópio. Na FISH,
as sondas têm pelo menos cerca de 100.000 pb, ou 100 kb (kilobases), mas elas podem ter tamanhos
maiores, até o de um cromossomo inteiro, dependendo do objetivo.
O preparo da lâmina é similar ao da citogenética convencional, porém, não há necessidade de
cultivar as células previamente, sendo possível observar células em interfase. A FISH pode ser utilizada
para avaliar alterações cromossômicas numéricas ou estruturais, tanto as que podem ser observadas
na citogenética convencional quanto as alterações menores, já que é possível observar a fluorescência
mesmo que a sonda tenha apenas 100kb. A vantagem de utilizar FISH no lugar da citogenética
https://www.shutterstock.com/pt/image-illustration/philadelphia-chromosome-karyotype-male-female-3d-485544793
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convencional é que ela é uma técnica mais rápida, não havendo necessidade de cultivar as células. Por
outro lado, as sondas fluorescentes podem ser muito caras e o microscópio de fluorescência que é
necessário para a FISH é um equipamento muito caro também. A citogenética convencional é
relativamente barata em termos de reagentes e equipamentos, mas exige analistas muito treinados
para reconhecer e identificar os cromossomos e perceber possíveis alterações.
Outra diferença é que na citogenética convencional são analisadas 20 metáfases, já na FISH são
observados cerca de 200 núcleos para liberar o resultado. Assim, a sensibilidade da técnica de FISH é
maior, podendo detectar alterações que estão presentes em uma menor quantidade de células, o que
é importante em casos de câncer. Além disso, como foi comentado, a técnica de FISH também
permite a detecção de alterações menores, pequenas demais para serem percebidas na citogenética
convencional.
As sondas de FISH podem funcionar de diferentes formas, com alvos diferentes. Para detectar
uma aneuploidia, por exemplo, é possível utilizar uma sonda que marque um cromossomo inteiro, ou
então uma sonda específica para o centrômero de um cromossomo específico. Assim, a quantidade
de sinais daquela fluorescência observados no núcleo irá refletir o número de cópias daquele
cromossomo na célula. Outra possibilidade é a sonda ser específica para um gene, por exemplo, para
vermos o número de cópias do gene na célula. Em alguns casos de câncer, pode haver amplificação
de um gene e esse estar em múltiplas cópias nas células tumorais. Ainda podemos ter sondas para
regiões de um cromossomo que podem estar deletadas em certas doenças, como é o caso de uma
parte do braço longo do cromossomo 22 (22q11.2) na Síndrome de DiGeorge.
Translocações em casos de câncer muitas vezes quebram um gene ao meio, ou unem o início de
um gene com o final de outro. Então, é comum existirem sondas para o segmento inicial ou
segmento final de um gene. Se utilizarmos uma sonda com fluorescência que seja captada como cor
vermelha para o início de um gene, e outra com fluorescência que seja lida como verde para o final
do mesmo gene, será possível saber se o gene está íntegro. Caso as duas sondas estejam muito
próximas, praticamente sobrepostas, saberemos que o gene está íntegro. Caso os dois sinais estejam
separados no núcleo, saberemos que houve rompimento do gene, provavelmente por uma
translocação.
TEMA 4 – MICROARRANJO
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Um microarranjo é basicamente uma lâmina, ou chip, com muitos micropoços contendo
pequenas sequências de DNA. A ideia aqui, novamente, é ligar DNA alvo e sonda e observar o
resultado, mas isso é feito simultaneamente para milhares ou milhões de sondas e alvos diferentes.
No contexto da citogenética molecular, o microarranjo veio como uma forma de verificar a
existência de alterações de ganho ou perda (duplicações ou deleções) de regiões menores, não
possíveis de serem detectadas por citogenética convencional ou por FISH. Mesmo em casos de
alterações detectáveis porFISH, o microarranjo teria a vantagem de possibilitar o teste do genoma
todo simultaneamente, mesmo sem saber em qual região poderia estar essa alteração.
Inicialmente, a busca por alterações no número de cópias acontecia pela hibridização genômica
comparativa, ou CGH (do inglês, comparative genomic hybridization). Nesta técnica, os cromossomos
da pessoa testada são hibridizados aos cromossomos de um indivíduo controle. O DNA de cada
indivíduo é marcado com uma fluorescência diferente e essa hibridização era feita com metáfases em
uma lâmina, de maneira parecida à citogenética convencional. Se em algum ponto de um
cromossomo houvesse mais cópias no cromossomo da pessoa testada, esta fluorescência ficaria mais
forte. Se houvesse menos cópias, a fluorescência do indivíduo controle ficaria mais forte. Dessa forma,
era possível avaliar a totalidade dos cromossomos quanto a duplicações ou deleções. Porém, isso era
possível apenas para alterações com tamanho suficiente para serem observadas ao microscópio.
Com base nisso, surgiu o CGH em arranjo, ou array-CGH (aCGH), no qual temos pequenos
segmentos de cada cromossomo em cada micropoço, as sondas. Teremos também um DNA teste e
um DNA referência, marcados com fluorescências diferentes, que serão co-hibridizados nesse
microarranjo, ou seja, ambos competem para se ligarem às sondas nos poços. Geralmente, será
utilizada uma fluorescência vermelha e uma verde. Se houver igual quantidade daquele trecho de
DNA nas duas amostras, a fluorescência será amarela, pois é a sobreposição das duas. Caso haja
ganho de cópias no DNA teste, sua fluorescência (geralmente vermelha) irá prevalecer. Se houver
perda de cópias, a fluorescência do DNA referência (geralmente verde) irá prevalecer. A fluorescência
é lida por um scanner e o resultado é interpretado com ajuda de um software, que irá quantificar a
fluorescência em cada poço (figura 6).
Figura 6 – Pedaço de uma lâmina de microarranjo, mostrando poços verdes (perda de DNA na
amostra teste), vermelhos (ganho de DNA na amostra teste) e amarelos (sem ganho nem perda)
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Créditos: Alila Medical Media/Shutterstock.
No aCGH, a ideia é ter sondas que cobrem todo o genoma. Porém, existem diferentes formatos
de lâminas, com números de poços diferentes e com tamanhos e distâncias entre as sondas variados.
Isso leva a diferentes resoluções nos testes. Mas é possível, por exemplo, detectar uma perda ou
ganho de um segmento de apenas 1 kb. Existem também outros tipos de microarranjos, feitos com
outros objetivos. É possível fazer um microarranjo por meio de cDNA para comparar a expressão
gênica global entre duas amostras.
Outra possibilidade é um microarranjo de variantes genéticas, chamadas de SNPs (do inglês
single nucleotide polymorphism), que são substituições de uma única base do DNA. Nesse caso, é
possível genotipar o indivíduo para aquele SNP, ou seja, descobrir se naquela posição ele tem A ou C,
por exemplo. Os SNPs podem genotipados com as técnicas de PCR que vimos anteriormente (com
exemplo da anemia falciforme), mas a vantagem do microarranjo é que podemos genotipar milhares
ou milhões de SNPs simultaneamente. Nesse caso, haveria uma sonda para cada alelo, cada uma com
uma fluorescência, que seriam hibridizadas com o DNA do indivíduo. Se o indivíduo for homozigoto,
apenas a fluorescência da sonda para o alelo que ele tem será observada. Caso o indivíduo for
heterozigoto, o sinal de ambas as sondas será observado.
Como o equipamento quantifica o sinal de cada fluorescência, por meio de um microarranjo de
SNPs também é possível observar se há ganho ou perda de material genético na região. Por isso,
atualmente, muitos laboratórios utilizam esse tipo de microarranjo no lugar do aCGH. Com isso, é
possível, ao mesmo tempo, avaliar perdas e ganhos e genotipar o indivíduo para milhões de variantes
genéticas.
https://www.shutterstock.com/pt/image-illustration/example-dna-microarrays-used-cancer-other-75924325
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TEMA 5 – MLPA
A sigla MLPA vem de Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, que significa amplificação
multiplex de sondas dependente de ligação. Esta técnica é baseada em PCR e permite detectar
deleções ou duplicações menores, como as que envolvem apenas um éxon de um gene. Com essa
técnica, serão testadas algumas dezenas de regiões simultaneamente, por isso é um multiplex. Porém,
é utilizada para casos em que já se sabe em qual gene estão sendo buscadas alterações, pois ela não
testa o genoma todo, como o microarranjo. A vantagem é que o custo do MLPA é bem menor que o
custo do microarranjo, então, quando se sabe qual região deve ser testada, é muito vantajoso.
Nessa técnica, haverá o pareamento de dois oligonucleotídeos adjacentes ao DNA alvo. Como
esses oligonucleotídeos estão adjacentes, mas não ligados entre si (não há a ligação fosfodiéster
entre eles), é utilizada uma enzima que faz essa ligação, a enzima DNA ligase. Nas nossas células, é a
DNA ligase quem faz a ligação entre os fragmentos de Okazaki na replicação, então é bem possível
que você já conheça essa enzima (figura 7).
Figura 7 – DNA ligase na replicação do DNA
Crédito: Ody_Stocker/Shutterstock.
Nessa técnica, teremos duas sondas complementares ao nosso DNA alvo de interesse, mas elas
são complementares a regiões adjacentes desse alvo. Se o alvo estiver presente, ambas as sondas se
hibridizam ao alvo e a DNA ligase irá ligar as duas sondas. Além da parte complementar ao DNA alvo,
estas sondas terão sequências de DNA que serão complementares a primers para uma PCR. Quando
houver ligação das duas sondas, isso servirá de DNA molde para a PCR com esses primers. Quando
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não houver ligação entre as sondas, não haverá molde para a PCR e, portanto, não haverá
amplificação.
Os primers utilizados para a PCR no MLPA são marcados com fluorescência e a eletroforese é
feita por eletroforese capilar, que já foi mencionada. Os equipamentos de eletroforese capilar, além
de separar o DNA por tamanho, possuem um detector de fluorescência. Assim, será possível saber o
tamanho e a fluorescência dos produtos de PCR. Outro ponto importante é que a quantidade de
fluorescência também é detectada e ela será maior quanto mais cópias houver do DNA alvo original.
Então, caso haja a deleção de uma cópia do segmento testado, por exemplo, é esperado um pico com
metade da altura do que o pico gerado quando há duas cópias. Assim, é possível sabermos se houve
ganho ou perda de cópias de cada região alvo testada.
Deleções são uma causa comum de doenças genéticas, muitas vezes sendo difíceis de detectar.
Por exemplo, o sequenciamento, que será visto mais adiante, é uma técnica importante e muito
utilizada no diagnóstico de doenças genéticas que não permite a detecção de deleções. Com isso,
técnicas como o aCGH e o MLPA são de grande relevância, pois permitem o diagnóstico molecular de
doenças causadas por esse tipo de alteração.
NA PRÁTICA
Um exemplo de aplicação das técnicas de citogenética vistas nesta aula é o diagnóstico de
leucemias. Por exemplo, no diagnóstico da Leucemia Mieloide Crônica (LMC), é essencial detectar a
presença da translocação entre os cromossomos 9 e 22, que já foi comentada. Essa translocação pode
ser observada por citogenética convencional. Inclusive, o cromossomo 22 translocado fica muito
menor, possibilitando sua identificação desde 1959, mesmo antes do desenvolvimento de técnicas de
bandeamento, e pouquíssimo tempo depois da descrição de que nós temos 46 cromossomos, que foi
em 1956. Desde sua identificação, este cromossomo é conhecido como cromossomo Philadelphia.
Essa translocação é descrita da seguinte forma: t(9;22)(q34;q11). Esta anotaçãomostra que os
cromossomos envolvidos são o 9 e o 22 e mostra as regiões envolvidas, ambas no braço longo dos
cromossomos. A translocação acaba unindo um pedaço de um gene do cromossomo 9 com um
pedaço de um gene do cromossomo 22, gerando o gene de fusão BCR-ABL1. Esse gene é transcrito e
traduzido, codificando uma proteína com atividade tirosina-quinase aumentada, o que leva ao
desenvolvimento da leucemia.
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Como comentado, essa translocação pode ser observada na citogenética convencional. Quanto
ao diagnóstico, geralmente será o exame de escolha. Porém, ao longo do tratamento, é feito um
acompanhamento do paciente, no qual é esperado que o número de células positivas para a
translocação, ou seja, células tumorais, vá diminuindo. Assim, a partir de um certo momento, é
possível que nenhuma das 20 metáfases analisadas pela citogenética convencional seja positiva para a
translocação, embora o paciente ainda tenha células tumorais. Então, técnicas mais sensíveis são
necessárias.
A técnica de FISH pode ser utilizada com uma maior sensibilidade que a citogenética
convencional. Porém, a técnica mais sensível e que permite uma melhor quantificação de células
leucêmicas é a RT-qPCR. O acompanhamento da quantidade de células positivas para a translocação
é essencial para o tratamento adequado. Existe um medicamento chamado Imatinib (Glivec®) que
consiste em uma terapia alvo para esta proteína alterada, sendo indicado para pacientes de leucemias
Ph+, ou seja, que são positivos para o cromossomo Philadelphia.
FINALIZANDO
Nesta aula, nós relembramos a estrutura dos cromossomos e os tipos de alterações
cromossômicas que podem ocorrer. Vale lembrar que alterações cromossômicas podem ser somáticas
ou germinativas, assim como qualquer outra variação genética. Uma alteração germinativa é aquela
que é observada em todas as células do indivíduo, inclusive na linhagem germinativa, podendo ser
herdada. No caso das alterações cromossômicas desse tipo, o indivíduo já nasce com uma doença ou
síndrome causada por essa alteração. Já as alterações somáticas são aquelas observadas em apenas
algumas células, geralmente células tumorais. No câncer, conhecer as alterações que levaram ao
surgimento da doença pode ser muito relevante para a escolha do tratamento mais adequado.
Nós vimos técnicas que avaliam o genoma todo, como a citogenética convencional e o aCGH,
bem como técnicas que avaliam regiões específicas de interesse, como a FISH e o MLPA. A escolha da
técnica mais adequada depende de sabermos que tipo de alteração leva ao surgimento da doença da
qual suspeitamos e do tamanho da alteração que estamos procurando, em termos de pares de base
no DNA.
A técnica de citogenética convencional avalia o genoma todo simultaneamente, mas permite
apenas observar alterações maiores que 5  Mb. Já o aCGH, que também avalia o genoma todo,
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permite a detecção de alterações que levem a ganho ou perda de DNA. O tamanho dessas alterações
depende de como o arranjo foi montado, mas pode ser a partir de 1 kb. A técnica de aCGH parece ser
muito vantajosa, mas ela apresenta alto custo, por isso, é utilizada apenas nos casos em que técnicas
mais acessíveis não estejam disponíveis.
A técnica de FISH irá avaliar segmentos cromossômicos específicos, e não mais o genoma todo.
Para utilizarmos essa técnica, precisamos saber em que região de qual cromossomo poderia estar a
alteração que estamos buscando, além disso, também é importante saber qual tipo de alteração
poderia ser. O tamanho do segmento detectado também depende da sonda, mas pode ser a partir de
100  kb. Vale lembrar que, pelo uso da fluorescência, tanto as sondas quanto o microscópio de
fluorescência tornam a FISH uma técnica relativamente cara, mas seu custo é bem inferior ao custo do
aCGH.
Se estivermos buscando alterações de ganho ou perda de DNA, outra alternativa é a técnica de
MLPA. Nessa técnica, é possível avaliar segmentos pequenos, como um único éxon de um gene. Por
ser uma técnica multiplex, vários segmentos podem ser avaliados simultaneamente. Porém, temos
que saber em quais segmentos de quais genes buscar. Dependendo da doença suspeita, isso é bem
possível. Nos casos em que isso não é possível, a técnica de aCGH passa a ser a única opção.
REFERÊNCIAS
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Research Applications. Front Cell Dev Biol., v. 4, p. 89, 2016.
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19/02/2024, 20:56 UNINTER
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